用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母以及生物测试方法

摘要

本发明提供一种用于检测环境样品中类雌激素化合物的双杂交酵母及其制备方法，其中该酵母中含有pGBKT7－ER酵母表达质粒和pGAD424－GRIP1酵母表达质粒，其中pGBKT7－hER酵母表达质粒包含雌激素受体基因，pGAD424－GRIP1酵母表达质粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受体共激活因子基因片段。本发明还提供了一种检测环境中类雌激素化合物的生物测试方法，其中包括将上述双杂交酵母细胞与待测样品共培养，加入邻硝基苯－β－D－吡喃半乳糖苷的反应液进行反应，根据终止反应后检测到的上清液在420nm处的吸光度值来计算类雌激素化合物的浓度。本发明采用重组雌激素受体基因的双杂交酵母用于测试，更加接近哺乳动物内分泌系统的真实作用情况，构建的酵母细胞基因性状稳定，易于培养、筛选，整个类雌激素效应的筛选过程操作简单，所需样品量少，成本低廉。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母以及生物测试方法，具体的说是涉及一种利用酵母双杂交技术获得的包含重组雌激素受体基因的双杂交酵母，以及利用该酵母来检测环境中类雌激素化合物的生物测试方法。

背景技术

环境中的内分泌干扰物，亦被称为环境激素，是指人类在生产、生活过程中释放到环境中的某些有毒化学物质，它们与人体和动物体内的激素具有类似的化学结构，并能够产生类似激素的作用。它们进入体内，扰乱了激素的正常分泌，使人和动物的生理过程发生紊乱，导致生殖、免疫等功能发生障碍。环境中的内分泌干扰物的干扰效应包括：雌激素干扰效应、雄激素干扰效应、甲状腺激素干扰效应等，特别是雌激素干扰效应能够对生物及人类生殖系统造成严重影响。尽管具有雌激素干扰活性的化合物在环境中浓度极小，但是其一旦进入人体和动物体内，可以与特定的雌激素受体结合形成复合物，该复合物进一步结合到细胞核中的雌激素反应元件(ERE)，启动/抑制下游基因的表达，干扰内分泌系统的正常功能。90年代对雌激素受体作用机制的研究进一步发现了雌激素受体的共激活因子(coactor)，并建立了新的受体作用理论(参见，Hong，H.，Kohlit，K.，Trivedit，A.，Deborah，L.，Johnson，D.L.和Stallcup，M.R.，1996，Natl.Acad.Sci.USA.93：4948-4952)。该理论认为，雌激素(或者环境中类雌激素物质)与相应雌激素受体的配体结合区(LBD)结合后引起构象改变，进一步结合共激活因子，促进转录。

对环境中雌激素干扰效应进行研究，通常采用化学分析和生物测试技术。化学分析需要高分辨色谱/高分辨质谱，除了分析费用高外，对仪器设备条件和人员素质有相当严格的要求。另外一种广泛采用的是利用重组雌激素受体酵母菌(Yeast Estrogen Screen，YES)进行测试，这种测试利用的是重组雌激素受体及受体反应元件构建的单杂交酵母。单杂交酵母方法并未考虑到雌激素受体共激活因子的作用。而且目前国内所用的重组酵母菌株几乎都来自国外实验室，基本上没有国内实验室进行菌株的构建工作。因此该重组菌种需要长期冷冻保存，一旦菌种发生回复突变，性状就很难回复。利用双杂交酵母技术将雌激素受体基因或基因片段以及共激活因子基因片段同时导入酵母细胞则可以克服单杂交酵母的缺点，并与新的受体作用理论相一致。已经有证据表明基于新的受体作用理论建立的核受体双杂交酵母系统更加接近哺乳动物内分泌系统的真实作用情况(参见，Nishihara，T.，Nishikawa，J.，2000，Journal of Health Science.46(4)：282-298)。而且，通过实验室直接构建酵母菌株，能够有效的控制回复突变的影响，测定环境化合物的雌激素干扰效应时能够得到更好的质量控制。

目前，通常采用报道基因的方法指示外界干扰、如化合物暴露等对基因转录的影响。其中，Lac Z就是一种常用的编码β-半乳糖苷酶的报道基因，其产物β-半乳糖苷酶具有强的酶催化活性，能够与特定底物反应生成新的有色化合物，易于检测。因此，通过简单测定β-半乳糖苷酶的活性，就能够表征对基因转录的影响。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术使用重组雌激素受体基因单杂交酵母对类雌激素污染物进行测定时由于缺乏受体共激活因子，因而不能模拟真核细胞真实情况，容易产生假阴性或是假阳性结果的缺陷，从而构建能够同时表达雌激素受体和受体共激活因子的双杂交酵母，并在此基础上建立一种经济高效的评价环境样品对雌激素受体干扰活性的生物测试方法。该检测方法快速简便，成本低廉，省时省力，应用广泛，所需样品量少，灵敏度高，能够反映环境样品中雌激素受体的诱导效应，并且通过标准曲线计算得到样品中类雌激素污染物的毒性当量值。

本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明提供一种用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母，该酵母包含pGBKT7-ER酵母表达质粒和pGAD424-GRIP1酵母表达质粒，其中所述pGBKT7-ER酵母表达质粒包含雌激素受体基因，所述pGAD424-GRIP1酵母表达质粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受体共激活因子基因片段。具体而言，上述雌激素受体基因优选人雌激素受体基因或具有如SEQ ID No.1所示序列的人雌激素受体基因片段。所述类雌激素化合物选自天然雌激素化合物、酚类及经过代谢转换能够形成酚类的化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、有机氯农药中的一种或几种。

本发明提供的上述双杂交酵母具体为一种酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ER-GRIP1，其已经于2007年12月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行了生物材料保藏，保藏编号为CGMCCNo.2307。

本发明还提供一种用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母的制备方法，其中包括以下步骤：

(1)构建包含雌激素受体基因的pGBKT7-ER酵母表达质粒；

(2)纯化包含具有如SEQ ID No.2所示序列的雌激素受体共激活因子基因片段的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒；

(3)采用上述两种质粒构建双杂交酵母ER-GRIP1；

(4)筛选双杂交酵母ER-GRIP1。

上述方法中所述雌激素受体基因优选人雌激素受体基因或具有如SEQ ID No.1所示序列的人雌激素受体基因片段。所述类雌激素化合物选自天然雌激素化合物、酚类及经过代谢转换能够形成酚类的化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、有机氯农药中的一种或几种。所述双杂交酵母ER-GRIP1具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ER-GRIP1，其保藏编号为CGMCC No.2307。

在上述步骤(1)中，包括设计雌激素受体配体结合域ER LBD的PCR引物，在上、下游引物的5′端分别引入EcoR I和BamH I单一酶切位点，并且上游引物P1：5′-TCGCCGGAATTCGCTGGAGACATGAGA-3′；下游引物P2：5′-TAACGCGGATCCTCAGACTGTGGCAGG-3′；在上述步骤(3)中，同时用pGBKT7-ER质粒和pGAD424-GRIP1质粒转化进入酿酒酵母细胞Y187(Saccharomyces cerevisiae)；在上述步骤(4)中，采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选双杂交酵母。其中，优选采用添加雌激素的X-gal缓冲液的菌落转移滤膜分析，所述雌激素例如17β-雌二醇；所述X-gal缓冲液为20mg·mL^-1 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基甲酰胺溶液。所述营养缺陷型筛选中采用的培养基为SD/-Trp/-Leu，其中包含20mg·L^-1腺嘌呤半硫酸盐，20mg·L^-1盐酸精氨酸，20mg·L^-1一水合盐酸组氨酸，30mg·L^-1异亮氨酸，30mg·L^-1盐酸赖氨酸，20mg·L^-1甲硫氨酸，50mg·L^-1苯丙氨酸，200mg·L^-1苏氨酸，30mg·L^-1酪氨酸，20mg·L^-1尿嘧啶，150mg·L^-1缬氨酸，6.7g·L^-1无氨基酸酵母氮源。

具体而言，在上述方法中，在构建pGBKT7-ER酵母表达质粒时，首先设计出人雌激素受体配体结合域(hER LBD)的PCR引物，并在上下游引物的5′端分别引入EcoR I和BamH I单一酶切位点；以含有hER LBD(SEQ ID No.1所示序列)的pASV3质粒(由英国Nottingham大学Heery教授惠赠。参见，Pierrat，B.，Heery，D.M.，1992，Gene.119(2)：237-245)作为模板进行PCR扩增；PCR产物用T4DNA连接酶连接于T-载体，构建的T-hER LBD质粒；将pGBKT7(购自Clontech公司)和T-hER LBD质粒分别用EcoR I和BamH I双酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳分析后切胶回收，pGBKT7和hER LBD插入片段的回收产物采用T4DNA连接酶连接，构建pGBKT7-hER酵母表达质粒。

具体而言，在上述方法中，纯化pGAD424-GRIP1酵母表达质粒时，用pGAD424-GRIP1(美国加州大学Stallcup教授惠赠。参见，Li，H.W.，Kim，J.H.，Koh，S.S.，Stallcup，M.R.2003.J.Biol.Chem.Biol.279(6)：4212-4220.)转化感受态大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆，提取质粒并纯化。

具体而言，在上述方法中，构建双杂交酵母ER-GRIP1时，同时加入pGBKT7-hER质粒和pGAD424-GRIP1质粒混合均匀，并加入感受态酿酒酵母细胞Y187(Saccharomyces cerevisiae)孵育，得到双杂交酵母hER-GRIP1。

具体而言，在上述方法中，筛选双杂交酵母ER-GRIP1时，采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选双杂交酵母，双杂交酵母通过营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)粗筛出阳性菌落，进一步使用菌落转移滤膜分析方法，将菌落影印到无菌的1#干燥滤膜上，液氮反复冻融，破碎细胞；将1#滤膜置于含雌激素的X-gal缓冲液的2#滤膜上，30℃孵育至出现明显蓝色菌落，将显色菌落继续培养备用。

本发明还提供一种检测环境中类雌激素化合物的生物测试方法，其中包括如下步骤：将上述双杂交酵母细胞与待测样品共培养，加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应，根据终止反应后检测到的上清液在420nm处的吸光度值来计算类雌激素化合物的浓度。

上述方法具体包括如下步骤：

(1)培养双杂交酵母ER-GRIP1细胞；

(2)绘制诱导标准曲线：首先将上述双杂交酵母细胞分别与已知系列浓度雌激素共培养，加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷反应液进行反应，终止反应后检测上清液在420nm处的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶活性的参数，绘制系列雌激素浓度相对双杂交酵母ER-GRIP1细胞的β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线；

(3)检测样品：将上述双杂交酵母细胞与待测样品共培养，加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应，终止反应后检测上清液在420nm处的吸光度值，对照步骤(2)制定的标准曲线计算出样品中类雌激素化合物的含量。

对于上述生物测试方法而言，在步骤(1)中，将ER-GRIP1细胞接种时调节菌液600nm处的吸光度值为0.1～0.2，30℃培养24h后调整菌液600nm处的吸光度值为0.7～0.8准备进行测试；所述待测样品为有机溶剂提取液，其中雌激素当量浓度为10^-11～10^-10mol·L^-1；所述类雌激素化合物选自天然雌激素化合物、酚类及经过代谢转换能够形成酚类化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、有机氯农药中的一种或几种。所述双杂交酵母ER-GRIP1具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ER-GRIP1，其保藏编号为CGMCC No.2307。

具体而言，在上述检测环境中类雌激素化合物的生物测试方法中，双杂交酵母ER-GRIP1细胞的培养方法为：将上述重组基因酵母hER-GRIP1的细胞接种到SD/-Trp/-Leu液体培养基中，检测菌液600nm处的吸光度值为0.1～0.2，30℃培养24h后调整酵母菌液600nm处的吸光度值为0.7～0.8。

绘制诱导标准曲线具体步骤为：将17β-雌二醇溶解到二甲基亚砜(DMSO)中，制备一系列的17β-雌二醇标准浓度反应液(浓度范围2×10^-12～2×10^-6mol/L)，按照0.5％的比例添加17β-雌二醇标准浓度反应液到hER-GRIP1酵母菌液中，制备暴露液；将暴露液接种至96孔板中(200μL/孔)；30℃培养2h后检测600nm处的吸光度值；再将含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液加入到96孔板中；30℃下充分反应后，添加1mol·L^-1的碳酸钠溶液终止反应；在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制E2(即雌二醇)对重组基因酵母hER-GRIP1细胞的β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线。

β-半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u＝(A_S-A_B)/t·V·D·OD_S，式中，u为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间(min)；V为测试体积(mL)；D为稀释因子；OD_S为测试样品在595nm处的吸光度值；A_S为测试样品在420nm处的吸光度值OD₄₂₀；A_B为空白对照在420nm处的吸光度。

上述检测样品的具体步骤为：按照0.5％的比例添加二甲基亚砜(DMSO)溶解的待测样品到hER-GRIP1酵母菌液中，制备暴露液；暴露液接种至96孔板中(200μL/孔)；30℃培养2h后检测600nm处的吸光度值；再将含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液加入到96孔板中；30℃下充分反应后，添加1mol·L^-1的碳酸钠溶液终止反应；在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，来检测待测化合物是否具有雌激素受体诱导活性，即将测得的结果与上述标准曲线比较，进而可以计算出环境样品中类雌激素化合物的含量，从而评价环境中类雌激素化合物的毒性效应。

本发明提供的用于检测环境样品中类雌激素化合物的双杂交酵母以及生物检测方法的优益之处在于：1)ER-GRIP1双杂交酵母细胞能够同时表达雌激素受体蛋白、雌激素受体共激活因子蛋白，支持最新的受体作用理论，最能模拟哺乳动物细胞内雌激素受体的作用机制，且表达基因产生的β-半乳糖苷酶的酶活性易于检测，很适合作为化合物毒性筛选、环境样品类雌激素效应评价方面的试验研究；2)酵母细胞试验快速、简便可以对大量环境样品或化学物质的内分泌干扰物效应进行前期筛选，为活体试验提供基础数据支持，弥补了活体试验试验周期长，费用高的不足；3)添加17β-雌二醇(1×10^-10mol·L^-1)的X-gal缓冲液在菌落转移滤膜分析中的应用，大大的缩短了操作时间，相当程度上减轻了假阳性结果干扰的可能性；4)利用SD/-Trp/-Leu营养缺陷型培养基进行酵母培养，能够有效防止重组酵母细胞的回复突变，减轻传代过程中质粒丢失的情况，使得重组酵母细胞的蛋白表达稳定，试验测试结果之间的平行性较好；5)利用重组雌激素受体基因双杂交酵母进行类雌激素污染物的筛选和毒性毒理研究时，操作简便，省时省力，所需样品量少，成本低廉；6)本发明克隆了人的雌激素受体基因，能够反映环境样品中的类雌激素化合物可能对人体产生的影响；7)与Nishihara文献报道克隆鼠的雌激素受体不同的是，本发明直接克隆人的雌激素受体基因或基因片段构建双杂交酵母，因此在测定环境化合物的雌激素干扰效应时能够直接体外预警化合物对人体内分泌系统可能存在的风险。在技术上采用了更先进的pGBKT7酵母表达质粒和酿酒酵母菌株Y187(Saccharomyces cerevisiae)，使得构建的ER-GRIP1菌株具有更高的灵敏度，其EC₅₀值为7.3×10^-11mol·L^-1，而Nishihara报道为>3×10^-10mol·L^-1。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明，其中：

图1为17β-雌二醇对重组酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线。其中横坐标是17β-雌二醇浓度，纵坐标是17β-雌二醇诱导的β-半乳糖苷酶活性；

图2为利用化学分析、单杂交重组雌激素受体基因酵母和双杂交重组酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)三种方法测试环境样品类雌激素效应的结果；其中横坐标是化学分析结果，纵坐标是单杂交重组雌激素受体基因酵母和双杂交重组酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)方法的测试结果；其中◆表示双杂交酵母细胞株(酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCCNo.2307))；■表示单杂交酵母细胞株；EEQ表示17β-雌二醇当量浓度(pg·L^-1)；YES表示酵母检测方法。

具体实施方式

本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ER-GRIP1已经于2007年12月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行了生物材料保藏，保藏编号为CGMCC No.2307。以下结合实施例具体说明酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)的制备及其在检测环境中类雌激素化合物的生物测试方法中的应用。

实施例1：酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)细胞的制备

1.构建包含雌激素受体基因片段(即SEQ ID No.1所示序列)的pGBKT7-hER酵母表达质粒。

首先设计出雌激素受体配体结合域(hER LBD)的PCR引物，并在上下游引物的5′端分别引入EcoR I和BamH I单一酶切位点，即上游引物P1：5′-TCGCCGGAATTCGCTGGAGACATGAGA-3′(下划线部分为EcoRI的酶切位点)；下游引物P2：5′-TAACGCGGATCC

TCAGACTGTGGCAGG-3′(下划线部分为BamH I的酶切位点)；以含有hER LBD(SEQ ID No.1所示序列)的pASV3质粒(由英国Nottingham大学Heery教授惠赠)2.5ng作为模板进行PCR扩增；PCR产物(0.3pmol)用T4DNA连接酶(1μL)连接于T-载体，构建的T-hER LBD质粒；将pGBKT7(1μg，购自Clontech公司)和T-hER LBD(1μg)质粒分别用EcoRI(1μL)和BamH I(1μL)双酶切，酶切产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分析后切胶回收，pGBKT7(0.03pmol)和hER LBD插入片段(0.3pmol)的回收产物采用T4DNA连接酶(1μL)连接，构建pGBKT7-hER酵母表达质粒。对质粒DNA进行序列测定，测序引物为：5′-TTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTC-3′。

2.纯化包含雌激素受体共激活因子基因片段(即SEQ ID No.2所示序列)的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒。

用10μL靶质粒pGAD424-GRIP1(美国加州大学Stallcup教授惠赠)转化100μL感受态大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆，提取质粒并纯化。0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA大小，同时对质粒DNA进行序列测定，测序引物为pGAD424通用引物(测序工作由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成)。所述含有氨苄青霉素的培养基包含100mg·L^-1氨苄青霉素，10g·L^-1胰蛋白胨，5g·L^-1酵母提取物，10g·L^-1 NaCl，15g·L^-1琼脂糖。

3.构建双杂交的酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)。

同时加入0.1μgpGBKT7-hER质粒和0.1μgpGAD424-GRIP1质粒混合均匀，并加入0.1mL新鲜制备的感受态酿酒酵母细胞Y187(Saccharomycescerevisiae)，200rpm，30℃孵育30min。加入70μL二甲基亚砜(DMSO)混合均匀后，42℃水浴放置15min；细胞迅速转移到冰浴，静置1-2min，构建双杂交的酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)。

4.筛选双杂交的酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)。

在上述方法中，筛选双杂交的酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)时，采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选双杂交酵母，双杂交酵母通过营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)粗筛出阳性菌落，进一步使用菌落转移滤膜分析方法，将菌落影印到无菌的1#干燥滤膜上，液氮反复冻融3～5次，破碎细胞；将1#滤膜置于含17β-雌二醇(1×10^-10mol·L^-1)的X-gal缓冲液的2#滤膜上，30℃孵育直到克隆出现明显的蓝色。显色的菌落即为阳性菌落，阳性菌落继续培养24h后备用。所述SD/-Trp/-Leu包含20mg·L^-1腺嘌呤半硫酸盐，20mg·L^-1盐酸精氨酸，20mg·L^-1一水合盐酸组氨酸，30mg·L^-1异亮氨酸，30mg·L^-1盐酸赖氨酸，20mg·L^-1甲硫氨酸，50mg·L^-1苯丙氨酸，200mg·L^-1苏氨酸，30mg·L^-1酪氨酸，20mg·L^-1尿嘧啶，150mg·L^-1缬氨酸，6.7g·L^-1无氨基酸酵母氮源；X-gal缓冲液为20mg·mL^-1 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基甲酰胺溶液。

实施例2：利用双杂交的酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)测定17β-雌二醇(E₂)的效应来绘制标准曲线。

酵母细胞培养：将制备的双杂交的酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCCNo.2307)细胞接种到SD/-Trp/-Leu液体培养基(组成与实施例1中相同)中，检测菌液600nm处的吸光度值(以培养基为空白)，调节吸光度值为0.1～0.2，30℃空气浴摇床中培养24h后调整菌液600nm处的吸光度值为0.7～0.8。

绘制标准曲线：取菌悬液0.995mL至对应的Eppendorf管中，加入5μLDMSO(空白)或5μL用DMSO溶解的E₂；将以上溶液各200μL依次转移到96孔板中。然后于130rpm，30℃于96孔板摇床振荡培养2h；培养结束后，首先检测600nm处的吸光度值；去除150μL酵母菌液；加入120μL测试缓冲液(每100mL基础缓冲液中加入3.33mL浓度为0.1％的SDS溶液和270μL β-巯基乙醇)和20μL氯仿，在30℃的恒温摇床上预培养10min；再加入40μL邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液(0.04g·L^-1)，启动酶反应，随着进一步的培养，可以逐渐看到培养液呈现越来越强的黄色；30℃下充分反应后(对于17β-雌二醇来说，这样的过程约需要20min)，添加100μL碳酸钠溶液(1mol·L^-1)终止反应；取200μL上清液在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制E₂对重组基因酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)细胞的β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线(图1)。

β-半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u＝(A_S-A_B)/t·V·D·OD_S，式中，u为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间(min)；V为测试体积(mL)；D为稀释因子；OD_S为测试样品595nm处的吸光度值；A_S为测试样品在420nm处的吸光度值OD₄₂₀；A_B为空白对照在420nm处的吸光度。

上述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液包含：21.51g·L^-1Na₂HPO₄·12H₂O，6.22g·L^-1 NaH₂PO₄·2H₂O，0.75g·L^-1 KCl，0.25g·L^-1MgSO₄·7H₂O，0.04g·L^-1邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷。

由图1可知，E2对双杂交的酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)细胞β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线的EC₅₀值为7.3×10^-11mol·L^-1，在2×10^-11～2×10^-10mol·L^-1范围内存在线性关系；与国际报道的E₂在重组酵母系统中EC₅₀为1×10^-11～3×10^-9mol·L^-1之间的结果相符，说明本发明制备的双杂交酵母对于E₂的敏感性与报道的其它方法建立的系统相近，初步表明双杂交雌激素受体基因酵母测评体系可以作为环境中类雌激素化合物的毒性效应的定量分析标准。

实施例3：利用双杂交的酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCC No.2307)生物测试方法评价环境样品的类雌激素污染物毒性。

分别采集某市不同水厂进水、出水作为样品。采用固相萃取的方法，加入二氯甲烷、正己烷提取样品中的类雌激素污染物，将提取到的有机溶剂在高纯氮气中吹干，加入DMSO溶解并制备成在标准曲线线性范围内任一浓度的测试用样品溶液。

利用实施例1中所述的双杂交的酿酒酵母ER-GRIP1(CGMCCNo.2307)生物测试方法评价环境样品的类雌激素污染物毒性，测定结果与单杂交重组雌激素受体基因酵母方法、质谱分析方法的测定结果进行了比较，见图2。

从图2可以看出，无论是单杂交酵母细胞和双杂交酵母细胞生物测试，所得到的结果与质谱分析类雌激素污染物的毒性当量之间有很好的相关关系。双杂交酵母细胞生物测试结果更接近化学分析(即质谱分析)，而且和国际上目前通常采用的单杂交重组基因酵母细胞测试方法有很好的可比性。图2的结果表示可以用本发明提出的方法，判断环境样品中类雌激素污染物的毒性当量或其潜在生态毒性的大小。

序列表

SEQ ID No.1

<110>中国科学院生态环境研究中心

<120>用于检测环境中类雌激素化合物的双杂交酵母以及生物测试方法

<130>DIC07110101

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>942

<212>DNA

<213>人

<400>1

SEQ ID No.2

<210>2

<211>4374

<212<DNA

<213>鼠

<400>2