猪科动物或羊用抗口蹄疫病毒药剂以及猪科动物或羊的口蹄疫的预防或治疗方法

摘要

本发明涉及含有3－氧代－3，4－二氢－2－吡嗪甲酰胺或其盐的猪科动物用抗口蹄疫病毒药剂。该药剂对猪科动物的口蹄疫的预防或治疗极为有效。并且，本发明还涉及含有3－氧代－3，4－二氢－2－吡嗪甲酰胺或其盐的羊用抗口蹄疫病毒药剂。该药剂对羊的口蹄疫的预防或治疗等也极为有效。

说明书

技术领域

本发明涉及含有3-氧代-3，4-二氢-2-吡嗪甲酰胺(以下称T-1105)或其盐的猪科动物或羊(以下称“猪科动物等”)用抗口蹄疫病毒药剂、含有T-1105或其盐的猪科动物等用饲料以及猪科动物等的口蹄疫的预防和治疗方法等的处理方法。

背景技术

口蹄疫是对家畜中的牛、猪及羊等偶蹄类动物传染力很强的疾病之一，会引起家畜的发育障碍、运动障碍等，是使家畜商品价值骤降的家畜特异性感染病，但对人不具感染性。对于世界畜牧业来说，无论是在出口国还是进口国的立场上，口蹄疫都位居最应该警戒且最重要的家畜传染病。

口蹄疫是国际性传染病，目前仍在亚洲、非洲及南美洲等世界各地广为流行。日本也于2000年发生了口蹄疫。一旦口蹄疫发生，由于口蹄疫病毒的传染性极强，对于防止其传播会伴有巨大的困难。一旦口蹄疫发生，对畜牧业的打击将会极其巨大。因此，在包括口蹄疫预防及治疗等的处理上，全世界付出了极大的努力。

控制口蹄疫的对策有，严格的进口管制、卫生管理、检疫的实施以及罹患动物的屠宰，在大流行时，则在地区水平或发病周边区域实施作为预防手段的使用灭活疫苗的预防接种程序。然而，口蹄疫的早期发现很难，且会以非常快的速度传播，疫苗接种无法及时到位。而且病毒容易发生变异，仅以疫苗的接种无法完全防止感染。也就是说，目前并不存在针对偶蹄目动物中猪科动物等的优良的口蹄疫治疗方法。

国际公开第WO00/10569号小册子上记载到，T-1105具有优良的抗流感病毒作用(专利文献1)。然而，对于猪科动物等用的抗口蹄疫病毒药剂以及对猪科动物等的口蹄疫的预防或治疗方法等的处理方法，还未见具体地公开。

专利文献1：国际公开第WO00/10569号小册子

发明内容

发明要解决的课题

优良的猪科动物等用抗口蹄疫病毒药剂以及对猪科动物等的口蹄疫的预防或治疗方法等处理方法受到强烈的需求。

解决课题的方法

在此情况下，本发明人进行了深入研究，结果发现，含有T-1105或其盐的抗口蹄疫病毒药剂对猪科动物具有很强的口蹄疫治疗效果，在对猪科动物的口蹄疫的治疗等的处理方面有效，从而完成了本发明。

进而发现，含有T-1105或其盐的抗口蹄疫病毒药剂对羊(绵羊)具有很强的口蹄疫治疗效果，在对羊的口蹄疫的治疗等的处理方面有效，从而完成了本发明。

发明效果

含有T-1105或其盐的抗口蹄疫病毒药剂在对猪科动物等的口蹄疫的预防和治疗等的处理方面有效。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。

在本说明书中，只要未特别指出，当T-1105或其盐存在溶剂化物和水合物时，也可以使用它们的溶剂化物和水合物。并且，也可以使用各种形状的结晶。

作为T-1105的盐来说，可举出通常已知的在羟基上形成的盐。作为在羟基上形成的盐，可举出：与钠和钾等碱金属形成的盐；与钙和镁等碱土金属形成的盐；铵盐；以及与三甲胺、三乙胺、三丁胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶，N-甲基吗啉、二乙胺、二环己胺、普鲁卡因、二苄胺、N-苄基-β-苯乙胺、1-二苯羟甲胺(ephenamine)、N，N′-二苄基乙二胺等含氮有机碱形成的盐。上述盐中，作为优选的盐，可举出药理学可接受的盐，进一步优选与钠之间的盐。

针对属于口蹄病毒属的口蹄疫病毒，本发明的含有T-1105或其盐的猪科动物等用的抗口蹄疫病毒药剂显示出优良的抗病毒作用。作为口蹄疫病毒，可举出血清型为A、O及C的欧洲型；血清型为Asia 1的亚洲型和血清型为SAT1、SAT2及SAT3的非洲型、以及它们的亚型。

特别是针对血清型为A、O和C、以及出现在亚洲的Asia 1的病毒，本发明的含有T-1105或其盐的猪科动物等用的抗口蹄疫病毒药剂具有更为优良的效果。

本发明中所述的猪科动物是指脊椎动物门哺乳纲偶蹄目猪科动物，具体地，可举出家猪和野猪，特别优选猪。

T-1105或其盐可以经注射用蒸馏水或生理盐水等稀释之后作为注射剂对猪科动物等非口服给药，或者可以按照公知的制剂学制造方法，根据需要使用制剂学允许的稀释剂、赋形剂，制成片剂、大型丸剂、粉末、颗粒剂、细粒剂、胶囊、乳剂、液体制剂、混悬剂、预混剂、糖浆、糊剂或气雾剂等动物用制剂，口服或非口服给药。

对于T-1105或其盐、或者其动物用制剂，可以根据需要使其混合在饲料中使用，例如，可以添加到包括干草、稻草类、牧草类、青刈饲料作物类、根果菜类、野草类、树叶类及青贮饲料等粗饲料；以及谷类、油粕类和复合饲料等浓缩饲料等饲料中使用。并且，可以添加到饮用水等中使用。

作为优选的给药形式，可举出制成包括肌肉注射、皮下注射及腹腔内注射等的注射剂的给药形式以及将T-1105混合在饲料内而混食口服的给药形式。

对于本发明的猪科动物等用的抗口蹄疫病毒药剂以及猪科动物等用饲料，例如，可以将T-1105或其盐用固态或液态的载体通过稀释或包覆等方法进行稳定化，例如制成片剂、大型丸剂、粉末、颗粒剂、细粒剂、胶囊、乳剂、液体制剂、混悬剂、预混剂、糖浆、糊剂或气雾剂等，或者使其分散于载体中之后或者直接添加至饲料或饮料中来制造。作为固体载体，可举出乳糖、蔗糖、淀粉、小麦粉、玉米粉、麸子、大豆油粕、脱脂米糠、菜籽油粕、豆腐粕、纤维素、酵母菌、鱼粉、花生榨渣、贝壳粉及碳酸钙等，作为液态载体，可举出水、生理盐水及生理学上无害的有机溶剂。并且，根据需要，也可以添加诸如乳化剂、分散剂、助悬剂、润湿剂、浓缩剂、胶凝剂及增溶剂等的辅助剂。本发明药剂也可以是预混合的形式。此外，也可以配合防腐剂、灭菌剂、驱虫剂、抗氧化剂、着色剂、芳香剂、抗菌剂、抗生素、酶制剂、乳酸菌制剂、退热剂、镇痛剂和消炎剂等。也可以配合其他动物药。而且，可以配合各种维生素类、矿物类及氨基酸类等。

本发明的猪科动物等用的抗口蹄疫病毒药剂是以口蹄疫的预防或/和治疗等处理为目的给药至猪科动物等家畜或动物的。尤其优选应用于猪。

对于给药剂量，可以根据对象动物的年龄、体重、症状和给药途径进行适当选择，举例来说，可以相对于动物的体重以1天1～2000mg/kg的剂量分1次至多次给药。也可以根据症状增加给药次数。另外，对给药期间无特别限制，但一般通过1～10天的给药就能获得足够的效果，且也可以间断性的给药。

实施例

下面，列举试验例对本发明进行说明，但本发明并不限定于此。本发明的T-1105或其盐可以通过购买市售品得到，或者通过公知方法或基于公知方法的方法以及将这些方法进行组合来制造。另外，试验例1～3是在独立行政法人、农业·食品产业技术综合研究机构、动物卫生研究所(东京都)实施的。

试验例1体外抗口蹄疫病毒作用

(1)测定T-1105对口蹄疫病毒(O/JPN/2000株)的效果。

将口蹄疫病毒(O/JPN/2000株)吸附(37℃，1小时)于猪源肾脏继代细胞，以达到约30～100个/盘。除去病毒液，用已调节为pH7.4的MEM培养基进行清洗之后，覆盖将T-1105从20μg/mL经二次稀释的含有2％牛血清加1.5％甲基纤维素的MEM培养基。培养3天，并用含0.2％结晶紫的10％中性缓冲福尔马林将细胞固定后，进行染色，对空斑进行计数。与未添加药剂组的空斑数进行比较，求得50％空斑形成抑制率(IC₅₀)。

结果为1.6μg/mL。

(2)测定T-1105对口蹄疫病毒(A、C及Asia 1)的效果。

A、C和Asia 1的病毒浓度分别为10TCID₅₀、10TCID₅₀和10^1.5 TCID₅₀，将病毒吸附于IBRS-2细胞(37℃，1小时)后，添加被从20μg/mL二次稀释了的T-1105，48小时之后用含0.2％结晶紫的10％中性缓冲福尔马林将细胞固定后，进行染色。在各个浓度上，如果4孔中1孔以上观察到对细胞病变效果的抑制，则该浓度判定为有效。

结果示于表1。

[表1]

T-1105显示了针对口蹄疫病毒的优良的效果。

试验例2(1)T-1105的药代动力学试验(猪、牛)

对猪(普通级，体重10kg，2头)以及牛(日本黑毛和牛，体重200kg，2头)进行了1％T-1105复合饲料的口服给药，给药剂量为100mg/kg。在给药后2小时和8小时，用经肝素润洗的注射筒从各动物的颈静脉采血1.5mL，然后迅速进行离心分离(4℃，2000rpm，10分钟)，将250μL血浆分别注入到1.5mL微管内。以使用了空白血浆的标准曲线为基础，测定了T-1105的浓度。其中，为制作标准曲线，向200μL空白血浆中添加5倍浓度的T-1105溶液50μL，实施与血浆前处理操作相同的操作。分别向250μL血浆试样和250μL标准曲线用血浆试样中添加500μL甲醇并搅拌，并将所得溶液进行离心分离(10000rpm，4℃，10分钟)。收集上清液，经除蛋白处理之后，进行减压干燥。用500μL的HPLC流动相溶解残渣，并进行离心分离(3000rpm，10℃，10分钟)，收集上清液，作为测定样品。以下述HPLC条件进行测定。

分析柱：Develosil ODS-MG-5(4.6mm I.D.×250mm)，野村化学株式会社制

保护柱：Develosil ODS-MG-5(4.0mm I.D.×10mm)，野村化学株式会社制

柱温：40℃

HPLC流动相：甲醇/1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)/蒸馏水/TBA-Br(50:50:900:1.6，v/v/v/w)

流速：1.0mL/min

检测波长：350nm

进样量：100μL

自动进样器温度：预设温度10℃

分析时间：约18分钟

制作标准曲线，由峰面积求取血浆试样中各个个体的T-1105浓度，并计算其平均值。

试验例2(2)T-1105的药代动力学试验(羊)

对羊(考力代羊，体重63kg和67kg，2头)进行了1％T-1105复合饲料的口服给药，给药剂量为100mg/kg。在给药后的2小时及8小时，使用经肝素润洗的注射筒从各个个体的颈静脉采血1.5mL，然后迅速进行离心分离(4℃，2000rpm，10分钟)，将250μL血浆分别注至1.5mL微管中。向血浆试样中添加500μL甲醇并搅拌，并进行离心分离(10000rpm，4℃，10分钟)。收集上清液，经除蛋白处理之后，进行减压干燥。用500μL的HPLC流动相溶解残渣，并进行离心分离(3000rpm，10℃，10分钟)，收集上清液，作为测定样品。以与试验例2(1)相同的条件进行测定。

用标准液制作标准曲线，由峰面积求出血浆试样中各个个体的T-1105浓度，并计算其平均值。

试验例2(1)和(2)的结果示于表2。

[表2]

T-1105在猪及羊体内维持了高血药浓度，显示了优良的药代动力学性能。

试验例3混食给药的有效性试验

使用猪全身感染模型评价了T-1105对口蹄疫的治疗效果。

对猪(普通级，体重10kg，给药组2头(猪编号1和2)、非给药组2头(猪编号3和4))将口蹄疫病毒10⁶ TCID₅₀接种于前肢足垫处，以诱发感染。

在接种病毒1小时前按200mg/kg的剂量进行T-1105的口服混食给药，在之后的6.5天期间，1天2次(400mg/kg/天)给药。在接种病毒后8天内观察临床症状的变化。同时，在接种病毒后3天内，测定血浆和鼻拭子中病毒量的变化。

临床症状的变化示于表3，血浆中的病毒量示于表4，鼻拭子中的病毒量示于表5。

[表3]

-：无异常，+：跛行，++：不能站立

T-1105非给药组在接种病毒第2天以后，出现跛行、站立困难，足上形成水泡；与此相比，T-1105给药组的动物均未出现外观上的任何变化。

[表4]

单位：TCID₅₀/μL

T-1105非给药组的血浆中病毒量急剧增加，而T-1105给药组的血浆中病毒量在检出限以下。

T-1105在猪全身感染模型中显示出优良的治疗效果。

[表5]

单位：TCID₅₀/1μL鼻拭子液

T-1105非给药组的鼻拭子中病毒量急剧增加，而T-1105给药组的鼻拭子中的病毒量几乎未增加。

T-1105在猪全身感染模型中显示出优良的治疗效果。

而且，T-1105给药组的猪在给药期间未发现有中毒的现象。

试验例4细胞毒性作用

将含有规定浓度T-1105的培养液以100μL/孔的量添加至96孔板(IWAKI公司制)上。接着，用培养液调配Vero细胞浓度至2×10⁴个/mL，将所得液体按100μL/孔的量植入，在37℃、5％二氧化碳的条件下培养4天。培养结束时，按照XTT法(例如，癌症研究(CANCER RESEARCH)，第48卷，p.4827-4833(1988年)等)测定活细胞数。

T-1105的50％细胞生长抑制浓度(IC₅₀)为250μg/mL以上。

由上述结果可知，T-1105安全性高，且作为猪科动物等用的抗口蹄疫病毒药剂，在由口蹄疫病毒引起的口蹄疫的治疗上有效。

制剂例1片剂

将10g的T-1105与4.4g乳糖、4.4g结晶纤维素、1.0g羧甲基淀粉钠及0.20g硬脂酸镁混合，并将混合粉末压片，使每片重200mg，得到每片含100mg T-1105的片剂。

制剂例2(复合饲料)

将30g的T-1105与2970g猪用市售饲料(JA全农制)混合，得到1％T-1105复合饲料3000g。在复合饲料中T-1105稳定，24小时不分解。

产业实用性

含有T-1105或其盐的抗口蹄疫病毒药剂在对猪科动物等的口蹄疫的预防或治疗等的处理上有效。