Tc－99m锡纳米胶体及其制备

摘要

本文公开一种锝标记的锡纳米胶体及其制备方法。所述胶体通过将放射性锝或其化合物的溶液与含有锡或其化合物、钠或其化合物、泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮的溶液混合来制备。作为允许淋巴转移的纳米尺寸粒子的所述胶体，其很容易制备，适于控制为均一尺寸，并且有可能作为核医学中的放射性药物，该放射性药物作为识别前哨淋巴结如乳腺癌中腋窝淋巴结的放射性示踪剂非常有用。

说明书

技术领域

本发明涉及锝标记的锡纳米胶体及其制备方法。更具体地，本发明涉及锝锡纳米胶体及其制备方法，作为允许淋巴转移的纳米尺寸粒子的所述胶体，其很容易制备，适于控制为均一尺寸，并且有可能作为核医学中的放射性药物，该放射性药物作为识别前哨淋巴结如乳腺癌中腋窝淋巴结的放射性示踪剂非常有用。

背景技术

用于核医学成像的锡胶体具有几微米的粒子尺寸，因此被肝枯否细胞吞噬，其主要用于肝成像。锡胶体可通过很简单的步骤制备。

利用主要被巨噬细胞摄取的概念，根据胶体的尺寸不同，其在生物学分布上有所不同。几微米的锡胶体粒子被肝内广泛分布的枯否细胞摄取。更小的胶体被脾和骨髓内的巨噬细胞捕获。影响胶体生物学分布的主要因素是粒子尺寸和亲水性。

胶体粒子已广泛用于核医学检查，用于测定淋巴转移和识别前哨淋巴结。当该胶体粒子尺寸大于500nm时，注射到胞间隙的放射性药物不会被运送到淋巴系统，而是保留在注射部位。小于5nm的粒子被吸收到毛细血管中而不进入淋巴系统，因而不停留在前哨淋巴结。在淋巴闪烁显像术中，用于淋巴显像的理想的粒子尺寸为10-30nm。

迄今为止，放射性药物如^99mTc-HAS、^99mTc-锑硫胶体和过滤的^99mTc-硫胶体已用于淋巴显像。按照粒子尺寸，将它们总结于表1中。

表1

 

胶体尺寸^99mTc-硫化锑3-12nm^99mTc-HAS4nm过滤的^99mTc-白蛋白胶体50-200nm过滤的^99mTc-硫胶体<200nm^99mTc-锡胶体(Hepatate)260-3900nm

前哨淋巴结是接受来自肿瘤部位淋巴引流的第一个淋巴结，癌细胞可能由该前哨淋巴结转移，从而由肿瘤块经过淋巴系统转移扩散。进行组织学检查时，如果前哨淋巴结不含有肿瘤细胞，则不必要进行大范围的淋巴结清扫。也就是说，因为肿瘤细胞不太可能经过淋巴系统转移，所以只进行去除肿瘤块的手术。这使患者在手术后更快地恢复正常活动，改善患者的生活质量，并使手术后的副作用减至最小。因此，进行了很多在手术前识别前哨淋巴结的尝试。

识别前哨淋巴结最广泛使用的方法涉及在肿瘤块周围注射放射性药物，通过成像监测放射性药物经过淋巴系统转移到淋巴结，以及在手术室中使用γ探测仪识别第一引流(前哨)淋巴结。或者，可通过注射染料并确定哪个淋巴结是前哨淋巴结来识别前哨淋巴结。但是，由于染料随着时间推移扩散到邻近组织或淋巴结，所以很难使用染料方法来识别前哨淋巴结。

近来，为了对乳腺癌患者进行治疗，已结合广泛应用的方法实施乳房切除术，其涉及识别前哨淋巴结以确定癌是否已经扩散，并确定在手术期间去除的区域范围。在该手术过程中，必须识别肿瘤部位周围的前哨淋巴结。如果在手术室使用γ探测仪可以识别前哨淋巴结，而不考虑通过核医学技术局部注射示踪剂后的时间，则可向外科医生提供稳定的手术方法。因为胶体和白蛋白通过前哨淋巴结快速转移达到更高位置，所以在局部注射胶体后，在手术室内需要通过在伤口周围切口，在限定时间内识别前哨淋巴结。这已成为限制检测前哨淋巴结后实施手术的方法的一个原因。根本原因是使用的粒子不适合和尺寸不均一。

识别前哨淋巴结特别重要，在到达淋巴结后，使用的示踪剂不可通过前哨淋巴结沿其路转移到上淋巴道。这是因为随着时间的推移，示踪剂的转移导致不能识别癌细胞从肿瘤部位转移到达的第一个淋巴结。根据广泛使用的吞噬机理，所用的示踪剂保留在淋巴结内，示踪剂在淋巴结内被巨噬细胞吞噬。所以，最重要的是使用具有可被巨噬细胞吞噬尺寸的示踪剂。

已知10-30nm的粒子对前哨淋巴结的识别最为理想。因此，如果通过简单方法可制备适当尺寸的粒子，则可通过在手术前检测前哨淋巴结估计癌细胞的扩散之后，确定对患者的治疗方案，由此为癌症患者确立更为有效的治疗策略。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种具有均一纳米粒子尺寸的锝标记的锡纳米胶体及容易地制备该胶体的方法，该胶体具有用于核医学成像的以下优点：体内稳定性和生物相容性高，适于淋巴闪烁显像术中的淋巴显像，以及对于识别例如肿瘤中的前哨淋巴结很有用。

为了达到上述目的，本发明提供一种锝锡纳米胶体，通过将放射性锝或其化合物的溶液与含有锡或其化合物、钠或其化合物、泊洛沙姆(poloxamer)和聚乙烯吡咯烷酮的溶液混合来获得。

此外，本发明提供一种制备锝锡纳米胶体的方法，包括：制备含有锡或其化合物、钠或其化合物、泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮的第一溶液；以及将放射性锝或其化合物的第二溶液与所述第一溶液混合。

根据本发明，锝锡纳米胶体是水溶性的、高度生物相容性的粒子，具有允许淋巴转移的纳米级尺寸。该纳米胶体很容易制备，将其尺寸适当控制为均一。因而，该纳米胶体有可能作为核医学中的放射性药物，该放射性药物作为识别前哨淋巴结如乳腺癌中的腋窝淋巴结的放射性示踪剂非常有用。

附图说明

图1显示根据本发明实施方式的、处于小瓶中的最终的锝-99m锡纳米胶体的照片；

图2显示根据本发明实施方式的锝-99m锡纳米胶体的粒子尺寸分布；

图3显示根据本发明实施方式的锝-99m锡纳米胶体的场发射扫描电镜(FE-SEM)图像；

图4显示根据本发明实施方式的锝-99m锡纳米胶体(^99mTc-SNPPPT-50)的FE-SEM图像；

图5显示根据本发明实施方式的被巨噬细胞摄取的^99mTc-SNPPPT-30胶体和^99mTc-SNPPBT-50胶体的图；

图6显示根据本发明的实施方式，静脉内注射到大鼠体内的锝-99m锡纳米胶体的生物学分布γ图像；

图7显示动态显像30min后获得的静态图像，其中根据本发明实施方式的锝-99m锡纳米胶体经皮下注射到兔的右后腿和左后腿；和

图8显示图7的结果作为系数/像素之比(coefficient/pixel ratio)的函数，在淋巴结内随时间变化的图。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明。

根据本发明的锝标记的锡纳米胶体是用于核医学的放射性药物，由于使用聚乙烯吡咯烷酮(在本文中还可简单表示为“PVP”)，所以具有能经过淋巴系统转移的纳米级粒子尺寸，可理想地用于识别例如肿瘤中的前哨淋巴结。

本发明中，锡化合物为二价锡溶液，通式为SnX₂，其中X是选自卤素原子、醋酸根、硫酸根、草酸根和琥珀酸根中的至少一个，但不限于此。

本发明中，钠化合物通式为NaX′，其中X′可以是卤素原子，但不限于此。

本发明中，用于控制胶体粒子尺寸的PVP是具有强的路易斯碱的水溶性叔酰胺的聚合物，具有高的生物相容性。PVP通常用作药物混悬液的稳定剂，该药物混悬液作为用于药物口服给予或局部给予的药物制剂。本发明中，PVP用作锡胶体的良好稳定剂，在一个实施方式中显示了PVP的这种作用。聚乙烯吡咯烷酮的代表性例子包括N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基-5-甲基-2-吡咯烷酮，但不限于此。

本发明中，用作缓释药物载体的泊洛沙姆，由于其对机体几乎没有毒性且显示热可逆的溶胶-凝胶转变行为，因此当与其它添加剂混合时，交联效率可能增加，还可作为高分子表面活性剂。泊洛沙姆是聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)的三嵌段共聚物，如下式1所示。

[式1]

其中，X、Y和Z为整数，可以按照泊洛沙姆的分子量来限制。

如上所述，含有锡或其化合物、钠或其化合物、泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮的溶液与放射性锝如^99mTc混合，形成具有允许淋巴转移尺寸的锝锡纳米胶体。以适当比混合上述成分，从而获得具有10-30nm，优选15-30nm尺寸的胶体粒子。该粒子尺寸范围允许胶体粒子的淋巴转移，因而有利于前哨淋巴结的检测和成像。非常大尺寸形式的粒子会沉淀，导致胶体稳定性降低。非常小尺寸的胶体粒子被吸收到毛细血管中而不进入淋巴系统，因而不停留在前哨淋巴结。

因为混合溶液为酸性，因而难以注射到动物包括人的体内，为了提高其pH值，可进一步含有pH调节剂。当将该溶液与适量的pH调节剂进行混合时，可实现最终胶体粒子尺寸的微调。pH调节剂的例子包括磷酸盐缓冲剂和碳酸氢钠，但不限于此。

在本发明的一个实施方式中，当使用适量的PVP、并用碳酸氢钠调节pH值时，由此获得的胶体粒子尺寸约为13nm，其最适于进行前哨淋巴结的检测和成像。电镜法显示胶体粒子尺寸非常均一、并且为球形。

如上所述的锝锡纳米胶体可通过如下方法制备，该方法包括：(a)制备含有锡或其化合物、钠或其化合物、泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮的第一溶液；以及(b)将放射性锝或其化合物的第二溶液与所述第一溶液混合。

该方法可进一步包括(c)将pH调节剂加入所述混合溶液中。

当使用适量的PVP和pH调节剂时，可获得具有允许淋巴转移尺寸的最终胶体粒子。此外，在这种情况下，可将粒子尺寸控制在各种水平。

在步骤(a)中，通过将重量份数之比为1-2:4-20:2-10:4-100的锡或其化合物、钠或其化合物、泊洛沙姆和聚乙烯吡咯烷酮混合来制备所述第一溶液，由此获得有利于淋巴转移、且尺寸均一的胶体粒子尺寸。

在另一实施方式中，当PVP的使用量不同，而锡或其化合物、钠或其化合物和泊洛沙姆的量固定时，可获得允许淋巴转移的纳米级尺寸，约为5nm-15nm。此外，纳米级尺寸可在预定的时间段内得以保持，因此显示出高的稳定性。

在步骤(b)中，将放射性锝或其化合物的第二溶液与步骤(a)制备的第一溶液以当量比为1/5-1/15进行混合。

将放射性锝例如^99mTc以当量比为1/5-1/15加入步骤(a)制备的第一溶液中，以形成放射性复合物。在此范围内，形成了均一、球形的锝锡纳米胶体复合物。

任选地，在步骤(c)中，当通过步骤(a)和步骤(b)获得的复合物具有难以将其注射到动物包括人体内的pH值时，将pH调节剂如磷酸盐缓冲剂或碳酸氢钠加入该锝锡纳米胶体复合物中以调节pH值。

适量的pH调节剂使具有所需尺寸的胶体粒子在尺寸上更为均一。因而，在实际操作中，相对于步骤(b)获得的复合物，以当量比约为0.1-1使用磷酸盐缓冲剂，以当量比约为10^-12-10^-10使用碳酸氢钠。

通过在肿瘤伤口周围局部注射如上制备的本发明的锝锡纳米胶体，可用于识别前哨淋巴结。局部注射后，在手术室中使用γ探测仪识别前哨淋巴结而不必考虑时间，由此提供稳定的手术操作方法。

通过以下实施例，可以更好地理解根据本发明的锝锡纳米胶体及其制备方法，提出该实施例是用于解释本发明，而不用于限制本发明。

实施例1-10：制备锝锡纳米胶体

(1)材料

氯化亚锡(SnCl₂)、氯化钠(NaCl)、氟化亚锡(SnF₂)和氟化钠(NaF)购自Sigma-Aldrich Chemical Co.。泊洛沙姆188和聚乙烯吡咯烷酮(PVP；Kollidon30)得自BASF Korea。锝-99m使用锝发生器(Samyoung Unitech.Co.Ltd.，韩国)抽取获得。

(2)制备锝锡纳米胶体(^99mTc-锡胶体)

称取1.25mg SnCl₂、10mg NaCl、5mg泊洛沙姆和10-50mg PVP，顺次放入真空小瓶(Daiichi Radioisotope Laboratories，Ltd，东京，日本)中。分别将1.25mg SnF₂、10mg NaF、5mg泊洛沙姆和10-50mg PVP放入真空小瓶。将此试验中的样品标记为“SNPPT”，该缩写词含有所用的每个化合物缩写的大写字母。将^99mTc高锝酸盐(1480-1850MBq)在5ml盐水中稀释并加入小瓶中，然后用手剧烈振摇小瓶以形成锝锡纳米胶体(^99mTc-锡胶体)。

当使用氯化亚锡(SnCl₂)和10-40mg PVP制备锝锡纳米胶体时，该胶体显示出7-11nm的小尺寸。但是，在这种情况下，胶体在几小时后形成白色沉淀，沉淀很大，致使胶体稳定性降低。当不使用PVP时，胶体尺寸非常大，为几微米。与之相比，当使用50mg PVP时，胶体显示出约10nm的恒定尺寸，甚至在24小时后仍不变。

当使用氟化亚锡(SnF₂)和0-50mg PVP制备锝锡纳米胶体时，该胶体为4-13nm的纳米级尺寸，该尺寸保持24小时，因此显示出该胶体很稳定。结果总结于下表2中。

表2

如上所述制备的^99mTc-锡纳米胶体的pH值小于5，在该pH值，很难将胶体注射到动物体内。为调节pH值，将0.3ml磷酸盐缓冲剂(0.1M，pH7.3)和10μl碳酸氢钠加入上述制备的胶体样品中。在^99mTc-锡纳米胶体与磷酸盐缓冲液和碳酸氢钠混合后，使用pH试纸检测pH值。

图1显示具有纳米粒子尺寸的最终^99mTc-锡胶体的照片。如图1所示，^99mTc-锡纳米胶体外观为无色并且透明。

<评价>

1.粒子尺寸

在韩国基础科学研究所Chon-Buk中心(Chon-Buk Center，Korea BasicScience Institute)，使用粒度分析仪(UPA-150；Microtrac，USA)评估实施例1-10制备的^99mTc-锡纳米胶体的粒子尺寸。结果总结在下表3-4中。所有样品平行制备三份，并且在三个独立的实验中进行分析(n＝3)。使用磷酸盐缓冲剂制备的样品标记为“SNPPPT”，使用碳酸氢钠制备的样品标记为“SNPPBT”。样品名末尾的数字代表PVP的使用量。

表3

如表3所示，显示SNPPPT-30在90min时成像的尺寸为139.0±139.2nm。

表4

如表4所示，显示SNPPBT-50在90min时成像的尺寸16.5±6.76nm。

在样品中，对SNPPT-30、SNPPT-50、SNPPPT-30和SNPPBT-50进行粒子尺寸分布分析，结果表示在图2中。

如表3-4以及图2所示，当使用磷酸盐缓冲剂时，观察到粒子尺寸随时间或PVP量的变化并没有显著差别，显示胶体的尺寸约为50nm-70nm。与之相比，当使用碳酸氢钠时，发现粒子尺寸随时间和PVP量的变化有很大差别。发现SNPPBT-40和SNPPBT-50的粒子尺寸约为13nm，与不使用pH调节剂时获得的胶体粒子的尺寸类似。

2.使用电镜法表征^99mTc-锡纳米胶体的形态和尺寸

使用场发射扫描电镜(FE-SEM)评估制备的^99mTc-锡纳米胶体(^99mTc-SNPPBT-50)的形态。将制备的^99mTc-锡纳米胶体适当稀释后，将3-5μl稀释液滴到硅晶圆片上，干燥约一天。然后使用溅射涂膜单元(日立E1030，日本)对样品涂覆铂(Pt)。涂覆厚度约为6nm。在韩国基础科学研究所Chon-Buk中心使用扫描电镜(S-4700扫描电镜；日立，日本)进行电镜评价。

图3显示根据本发明的^99mTc-锡纳米胶体的FE-SEM图像。

作为对照，只将50mg PVP加入5ml生理盐水中，使用FE-SEM进行分析。在图3中，照片(a)和(c)分别显示“PVP-50+盐水”在200,000和50,000放大倍数下的FE-SEM图像。如照片(a)和(c)所示，PVP将方形特征的盐非常均一地分布开来。

在图3中，照片(b)和(d)显示了使用50mg PVP和碳酸氢钠制备的锝锡纳米胶体(^99mTc-SNPPBT-50)的FE-SEM图像，将该胶体滴到硅晶圆片上，并用FE-SEM分析。照片(b)和(d)分别显示“^99mTc-SNPPBT-50”在200,000和50,000放大倍数下的FE-SEM图像。粒子尺寸如照片(b)中的标尺所示。FE-SEM显示出生成了约为13nm的球形胶体粒子，这些结果与使用粒度分析仪获得的结果相同。此外，胶体粒子有高度均一的尺寸分布。

图4显示使用50mg PVP和磷酸盐缓冲剂制备的锝锡纳米胶体(^99mTc-SNPPPT-50)的FE-SEM图像。如图4所示，发现胶体的粒子尺寸约为80-90nm。与^99mTc-SNPPBT-50不同，^99mTc-SNPPPT-50显示出不均一的形态。

3.体外细胞试验

RAW 264.7巨噬细胞得自韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)。将1×10⁶个细胞接种于无血清的RPMI-1640中，在37℃、5％ CO₂下于培养箱内培养过夜。在确认已经稳定后，在0μl、0.5μl和1μl的^99mTc-SNPPPT-30和^99mTc-SNPPBT-50中培养细胞20min。然后用胰蛋白酶-EDTA使细胞脱离，并用1×PBS洗涤两次。用γ计数器(COBRA II，Packard)测量放射性。用每个样品的蛋白浓度来校正放射性。收集来自三个独立实验的结果。

图5显示^99mTc-SNPPPT-30胶体和^99mTc-SNPPBT-50胶体的细胞摄取。如图5所示，当比较^99mTc-SNPPPT-30胶体和^99mTc-SNPPBT-50胶体被巨噬细胞的摄取时，在同一浓度下，较小的^99mTc-SNPPBT-50显示约2.1倍的更高的细胞摄取，并且显示在两倍浓度下约2.7倍的更高的细胞摄取。

4.γ成像和前哨淋巴结成像

按照韩国全北大学校医学院动物伦理委员会(Animal EthicsCommittee，College of Medicine，Chonbuk National University)提供的动物实验指南进行所有的动物试验。在实验前一周购买6-7周龄的大鼠(Orient-Bio，首尔，韩国)和新西兰白兔(2.5-3.0kg，哈尼尔(Hanil)，全州，韩国)。将氯胺酮(ketamine)和隆朋(rompun)的混合物注射到兔的耳静脉使其麻醉。分别在兔的右后腿脚趾和左后腿脚趾间注射^99mTc-SNPPPT-30和^99mTc-SNPPBT-50。将兔仰卧放置，将其前腿和后腿固定。使用γ照相机ECAM(SIMENS Medical System Inc.，Illinois，USA)获得动态和静态图像。以30sec至30min为时间间隔获得动态图像。然后，在40min、60min、160min、190min和220min时获得静态图像。对所得图像上选取的感兴趣的区域(ROI)进行计算得到系数值，并将两边相比较。

图6显示根据本发明的锝锡纳米胶体(A：^99mTc-SNPPPT-30，B：^99mTc-SNPPBT-50)生物学分布的γ图像，其中将7.4MBq的每种胶体静脉内注射到大鼠体内，注射5min后获得γ图像。^99mTc-SNPPPT-30主要停留在肝内，并在骨髓图像中也有显示。与之相比，较小的^99mTc-SNPPBT-50显示在骨髓图像中，并且通过肾快速排泄。

这些结果显示出^99mTc-SNPPBT-50的粒子尺寸小到足以被骨髓内的单核吞噬细胞系统(MPS)摄取，并且能够通过肾小球少量排泄。

图7显示动态显像30min后获得的静态图像，其中将根据本发明的锝-99m-锡纳米胶体皮下注射到兔的右后脚和左后脚。图8显示图7的结果作为系数/像素之比的函数，在淋巴结内随时间变化的图。分别将^99mTc-SNPPPT-30和^99mTc-SNPPBT-50皮下注射到兔的右后脚和左后脚。如图7和图8所示，在^99mTc-SNPPBT-50约为13nm的情况下，腘淋巴结内的放射性随时间的推移而增加。与之相比，^99mTc-SNPPPT-30的放射性显示出在起始峰后逐渐降低。

如以上实施例和实验中的数据所示，发现PVP可作为锝-99m锡纳米胶体的稳定剂。使用两种不同的缓冲剂，将制备的锝-99m锡纳米胶体最终调节为适用于机体的pH值。另外，发现加入缓冲剂还影响胶体粒子的尺寸。此外，发现通过改变PVP的量和缓冲剂的类型，可获得具有理想粒子尺寸的最终胶体。

实施例制备的Tc-99m锡胶体中，发现^99mTc-SNPPBT-50具有用于前哨淋巴结识别和成像的最适尺寸。此外，电镜法显示出^99mTc-SNPPBT-50的粒子尺寸均一并且为球形。在相同条件下进行重复，相同尺寸胶体的合成可以得到再现。细胞试验和体内评价显示约为15-30nm的胶体粒子能被巨噬细胞充分摄取。

总之，使用锡和PVP很容易制备纳米尺寸的胶体。在这种情况下，胶体的粒子尺寸非常均一，平均约为13nm。细胞试验显示：与^99mTc-SNPPPT-30相比，^99mTc-SNPPBT-50胶体被巨噬细胞的摄取更高。

当根据本发明的锝-99m锡纳米胶体应用于癌症患者，以使用γ探测仪识别前哨淋巴结时，预计前哨淋巴结将得到准确识别。另外，该胶体能使外科医生进行手术而不受时间限制。此外，小于100nm的^99mTc-SNPPPT-30被枯否细胞捕获，因而可以用于肝成像。