钙离子化介孔二氧化硅纳米粒基因传递系统及其制法

摘要

一种钙离子化介孔二氧化硅纳米粒基因传递系统，它是一种钙离子化的介孔二氧化硅纳米粒结合DNA质粒的基因传递系统，其中按质量比计，钙离子化介孔二氧化硅纳米粒∶DNA质粒＝0.5～50∶1。钙离子化介孔二氧化硅纳米粒与未修饰的二氧化硅纳米粒相比，经电泳实验及干细胞转染实验说明其对质粒DNA的结合效果更佳。钙离子化修饰二氧化硅纳米粒与传统的表面改性方法相比，更加简单。本发明公开了其制法。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及基因传递系统，具体涉及一种钙离子化介孔二氧化硅纳米粒的基因传递系统。

背景技术

无论在基因表达调控，还是在基因治疗研究方面，基因传递系统(gene deliverysystems，GDS)都起着非常重要的作用。常用的GDS通常包括了病毒及非病毒两大类，虽然病毒型GDS转染效率高，但由于该系统存在自身局限性，如：能诱导宿主免疫反应、具有潜在的致瘤性、装载容量有限、代价高等，特别是1999年基因治疗临床试验中，出现首例运用腺病毒载体致人死亡的严重后果，其安全性问题迫使人们对病毒型GDS的选择持更为谨慎的态度，目前，在严格控制病毒型GDS临床应用的同时，人们把注意力和希望逐步转向非病毒GDS的研究和应用。介孔二氧化硅纳米粒作为一类新型的药物载体材料，因其具有性质稳定、生物相容、无毒、可“官能化”等特点而倍受人们关注。从DNA-纳米粒的形成过程看，一般由带负电荷的DNA与带正电荷的材料通过静电作用结合而成，对于带负电荷或电荷较弱的介孔二氧化硅纳米粒，必须先阳离子化修饰以提高其电位，已有的方法主要包括胺基偶联[参见：Roy I，Ohulchanskyy TY，Bharali DJ，et al.Opticaltracking of organically modified silica nanoparticles as DNA carriers：a nonviral，nanomedicine approach for gene delivery.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(2)：279.]、阳离子聚合物包裹[参见：Fuller J E，Gregory T Z，Ferreira L S.Intracellular deliveryof core-shell fluorescent silica nanoparticles[J].Biomaterials，2008，29：1526.]等。

本发明则提供了一种更为简便的修饰工艺，即在成功制备了介孔二氧化硅纳米粒后，利用其多孔、比表面积和孔体积大的特点，先吸附钙离子使其钙离子化，再与DNA结合，形成DNA-二氧化硅纳米粒，具体见工艺流程图。

发明内容

本发明采用简单的钙离子化技术，提供了一种基于二氧化硅空心纳米粒基因传递系统的对质粒DNA结合性能更好的新型基因传递系统。

本发明的技术方案如下：

一种钙离子化介孔二氧化硅纳米粒基因传递系统，它是一种钙离子化的介孔二氧化硅纳米粒结合DNA质粒的基因传递系统，其中按质量比计，钙离子化介孔二氧化硅纳米粒:DNA质粒＝0.5～50:1。

一种制备钙离子化介孔二氧化硅纳米粒基因传递系统的方法，它基本上由下列步骤组成：

步骤1.取20-80ml环己烷，加入NP-10 4-8ml，混匀；加入1-3ml正己醇，25.6％氨水1-3ml，室温搅拌1h；缓慢滴加正硅酸四乙酯3-5ml，室温搅拌24h；加入无水乙醇40-80ml，超声1h；在15000rpm，离心15min，沉淀用蒸馏水洗三次；加入适量水冷冻干燥，得到二氧化硅纳米粒粉末8g-32g。

步骤2.取1-3g二氧化硅纳米粒加入0.6M Na₂CO₃ 1000-3000ml，60℃-70℃，200W分别超声4-5分钟，15000rpm，离心15min，蒸馏水洗涤三次；加入10ml蒸馏水，冷冻干燥，得到二氧化硅空心纳米粒。

步骤3.取二氧化硅空心纳米粒20mg加入2mol/L CaCl₂溶液0.5-2ml，室温振摇后得到钙离子化介孔二氧化硅纳米粒。。

步骤4.取钙离子化介孔二氧化硅纳米粒10μl，加入0.2-4μgDNA质粒，4℃，24小时振摇。得到钙离子化介孔二氧化硅纳米粒-DNA的复合物的基因传递系统。

有益效果

钙离子化介孔二氧化硅纳米粒与未修饰的二氧化硅纳米粒相比，经电泳实验及干细胞转染实验说明其对质粒DNA的结合效果更佳。钙离子化修饰二氧化硅纳米粒与传统的表面改性方法相比，更加简单。

附图说明

图1：钙离子化介孔二氧化硅纳米粒透射电镜图；

图2：纳米粒能谱图，其中A为介孔二氧化硅纳米粒能谱图；B为钙离子化介孔二氧化硅纳米粒能谱图；

图3：不同类型纳米粒-DNA复合物电泳图，其中，A为游离质粒DNA，B为介孔二氧化硅纳米粒-DNA复合物，C为钙离子化介孔二氧化硅纳米粒-DNA复合物；

图4：干细胞转染结果图，其中，A为介孔二氧化硅纳米粒-DNA复合物转染结果，B为钙离子化介孔二氧化硅纳米粒-DNA复合物转染结果。

具体实施方式

以下实施例所用材料和仪器：

实验材料：环己烷(国药集团化学试剂有限公司)；正硅酸四乙酯(国药集团化学试剂有限公司)；NP-10(上海嘉方贸易有限公司)；氯化钙(国药集团化学试剂有限公司)

实验仪器：电动搅拌器JJ-1(金坛市大中仪器厂)；超低温高速离心机(Heareus，德国)；H66025超声清洗机(无锡超声电子设备厂)；JEM-2100透射电子显微镜(日本电子)；JSM-7001F能谱分析仪(日本电子)

实施例一

取30ml环己烷，加入0.01M NP-10 4ml，混匀；加入1ml正己醇，25.6％氨水1ml，室温搅拌1h；缓慢滴加0.02M正硅酸四乙酯3ml，室温搅拌24h；加入无水乙醇40ml，超声1h；在15000rpm，离心15min，沉淀用蒸馏水洗三次；加入适量水冷冻干燥，得到二氧化硅纳米粒粉末。

取2g二氧化硅纳米粒加入0.6M Na₂CO₃ 1000ml，60℃，200W超声4分，15000rpm，离心15min，蒸馏水洗涤三次；加入10ml蒸馏水，冷冻干燥，得到介孔二氧化硅纳米粒(见图1)。

取介孔二氧化硅空心纳米粒20mg加入2M CaCl₂ 0.5ml，室温振摇后得到钙离子化介孔二氧化硅纳米粒，钙离子化后出现明显的钙元素峰(见图2B)。

取钙离子化介孔二氧化硅纳米粒10μl，加入0.2μg质粒，4℃，24小时振摇。得到钙离子化介孔二氧化硅纳米粒-DNA的复合物。

实施例二

取80ml环己烷，加入0.01M NP-10 8ml，混匀；加入3ml正己醇，25.6％氨水3ml，室温搅拌1h；缓慢滴加0.02M正硅酸四乙酯5ml，室温搅拌24h；加入无水乙醇80ml，超声1h；在15000rpm，离心15min，沉淀用蒸馏水洗三次；加入适量水冷冻干燥，得到二氧化硅纳米粒粉末。

取3g二氧化硅纳米粒加入0.6M Na₂CO₃ 2000ml，65℃，200W分别超声4分，15000rpm，离心15min，蒸馏水洗涤三次；加入10ml蒸馏水，冷冻干燥，得到二氧化硅空心纳米粒。

取二氧化硅空心纳米粒20mg加入2M CaCl₂ 0.8ml，室温振摇后得到钙离子化介孔二氧化硅纳米粒。

取钙离子化介孔二氧化硅纳米粒10μl，加入1.5μg质粒，4℃，24小时振摇。得到钙离子化介孔二氧化硅纳米粒-DNA的复合物。

实施例三

取50ml环己烷，加入0.01M NP-10 5ml，混匀；加入1.5ml正己醇，25.6％氨水2ml，室温搅拌1h；缓慢滴加0.02M正硅酸四乙酯3ml，室温搅拌24h；加入无水乙醇50ml，超声1h；在15000rpm，离心15min，沉淀用蒸馏水洗三次；加入适量水冷冻干燥，得到二氧化硅纳米粒粉末20g。

取3g二氧化硅纳米粒加入0.6M Na₂CO₃ 3000ml，70℃，200W分别超声4分30秒，15000rpm，离心15min，蒸馏水洗涤三次；加入10ml蒸馏水，冷冻干燥，得到二氧化硅空心纳米粒。

取二氧化硅空心纳米粒20mg加入2M CaCl₂ 1.2ml，室温振摇后得到钙离子化介孔二氧化硅纳米粒。

取钙离子化介孔二氧化硅纳米粒10μl，加入1.5μg质粒，4℃，24小时振摇。得到钙离子化介孔二氧化硅纳米粒-DNA的复合物。

实施例四

取60ml环己烷，加入0.01M NP-10 5ml，混匀；加入1ml正己醇，25.6％氨水1.5ml，室温搅拌1h；缓慢滴加0.02M正硅酸四乙酯5.5ml，室温搅拌24h；加入无水乙醇70ml，超声1h；在15000rpm，离心15min，沉淀用蒸馏水洗三次；加入适量水冷冻干燥，得到二氧化硅纳米粒粉末。

取2g二氧化硅纳米粒加入0.6M Na₂CO₃ 1000ml，70℃，200W分别超声5分，15000rpm，离心15min，蒸馏水洗涤三次；加入10ml蒸馏水，冷冻干燥，得到二氧化硅空心纳米粒。

取二氧化硅空心纳米粒20mg加入2M CaCl₂ 2ml，室温振摇后得到钙离子化介孔二氧化硅纳米粒。

取钙离子化介孔二氧化硅纳米粒10μl，加入4μg质粒，4℃，24小时振摇。得到钙离子化介孔二氧化硅纳米粒-DNA的复合物。

实施例五

1.制备1％的琼脂糖凝胶，加入0.5μg/ml溴化乙锭，铺板，加样，在100V电泳1h后采用凝胶成像系统观察结果。如图3所示，钙离子化的介孔二氧化硅纳米粒能够较好的结合质粒DNA，而未修饰的介扎二氧化硅纳米粒结合能力较差。

琼脂糖DNA电泳实验步骤：

步骤1.制备1％琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0％琼脂糖凝胶液。

步骤2.胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板.将内槽放入卡槽内，并在固定位置放好梳子。冷却到65℃左右，向琼脂糖凝胶液中加入0.5μg/ml溴化乙锭，混匀，小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。

步骤3.加样：在点样板上混合DNA复合物样品和上样缓冲液，用10μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内。

步骤4.电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

步骤5.电泳完毕后，取出凝胶，再用清水漂洗10min。

步骤6.观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。可见钙离子化介孔二氧化硅纳米粒对质粒DNA具有明显的吸附作用(见图3C)

2.以GFP质粒为报告基因，按照实施例一所述制备钙离子化介孔二氧化硅纳米粒-DNA复合物。二十四孔板培养SD大鼠骨髓干细胞，细胞浓度达2.5×10⁵/ml完全培养基/孔，孵育24h后，用无血清培养基置换原培养基，加入钙离子化介孔二氧化硅纳米粒-DNA复合物/介孔二氧化硅纳米粒-DNA复合物，使每孔质粒DNA量均为2μg，孵育4h后，置换新鲜的含血清培养基，继续孵育48h，荧光倒置显微镜观察。如图4所示，介孔二氧化硅纳米粒-DNA复合物的转染效率几乎为零，钙离子化介孔二氧化硅纳米粒-DNA复合物的转染效率有所提高。结果表明，经钙离子化后的介孔二氧化硅纳米粒转染效率较未修饰的介孔二氧化硅纳米粒有所提高。

细胞转染实验步骤

步骤1.干细胞的分离及培养：将SD大鼠拉颈处死，体积分数为75％乙醇浸泡3～5min，无菌条件下取出胫骨和股骨；将其两端干骺端切除，显露骨髓腔，用无菌注射器吸取适量PBS彻底冲洗骨髓腔；反复吹打冲出的骨髓，使骨髓细胞充分分散；所获骨髓单细胞悬液沿管壁缓慢滴加于预置的Percoll分离液(相对体积质量1.073)的离心管中，骨髓单细胞悬液与分离液的比例为1:1；2000rpm，离心20min，吸取中间云雾状细胞层，用PBS洗涤3次；重新悬起细胞，加入完全培养基(含体积分数为10％胎牛血清的DMEM)，置于培养瓶中，37℃体积分数为5％的CO₂培培养箱中培养。

步骤2.细胞转染：

二氧化硅纳米粒的转染：

取二氧化硅纳米粒-DNA的复合物(20μg/ml)分别加至24孔板中(2.5×10⁵/孔)并轻轻摇动使均匀混合；放置37℃CO₂培养箱孵育24-48h，以报告基因转染效率作为对照。

钙离子化二氧化硅纳米粒的转染：

取钙离子化二氧化硅纳米粒-DNA的复合物(20μg/ml)分别加至24孔板中(2.5×10⁵/孔)并轻轻摇动使均匀混合；放置37℃CO₂培养箱孵育24-48h，以报告基因转染效率作为对照。