高级脂肪酸衍生物类新化合物及其制备方法和抗肿瘤用途

摘要

本发明属于高级脂肪酸衍生物类的新化合物保护，涉及到化合物和制备方法及其在抗肿瘤、逆转肿瘤细胞多药耐药性、提高其它药物在治疗肿瘤时的再敏感性的方面。

说明书

技术领域

本发明属于高级脂肪酸衍生物类新化合物及其在抗肿瘤、逆转肿瘤细胞多药耐药性、提 高其它药物在治疗肿瘤时的再敏感性的方面。高级不饱和脂肪酸能逆转肿瘤细胞的耐药性，抑 制多种肿瘤细胞的增殖和转移、诱导肿瘤细胞分化甚至凋亡，还能明显改善肿瘤患者的体质， 提高肿瘤患者的存活率。

自从1921年Freunel发现一些二元羧酸，如琥珀酸和辛二酸，具有溶解肿瘤细胞作用以来， 脂肪酸的抗肿瘤作用引起了人们的广泛研究。2001年秦箐开始对板蓝根进行研究。系统地研 究板蓝根的主要活性成分中，发现板蓝根高级不饱和脂肪酸具有抗肿瘤作用。从而以高级脂 肪酸为先导化合物进行研究，对其进行结构修饰和改造，合成了一系列衍生物，借助于药理 学等手段，通过定量构效关系(QSAR)的研究，阐明其药理作用机制。目的是寻找能在抗 肿瘤、逆转肿瘤细胞多药耐药性方面有显著作用的新化合物。

Danbara等认为ω-3脂肪酸对细胞凋亡的诱导作用主要是通过上调Bcl-2家族中凋亡诱导蛋 白Bak和Bcl-xS的表达，同时下调凋亡抑制蛋白Bcl-xL和Bcl-2的表达而完成的。业已证实在体 外培养条件下ω-3脂肪酸可诱导乳腺癌、白血病等细胞凋亡。另外不饱和脂肪酸能明显降低 Ga蛋白FI值，通过Ga蛋白信号传导途径影响下游信号如PKC-NFxB，从而启动bcl-2基因的表 达，使肿瘤细胞发生凋亡。Kato T等将人结肠癌细胞移植入裸鼠体内，结果显示在饲料中添 加不饱和脂肪酸的实验组，肿瘤的重量明显减轻，与不添加组有显著性差异。其机制是不饱 和脂肪酸通过调节细胞因子而引起肿瘤细胞的凋亡。另一个方面，脂肪酸是细胞膜组成的必 需成分，多不饱和脂肪酸的改变，对细胞膜的结构、性质和功能都有重要影响。细胞膜中脂肪 酸成分的不同，直接影响着细胞膜的结构、流动性和通透性，影响着膜上功能蛋白的构象和功能 发挥。因此饮食与培养基中的脂肪酸可影响和改变瘤细胞膜的脂肪酸组成。从而抑制肿瘤细 胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡。而一般认为脂肪酸的游离羧基是抗肿瘤的活性基团，酯化后活 性下降，而且在血浆中与蛋白结合后也会使之活性下降。

不饱和脂肪酸由于具有脂溶性大，能透过组织进入到靶器官和进入肿瘤细胞内；分子量 一般较大，化学性质活泼，所以不仅能直接作为抑制肿瘤的药物，也能作为一种载体，携带 药物进入到靶器官；也能经过结构改造，合成新的活性更强的药物。这是不饱和脂肪酸在抗 肿瘤方面的另外一个重要作用。

有研究报告，由磷脂、胆固醇和油酸所组成的油酸多相脂质体(PL139)是与生物膜类 似超微粒球状体，作为载体能携带药物进入细胞内，能提高巨噬细胞的吞噬功能。脂质过氧 化产生的活性氧能提高肿瘤细胞对药物的敏感性，产生的自由基和脂质过氧化物则可抑制肿 瘤细胞的表达，缩短染色体的端粒，促进肿瘤细胞的凋亡。

目前临床上面所使用的化疗药物的副作用大、选择性不高，而肿瘤患者一般需要长期用 药，因而药物对肿瘤患者其他正常器官损害大，容易产生耐受。面对目前临床上化疗药的诸 多不足，在对高级脂肪酸进行结构修饰时，我们目的除了是要筛选能增加抗肿瘤，逆转肿瘤 细胞多药耐药性作用的新化合物，更要求新化合物对肿瘤细胞有特意选择性作用即高效、低 毒，以此来改变目前肿瘤临床用药的不足。

发明内容

一、各化合物结构式

1.高级脂肪酸衍生物类的新化合物，具体涉及的化合物，如下定义。

(1)化合物I：CH₃(CH₂)_m1CH＝CH(CH₂)_n1COR

其中10≤m1+n1≤22，m1＝1～13，n1＝1～21；R为：—N(CH₂CH₂Cl)₂，—N(R₁)CONHR₂。 其中R₁、R₂可以相同，也可以不同，为如下结构：

A、B、C、D、E为—H、—OH、—NH₂、—NO₂、—CH₃、—OCH₃、—OCH₂CH₃、—CH₂NH₂。

(2)化合物II：CH₃(CH₂)_m2CH＝CH(CH₂)_n2CH＝CH(CH₂)_x1COR

其中m2+n2≤11；8≤m2+n2+x1≤20；m2＝1、4、7、10；n2＝1、4、7、10；x1≥1；R 同化合物I式中的R。

(3)化合物III：CH₃(CH₂)_m3CH＝CH(CH₂)_n3CH＝CH(CH₂)_x2CH＝CH(CH₂)_yCOR

其中m3+n3+x2≤9；6≤m3+n3+x2+y≤18；m2＝1、4、7；n2＝1、4、7；x2＝1、4、7；y≥1； R同化合物I式中的R。

(4)化合物IV：CH₃(CH₂)_zCOR

其中z＝12～24；R同化合物I式中的R。

(5)上述(1)所涉及的化合物：

N，N—二(2-氯乙基)芥酸酰胺；N，N’—二环己基—N—芥酸酰脲，R为

(6)芥酸乙醇酰胺、山嵛酸乙醇酰胺、芥酸二甲氨基乙醇酯、山嵛酸二甲氨基乙醇酯。

2.根据1所述的高级脂肪酸衍生物类的新化合物，包括由酸，如盐酸，硫酸，磷酸，与 这些化合物所形成的盐，以及由强碱，如氢氧化钠、氢氧化钾，与这些化合物所形成的盐。

3.根据1、2所述的高级脂肪酸衍生物类的新化合物及其盐的含结晶水合物。

二、各化合物的制备方法

1.当R为—NHCH₂CH₂OH：以适量的甲苯作溶剂，加入1当量分别与化合物I、II、III、 IV所对应的脂肪酸和3当量的乙醇胺，使两者完全溶解与甲苯，再加入适量的金属钠；加热 回流反应约120分钟，油浴温度控制在(70±2)℃。柱层析分离纯化。

2.当R为—OCH₂CH₂N(CH₃)₂：以适量的甲苯作溶剂，加入1当量分别与化合物I、II、 III、IV所对应的脂肪酸和6当量的N，N—二甲氨基乙醇胺，使两者完全溶解与甲苯，再加 入适量的金属钠；加热回流反应约60分钟，油浴温度控制在(60±2)℃。柱层析分离纯化。

3.当R为

在微型二口烧瓶中加入化合物I、II、III、IV所对应的脂肪酸和1:2当量的DCC；加入 二氯甲烷适量，固体氢氧化钠少许。加入磁子进行搅拌，冰浴反应12小时。反应停止后，加 入pH3～4的盐酸水溶液，振荡30分钟，然后加入二氯甲烷，待混合物分成两相，弃上层； 下层用pH3～4的盐酸水溶液，洗涤两次，弃上层水洗液，干燥。

4.当R为—N(CH₂CH₂Cl)₂，在微型二口烧瓶中加入化合物I、II、III、IV所对应的脂肪 酸和3倍当量氯化亚砜，吡啶少许。加入磁子进行搅拌，70℃反应4小时。抽干氯化亚砜， 加入四氢呋喃，双(2-氯乙基)胺盐酸盐，室温反应12小时。

三、具体实施方式

实施例一：芥酸乙醇酰胺的合成

合成反应：在二口烧瓶中加入适量的甲苯(作溶剂)，再加入1:8g芥酸甲酯和0.987g乙 醇胺，两者摩尔比为1:3。摇动，使芥酸甲酯和乙醇胺完全溶解于甲苯，再加入适量催化剂 金属钠。放入搅拌磁子，装上回流冷凝管，以液体石蜡为浴液，加热搅拌反应(恒温于70℃)， 2小时后停止反应。

分离纯化：薄层层析用硅胶H柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱。分段收集，薄层检查， 相同部分合并、回收溶剂，分离得到白色固体0.7506g。

波谱鉴定：

IR(v_Max、KBr、cm^-1)：3295(v_NH)，1653(v_C＝O)，1555(δ_NH)，为明显的酰胺I带和 酰胺II带，显示了仲酰胺的存在，2925(C—H)，726(—(CH₂)_n—)，表明了甲基和长链亚甲 基的信号，红外光谱数据符合芥酸乙醇酰胺的结构，其结构式如下：

CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₁₁COONHCH₂CH₂OH

实施例二：芥酸二甲氨基乙醇酯的合成

合成反应：在二口烧瓶中加入适量的甲苯(作溶剂)，再加入芥酸乙酯2.0g和N，N—二 甲氨基乙醇胺3.0g。摇动，使芥酸乙酯和N，N—二甲氨基乙醇胺完全溶解于甲苯，再加入 适量催化剂金属钠。放入搅拌磁子，装上回流冷凝管。以液体石蜡为浴液，加热搅拌反应(恒 温于60℃)，1小时后停止反应。

分离纯化：薄层层析用硅胶H柱层析，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱。分段收集，薄 层检查。相同部分合并、回收溶剂。分离得到浅黄色油状液体0.1102g。

波谱鉴定：

IR(v_Max、KBr、cm^-1)：1742(C＝O)、1166(C—O—C)，显示了脂肪酯基的存在，2925 (C—H)，723(—(CH₂)_n—)，表明了甲基和长链亚甲基的信号，红外光谱数据符合芥酸二甲 氨基乙醇酯的结构，其结构式如下：

CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₁₁COOCH₂CH₂N(CH₃)₂

实施例三：N，N’—二环己环—N—芥酸酰脲的合成

合成反应：在微型二口烧瓶中加入芥酸4.0g，DCC2.5g；加入二氯甲烷4.0ml，固体氢氧 化钠少许。加入磁子进行搅拌，冰浴反应12小时。反应停止后，加入pH3～4的盐酸水溶液 30ml，振荡半小时，然后加入20ml二氯甲烷，待混合物分成两相，弃上层；下层用pH3～4 的盐酸水溶液10ml，洗涤两次，弃上层水洗液，干燥。

分离纯化：取粗产物2.0g，酸性氧化铝70g，常压柱层析法，用石油醚—乙酸乙酯(98.5:1.5) 进行淋洗。分段收集，TLC法检测，合并相同流分，回收溶剂。分离得无色化合物0.30g。

波谱鉴定：

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)δppm：6.97(1H，—CO—NH—)，5.33(2H，m，—CH＝CH —)，3.88(1H，s，—CO—N(CO—R)—CH—)，3.66(1H，s，—CO—N—CH—)，2.38(2H， t，—CH₂—CON—)，2.00(4H，m，—CH₂—C＝C—CH₂—)，1.95(8H，N—C(CH₂—)₂)， 1.61(2H，m，—CH₂—C—CON—)，1.30(40H，m，—(CH₂)_n—)，0.90(3H，t，CH₃—C —)。

¹³C-NMR(500MHz，CDCl₃)δppm：173.1(C—10)，153.5(C—8)，129.3(C—22)， 129.3(C—23)，55.3(C’—1)，49.2(C—6)，35.3～24.1(C—1，C—2，C—3，C—4，C— 5，C’—2，C’—3，C’—4，C’—5，C’—6，C—11～C—21，C—24～C—30)，22.1(C—31)。

IR(v_Max、KBr、cm^-1)：3328.5(v_-N-H)，3004.1(v_＝C-H)，1625.9、1570.1(v_C＝O)，2927.5、 2854.1(v_-C-H)，1436.7、1311.6(δ_-C-H)，721.9处的吸收峰则显示可能存在—(CH₂)_n—，其 中n>4。

根据反应物结构，综合以上光谱数据，鉴定该化合物为

N，N’—二环己环—N—芥酸酰脲，其结构式如下：

实施例四：N，N—二(2-氯乙基)花生酸酰胺

合成反应：在微型二口烧瓶中加入花生酸4.0g，加入氯化亚砜3.0ml，吡啶两滴。加入磁 子进行搅拌，70℃反应4小时。抽干氯化亚砜，加入四氢呋喃6ml，双(2-氯乙基)胺盐酸盐 3.0g，室温反应12小时。反应停止后，加入pH3～4的盐酸水溶液30ml，振荡半小时，然后 加入20ml二氯甲烷，待混合物分成两相，弃上层；下层用PH3～4的盐酸水溶液10ml，洗涤 两次，弃上层水洗液，干燥。

分离纯化：取粗产物2.0g，酸性氧化铝70g，常压柱层析法，用石油醚—乙酸乙酯(99:1) 进行淋洗。分段收集，TLC法检测，合并相同流分，回收溶剂。分离得无色化合物0.50g。

波谱鉴定：

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)δppm：4.12(4H，s，—N—CH₂—)，3.59(4H，s，—N —C—CH₂—)，2.32(2H，t，—CH₂—CON—)，1.62(2H，m，—CH₂—C—CON—)，1.31 (32，m，—(CH₂)_n—)，0.88(3H，t，CH₃—C—)。

¹³C-NMR(500MHz，CDCl₃)δppm：173.9(C—4)，63.3(C’—1，C—1)，44.4(C’—2， C—2)，34.3(C—5)，31.9～22.7(C—6～C—22)，22.7(C—23)。

根据反应物结构，综合以上光谱数据，鉴定该化合物为N，N—二(2-氯乙基)花生酸酰胺， 其结构式如下：

药理作用

一.CH₃(CH₂)_m1CH＝CH(CH₂)_n1COR，当R为—N(R₁)CONH R₂以化合物N，N—二(2-氯 乙基)芥酸酰胺抗肿瘤为例：

1.化合物N，N—二(2-氯乙基)芥酸酰胺体外抗肿瘤细胞学实验 该化合物对舌癌TCA8113与卵巢癌SKOV3分别在0.15μg/ml～10.0μg/ml与 0.15μg/ml～50.0μg/ml的浓度范围有较强的杀伤效应，杀伤率均超过30％，但与浓度递增无明 显的正相关，在100.0μg/ml以上的浓度反而杀伤效果不佳，具体见表1。

表1.化合物N，N—二(2-氯乙基)芥酸酰胺体外肿瘤细胞杀伤效应(％)

2.化合物N，N—二(2-氯乙基)芥酸酰胺抗肿瘤动物实验

从中国科学院上海细胞中心购买S180细胞，在BLBC/c小鼠小鼠腹腔内传代，连续传三 代；取传至第四代的第八天的腹水细胞，用生理盐水洗涤一次后，用生理盐水稀释至1×10⁸个/ml，每只小鼠注射0.2ml建立腹水瘤动物模型。

(1)药物配制：精密称量N，N—二(2-氯乙基)，加95％酒精溶解，再加生理盐水，按 一定倍数稀释成下列浓度：5.0mg/ml、2.5mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.02mg/ml。酒 精最高浓度为2.5mg/ml组，不高于5％。

(2)实验分组与给药方案：建模第二天开始腹腔注射给药，连续每天给药一次，腹腔注 射给药剂量分别为500μg/10g、250μg/10g、50μg/10g、10μg/10g与2.0μg/10g，以此分为高中 低五个剂量组，每组20只BLBC/c小鼠；对照组注射相应量的生理盐水。

(3)动物实验中，由表2可以看出，中剂量组(10μg/10g～50μg/10g)的生命延长率较 高，而高剂量组(250μg/10g～500μg/10g)与2.0μg/10g低剂量组则无显著改善其生命延长率， 尤其是50.0μg/10g剂量组，生存超过30天的治愈动物数为12只。

表2.化合物N，N—二(2-氯乙基)芥酸酰胺抗肿瘤动物实验

二.CH₃(CH₂)_m1CH＝CH(CH₂)_n1COR，当R为

时，以化合物N，N’—二环己基—N—芥酸酰脲抗肿瘤为例。

化合物N，N’—二环己基—N—芥酸酰脲体外抗肿瘤细胞学实验，该化合物对舌癌 TCA8113与卵巢癌SKOV3在0.15μg/ml～50.0μg/ml的浓度范围有较强的杀伤效应，而对卵巢 癌SKOV3在100.0μg/ml浓度也有一定杀伤，杀伤率均超过30％，但与浓度递增无明显的正 相关，其余的在100.0μg/ml以上的浓度反而杀伤效果不佳，具体见表3。

表3　化合物N，N’—二环己基—N—芥酸酰脲体外肿瘤细胞杀伤效应(％)

三.当化合物为芥酸乙醇酰胺、山嵛酸乙醇酰胺、芥酸二甲氨基乙醇酯、山嵛酸二甲氨 基乙醇酯，以芥酸乙醇酰胺、芥酸二甲氨基乙醇酯为例：

芥酸乙醇酰胺与芥酸二甲氨基乙醇酯对肝癌细胞的杀伤效果不佳，IC50分别为1125.6与 806.4μg/ml，但对阿霉素耐药的肝癌细胞有较好的耐药逆转作用，逆转倍数分别为2.98与3.72。

表4.芥酸乙醇酰胺与芥酸二甲氨基乙醇酯肝癌细胞杀伤与耐药逆转实验结果