豆甾烷－3,5,6－三醇及其衍生物用于制备抗病毒药物的用途以及新的豆甾烷－3,5,6－三醇衍生物

摘要

本发明涉及豆甾烷－3，5，6－三醇及其衍生物用于制备抗艾滋病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)的药物的用途。本发明还涉及新的豆甾烷－3，5，6－三醇衍生物、含有豆甾烷－3，5，6－三醇及其衍生物的药物组合物以及使用豆甾烷－3，5，6－三醇及其衍生物治疗艾滋病和乙型肝炎的方法。

说明书

本发明是申请日为2005年5月26日的中国专利申请200510074395.0的分案申请，原申请的发明名称为“豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制备抗病毒药物的用途以及新的豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物”。

发明领域：

本发明涉及豆甾醇衍生物用于制备抗逆转录病毒药物的用途，更具体地，本发明涉及豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制备抗艾滋病毒(HIV)和抗乙型肝类病毒(HBV)的药物的用途。本发明还涉及含有豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物的药物组合物以及使用豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物治疗艾滋病和乙型肝炎的方法。

背景技术：

HIV感染已对我国人们的健康构成严重威胁。HIV感染者在1989年后急剧上升，到目前为止，为84万，其中艾滋病患者8万，艾滋病死亡人数已达22万。其疫情特点是持续增长，流行呈聚集性分布，扩散迹象形成。专家推测到2010年将达到1000万人。

目前，抗HIV药物研究的重点为融合抑制剂、逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及整合酶抑制。虽然已有10余种药物可以有效地缓解症状，延长病程，但仍存在很多问题，如不能彻底清除体内病毒、停药反弹、易产生耐药性、副作用大及每年的昂贵费用，使得这些药物的应用受到很大限制。特别是占全球感染者90％以上的广大发展中国家的感染者根本无法接受治疗。因此，进一步研制和开发低毒有效甚至能够清除病毒的抗病毒药物仍是一项迫切而艰巨的任务。

式I豆甾烷-3，5，6-三醇为已知化合物，

但到目前为止，关于其本身及其衍生物在抗逆转录病毒，尤其是抗HIV病毒和抗HBV病毒方面的用途尚未见报道。

发明内容：

本发明人在研究中出人意料地发现具有下式II的豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物在抑制HIV病毒和HBV病毒方面显示出良好的活性。

因此，本发明的第一方面涉及式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制备抗HIV病毒的药物的用途：

其中，

R₁，R₂和R₃相同或不同，各自独立地为H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷酰基、C₇-C₁₁芳酰基、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、果糖，

R₄为具有以下结构的基团

本发明的第二个方面涉及上述式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制备抗乙型肝炎病毒的药物的用途。

本发明的第三个方面涉及新的式II豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物

其中，

R₁，R₂和R₃相同或不同，各自独立地为H，C₁-C₆烷基，C₁-C₆烷酰基，C₇-C₁₁芳酰基，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，果糖，

R₄为具有以下结构的基团：

条件是，当R₁，R₂和R₃同时为H时，R₄不为

本发明的第四个方面涉及含有式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物以及一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明的第五个方面涉及治疗艾滋病和乙型肝炎的方法，该方法包括给予需要治疗的对象治疗有效量的式I或式II化合物。

根据本发明的一个优选实施方式，在式III豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物中，R₁，R₂和R₃相同或不同，为乙酰基、丙酰基、丁酰基或苯甲酰基。

活性成分的提取

根据本发明，式I豆甾烷-3，5，6-三醇是已知化合物，其可通过本领域已知方法得到，例如可以通过以下方法获得：

用95％的乙醇加热回流提取杜仲，减压浓缩后的浸膏采用不同极性的溶剂依次进行提取，对其中的乙酸乙酯部分进行纯化，以石油醚氯仿系统进行梯度洗脱，收集有关馏分，即可得到豆甾烷-3，5，6-三醇。

抗病毒活性研究

采用HIV病毒感染的MT4细胞为实验模型，以病毒引起的合胞体的产生为评价指标，观察药物的作用。研究发现，式I豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物可以有效地保护病毒感染的细胞，使其不产生病变，并且效果显著，IC₅₀值为9.38μg.ml^-1，从而首次发现豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物具有抗HIV作用。另外，采用HepG 2.2215细胞系对豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物的抗HBV活性进行了测定。

附图说明：

图1和图2显示了正常的MT4细胞。

图3和图4显示了被HIV感染的MT4细胞。

图5显示了豆甾烷-3，5，6-三醇对于被HIV感染的MT4细胞的抗细胞病理作用。

具体实施方式

仪器与材料

MS：Zabspec高分辨质谱仪(Micromass公司)。

NMR：JNM-ECA-400超导核磁共振仪(日本电子株式会社)，TMS为内标。

Varian^UNITY INOVA600超导核磁共振仪.

熔点仪：RY-1熔点仪(天津市分析仪器厂)。

硅胶：薄层层析用硅胶H、HF254(青岛海洋化工厂)。

纤维素板：Merk公司。

薄层显色：紫外灯254，366nm，碘蒸汽、1％FeCl₃醇溶液。

药材来源

中药杜仲皮，购自广州南方医院中药房。

实施例1 豆甾烷-3，5，6-三醇的提取、分离和结构鉴定

将药材(10Kg)用95％乙醇加热回流提取三次，合并提取液，减压浓缩至干，得浸膏736g。将浸膏溶于水中，必要时加热使其完全溶解。采用不同极性的溶液依次进行萃取，分为石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水四个部分，对乙酸乙酯部分进行纯化分离。用石油醚-氯仿系统(50:1-5:1)作洗脱剂进行硅胶柱层析，收集第14-24馏分，合并后在甲醇中析出白色片状结晶，mp：249-252℃，称为式I化合物。

上述白色片状结晶的Libermann-Burchard反应呈阳性，EI-MS给出分子离子峰M/Z448(M⁺)，结合¹³C-DEPT和¹HNMR确定分子组成C₂₉H₅₂O₃，不饱和度为4，¹³C-DEPT显示29个碳信号，其中在δ60-80区域有2个连氧叔碳(CH)：δ 65.63和74.22，一个连氧季碳δ 75.85。EI-MS谱上可见连续脱水的碎片峰：M/Z430.2(M-H₂O，100)，412.2(M-2H₂O，74)，上述数据表明为甾醇类化合物。进一步根据EI-MS谱所示有失去C17侧链的离子峰：M/Z290(M-H₂O-C₁₀H₂₀，26)，271(M-2H₂O-C₁₀H₂₁，22)，说明该化合物为具有10个饱和碳的侧链，这与豆甾烷类化合物的质谱裂解规律基本吻合，故将化合物¹³C-DEPT和¹H-NMR与类似母核的豆甾烷醇类化合物进行比较归属，化合物的EI-MS，¹HNMR，¹³CNMR与文献报道的豆甾烷-3，5，6-三醇基本吻合(蔡雄，谭小秋，潘德济，等.玉柏石松的甾体成分研究.中草药，1989，7：44；Deshmane.S.S，Sukh Dev.High Isoprenoids-II Triterpenoidsand Steroids of Saccharum Officinarum.Tetrahedron，1971，27：1109-1118；Zhao M，Duan J.A，Huang WZ，et al.Steroids andAnthraquinones from Astragalus hoantchy.Journal of ChinaPharmaceutical University，2003，34(3)：216；以及于德泉，杨峻山，分析化学手册(7)化学工业出版社，2002，891)，故确定式I化合物为具有以下结构的豆甾烷-3，5，6-三醇。

式I化合物的波谱数据

EI-MS(M/Z，％)456(M⁺，2)，438(2)，300(4)，248(100)，235(4)，207(40)，203(50)，189(17)，133(51)。

¹H-NMR(DMSO-d₆，600Hz)δ ppm 0.65(3H，s，18-H)，1.02(3H，s，19-H)，3.61(1H，s，3-H)，3.80(1H，m，3-H)，4.37，4.13(1H，1H，d，d，J＝4.2Hz，6.0Hz，5-OH，6-OH)，3.61(1H，s，5-OH)

¹³C-NMR(DMSO-d₆)δ ppm 39.03(C-1)，30.98(C-2)，65.63(C-3)，31.89(C-4)，74.22(C-5)，75.85(C-6)，42.17(C-7)，29.90(C-8)，45.02(C-9)，35.47(C-10)，20.62(C-11)，40.82(C-12)，39.02(C-13)，55.57(C-14)，23.78(C-15)，27.78(C-16)，55.77(C-17)，11.68(C-18)，16.19(C-19)，37.69(C-20)，18.50(C-21)，33.25(C-22)，25.47(C-23)，44.46(C-24)，28.62(C-25)，19.62(C-26)，18.85(C-27)，22.52(C-28)，11.82(C-29)。

实施例2 式I化合物抗HIV作用研究

材料与方法

药物

将实施例1中所得的式I化合物样品用DMSO溶解，以DMSO二倍稀释成六个浓度。对照药物AZT购自Sigma公司。

试剂

DMSO：军事医学科学院进口分装；RPMI-1640培养基：Invitrogen公司；小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司。

细胞和病毒

MT4细胞株：引自日本；HIV-1IIIB：引自美国。

病毒毒力测定：10倍稀释8个浓度HIV在RPMI-1640培养液中观察细胞病变，计算TCID₅₀为10^-6。

式I化合物对细胞的毒性测定

按照文献(Rudi Pauwels，Jan Balzarini，Masanori Baba，etal.Rapid and automated tetrazolium-based colorimetric assay forthe detection of anti-HIV compounds.J Virol Meth，1988，20：309)描述的方法，将MT4细胞2×10⁵个/ml接种于96孔板中，0.1ml/孔，加入验证化合物，验证化合物二倍稀释为1000μg/ml-7.8μg/ml，阳性对照药AZT三倍稀释为500μg/ml-6.3μg/ml，每个浓度接种3孔，同时设正常细胞对照，DMSO溶剂对照及空白MT₄细胞对照(不加病毒)，置37℃5％CO₂培养箱内培养6天。MTT法测定细胞活性，确定CC₅₀值。

式I化合物对HIV诱导的MT4细胞病变的抑制作用

按照文献(陈春英，黄学华，周井炎等，硫酸酯化箬叶多糖的结构修饰及其抗艾滋病病毒作用，药学学报，1998，33：264)所述方法，将MT4细胞2×10⁵个/ml接种于96孔板中，0.1ml/孔，分别加入1000TCID₅₀的HIV病毒100μl，同时设正常细胞对照和病毒对照，然后分别加入成倍稀释五个浓度的样品及AZT 100μl，每个样品浓度设三个平行孔，置37℃ 5％CO₂培养箱内培养，72小时后在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)。CPE判定标准：无合胞体形成“-”，无合胞体形成但细胞不规则“±”，有合胞体形成“+”。

IC₅₀的判定：(1)只一复孔为“+”，另两复孔为“-”或“-”与“±”，此药物浓度可视为IC₅₀。

(2)三复孔分别为“+”，“-”与“±”，此药物浓度可视为IC₅₀。

(3)三复孔均为“±”，此药物浓度可视为IC₅₀。

(4)三复孔均为“+”，下一个浓度作用下的三复孔均为“-”，两个浓度的中间值可视为IC₅₀。

选择指数(SI)：CC₅₀/IC₅₀。

结果

HIV诱导MT4细胞病变模型的建立

正常MT4细胞为悬浮细胞，呈聚集状生长，边界清晰，折光性好(图1和2)。HIV感染细胞3天，有合胞体产生，但细胞活性基本正常(图3)。HIV感染细胞第7天，细胞出现死亡，合胞体产生，有大的空泡出现(图4)，说明细胞病变明显。

式I化合物抑制细胞病变作用及细胞毒性

结果显示，式I化合物的抗HIV作用显著，抑制细胞病变的IC₅₀值为9.38μg/ml(表1)。细胞毒性实验显示，该化合物的CC₅₀值大于1000μg/ml。并且，式I化合物的SI值大于50，说明其抗HIV作用强。

表1.在HIV-1/MT4培养体系中的式I化合物对于HIV-1诱导的CPE的抑制作用

由抑制细胞病变结果可见，式I化合物对细胞病变具有显著的抑制作用。加药后第三天，未见有病变产生，细胞状态好，与正常对照组无差别。加药第7天观察，未见有细胞病变产生，细胞呈簇状生长，边界光滑，且细胞活性好于正常对照组细胞(图5)。

实施例3 式I化合物的抗HBV作用研究

材料和方法

药物：

将实施例1所得的式I化合物样品用DMSO溶解，以DMSO二倍稀释成六个浓度。对照药物GS101(阿昔洛韦)由军事医学科学院二所提供。

细胞培养

HepG2.2215细胞系为HBV DNA克隆转染的人肝癌细胞(HepG2)，由美国Mount Sinai医学中心构建，军事医学科学院引进，用含10％胎牛血清、谷胺酰胺、100μg.ml^-1青霉素、100μg.ml^-1链霉素、100μg.ml^-1卡那霉素的MEM培养液培养。定期用含380μg.ml^-1G418的培养液筛选。选取生长良好的HepG2.2215细胞，用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，浓度为1×10⁵个.L^-1。悬液接种于96孔培养板中，正常培养48小时后加入含有不同浓度药物的培养液，培养4d后更换含相同药物浓度的培养液，继续培养4d。收集8d细胞上清检测HBsAg、HBeAg及细胞存活率。

试剂

HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂盒，HBV DNA PCR检测试剂盒(北京华美生物工程有限公司)；噻唑蓝(MTT)；胰蛋白酶；EaglesMEM细胞培养干粉，G-418(Geneticin)，美国GIBCO公司；胎牛血清，美国Hyclone Lab公司。

药物对细胞的毒性实验

药物用DMSO配制成2mg.ml^-1，2倍稀释成6个浓度加入96孔板，每浓度4孔，另设空白对照组，每4天换同浓度药液，再培养4天，设无药物细胞对照组。实验第8天，倾去培养液，每孔加入含MTT的培养液(400μg.ml^-1)，每孔100μl，37℃，5％CO2孵育4小时，弃上清，加DMSO 100μl溶解，待甲瓒颗粒完全溶解后，酶标仪540nm波长测定OD值。结果显示，豆甾烷-3，5，6-三醇的半数无毒浓度(CC₅₀)大于1000μg/ml。

细胞存活实验

实验采用MTT法检测，方法与上述细胞毒性实验相同。药物浓度为100μg.ml^-1-3.125μg.ml^-1。细胞用药后，检测得各个浓度孔中培养上清的光密度值，取均值后按下式计算细胞存活率，其中给药组为给予不同浓度的实验组；空白组为不加酶结合底物而平行操作的空白对照组；对照组为不加药物处理的细胞对照组。细胞存活率＝[(D_给药组-D_空白组)/(D_对照组-D_空白组)]×100％。镜检未见给药组与对照组细胞存在形态学差异。

HBsAg、HBeAg含量的检测

收集用药后培养上清，按HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂盒说明书测得各个浓度孔中培养上清的OD值，取均值后按下式计算抗原抑制率，抗原抑制率＝[(D_对照组-D_给药组)/(D_对照组-D_空白组)]×100％。实验重复进行3次。药物对抗原的半数有效浓度(IC₅₀)，按Logistic法计算，Logistic法拟和作图，曲线形状若为典型的S型浓度-效应曲线，可以说明药物具有良好的量效关系，可以得到在不同浓度药物处理时抗原生成量，测定最大值和最小值，最大抑制率、最低抑制率、抑制50％所需浓度(IC₅₀)。IC₅₀为抑制曲线中最重要的参数，浓度越低表示药物的抑制活性越高。检测半数无毒浓度CC₅₀。治疗指数(SI)＝CC₅₀/IC₅₀。结果见表2，经计算得到的抗原抑制率在30-40％之间。

表2.式I化合物对HBV抗原表达和细胞增殖的作用(n＝3，^-x±s)

*P<0.05   **P<0.01