一种治疗女子不孕症的药物组合物及其制备方法和质量控制方法

摘要

本发明公开了一种用于治疗女子不孕症的药物组合物及其制备方法和质量控制方法，该组合物是由淫羊藿、黄精、续断、石菖蒲、香附及甘草制成的药剂学上可接受的丸剂、颗粒剂、片剂、糖浆剂、合剂、口服液、滴丸剂、胶囊剂、注射剂任一种药剂学上可接受的剂型。其质量控制方法包括：淫羊藿、黄精、续断、甘草、香附、石菖蒲的薄层鉴别；淫羊藿、续断、甘草的HPLC含量测定；总黄酮、总皂苷的含量测定。药效学实验包括：体内实验和体外细胞实验以及临床实验。上述实验结果表明：本发明的药物组合物具有温肾填精，调经种子的功效，可用于治疗女子不孕症。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物组合物及其制备方法和质量控制方法，特别是涉及一种用于治疗女子不孕症的药物组合物及其制备方法和质量控制方法。

背景技术

一般认为，育龄夫妇婚后同居，未避孕，性生活正常，两年以上(美国妇产科教材和不孕协会则把时间定为1年)女方未受孕的现象称之为“不孕症”。由男方原因造成的不育症或不孕症叫作“男性不育症”或“男性不孕症”，老百姓一般将其统称为不育症。女子不孕症致病因素很多，发病机理颇为复杂，主要因素为卵子成熟障碍等。男子不育主要因素为精子成熟障碍和精子运输障碍等。

目前西医针对女子不孕症的主要治疗手段是使用药物诱发排卵、输卵管阻塞复通术、输卵管切除术和腹腔镜技术清除病灶来进行治疗；针对男子不育的治疗手段包括药物和手术，治疗药物主要包括促性腺激素释放激素(GnRH)、促性腺激素(FSH、HMG)、绒毛膜促性腺激素(HCG)、克罗米芬等；手术治疗包括附睾下降固定术、精索静脉结扎术、输精管吻合术和输精管—附睾—睾丸吻合术。此外辅助生育技术包括人工授精(IUI)、体外授精—胚胎移植(IVF-ET)、单精子胞浆内注射(ICSI)也是治疗不孕不育的常用手段。然而，目前药物和手术治疗不但费用昂贵而且加重患者痛苦、治愈率不高、复发性大，副作用和后遗症大。鉴于目前西药大多作用于单一靶点或环节，致使疗效不佳。而现代中药复方是通过多靶点、多环节和多系统来治疗该病，对妇科疾病，尤其是慢性和疑难杂病有较好疗效，给我们的研究提供了很好的帮助和很好的研究对象。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种疗效显著、服用后不易复发的治疗女子不孕症的药物组合物及其制备方法和质量控制方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种用于治疗女子不孕症的药物组合物，按重量份组分计算，所述药物组合物包括以下有效成分的原料：淫羊藿15-45份、黄精12-36份、续断12-36份、香附9-27份、石菖蒲9-27份、甘草6-18份。

所述的治疗女子不孕症的药物组合物，按重量份组分，优选包括以下有效成分的原料：淫羊藿30份、黄精24份、续断24份、香附18份、石菖蒲18份、甘草12份。

所述药物组合物为丸剂、颗粒剂、片剂、糖浆剂、合剂、口服液、滴丸剂、胶囊剂、注射剂任一种药剂学上可接受的剂型，以及缓释或控释技术在上述剂型中的应用。

所述药物组合物优选为合剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂中的一种或多种。

所述药物组合物优选为合剂。

所述药物组合物的口服液的制备方法，香附和石菖蒲加12倍量水，蒸馏6小时提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；药渣再加12倍量水煎煮1小时，药液过滤备用；剩下的4味分别用10倍量水煎煮3次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述药液合并，减压浓缩至相对密度1.10-1.12/60℃，静置24小时，取上清液回收乙醇并浓缩至相对密度1.04/20℃，静置48小时，取上清液滤过，滤液加入前述挥发油、吐温-80及适量矫味剂，调整体积至1000mL，滤过，分装，灭菌，即得所述口服液。

所述药物组合物糖浆剂的制备方法，香附和石菖蒲加12倍量水，蒸馏6小时提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；挥发油用6倍量的β环糊精包合成包合物；药渣再加12倍量水煎煮1小时，药液过滤备用；剩下的4味分别用10倍量水煎煮3次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述药液合并，减压浓缩至相对密度1.10-1.12/60℃，静置24小时，取上清液回收乙醇并浓缩至密度1.18，另取蔗糖650份加水煎煮，溶解后，滤过，浓缩制成糖浆，与上述浓缩液混匀，煮沸，放冷，加入防腐剂、上述挥发油、吐温-80，调整体积至1000mL，分装，灭菌，即得所述糖浆剂。

所述药物组合物片剂的制备方法，香附和石菖蒲加12倍量水，蒸馏6小时提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；挥发油用6倍量的β环糊精包合成包合物。药渣再加12倍量水煎煮1小时，药液过滤备用；剩下的4味分别用10倍量水煎煮3次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述药液合并，减压浓缩至相对密度1.10/60℃的药液，加乙醇使含醇量达到50％，搅拌，静置24小时，吸取上清液回收乙醇，浓缩成相对密度为1.33-1.35/60℃的浸膏，取浸膏1份，加2倍量蔗糖，1倍量糊精及乙醇适量，制粒，干燥，与挥发油的β环糊精包合物及1wt％的硬脂酸镁混匀，压片，即得所述片剂。

所述药物组合物合剂的制备方法，将淫羊藿、黄精、续断、香附、石菖蒲、甘草六味，分别加8倍量水和4倍量水煎煮二次，每次煎煮后于85℃保温20分钟，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度不低于1.06/80℃下，离心，取上清液，加入蔗糖200份、苯甲酸钠3份、羟苯乙酯0.5份，加水制成1000mL，混匀，灌装，即得所述合剂。

所述药物组合物合剂的质量控制方法，包括：淫羊藿、黄精、续断、香附、石菖蒲、甘草的薄层鉴别；淫羊藿、甘草、续断的HPLC含量测定；总黄酮、总皂苷的含量测定。

所述药物组合物合剂的质量控制方法，其药效学研究包括：

(1)体内实验：自体移植复制雌性大鼠子宫内膜异位症，检测血浆β—内啡肽β-EP，血清雌二醇E₂、孕酮P水平；

(2)体外细胞实验：培养卵巢颗粒细胞，测定药物干预之后细胞的生长情况。

所述合剂的质量控制方法，其临床实验包括：60例患者随机分为治疗组30例，对照组30例，药物治疗一个疗程之后，测定卵泡直径，测定抗子宫内膜抗体EMAb，测定肿瘤坏死因子TNF-a、白介素-6IL-6。

本发明的药物组合物合剂的质量控制方法具体如下：

一、性状

棕色至棕褐色的液体，久置可有少量沉淀；味甜、微苦。

二、鉴别

(1)淫羊藿的鉴别

取本发明的药物组合物合剂10mL，置于聚酰胺柱(聚酰胺5g，内径0.9cm，柱长25cm)以100mL水洗脱，弃去洗脱液，再以乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿对照品，加甲醇制成每1mL各含10ug的溶液，作为对照品溶液；将除淫羊藿之外的所有组分按处方比例制成空白样品，同法操作，作为空白对照品溶液。吸取上述3种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(体积比10:1:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在置紫外光灯365nm下检视。结果发现：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照液在相应位置上无此斑点，即说明空白无干扰。

(2)甘草的鉴别

取本发明的药物组合物合剂10mL，滴加50wt％硫酸溶液1mL，离心，弃上清液，沉淀用水洗2次，每次10mL，取沉淀，加乙醇10mL使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液；取甘草酸铵对照品加乙醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；另取缺甘草的阴性对照样品同供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。吸取上述三种溶液各10μL分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(体积比15:1:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯254nm下检视。结果发现：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，而阴性对照液在相应位置上无此斑点，即说明空白无干扰。

(3)续断的鉴别

取本发明的药物组合物合剂15mL，用水饱和的正丁醇提取3次，每次15mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加3mL甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取缺续断的阴性对照样品同法制成阴性对照溶液；取续断对照药材1.2g，加水30mL，水煎15min，滤过，取滤液，同法制得对照药材溶液。吸取上述3种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(22:40:15:10)的上层液作为展开剂。展开，取出，晾干。喷以10wt％的硫酸乙醇溶液，105℃加热，至斑点清晰，日光下检视。结果发现：供试品色谱中，在与续断对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，而阴性对照液在相应位置上无此斑点，即说明空白无干扰。

(4)黄精的鉴别

取本发明的药物组合物合剂5mL，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取两次，每次10mL，合并提取液，回收正丁醇至干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄精药材4g，同法制成对照药材溶液。吸取对照药材溶液1uL、供试品溶液4uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-水(体积比5:2:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2wt％的2，4-二硝基苯肼乙醇溶液。结果发现：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照液在相应位置上无此斑点，即说明空白无干扰。

(5)香附的鉴别

取本发明的药物组合物合剂10mL，用水饱和的正丁醇提取3次，每次10mL，合并正丁醇提取液，回收正丁醇至干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；取缺香附自制样品10mL，同法制成阴性对照溶液；另取α-香附酮对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各5μL及对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-冰醋酸(体积比60:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm下检视。结果发现：供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同的深蓝色斑点，喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，斑点渐变为橙红色，阴性对照无干扰。

(6)石菖蒲的鉴别

取本发明的药物组合物合剂10mL，用水饱和的正丁醇提取3次，每次10mL，合并提取液，回收正丁醇至干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；取缺石菖蒲自制样品10mL，同法制成阴性对照溶液；另取石菖蒲对照药材，加石油醚制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(8:2)为展开剂，展开，取出，晾干，放置约1小时，置紫外光灯365nm下检视。结果发现：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；再以碘蒸气熏至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

三、检查

符合《中国药典》合剂项下的各项规定。

四、含量测定

1.甘草酸的含量测定

1.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱(5μm，4.6mm×150mm)；

流动相：甲醇：0.01mol/L盐酸溶液(75:25)；

流速：1mL/min；检测波长：250nm；柱温：20℃；进样量：5μL。

1.2 对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥器中减压干燥至恒重的甘草酸铵对照品适量，加甲醇溶解，制成每1mL含甘草酸铵0.27mg的溶液，即得对照品溶液。

1.3 供试品溶液的制备

精密取批号为060810的本发明的药物组合物合剂1mL，置10mL的量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密吸取1mL，置2mL的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，3000r/min离心5min，取上清液，即得供试品溶液，进样前用0.45μm的膜滤过。

1.4 阴性对照实验

取按处方比例及制备工艺制备的缺甘草的阴性样品，和按供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。按上述色谱条件进样分析。结果表明：其他成分对甘草酸的测定无干扰，HPLC谱图见图1A、B、C。

1.5 线性关系考察

精密称取甘草酸铵对照品6.6mg，加甲醇制成每1mL含甘草酸铵0.66mg的溶液，分别精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5mL置10mL量瓶中，加甲醇稀释成不同浓度的对照品溶液，分别进样5μL，以前述色谱条件分别进样分析，测定其峰面积对浓度进行线性回归，得回归方程如下：Y＝4248.6x-2.0685(r＝0.9998)。结果表明：甘草酸在0.033～0.135mg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。

1.6 精密度试验

日内精密度：取浓度为0.033mg/mL的甘草酸铵对照品溶液，精密吸取5μL，同一天内进样5次，峰面积RSD为0.77％。

日间精密度：上述对照品溶液，在6天内重复进样，所得峰面积RSD为1.71％。

1.7 重复性实验

取批号060830的供试品5份，按前述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依前述液相色谱条件平行测定5份含量，结果RSD为0.20％(n＝5)，说明方法重现性好。

1.8 加样回收率实验

精密吸取已知含量的本发明的药物组合物合剂(批号：060830)1mL，置10mL的量瓶中，共5份，分别精密加入甘草酸铵对照品溶液(浓度0.660mg/mL)1mL，然后按供试品溶液的制备方法制备，测定，计算加样回收率，平均回收率为100.2％，RSD为0.54％(n＝5)，符合含量测定方法学要求，具体结果见表1。

表1  甘草酸加样回收率试验结果(n＝5)

1.9  稳定性实验

取1.3项下供试品溶液，按上述液相色谱条件，分别于0、2、4、8、24h进样测定。结果发现其峰面积RSD为5.65％，表明供试品溶液在24h内稳定。

1.10  样品测定结果

取5批供试品(批号060810，060814，060830，070531，070724)，按1.3项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，分别注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算其中甘草酸的含量，结果见表3。

2.淫羊藿苷的含量测定

2.1  色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱(5μm，4.6mm×150mm)；

流动相：甲醇：0.01mol/L盐酸溶液(55:45)；

流速：1mL/min；检测波长：270nm；柱温：20℃；进样量：5μL。

2.2  对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥器中减压干燥至恒重的淫羊藿苷对照品适量，加甲醇溶解，制成每1mL含淫羊藿苷0.15mg的溶液，即得对照品溶液。

2.3  供试品溶液的制备

精密取本品1mL，置10mL的量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密吸取1mL，置2mL的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，3000r/min离心5min，取上清液，即得供试品溶液，进样前用0.45μm的膜滤过。

2.4  阴性对照实验

取按处方比例及制备工艺制备的缺淫羊藿的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。在上述色谱条件下测定，结果表明，其他成分对淫羊藿苷的测定无干扰，其HPLC谱图见图2A、B、C。

2.5 线性关系考察

精密称取淫羊藿苷对照品6mg，加甲醇制成每1mL含淫羊藿苷0.6mg的溶液，分别精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5mL置10mL量瓶中，加甲醇稀释成不同浓度的对照品溶液，分别进样5μL，以2.1项下的色谱条件分别进样分析，测定其峰面积对浓度进行线性回归，得回归方程：y＝7791.3x+17.077(r＝0.9999)。结果表明：淫羊藿苷在0.015～0.15mg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

日内精密度：取浓度为0.03mg/mL的淫羊藿苷对照品溶液，精密吸取5μL，同一天内进样5次，峰面积RSD为1.70％。

日间精密度：上述对照品溶液，在6天内重复进样，所得峰面积RSD为1.99％。

2.7 重复性实验

取批号060830的供试品5份，按2.3项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依其项下液相色谱条件平行测定5份含量，结果RSD为0.02％(n＝5)，说明该方法简便，重现性好。

2.8 加样回收率实验

精密吸取已知含量的本发明的药物组合物合剂(批号060830)1mL，置10mL的量瓶中，共5份，分别精密加入淫羊藿苷对照品溶液(浓度为0.6mg/mL)1mL，然后按供试品溶液的制备方法制备，测定，计算加样回收率，平均回收率为100.30％，RSD为0.96％(n＝5)，符合含量测定方法学要求，其结果见表2。

表2  淫羊藿苷加样回收率试验结果(n＝5)

2.9  稳定性实验

取2.3项下供试品溶液，按上述液相色谱条件，分别于0、2、4、8、24h进样测定。结果，其峰面积RSD为2.11％，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.10  样品测定结果

取5批供试品(批号060810，060814，060830，070531，070724)，按2.3项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，分别注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算其中淫羊藿苷的含量，结果见表3。

表3  甘草酸和淫羊藿苷含量测定结果

3.川续断皂苷VI的含量测定

3.1 对照品溶液制备

精密称取经五氧化二磷干燥器中减压干燥至恒重的川续断皂苷VI对照品适量，以流动相制成相应浓度的对照品溶液。每次测定前微孔滤膜滤过。

3.2 样品溶液制备

精密取本发明的药物组合物合剂(批号060810)1mL，置10mL的量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密吸取1mL，置2mL的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心(3000r/min)5min，取上清液，即得样品溶液，进样前用0.45μm的膜滤过。

阴性对照样品：按处方比例，除去川续断药材的成分，按相同的制备方法制得阴性样品溶液。

3.3 色谱条件

色谱柱：Zorbax EcLipse XDB-C18柱(5μm，4.6mm×150mm)；

流动相：甲醇：0.01mol/L盐酸溶液(69:31)；流速：1mL/min；

检测波长：212nm；柱温：20℃；进样量：5μL。

色谱结果图见图3A、B、C。

3.4 标准曲线制备

精密称取川续断皂苷VI对照品2.3mg，加甲醇制成每1mL含川续断皂苷VI2.3mg的溶液，分别精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5mL置10mL的量瓶中，加甲醇稀释成不同浓度的对照品溶液，分别进样5μL，以3.1项下的色谱条件分别进样分析，测定其峰面积对浓度进行线性回归，得回归方程：y＝1629.9x+72.344(r＝0.9989)。结果表明：川续断皂苷VI在0.022～0.23mg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。

3.5 样品溶液浓度测定

取5批供试品(批号060810，060814，060830，070531，070724)，按3.1项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，分别注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算其中的含量，结果见表4。

表4  本发明的药物组合物合剂川续断皂苷VI的含量测定结果

3.6 回收率考察

精密吸取已知含量的本发明的药物组合物合剂(批号：060830)1mL，置10mL的量瓶中，共5份，分别精密加入川续断皂苷VI对照品溶液(浓度0.66mg/mL)1mL，然后按供试品溶液的制备方法制备，测定，计算加样回收率。结果表明：平均回收率100.18％，RSD为0.54％(n＝5)，符合含量测定方法学要求，具体数值见表5。

表5  本发明的药物组合物合剂川续断皂苷VI的加样回收率试验结果(n＝5)

3.7 精密度考察

日内精密度：取浓度为2.3mg/mL的川续断皂苷VI对照品溶液，精密吸取5μL，同一天内进样5次，峰面积RSD为1.7％。

日间精密度：上述对照品溶液，在6天内重复进样，所得峰面积RSD为1.24％。

3.8  重现性试验

取批号060830的供试品5份，按3.2项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依其项下液相色谱条件平行测定5份含量，结果RSD为1.67％(n＝5)，说明方法重现性好。

3.9 稳定性试验

取3.2项下供试品溶液，按上述液相色谱条件，分别于0、2、4、8、24h进样测定。结果，其峰面积RSD为5.5％，表明供试品溶液在24h内稳定。

4.总黄酮的含量测定

4.1 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的淫羊藿苷对照品4.8mg，置20mL量瓶中，加甲醇适量，超声使之溶解，用甲醇稀释至刻度，制成每1mL含0.24mg淫羊藿苷的对照品溶液。

4.2 供试品溶液的制备

本发明的药物组合物合剂检测时用甲醇稀释200倍，作为供试品溶液。

4.3 阴性样品溶液的制备

按处方比例，除去淫羊藿药材成分，按与供试品溶液相同的制备方法制得阴性样品溶液。

4.4 检测波长的确定

精密量取上述淫羊藿苷对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各2mL，分别置25mL量瓶中，并分别精密加入0.1mol/L三氯化铝试液1.0mL，分别用甲醇稀释至刻度，摇匀，置70℃水浴中加热10min使充分显色，放置15min。以试剂为空白，照分光光度法，在200～600nm波长范围内进行扫描。结果发现：对照品溶液与供试品均在415nm波长处有良好的吸收峰，阴性对照液在此波长处无干扰，故选择415nm波长处测定总黄酮的含量。

4.5 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液0mL，2.0mL，4.0mL，6.0mL，6.25mL，10mL于50mL量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀。分别精密量取10.0mL，各加人0.1mol/L三氯化铝溶液1.0mL，摇匀，于70℃恒温水浴中加热10min使充分显色，取出后室温放置15min，以第1份试样为空白，照分光光度法，在415nm波长处测定吸光度。以淫羊藿苷质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程：A＝0.0698C+0.0008，r＝0.9985。结果表明：淫羊藿苷在0.096～0.48mg/ml范围内呈良好的线性关系。

4.6 加样回收率

精密量取5份己知总黄酮量的供试样品，各加入一定量的标准品溶液，稀释后测定，总黄酮含量测定按“线性关系考察”项下进行，计算回收率。结果见表6。

表6  总黄酮的加样回收率

4.7 显色剂用量的确定

精密量取淫羊藿苷对照品溶液和供试品溶液各2mL，分别置10mL量瓶中，各精密加入0.1mol/L的三氯化铝试液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，于70℃恒温水浴中加热10min使充分显色，取出后室温放置15min，以试剂为空白，照分光光度法，在200～600nm波长范围内进行扫描。结果发现：当三氯化铝试液用量为1ml时，淫羊藿苷对照品溶液和供试品溶液均在415nm波长处有良好的吸收峰。

4.8 显色稳定性考察

淫羊藿苷对照品溶液和供试品溶液显色后，放置不同的时间测定其吸收度。结果表明：淫羊藿苷对照品溶液和供试品溶液显色后15～40min内显色稳定，吸收度变化不大。

4.9 重现性试验

取同一样品重复取样测定5次，按上述方法操作，计算总黄酮含量，计算测定方法的重复性，5次测定结果的RSD平均值为0.97％。

4.10 精密度试验

按样品测定项下方法，对同一对照品溶液连续测定5次，测得吸收度值，计算相对标准偏差RSD为0.46％，结果表明该方法精密度良好。

4.11 样品测定

检测时精密量取供试品溶液10mL，精密加入0.1mol/L的三氯化铝试液1mL，摇匀，于70℃恒温水浴放置10min，取出后室温放置15min，以试剂为空白，按比色法规定进行检查，在415nm波长处测定吸光度。按照回归方程计算，总黄酮按淫羊藿苷计，结果见表7。

表7  本发明的药物组合物合剂中总黄酮含量的测定结果

5.总皂苷的含量测定

5.1 对照品溶液

精密称取干燥至恒重的川续断皂苷VI对照品3.4mg，置10mL量瓶中，加氯仿适量，超声使之溶解，用氯仿稀释至刻度，制成0.34mg/mL川续断皂苷VI对照品溶液。

5.2 供试品溶液制备

精密量取本发明的药物组合物合剂4mL于圆底烧瓶中，加入2mol/L盐酸80mL于70℃加热回流3h，用氯仿分三次(30ml，20ml，10ml)回流萃取，各20min，收集氯仿层，回收至干。用氯仿定容至50ml容量瓶中，即得供试品液。

5.3 线性关系

精密吸取川续断皂苷VI标准溶液0.0mL，0.1mL，0.2mL，0.5mL，1mL，2mL，3mL于10mL刻度试管中，水浴蒸干。加入0.2mL5％的香兰素-冰醋酸和0.8mL的高氯酸，涡旋，于70℃恒温水浴加热20min，取出，立即用冰水冷却，加冰醋酸9mL，摇匀，550nm下测定吸光度值，以川续断皂苷VI质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线并进行线性回归。得线性方程：A＝1629.9C+72.344，r＝0.9989；线性范围：0.0034～0.102mg/ml。

5.4 回收率试验

精密量取5份已知总皂苷含量的样品，各加入一定量的标准品溶液，稀释后测定，总皂苷含量测定按供试样品制备方法和测定条件进行测定，计算回收率，结果平均回收率为100.84％，RSD＝1.29％(n＝5)，结果见表8。

表8  回收率试验结果

5.5 精密度试验

精密吸取上述对照品溶液，按上述方法在550nm波长处测定吸光度，重复测定5次，RSD值为1.45％，表明精密度良好。

5.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24h进行测定，测定吸光度RSD为1.25％，表明样品溶液在24h内温度。

5.7 重复性试验

取同一批次的本发明的药物组合物合剂5份，分别照供试品溶液制备项下操作制备样品液5份，按样品含量测定法测定吸光度，结果RSD为1.16％，表明此法重现性良好。

5.8 样品的测定

精密吸取上述供试品溶液0.05mL，置于10mL刻度试管中，水浴蒸干加入0.2mL 5％的香兰素-冰醋酸和0.8mL的高氯酸，涡旋，于70℃恒温水浴加热20min，取出，立即用冰水冷却，加冰醋酸9mL，摇匀，以试剂为空白，按比色法规定进行检查550nm下测定吸收度值取，按照回归方程计算，以川续断皂苷VI计，总皂苷结果见表9。

表9  本发明的药物组合物合剂中总皂苷的含量测定结果

所述药物组合物合剂的药效学实验具体如下：

一、动物实验

1.1 实验动物

普通级雌性成熟未交配过的SD大鼠50只，鼠龄60～80d，体重200±20g，由岳阳医院实验动物中心提供。给予标准光照周期(14h光照、10h黑夜)、室内温度(20±2)℃、湿度40％～50％、标准饲料和水。饲养于岳阳医院实验动物中心。

1.2 药物

那曲酮由北京四环制药厂生产，规格5mg/粒；本发明的药物组合物合剂由本院药剂科制剂室提供。

1.3 检测试剂盒与仪器

β-内啡肽(β-EP)、雌二醇(E₂)、孕酮(P)放免检测药盒(第二军医大学提供)；80-1型离心机(上海手术器械厂)；XW-80A漩涡混合器；DL-8R冷冻离心机；SN-695B型智能放免γ测量仪。

1.4 造模方法

1.4.1 筛选合格大鼠

所有雌性大鼠每日进行阴道涂片检查，选择动情周期在4～5d的大鼠，随机分为模型组及假手术组。在第三个动情周期的动情期，将大鼠进行自体移植法手术造模及假手术。

1.4.2 大鼠子宫内膜异位症模型(EMT)的建立

SD雌性大鼠，以苯甲酸雌二醇30μg/kg皮下注射，连续给药3d后，以1％的盐酸氯氨酮40mg/kg，腹腔注射麻醉，手术在室温28～30℃无菌条件下剖腹，切口长约1.5cm，切取右侧宫角处的一段子宫，长约1cm，迅速将其置于生理盐水中，纵向切开将子宫内膜与肌层分离，并剪取约5mm×5mm的内膜组织块，将内膜面向上对着体壁，将组织块四角用7～0棉纶单丝线缝于右侧腹壁血管丰富处。右侧子宫角行端对端吻合术。关腹前予以庆大霉素生理盐水溶液冲洗腹腔，最后缝合各层组织，普通级环境饲养。术后的4周，第2次剖腹观察，电子卡尺测量异位子宫内膜体积，以体积不小于20立方毫米，内膜囊泡可见透明积液为造模成功标准。

1.4.3 假手术组处理方法

手术条件及麻醉、开腹方法均同EMT模型组，开腹后将右侧子宫角结扎，目的使假手术组达到与EMT组均为单侧宫角子宫的生殖环境。同样以庆大霉素生理盐水冲洗腹腔，逐层缝合各层组织。

1.4.5 动物分组及给药方法

所有实验动物均同样环境饲养。

取造模成功大鼠40只，随机分为模型对照组(EMT组)、那曲酮组、毓麟合剂组、淫羊藿组，各10只，另设假手术组大鼠10只。各组动物养伤一个半月之后所有实验动物均于每日上午8点灌药，那曲酮组2mg/kg·d，毓麟合剂组11g/kg·d，淫羊藿组2.7g/kg·d，模型对照组与假手术组灌服生理盐水7.5ml/kg·d。所有动物连续给药1个月，于最后1次给药3h后采血，加肝素和抑肽酶，检测各项指标。

1.5 检测指标及方法

眼球后静脉取血，放射免疫法检测大鼠血浆β-EP水平、血清E₂和P水平。

实验步骤：β-EP标准品各25.6ng，使用时用缓冲液稀释成每100μL分别含2.5、5、10、20、40、80、160、320、640、1280pg的标准品。具体数值见表10。

表10  检测指标

E₂和P的检测方法与β-EP的检测方法相同。

1.6 统计方法

全部数据采用EXCEL分析统计，采用单因素方差分析。

1.7 结果

各组大鼠动情前期β-EP水平检测结果分别如表11、12、13所示。

表11  各组大鼠血浆β-EP水平比较(n＝10，x±s)

各组数据与模型组相比较^**P<0.01。

表11结果显示：模型组血浆β-EP水平升高，与假手术组相比有显著性差异(P<0.01)；那曲酮、毓麟合剂组β-EP水平降低，与模型组相比均有显著性差异(P<0.01)。由此说明毓麟合剂可以通过影响β-EP水平从而调节下丘脑-垂体-性腺轴来达到治疗作用。

表12  各组大鼠血清E₂水平比较(n＝10，x±s)

各组数据与模型组相比较^*P<0.05。

表12结果显示：模型组血浆E₂水平升高，与假手术组相比有显著性差异(P<0.05)；那曲酮、毓麟合剂组E₂水平降低，与模型组相比均有显著性差异(P<0.05)。本实验证明：毓麟合剂可改善高E₂状态，使异位内膜的增殖速度降低，血管生成减少，血供减少，使异位内膜萎缩，由此达到改善内异症患者盆腔内环境，抑制异位内膜组织的生长，改善子宫环境，有利于女子受孕。

表13  各组大鼠血清P水平比较(n＝10，x±s)

各组数据与模型组相比较^*P<0.05。

表13结果显示：模型组血浆P水平升高，与假手术组相比有显著性差异(P<0.05)；那曲酮、毓麟合剂组P水平降低，与模型组相比均有显著性差异(P<0.05)。本实验证明：毓麟合剂通过降低孕激素水平来达到抑制异位内膜生长的作用。

二、细胞实验

1.材料

1.1 试验药物

该药物组合物制成合剂后用水饱和的正丁醇提取，提取液浓缩至干，用含小牛血清的培养基配成2×10^-4、2×10^-5、2×10^-6g/ml，备用。

1.2 试剂

DMEM/F12培养基，美国GIBCO公司。小牛血清(FCS)，杭州四季清血清厂。噻唑蓝(MTT)，Ultra pure grade，Amresco分装，Easy Biotech怡成生物。台盼蓝(Trypan blue)：Chroma进口分装，上海化学试剂厂。二甲亚砜(DMSO)，AR，上海久意化学试剂有限公司。D-hank’s液为实验室按照细胞培养的工具书配制。

1.3 动物

SD大鼠，雌性，220～280g，上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物实验中心。

1.4 仪器

高速冷冻离心机RS-20III，日本精工；BUCH(B-490)旋转蒸发仪，Switzerland；pH/Mv/℃meter，Cole Parmaer，新加坡；Spectra MAX190：美国Molecular Devices公司；NAPCO CO2 INCUBATOR：Precision Scientific；倒置生物显微镜：XSZ-D2，重庆光学仪器厂。

1.5 方法

4只大鼠脱颈处死，放入盛有75％酒精的玻璃缸内，浸泡2min。在半无菌的状态下打开腹腔，把卵巢及周围附着的脂肪组织一并取出，迅速放入灭菌的培养皿内，然后在超净台内用D-Hank’s冲洗将卵巢逐个冲洗数遍；随后除去多余的脂肪、输卵管、血液残留等，在显微镜下用注射针头刺破卵泡，轻轻挤压，400目钢筛过滤，800rpm离心5min，计数，并用台盼蓝统计细胞活力，镜下未见染蓝色的死细胞，因此细胞活率为100％；最后以10⁶个/mL种板，每个浓度6复孔，第四天更换新的、预温的培养基，并加入雌性大鼠血清终浓度为10％，使该合剂形成三个不同的终浓度：10^-4、10^-5、10^-6(分别以YI、II、III标示)。继续培养，48h后用MTT法测定细胞生长情况。

2.结果

表14为合剂对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞生长的影响数据。结果显示，与空白对照组相比，在合剂三个终浓度下均显示对大鼠卵巢颗粒细胞的生长有明显作用，说明药物组合物对卵巢颗粒细胞生长有促进作用，从而对女子受孕发挥作用。

表14  合剂对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞生长的影响

三、临床研究资料

1.临床资料

1.1 病例来源

所有患者均来自我院门诊患者。60例患者随机分为：①治疗组30例，年龄24-38岁，平均31.23±6.89岁；病程3-8年，平均5.56±2.32年；②对照组30例，年龄22-38岁，平均30.35±7.84岁；病程2-7年，平均4.96±2.85年。两组患者年龄分布、病程比较差异均无显著性，具有可比性。

1.2 病例纳入标准

符合子宫内膜异位症及不孕症的诊断标准，按照中药新药治疗盆腔子宫内膜异位症的临床研究指导原则中医辨证标准，符合气滞血瘀伴肾虚型且丈夫精子正常的患者。

1.3 排除标准

合并子宫肌瘤、盆腔炎、生殖器癌，其它局部或全身性恶性肿瘤患者；同时接受其它治疗者；曾使用西药及其它中药治疗子宫内膜异位症不孕，停药不够3个月者；月经周期超过40天或少于25天；有心、肝、肾等重要器官疾病患者。

2 治疗方法

2.1 治疗组

采用我们自制药物组合物制成的合剂：淫羊藿30g，黄精24g，续断24g，香附18g，石菖蒲18g，甘草12g。每日1瓶分两次服用，2个月为1个疗程。

2.2 对照组

采用内美通(英国罗素优克福公司生产，每粒2.5mg)于月经第2天开始口服，每周2粒，连用2月。

2.3 观察指标

2.3.1 卵泡直径测定

两组患者均行阴道B超检查以监测卵泡发育情况，采用日本ALoKAssD1700彩色多普勒超声诊断仪，阴道探头频率5.0MHz。自月经周期第8天开始监测卵泡发育，最大卵泡直径<10mm，每3天测1次；最大卵泡直径10～15mm，每2天测1次；最大卵泡直径>15mm者，每天测1次；直径>18mm为成熟卵泡。两组均于停药3个月后开始监测。

2.3.2 抗子宫内膜抗体(EMAb)测定

治疗前及治疗后停药3个月后分别取血样测EMAb效价。

2.3.3 肿瘤坏死因子(TNF-a)、白介素-6(IL-6)测定

两组均于治疗前及停药3个月后分别取血样测定TNF-a、IL-6效价。

3.疗效观察

3.1 临床疗效判定标准

参照《子宫内膜异位症中西医结合诊疗标准》中的疗效判定标准。

痊愈：症状全部消失，盆腔包块等局部体征基本消失，不孕患者3年内妊娠或生育。

显效：症状基本消失，盆腔包块缩小。

有效：症状减轻，盆腔包块无增大或略缩小，停药3个月内症状不加重。

无效：主要症状无变化或恶化，局部病变有加重趋势。

3.2 治疗结果

结果如表15所示。

表15  两组临床疗效比较

与对照组相比，P>0.05。

3.3 两组最大卵泡直径、成熟卵泡个数均值比较

结果如表16所示。

表16  两组最大卵泡直径、成熟卵泡个数均值比较

^*组内治疗前后相比，P<0.05。

3.4 两组治疗前后血清EMAb效价比较

结果如表17所示。

表17  两组治疗前后血清EMAb效价比较

^*组内治疗前后相比，P<0.05。

3.5 两组治疗前后IL-6、TNF-a效价比较

结果如表18所示。

表18  两组治疗前后IL-6、TNF-a效价比较

4.讨论

子宫内膜异位症是育龄妇女的常见病，近年来其发病率明显上升，生育年龄妇女内异症的发生率约为5％～10％，80％的患者有明显的痛经，50％合并不育，严重影响患者的生活质量。子宫内膜异位症引起不孕的机制至今未完全阐明。目前认为内异症对不孕的影响是多因素、多环节作用。内异症可能因多种原因引起不孕症，如卵泡生成受损，尤其在中重度内异症中，低质量的卵母细胞可降低受精率，最终降低胚胎质量。一般认为，瘀血是子宫内膜异位症的核心病机。1990年中国中西医结合学会妇产科专业委员会第三届学术会议将子宫内膜异位症中医诊断标准修订为血瘀症。在血瘀的基础上，又有气滞血瘀、气虚血瘀、肾虚血瘀、寒凝血瘀、痰瘀互结、湿热瘀阻等不同。中医学典籍中无子宫内膜异位症病名的记载，据其临床表现当属祖国医学痛经、不孕、月经不调、症瘕等范畴。瘀血内阻已经成为本病公认的发病机制，我们在长期的实践中，根据其病程长，病情缠绵难愈，复发率高的特点，并结合国内外近年来对本病发病原因的研究结果，提出元气亏损，痰热瘀血闭阻胞络是子宫内膜异位症的病理基础。全方以黄精补中益气，填补精髓，淫羊藿补命门、助肾阳为主，二药配合补阴益阳共为君药；配以续断加强补益肝肾的作用为臣药；佐以制香附疏肝理气调经，石菖蒲舒心气开窍；甘草为使调和诸药。这使得毓麟合剂具有良好的温肾益精，调经种子的功效。研究结果表明，该合剂可明显缓解内异症患者症状，其有效率达70％，与西药内美通比较临床疗效无统计学差异。该合剂治疗子宫内膜异位症能显著增加最大卵泡直径，降低血清EMAb、TNF-a及IL-6水平，从而提高受孕率。且副作用小，价格相对低廉，不失为治疗内异症不孕的有效方法之一。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。

图1A为甘草酸对照品的HPLC谱图。

图1B为甘草酸供试品的HPLC谱图。

图1C为甘草酸阴性对照品的HPLC谱图。

图2A为淫羊藿苷对照品的HPLC谱图。

图2B为淫羊藿苷供试品的HPLC谱图。

图2C为淫羊藿苷阴性对照品的HPLC谱图。

图3A为川续断皂苷VI对照品的HPLC谱图。

图3B为川续断皂苷VI供试品的HPLC谱图。

图3C为川续断皂苷VI阴性对照品的HPLC谱图。

其中图1A、B、C中的1为甘草酸，2为淫羊藿苷；图2A、B、C中的1为淫羊藿苷；图3A、B、C中的1为川续断皂苷VI。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

实施例1

药物组合物口服液的制备：

原料：淫羊藿300g、黄精240g、续断240g、香附180g、石菖蒲180g、甘草120g。

制备：香附和石菖蒲加12倍量水，蒸馏6小时提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；药渣再加12倍量水煎煮1小时，药液过滤备用；剩下的4味分别用10倍量水煎煮3次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述药液合并，减压浓缩至相对密度1.10-1.12(60℃)，静置24小时，取上清液回收乙醇并浓缩至相对密度1.04(20℃)，静置48小时，取上清液滤过，滤液加入上述挥发油、吐温-80及适量矫味剂，调整体积至1000mL，滤过，分装，灭菌，即得所述口服液。

服用：一日两次，每次50ml。

实施例2

药物组合物合剂的制备：

原料：淫羊藿300g、黄精240g、续断240g、香附180g、石菖蒲180g、甘草120g。

制备：以上六味，分别加8倍量水和4倍量水煎煮二次，每次煎煮后于85℃保温20分钟，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度不低于1.06(80℃)，离心，取上清液，加入蔗糖200g、苯甲酸钠3g、羟苯乙酯0.5g，加水制成1000mL，混匀，灌装，即得所述合剂。

服用：一日两次，每次50ml。

实施例3

药物组合物糖浆剂的制备：

原料：淫羊藿300g、黄精240g、续断240g、香附180g、石菖蒲180g、甘草120g。

制备：香附和石菖蒲加12倍量水，蒸馏6小时提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；挥发油用6倍量的β环糊精包合成包合物。药渣再加12倍量水煎煮1小时，药液过滤备用；剩下的4味分别用10倍量水煎煮3次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述药液合并，减压浓缩至相对密度1.10-1.12(60℃)，静置24小时，取上清液回收乙醇并浓缩至密度1.18，另取蔗糖650g加水煎煮，溶解后，滤过，浓缩制成糖浆，与上述浓缩液混匀，煮沸，放冷，加入防腐剂、上述挥发油、吐温-80，调整体积至1000mL，分装，灭菌，即得所述糖浆剂。

服用：一日两次，每次50ml。

实施例4

药物组合物片剂的制备：

原料：淫羊藿300g、黄精240g、续断240g、香附180g、石菖蒲180g、甘草120g。

制备：香附和石菖蒲加12倍量水，蒸馏6小时提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；挥发油用6倍量的β环糊精包合成包合物。药渣再加12倍量水煎煮1小时，药液过滤备用；剩下的4味分别用10倍量水煎煮3次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述药液合并，减压浓缩至相对密度1.10(60℃)的药液，加乙醇使含醇量达到50％，搅拌，静置24小时，吸取上清液回收乙醇，浓缩成相对密度为1.33-1.35(60℃)的浸膏，取浸膏1份，加2倍量蔗糖，1倍量糊精及乙醇适量，制粒，干燥，与挥发油的β环糊精包合物及1％硬脂酸镁混匀，压片，共制成1000片，即得所述片剂。

服用：一日三次，每次10片。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。