用于棘球白素类药物耐药性的检测法

摘要

本发明提供了一种分析真菌基因FKS1的两个短部分的突变的核酸扩增检测法。这些靶序列中的突变显示出与棘球白素类药物的耐药性的相关性。该检测法可包括通过测序检测或通过标记的杂交探针检测。还提供了进行这种检测的引物、探针和试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及真菌的核酸检测法。

发明背景

真菌感染是重症患者发病和死亡的重要原因，并且由于无法迅速诊断和有效治疗而加重感染后果。抗真菌药物的普遍使用导致对天然耐药的真菌菌种的选择效应，并且敏感菌种也出现耐药性。有效的抗真菌药物的种类很少，阻碍了真菌疾病的治疗。近来，卡泊芬净作为第一个新型棘球白素(echinocandin)药物应用于临床，这类药物阻断β-(1→3)-D-葡聚糖合酶而定向作用于真菌细胞壁。随着卡泊芬净的使用迅速增加，目前已有报道念珠菌(Candida)的临床分离群在体外的敏感性降低，治疗失败与体外最低抑菌浓度值或MIC较高之间密切相关。随着患者使用卡泊芬净增加，以及其他棘球白素类药物包括micafungin和阿尼芬净上市销售，预计MIC值提高的临床分离群的数目会越来越多。

本发明的一个方面是核酸检测法，检测与包括但不限于念珠菌(Candida)的真菌中与棘球白素类药物耐药性相关的遗传突变。

本发明的另一方面是进行特定区域的指数式核酸扩增的核酸检测法，该区域编码FKS1蛋白，并优选结合序列测定或使用标记的等位基因识别探针进行检测。

本发明的又一方面是引物和探针的寡聚核苷酸组和试剂的试剂盒，用于进行上述实验。

发明概述

棘球白素类为近年来上市销售的新型主要用于抗真菌的药物。真菌细胞壁必须保持完整，结构缺失甚至发生某些明显改变，真菌就无法生存。细胞壁为层状结构的细胞外基质，由外层的糖蛋白与内层的糖聚合物包括葡聚糖、壳多糖和半乳甘露聚糖组成。在腐生性真菌和致病性真菌中，糖层主要包括β(1→3)-葡聚糖和(1→3)-葡聚糖，但也含有一些β(1→6)-葡聚糖和壳多糖。真菌细胞壁释放葡聚糖作为胞外聚合物(exopolymers)进入感染真菌患者的血液中，已知其激发广泛的先天免疫反应。真菌细胞壁是一种动态结构，在细胞壁的生物合成中组成性聚合物不断的进行化学修饰和重排。例如Fks1p是生成β(1-3)葡聚糖的葡聚糖合酶复合物的推定催化亚基，已知其共定位(co-localized)于皮质肌动蛋白斑内。其向细胞表面移动到达细胞壁结构重塑位点，具有固定Fks1p的细胞的细胞壁的结构和功能均有缺陷。Fks1p是FKS1基因的产物。棘球白素类为通过N-连接到脂肪酰基侧链的环状六肽，抑制负责大多数细胞壁生物聚合物生物合成的β(1→3)-D-葡聚糖合酶。棘球白素类药物、卡泊芬净、micafungin和阿尼芬净为新型抗真菌化合物，作用于真菌细胞壁定向阻断β-1，3-D-葡聚糖合酶。卡泊芬净是该类第一个被批准的药物，近来许多研究评价在治疗真菌感染中的安全性和耐受性，证明在临床上或实验室中对大多数患者没有严重的药物不良反应。

这些药物对念珠菌(Candida)和曲霉菌(Aspergillus spp)具有广谱抗真菌活性，与目前所用抗真菌药物没有交叉耐药性，因而对耐受唑类药物的酵母菌和霉菌均有效。重要的是由于其特异性作用于细胞壁，棘球白素类对酵母菌具有杀菌作用。它们对霉菌有效，但仅抑制菌丝的生长锥。但是它们几乎不抑制侵袭性接合菌亚纲(Zygomycetes)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)或镰刀菌(Fusarium spp)。然而其在临床上非常有效的抑制曲霉菌(Aspergillusspp)。美国及其它国家已经批准卡泊芬净用于治疗许多严重的真菌感染，包括顽固性或不耐受其它治疗的曲霉病患者，食道念珠菌病、念珠菌血症及其它念珠菌感染(包括腹内脓肿、念珠菌性腹膜炎、胸膜间隙感染)。卡泊芬净也用于疑似真菌感染的持续发热与中性白细胞减少患者的经验治疗。目前广泛使用卡泊芬净，与三唑类药物如伏立康唑联用，主要用于抗酵母菌和霉菌的抗真菌治疗。紧密相关的药物micafungin和阿尼芬净的上市将近一步扩大这类高效的新型药物在临床上的使用范围。

自从2002年批准第一个棘球白素上市销售以来，卡泊芬净在临床上的使用越来越多，特别是在美国卡泊芬净近来已扩展使用到包括食道念珠菌病、念珠菌血症及其它念珠菌感染，以及经验治疗上。已经描述了对卡泊芬净的体外敏感性降低的念珠菌临床分离群，并且注意到在体内治疗失败与体外卡泊芬净MIC值提高有关，虽然尚未确定最低抑菌浓度(MIC)与临床疗效的严格相关性。随着患者使用卡泊芬净增加，以及micafungin(2005年6月)和阿尼芬净上市销售，预计MIC值提高的临床分离群的数目会越来越多，并且由于药物敏感性降低导致治疗失败的患者也会越来越多。

本发明包括核酸检测法，用于检测真菌例如酵母菌的念珠菌(Candida)属和霉菌的曲霉菌(Aspergillus)属的突变，产生对棘球白素类药物包括卡泊芬净、micafungin和阿尼芬净的耐药性。检测适用于含有或怀疑含有真菌的任何样品，包括但不限于得自人的样品，例如血、尿或组织样品。念珠菌(Candida)种类包括白色念珠菌(C.albicans)、克柔念珠菌(C.krusei)、高里念珠菌(C.guillermondii)、光滑念珠菌(C.glabatra)、热带念珠菌(C.tropicalis)及近平滑念珠菌(C.parapsilosis)。曲霉菌(Aspergillus)种类包括烟曲霉菌(A.fumigatus)、黄曲霉菌(A.flavus)、黑曲霉菌(A.niger)、构巢曲霉菌(A.nidulans)和土曲霉菌(A.terreus)。检测靶标为FKS1p蛋白家族中一个或优选两个保守区域对应的核酸(DNA、RNA)序列。对应于CaFks1p中Phe₆₄₁至Pro₆₄₉的氨基酸序列的区域，我们称为第一区或HS1。本发明检测的核酸靶序列对应于保守区域，但是可能对应于每个保守区域的一个末端或两个末端上的一个、两个或少数几个，最多达5个的另外的氨基酸。对应于CaFks1p中Asp₁₃₅₇至Leu₁₃₆₄的氨基酸序列的区域，我们称为第二区或HS2。本发明检测的核酸靶序列与保守区域相对应，但也可对应于末端上的其它的氨基酸，从CaFks1p的第1345位氨基酸到Leu₁₃₆₄外延超出的一个、两个或多达5个氨基酸，例如从1345至1369位氨基酸。使用实验室菌株及临床分离群，在那些区域内，我们已经鉴别出许多产生棘球白素耐药性的突变。在实验室菌株中，我们使用CAI4和M70(参见实施例2)及我们制备的实验室突变体(本文指定为“NR”株，实施例NR2)。从实验室菌株和临床分离群，我们鉴别出许多引起耐药性的单一氨基酸改变，包括F641L、F641S、S645P、S645Y、S645F、D648Y、P649H、R1361H和R1361G，以及许多负责氨基酸改变的SNPs。

本发明实验包括核酸序列的扩增，这些核酸序列包括上述靶序列，即核酸靶序列，也就是对应于或编码上述氨基酸序列的DNA或RNA。可用任何指数式扩增方法，包括例如PCR(聚合酶链式反应)(参见美国专利第4,965,188号和已公开的申请WO 03/054233A1)、LCR(连接酶链式反应)、NASBA基于核酸序列的扩增)、SDA(链置换扩增)、3SR(自动维持序列扩增)、TMA(转录介导的扩增)和Qβ复制酶介导的扩增，上述所有技术均为本领域所熟知。

可通过任何方法检测扩增的靶序列内的突变，包括但不限于序列测定方法和使用标记的杂交探针检测。序列测定方法包括例如传统的双脱氧序列测定以及焦磷酸测序，二者均为本领域中已知的技术。利用杂交探针检测，可扩增后检测即终点检测，或实时检测即在扩增过程中检测。利用杂交探针实时检测方法包括美国专利第5,487,972号和美国专利第5,538,848号中所述的5′核酸酶检测方法；利用在美国专利第5,925,517号中所述的分子信标(molecular beacon)探针检测；使用FRET探针对检测；使用在Li，Q.等(2002)“A New Class ofHomogeneous Nucleic Acid Probes Based on Specific DisplacementHybridization(一种新型的基于特异性置换杂交的均相核酸探针)”，Nuc.Acid Res.30：(2)c5中所述的双链探针检测；使用在Afonia等(2002)“Minor Groove Binder-Conjugated DNA Probes for Quantitative DNADetection by Hybridization-Triggered Fluorescence(小沟结合剂缀合的DNA探针，用于通过杂交激发的荧光定量检测DNA)”Biotechniques 32：946-9中所述的小沟结合(MGB)探针检测。

本发明的探针检测方法使用至少一种等位基因识别探针，也就是说在检测条件下，该探针与一个等位基因(例如野生型序列)杂交并产生信号，而不与另一个等位基因(例如突变体等位基因)杂交。等位基因识别探针通常具有相当短的结合序列，典型的长度不超过25个核苷酸，经常比25个核苷酸少5-10个核苷酸。本发明的耐药突变体检测可使用一个或多个探针检测整个靶序列。多探针(Multiple probes)也可用于鉴别特定的突变，即一个探针特异靶向于特定核苷酸位点产生的或怀疑产生的一个突变。多探针检测可包括每个扩增含有一种探针的平行扩增(parallel amplifications)，也包括部分或全部复合式(multiplexed)检测，其中每个反应器包括两种或多种不同探针。

本发明的检测试剂盒包括探针和扩增引物。通常引物不作为指示探针，但是并非不能具有这种作用。例如所谓的“蝎形”引物包括连接的发夹或分子信标、探针。Whitcombe等(1994)＂Detection of PCRProducts Using Self-Probing Amplicons and Fluorescence，＂(使用自身探针扩增子和荧光检测PCR产物)Nat.Biotechnol.117：804-807。检测试剂盒优选包括扩增和检测所需的所有试剂，至少包括需要的引物、探针、聚合酶和dNTPs。检测试剂盒可包括用于其它目的，例如对照组寡聚核苷酸扩增的引物和探针。试剂盒也可包括样品制备试剂。

本发明也包括至少包括检测所需的引物和探针在内的寡聚核苷酸组。在这个组中可任选包括对照组寡聚核苷酸。

本发明的一个或多个实施方案详细描述于附录的图表及下述说明书中。本发明的其它特征、目标和优点自说明书和图表及权利要求书是显而易见的。

在本申请书中，使用了部分缩写。

GS是葡聚糖合酶的缩写。

Fks1p是Fks1蛋白的缩写，目前指负责β(1-3)-葡聚糖生成的葡聚糖合酶复合物的催化亚基。

FKS1为编码Fks1p的基因。

CaFks1p为白色念珠菌的Fks1蛋白。

CaFKS1为白色念珠菌的FKS1基因。

Ser₆₄₅是氨基酸的常规命名方法，此例指丝氨酸及在蛋白质中它的位置。在CaFks1p中，丝氨酸是第645位氨基酸。

S645P指示一个突变，第一个字母指野生型蛋白质中的氨基酸(此例“S”指丝氨酸)，接着是氨基酸位置(在此例中“645”指野生型的Ser₆₄₅)，最后是指突变的氨基酸(此例中“P”指脯氨酸)。

T1933C指在第1933位核苷酸的基因突变，T突变为C。在基因CaFKS1，第1933位核苷酸存在于编码CaFks1p的Ser₆₄₅三联体密码中，这种突变导致氨基酸改变。

SNP是“单核苷酸多态性”的缩写。

附图简述

图1A和1B显示CaFKS1的基因序列(GenBank检索号D88815)，包括加下划线的使对棘球白素敏感性降低的突变区域。

图2显示CaFks1p的氨基酸序列(GenBank检索号BAA21535)，包括加下划线的使对棘球白素敏感性降低的突变区域。

图3显示酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)Fks1p的氨基酸序列与白色念珠菌(Candida albicans)Fks1p的氨基酸序列的序列比对。

图4显示实施例中利用的引物、探针和试探靶(probe targets)的序列。

图5显示杂合子样品的实时PCR检测荧光曲线图。

图6A-6D为纯合子样品的实时PCR检测荧光曲线图。

图7显示作为多重实时检测的检测结果的格式(format)。

发明详述

真菌的FKS1基因转录为相应信使RNA(mRNA)，再翻译为1，3-β-D-葡聚糖合酶(GS)亚基Fks1p。设计本发明实验检测各种真菌中保守的两个短基因区域中的一个或两个区域。已知念珠菌和一些曲霉菌物种的氨基酸序列及其对应的基因序列。

现有CaFKSl的几条序列。为了设计扩增引物和探针，我们使用3条序列：GenBank检索号D88815、F027295和CA2043。图1A和图1B代表核苷酸序列D88815。图2代表CaFks1p的氨基酸序列。本发明实验靶序列包括的两个短DNA序列在图1A和图1B中下面加有下划线。对于CaFKS1，那些序列指自T1921至T1947和自G4069至G4092的核苷酸序列。图2中相应的CaFks1p的短核苷酸序列加有下划线。这些序列指自F(Phe)641至P649和自D1357至L1364的氨基酸序列。

为了定位不同真菌产生的Fks1蛋白的氨基酸序列，用常规序列比对显示定位。图3说明白色念珠菌和酿酒酵母菌(S.cerevisiae)的序列比对。线的上方是白色念珠菌的野生型CaFks1p蛋白从第641位氨基酸(Phe₆₄₁)到第649位氨基酸(Pro₆₄₉)的一段序列。该段序列非常类似于酿酒酵母菌Fks1p的从第639位氨基酸(Phe₆₃₉)到第647位氨基酸(Pro₆₄₆)的氨基酸序列。线的下方是白色念珠菌的野生型CaFks1p蛋白从第1357位氨基酸(ASp₁₃₅₇)到第1364位氨基酸(Leu₁₃₆₄)的一段序列。该段序列非常类似于酿酒酵母菌Fks1p的从第1353位氨基酸(Asp₁₃₅₃)到第1360位氨基酸(Leu₁₃₆₀)的氨基酸序列。其他真菌种类的Fks1蛋白可进行类似的序列比对。

对每个物种相关氨基酸序列的描述有利于本领域技术人员确定氨基酸序列相应的基因序列。另外对于每个物种相关氨基酸序列定位的描述有利于本领域技术人员定位其他物种对应的氨基酸序列，从而定位其相应的基因序列；对于一个物种相关基因序列定位的描述有利于本领域技术人员定位其他物种对应的基因序列和相关氨基酸序列。因为我们主要使用白色念珠菌和克柔念珠菌，本文的描述基于白色念珠菌氨基酸序列和基因序列。白色念珠菌(CaFKS1)的FKS1基因序列为GenBank检索号D88815。白色念珠菌(CaFKS1)相应的氨基酸序列为GenBank检索号BAA21535。其他物种的序列为：烟曲霉菌U79728、枸巢曲霉菌AACD01000061、光滑念珠菌CR380953、克柔念珠菌DQ017894、新型隐球菌AAEYO 1000070、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)AF148715、粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)XM327156、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)AF191096、酿酒酵母菌U08459、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)CR382131。

本发明实验涉及检测图2中加下划线的两个短氨基酸序列相应的核酸序列，优选DNA序列。对于第一个加下划线的序列，此第一条靶序列包括DNA或RNA，其最少编码Phe₆₄₁至Pro₆₄₉的序列(使用CaFks1p作参照)，任选编码在一端或两端的1-5个优选1个或2个附加的氨基酸。对于第二个加下划线的序列，此第二条靶序列包括DNA或RNA，其最少编码ASp₁₃₅₇至Leu₁₃₆₄的序列，任选编码在一端或两端的1-5个优选1个或2个附加的氨基酸。

本发明实验包括扩增含有第一条靶序列的第一个核酸区域。优选本发明实验也包括扩增含有第二条靶序列的第二个核酸区域。第一区域和第二区域都可使用一个二者均包括在内的单引物对扩增。或者可使用两个引物对，第一对包括第一区，第二对包括第二区。特别是如果序列测定用于检测靶序列的突变，那么我们优选使用较短的扩增子，因此使用两个引物对。正如上述所示，本发明实验不局限于特定的扩增。虽然迄今为止如实施例所述，我们使用聚合酶链反应(PCR)扩增，但是也可使用其他技术。

靶序列中突变的检测可通过序列测定完成。如实施例所述，我们使用循环测序法，但是也可使用其他序列测定方法。靶序列中突变的检测也可利用杂交探针完成，该杂交探针在实验中识别野生型靶序列和包括突变的序列。杂交探针可为DNA、RNA或二者的组合。它们可包括非天然(non-natural)的核苷酸，例如2′O-甲基核糖核苷酸。可包括非天然的核苷酸间键，例如磷硫酰键。它们可为PNA。本发明实验适合的杂交探针包括与靶序列等位基因杂交产生可检测信号的探针。探针优选经荧光标记并且产生可检测荧光信号。使用杂交探针检测可为终点检测(end-point detection)，即扩增完成后检测。本发明探针测定方法优选均相测定(homogeneous assays)，即测定时不需要分离结合的探针和未结合的探针。更优选的均相测定包括实时检测，最优选实时荧光检测，即在扩增过程中多次检测。对于实时扩增检测，我们优选双重荧光标记的探针，最优选用荧光团标记也用非荧光猝灭剂例如4-(4′-二甲氨基-苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)标记的探针。

实时检测可采用任何适当的探针方法，包括采用结合DNA荧光染料例如SYBR染料的杂交探针，双链DNA存在则发出荧光。例如SYBR绿色染料可用于检测扩增，等位基因识别荧光杂交探针可用于检测野生型靶序列的扩增，探针荧光曲线的斜率指示纯合性野生型靶、突变体和野生型靶杂合体或纯合性突变体靶的存在。另一种方法为使用容许错配探针(mismatch-tolerant probe)检测扩增的靶序列(野生型或突变体)的一条链，并使用一个或多个等位基因特异性探针与另外一条链杂交从而确定靶序列是否突变。或者如实施例所证明，可以使用多探针，野生型靶序列和特异性突变存在就发出信号。在第一条和第二条靶序列中，我们已经鉴定出几种突变导致卡泊芬净敏感性降低。在第一条靶序列中为(使用CaFKS1作参考)T1921C、T1922C、G1932T、T1933C、C1934A、C1934T、C1934G、G1942T和C1946A。在第二条靶序列中为(使用CaFKS1作参考)C4081G和G4082A。

现有许多用于突变分析和SNP基因分型的分子方法。其中通过自身报告分子信标探针检测的实时PCR是一种非常有效的方法。与线性探针相比，由于其具有发夹结构，在分子内杂交和分子间杂交达到热力学条件平衡(thermodynamically conditioned equilibrium)，使设计的分子信标探针能够高度特异性且在宽广的温度范围内区分密切相关的靶序列。具有识别能力的分子信标已经成功用于分析导致抗生素耐药性的突变、等位基因分化、纯合和杂合的SNPs，以及许多其他应用。

分子信标探针的选择性有利于分析导致卡泊芬净敏感性降低的CaFKS1等位基因。对于我们指定为“HS1”序列的第一条靶序列的检测集中于第645个CaFKS1密码子突变T1933C、C1934A和C1934T，用白色念珠菌的临床分离群已经鉴别其降低对卡泊芬净的敏感性。由于在该区域内存在SNP T1929A，设计用于检测靶区域内抗性等位基因的等位基因特异性探针不太容易。为了适应在很多临床分离群中出现的这种SNP，在相应SNP位点使用摆动碱基设计探针。向探针中引入摆动碱基减少了整个荧光发射输出，因为在给定条件下仅有半数探针分子库与互补的靶DNA特异性结合。由于无论在CaFKS1中有没有T1929A SNP，这些探针对全部白色念珠菌菌群均有活性，因此简并探针的多样性较高带来的益处远大于绝对荧光强度的损失。

合成了与1种野生型和3种突变体CaFKS1等位基因相对应的4种简并分子信标，这4种探针都显示出极好的识别性质，对于多数靶的匹配/错配(match-to-mismatch)的信号比例接近100％。观察到4种探针仅与互补的DNA靶特异性杂交。唯一的例外是分子信标CaFKS1-WT与含有T1922C等位基因模板少量的杂交。这种结果可通过探针域内错配的侧面定位(lateral location)解释，也可通过热力学已知的相对稳定DNA-DNA错配的形成T·G错配的能量学形成解释。在等位基因异质结合(allele heterozygosity)情况下，与纯合模板相比，分子信标探针(识别野生型和突变体序列)产生一半强度的荧光信号。

降低对卡泊芬净敏感性的突变体极少产生，发生频率与每个活细胞<10^-8的突变频率一致。耐药性突变体的形成需要在含卡泊芬净固体培养基上长时间孵育(>7天)，残存细胞生长出现。在预先不接触药物的白色念珠菌培养物中，我们尚未发现卡泊芬净耐药性细胞。通过等位基因特异性分子信标分析两种不同菌株中85个(Eight-five)自发产生的敏感性降低的突变体。发现在菌株CAI4的35个分离群中的突变与先前所述置换相同，影响编码Ser₆₄₅的密码子。这些突变也包含菌株M70的50种卡泊芬净耐药性衍生物中绝大多数。从6株得自M70的自发突变体中检测到3种新型突变，也就是T1922C、G1932T和C1934G，影响编码Phe₆₄₁、Leu₆₄₄和Ser₆₄₅的密码子。这些结果与近来对于卡泊芬净敏感性降低的白色念珠菌实验室和临床菌株的突变分析结果一致。发现绝大多数的核苷酸置换位于CaFKS1的第645位密码子。在CaFKS1其他位点中新发现的突变仅见于M70菌株的子代，并且相对频率不超过12％。

所有单独应用的分子信标使得能够对全部85种卡泊芬净耐药性衍生物进行基因分型。在79个菌株中已经正确鉴别且DNA序列分析确认了分子信标靶向的3种等位基因。在6个菌株中也通过DNA序列分析确认了非分子信标靶向的3种新型突变。在通用封闭管检测(universal closed tube assay)进行的单独反应中使用所有4个分子信标，用于检测CaFKS1中第一条靶序列内的卡泊芬净耐药性突变。在实验中，FAM信号表示存在野生型CaFKS1等位基因，而HEX荧光表示DNA样品中存在T1933C、C1934A或C1934T CaFKS1突变的一种。从产生FAM和HEX信号的杂合上述3种突变的白色念珠菌菌株中提取DNA。如此可准确检测引起卡泊芬净敏感性降低的白色念珠菌中CaFKS1基因内纯合状态与杂合状态的已知突变。本实验也足以鉴别可影响药物敏感性的这一区域内的其他突变。

正如上面所述，突变将卡泊芬净敏感性降低与CaFKS1中短保守区域联系起来。最显著的基因座(locus)是Ser₆₄₅，并且包括在白色念珠菌的实验室和临床分离群中都发现的置换S645P、S645Y、S645F。这些突变表现出能够支配并赋予杂合状态和纯合状态下的卡泊芬净耐药性。靶向于这些突变的诊断用探针可提供一种迅速和准确评价白色念珠菌中卡泊芬净耐受性的工具。

基于FKS1突变分析迅速诊断卡泊芬净耐药性，这种诊断必须能够区分单个核苷酸不同的杂合的和纯合的等位基因，能够以多重形式同时检测这些等位基因。分子信标技术是用于等位基因识别和多重检测的极好的技术。

通过超过50个卡泊芬净敏感性降低的白色念珠菌的临床和实验室分离群的DNA序列分析，显示出3种突变，即T1933C、C1934A和C1934T，分别导致氨基酸改变S645P、S645Y和S645F。除了那些核苷酸置换外，序列比对揭示在此区域有另外一个变异位点。在所有已分析的白色念珠菌菌株中约有25％观察到T1929A单一同义核苷酸置换，在作为白色念珠菌基因组序列测定课题一部分的菌株SC5314中也有报道。这种观察是重要的，因为有可能改变覆盖此区域的等位基因特异性探针识别所需的探针-扩增子杂交。基于CaFKS1序列分析数据，我们设计了4种对应于1920位至1944位核苷酸的等位基因特异性分子信标探针。实施例中详细描述了这个过程。一种探针与卡泊芬净敏感性白色念珠菌菌株中发现的野生型(WT)CaFKS1等位基因互补，而其他3种探针与卡泊芬净耐药性分离群中发现的突变体CaFKS1等位基因(C1934A、C1934T、T1933C)互补。所有信标的6个核苷酸长的茎部区域相同，为5′CGCGAG和CTCGCG3′，用A/T50∶50的摆动碱基合成在第1929位CaFKS1SNP相应位点从而确保与靶序列对应。野生型分子信标CaFKS1-WT用FAM在5′端标记，而其他3种突变体信标用HEX在5′端标记。所有分子信标的3′末端用DABCYL猝灭剂修饰。实施例3中描述了特异性引物和探针的设计。实施例4中描述了探针识别的温度窗(temperature window)。在温度窗中进行检测。

通过在含有4μg/ml(40倍MIC)卡泊芬净的固体生长培养基上直接选择白色念珠菌菌株CAI4和M70的耐受卡泊芬净的自发性突变体。两种菌株中耐受卡泊芬净的自发性衍生物形成的频率<10^-8突变体/活细胞。对于两种菌株，观察到在含有卡泊芬净的培养板上形成很少的萎缩的缓慢生长的菌落。这些菌落划线分离到含有相同浓度卡泊芬净的新培养板上不再生长。孵育时间延长到10天以上后，少量小的萎缩菌落产生光滑、快速生长的衍生物，再接种后在含有卡泊芬净培养基中能够持续培养。每个培养板上只保存培养一个这种衍生物用于进一步分析。菌株CAI4和M70各自分离35个和50个卡泊芬净敏感性降低的分离群。对于所有实验室得到的分离群，体外卡泊芬净敏感性测定显示卡泊芬净的MIC值提高到>16μg/ml。在实施例2中描述了详细的分离步骤。

初步测定CAI4和M70菌株的CaFKS1基因的序列(参见实施例2)揭示在CAI4的CaFKS1基因中存在T1929A SNP，而在M70中没有此突变。从CAI4和M70亲代菌株及其卡泊芬净耐药性衍生物提取染色体DNA，并且作为模板与CaFKS1分子信标一起用于实时PCR实验。图4给出了多种野生型和突变体靶、使用的引物和分子信标探针的核苷酸序列。图4中探针的探针区域和靶链的靶序列下加有下划线。探针和靶序列中与CaFKS1的HS1域的突变对应的碱基为黑体字。指示为W的碱基位置指示两种在此位置仅是A或T的差别的简并分子信标的等摩尔混合物。每种染色体DNA样品分别与代表不同的降低敏感性的等位基因的单分子信标探针进行4次独立的PCR反应。实施例5中描述了实时PCR反应。61℃的退火温度适用于所有反应，从而极好的区分不同CaFKS1等位基因(参见实施例4)。从CAI4菌株的所有35种卡泊芬净耐药性衍生物中均发现了突变体CaFKS1等位基因。其中大多数(20个分离群)具有杂合突变wt/T1933C，其他15个突变体含有纯合突变T1933C、C1934A或C1934T。在T1933C杂合中，从分子信标CaFKS 1-WT和CaFKS1-T1933C产生两种类似强度的信号(图5)。图5为使用单分子信标和DNA靶的4个独立PCRs的结果。CaFKS1-T1933C信标+具有杂合T1933C突变的CaFKS1等位基因的DNA，CaFKS1-WT信标+具有纯合T1933C突变的CaFKS1等位基因的DNA，CaFKS1-T1933C信标+具有杂合T1933C突变的CaFKS1等位基因的DNA，CaFKS1-WT信标+具有杂合T1933C突变的CaFKS1等位基因的DNA。

图6A-6D显示通过4种分子信标CaFKS1-WT(图6A)、CaFKS1-T1933C(图6B)、CaFKS1-C1934A(图6C)和CaFKS1-C1934T(图6D)区分10种CaFKS1纯合等位基因。每个图概括用有突变的单个DNA等位基因进行的11次单独的PCRs结果：野生型(无突变或SNP)，T1933C，C1934A，C1934T、T1929A SNP，T1933C+T1929A SNP，C1934A+T1929A SNP，C1934T+T1929A SNP，T1922C，G1932T+C1934G，空白(无DNA)。

具有纯合CaFKS1突变的DNA样品产生对CaFKS1-WT无信号的相应突变体分子信标的特殊反应(图6B-6D)。相反从仅与CaFKS1-WT探针相互作用的CAI4亲代菌株提取的染色体DNA用突变体信标检测不到荧光信号(图6A)。

M70菌株的卡泊芬净耐药性衍生物的CaFKS1等位基因进行基因分型，揭示在50份样品中有44份存在已知突变T1933C、C1934A或C1934T。对于CAI4突变体，大多数M70衍生物获得杂合突变T1933C。已经发现敏感性降低的50个菌株中有25个含有T1933C置换位于一个CaFKS1拷贝。在6个菌株中检测到杂合突变C1934A和C1934T。具有杂合突变T1933C、C1934A或C1934T的DNA样品进行的所有实时PCR产生两种荧光信号，一种来自CaFKS1-WT分子信标，另一种来自3种杂交体分子信标CaFKS1-T1933C、CaFKS1-C1934A或CaFKS1-C1934T中的一种。在CaFKS1的第1933位和第1934位上的杂合突变外，在通过与相应的突变体分子信标CaFKS1-T1933C、CaFKS1-C1934A或CaFKS1-C1934T特异性杂交鉴别的13种菌株中也检测到这些位点上有纯合置换(图6B-6D)。

在50种菌株中有6种菌株的染色体DNA的PCR扩增仅能通过野生型分子信标检测，而突变体分子信标(5种菌株)完全检测不到，一种菌株野生型和突变体分子信标都检测不到。考虑到探针的这种等位基因特异性，这些数据显示模板序列以未知方式改变。

从所有卡泊芬净耐药性菌株CAI4和M70得到所有CaFKS1的DNA序列，用于确定实时PCR结果和解释用6种M70衍生物无法区分的情况。发现对于35种CAI4衍生物和44种M70衍生物来说，实时PCR结果和序列测定结果100％相关。在实时PCR实验中通过与分子信标CaFKS1-T1933C、CaFKS1-C1934A或CaFKS1-C1934T杂交检测突变位点在CaFKS1的1933位和1934位的所有杂合突变和纯合突变，用DNA序列测定加以确证。在5种M70衍生物的CaFKS1基因中发现存在新型纯合突变T1922C，在实时PCR实验中没有显示明确结果。另外DNA序列分析揭示出一种M70卡泊芬净耐药性衍生物的CaFKS1基因中两种新型纯合突变G1932T和C1934G，在实时PCR实验中这两种突变不产生任何荧光反应。经序列测定揭示预期的所有CAI4菌株的衍生物具有T1929A SNP，而M70菌株的衍生物没有T1929A SNP。

使用单CaFKS1分子信标有可能进行白色念珠菌CaFKS1基因中3种已知突变的基因分型。我们进一步研究所有4种简并CaFKS1分子信标组合应用于多重实时PCR实验的可能性，适于同时评价给定DNA样品中的突变。参见实施例5。我们收集所有4种CaFKS1分子信标，为区分野生型和突变体用不同的荧光标记，向每个PCRs体系加入聚集的探针混合物。得自野生型菌株CAI4和M70的染色体DNA以及这些菌株中代表12种不同CaFKS1基因型的12种卡泊芬净耐受性衍生物的染色体DNA作为多重实时PCRs反应的模板。除了退火温度为60℃外，多重实时PCR实验的实验条件与单独使用单分子信标的实时PCR相同。野生型分子信标CaFKS1-WT用FAM标记，杂交体分子信标CaFKS1-T1933C、CaFKS1-C1934A或CaFKS1-C1934T用HEX标记。使用这些探针，我们能够通过荧光输出的性质鉴别卡泊芬净敏感性菌株和卡泊芬净耐药性菌株。

图7表明MX4000软件处理CaFKS1突变体的多种实时PCR的图形输出。当观察到FAM信号时，上面半圆形变亮，报告存在野生型CaFKS1DNA。当观察到HEX信号时，下面半圆形变亮，报告CaFKS1DNA中存在3种所示突变体的任何一种。纯合CaFKS1等位基因产生FAM信号或HEX信号，而杂合CaFKS1等位基因产生FAM信号，也产生HEX信号。

敏感性菌株CAI4和M70的DNA进行多重实时PCR时仅观察到FAM荧光。CaFKS1内具有纯合突变T1933C、C1934A或C1934T的DNA进行多重实时PCR仅报道HEX荧光(图7)。当分析CaFKS1基因中已知具有杂合突变T1933C、C1934A或C1934T的菌株的DNA时，检测到相等强度的FAM和HEX信号(图7)。用从CaFKS1内具有两种新型突变G1932T和C1934G的菌株提取的染色体DNA进行多重实时PCR，既不产生FAM荧光也不产生HEX荧光。在用从含有杂合突变T1922C的菌株提取的染色体DNA进行反应中观察到微弱的FAM信号。

我们也已经设计出引物和探针用于称为“HS2”的第二个靶区域的，特异性用于一种突变体G4082A。在实施例6中已有报道。对突变体C4081G或任何其他这类突变体的突变体探针，可以在设计包括第二个靶区域的检测中进行类似设计，无论如上述实例中所述单独或联合用于HS2，或HS1和HS2。

实施例1

已经利用4种不同菌株成功进行了CaFKS1基因相关片段的核酸扩增以及与其结合使用的鉴别突变体的循环测序。自菌株CAI4-R1、NR2、NR3和NR4的基因组DNA扩增CaFKS1(约450bp)片段。基于CaFKS1序列(GenBank检索号D88815)，PCR所用正义引物和反义引物分别为5′-GAAATCGGCATATGCTGTGTC-3′和5′-AATGAACGACCAATGGAGAAG-3′。PCR产物克隆进入pCR2.1(Invitrogen)并测定DNA序列。对于念珠菌临床分离群，使用5′-CATTGCTGTGGCCACTTTAG-3′和5′-GGTCAAATCAGTGAAAACCG-3′分别作为正向引物和反向引物扩增大部分CaFKS1ORF(约2.6kb)用于DNA序列分析。除了上述CaFKS1的第一个靶区域(与第1921位至第1947位编码核苷酸一致)以外，这个片段包括第4069位至第4092位的第二条靶核苷酸。纯化PCR产物，用荧光标记(Pico Green，分子探针)定量，使用DTCS QuickStart Kit(Beckman Coulter)从5′和3′两个方向测序。

实施例2

使用核酸扩增和循环测序法的DNA序列分析可作为检测技术单用，也可作为对照评价基于探针的检测。

用Q-Biogene FastDNA kit(Q-Biogene，Irvine，CA)，自液体YPD培养基中生长过夜的细胞提取白色念珠菌染色体DNA。在iCyclerthermocycler(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上进行PCR实验。使用引物CaFKS1-F1719和CaFKS1-R2212(图4)扩增命名为HS1的CaFKS1区域。每个100-μl PCR反应体系含有分别为0.25μM的两种引物，2.5U的iTaq DNA聚合酶(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，0.5mM dNTPs、50mM KCl、4mM MgCl₂、20mM Tris-HCl，pH＝8.4、约50ng的白色念珠菌染色体DNA。循环条件是1次循环，95℃3分钟；35次循环，95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟；1次循环，72℃ 3分钟。使用Montage PCR纯化试剂盒(Millipore，Bedford，MA)纯化PCR产物。使用iCycler热循环仪根据制造商建议使用CEQ^TM DyeTerminator Cycle Sequencing-Quick Start kit(Beckman Coulter，Fullerton，CA)得到并纯化测序用PCR产物。引物CaFKS1-F1719或CaFKS1-R2212用于序列测定反应。测序PCR的循环条件是1次循环，95℃ 3分钟；30次循环，96℃ 20秒，50℃ 20秒，60℃ 1分钟。所有DNA序列测定均在CEQ^TM 8000 Genetic Analysis System(BeckmanCoulter，Fullerton，CA)上完成。CEQ^TM 8000 Genetic Analysis SystemSoftware(Beckman Coulter，Fullerton，CA)用于控制硬件和分析序列测定后结果。

白色念珠菌菌株CAI4购自ATCC(ATCC，Manassas，VA)。白色念珠菌菌株M70得自Merck培养物保藏中心(MRL，Rahway，NJ)。菌株生长在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YPD)培养基(1％酵母提取物、2％Bacto蛋白胨、2％葡萄糖)。为了菌株CAI4生长，YPD培养基中加入25mg/ml的尿嘧啶核苷(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。直接向YPD加入卡泊芬净(Merck，Rahway，NJ)至4μg/ml。琼脂平板孵育在30℃下，液体培养物在30℃下培养在旋转摇床(100转/分钟)上含有3mlYPD的12ml培养管中。在RPMI-1640培养基(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中采用液体微量肉汤稀释检测法(liquid microbroth dilutionassay)评价对卡泊芬净的敏感性，该实验在NCCLS资料M27-A2已有概述。

经100ul(～10⁸个细胞)液体YPD培养物在含有4μg/ml卡泊芬净的YPD培养板中培养18小时，分离出白色念珠菌菌株CAI4和M70的自发卡泊芬净耐药性突变体。连续稀释的过夜培养物接种于未加抗生素(无抗生素选择压力)的YPD培养皿中，从而精确测定起始菌落计数。(抗生素)选择培养板在30℃下孵育10-14天。从每一个选择培养板中再接种至少4个单独的耐药菌落于新的含有卡泊芬净培养板中，从而确定这种耐药性表型。

实施例3

已报道GenBank检索号为D88815、AF027295和CA2043的三种CaFKS1DNA序列用于FKS1分子信标及引物设计。本领域已知检测用引物和探针的设计。可得到许多有助于研究者的公开文献。另外计算机软件包可用来提高效率并减少需反复实验确定的调整(参见实施例4)。我们使用这种软件包。使用Beacon Designer 3.0软件(PREMIERBiosoft，Palo Alto，CA)设计分子信标和DNA引物(图4)。预设的软件参数适于构建所有分子信标和引物。用荧光团5-羧基荧光素(FAM)和6-羧基-2′，4，4′，5′，7，7′-六氯荧光素(HEX)在5′末端，用dabcyl在3′末端标记分子信标。分子信标和引物均购自Biosearch Technologies(BiosearchTechnologies，Novato，CA)。在全部温度范围，25℃-95℃内测定CaFKS1等位基因特异性分子信标与单链靶寡聚核苷酸杂交的杂交性质(图4)。用Stratagene MX4000多重定量PCR系统(Stratagene，La Jolla，CA)进行分子信标定向杂交。使用MX4000软件，选择“分子信标解链曲线”实验模式监测、分析数据。每个50μl杂交反应混合体系含有1x Stratagene Core PCR缓冲液、4mM MgCl₂、100pmol分离的靶寡聚核苷酸和5pmol分子信标。实验温度条件包含在95℃下加热3分钟，然后用112秒冷却到80℃，然后用30秒冷却到25℃，温度下降梯度为0.5℃。在冷却步骤终点测定每次单独反应发出的荧光。“分子信标解链曲线”实验最终数据转换为“SYBR Green(解离曲线)”实验模式。由MX4000软件确定每个分子信标-靶序列对的解链温度(T_m)，作为与荧光输出的一阶导数-R′(T)的最大值相对应的温度点。每个热曲线实验重复3次。

实施例4

在两个或多个等位基因间核酸杂交探针的识别能力具有温度依赖性，即如果探针在70℃识别与靶序列有1个核苷酸不同的序列，在40℃下探针可能与靶错配，从而在如此低温下无法识别。

我们把探针的等位基因识别能力看作探针设计和实验设计的一部分。测定分子信标对代表野生型CaFKS1和具有第1933位和第1934位的卡泊芬净耐药性突变以及第1929位的SNP的不同CaFKS1等位基因的8个DNA寡聚核苷酸模板的杂交曲线(图4)。图4中这些寡聚核苷酸称为“靶”，用于探针的解链曲线分析。在数个靶序列中，加下划线的部分与一种探针互补配对，如图所示，加入另外的末端重复腺苷从而减少解链曲线分析期间二级结构形成。首先用两种DNA靶评价其与每种分子信标探针的杂交，此DNA靶与探针域序列互补，不同之处在于与第1929位SNP对应的核苷酸碱基。每种简并的分子信标探针与这些DNA靶形成两种类型的分子间杂交体。靶寡聚核苷酸和具有互补序列的分子信标亚群形成稳定的杂交体。另一种在第1929位具有单错配(single mismatched)核苷酸的分子信标探针亚群与相同DNA靶形成较不稳定的杂交体。结果，以荧光输出的一阶导数(-R′(T))表示的混合探针的解链曲线显示两个独特的峰，分别对应于较稳定和较不稳定的分子信标-靶杂交体的T_ms。然后我们研究了每种分子信标与非互补DNA寡聚核苷酸(图4)的杂交。尽管这种错配杂交体通常比互补的更不稳定，但是分子信标的简并性对于这两种杂交体亚群能产生相同的趋势。通过靶寡聚核苷酸与单错配的信标亚群形成较稳定的分子间杂交体，相反较不稳定的杂交体包含寡聚核苷酸和双错配(double mismatches)的信标亚群。8个简并分子信标与靶寡聚核苷酸对中的每一对得到的两个T_m值中只考虑较高的T_m值，其对应于单错配或没有错配的较稳定的信标-靶杂交体。这些CaFKS1分子信标与其互补DNA靶的T_m值相当接近，温度范围降至62.7℃-64.0℃。相应的识别窗也占据类似的温度范围(thermal diapason)。通过改变单个信标的探针域序列的长度达到这种一致性。分子信标CaFKS1-WT、CaFKS1-T1933C、CaFKS1-C1934A和CaFKS1-C1934T相应的具有24、23、25和25个核苷酸的探针域。

实施例5

用图4所述的引物和探针证明了实施扩增检测法。本实验包括通过聚合酶链反应(PCR)扩增DNA和利用分子信标探针实时检测。

关于使用各个单探针(图4)的检测步骤如下。在Stratagene Mx4000多重定量PCR系统上使用“定量PCR(多标准)(Multiple Standards)”设置进行实时PCR实验。 QPCR Core试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)中的试剂可用于所有反应。每个50-μl PCR反应体系含有1xStratagene Core PCR缓冲液、0.2μM分子信标、分别为0.25μM的HS1AN2和HS1SN2引物(图4)，2.5U  Taq DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)、0.4mM dNTPs、4mM MgCl₂和约50ng白色念珠菌染色体DNA。在多重PCR实验中，这4种分子信标(图4)各自的浓度为0.2μM。实时PCR温度循环参数为：1次循环95℃ 10分钟；45次循环，95℃ 30秒，61℃ 30秒，72℃ 30秒钟。当以多重方式进行PCR实验时使用60℃的退火温度。为了平衡不同分子信标产生的荧光信号强度，M x 4000系统的滤光器放大装置(filter gain set)更换为FAM-960HEX-720。退火期间荧光强度测定3次。

Stratagene Mx4000系统在PCR扩增期间产生的荧光信号使用M x 4000软件实时检测。在每次运行终点，将扩增图数据转变为图形并保存为图象文件，或导出至Microsoft Office Excel并保存为表格文件。在多重PCR反应情况下，PCR扩增的最终结果由“定量PCR(多标准)”实验模式转变为“定量读板”实验模式。单个荧光团(Rpost-Rpre)发射荧光的总变化作为分析值。结果转换为图形或数字格式并保存为图象文件或表格文件。

除了温度循环的退火温度为60℃而不是61℃外，我们利用上述PCR扩增进行多重检测。在相同反应中使用多探针。

实施例6

已经设计出引物和分子信标，用于我们称为HS2的第二条DNA序列的PCR扩增。这些引物具有下面的序列：

CCATTTGGTTGTTACAATATTGC-3′

CCAATGGAATGAAAGAAATGAAG-3′

为了区分棘球白素-耐药突变体G4082A和野生型基因序列，设计了用于一对等位基因识别分子探针的核苷酸序列。每个序列的一个末端用荧光团标记，另一端用无荧光的猝灭剂例如DABCYL标记。当然也可使用可区分的荧光团使野生型探针只与野生型基因序列杂交而发出荧光，使突变体探针只与突变体序列杂交而发出荧光，在含有这些探针中的一种的终点检测和实时扩增检测中，或者在含有所有两种探针的多重检测中都适用，无论含有或不含有第一条靶序列的引物或探针。

分子信标探针具有长度为24个核苷酸的单链环，两侧为形成6个核苷酸茎区的互补的3′和5′臂序列(arm sequences)。两探针的计算Tm均为61.5℃。序列为：

野生型探针：

CGCGAGGATTGGATTAGACGTTATACTTTGCTCGCG

突变体探针：

CGCGAGGATTGGATTAGACATTATACTTTGCTCGCG

互补臂序列加有下划线，突变体中的单核苷酸突变标为黑体。

本发明已经描述了许多实施方案。然而应理解在不偏离本发明精神和范围内可作各种修改。例如可使用除PCR外的其他扩增方法比如NASBA，可使用除分子信标探针外其他等位基因识别探针。相应的其他实施方案也在本发明范围内。