胆甾－4－烯－3－酮衍生物用于获得细胞保护药物的用途

摘要

本发明涉及胆甾－4－烯－3－酮衍生物在获得细胞保护药物中的用途，其中不包括神经保护药物。

说明书

本发明涉及胆甾-4-烯-3-酮衍生物在获得细胞保护药物中的用 途，其中不包括神经保护药物。

细胞变性过程的特征在于细胞的功能障碍，常常会导致不希望的 细胞活性和细胞死亡。

细胞已经发展出对应激应答的适应机制，该机制延长了它们的生 命或者延迟或防止了细胞死亡(细胞保护机制)。

但是，这些细胞保护机制有时是不足够、不适当的或诱导的太迟 而并不有效，因此细胞死亡。因此，人们感兴趣的是发展新的可以促 进细胞保护的细胞保护药物。这是本发明的目的之一。

术语“细胞保护”是指天然或非天然药剂保护细胞免于细胞死亡， 特别是病理性细胞死亡，和/或防止细胞功能障碍而导致细胞死亡的能 力。这些细胞功能障碍可以是例如，线粒体源的例如产生ATP的能力 降低，不能获得和/或保留钙，或产生自由基。

在细胞死亡的主要机制中，细胞坏死、细胞凋亡和坏死性细胞凋 亡(necroptosis)之间的区别是很大的。

细胞坏死是所谓的“意外的”细胞死亡，其在组织受到损害时发 生。最受影响的是细胞的质膜，导致细胞的内稳态改变。细胞将会吸 收水至一定程度，导致质膜溶解。这种细胞溶解导致细胞质的内容物 释放到周围的介质中。细胞坏死是炎症过程的起点。

细胞坏死会影响一系列的细胞或组织，而其他相邻的部分会保持 存活。所导致的转变是细胞或组织坏疽。

换句话说，细胞坏死只限于形态学的改变，其是在当细胞到达其 生命的终点时所发生的，是例如显著的损伤例如器官的血液供应中断 或减少，体温过高(温度显著升高)，化学中毒，物理性休克等等事件 的结果。

最为人所知的一种细胞坏死是由于冠状动脉的阻塞(梗阻)而在梗 塞形成时(心肌血流供应中断)心肌发生的坏死。

细胞凋亡是生物体的正常生理学的一个完整部分。它是受到高度 调节的细胞死亡的生理学形式，是多细胞生物体的生存所需要的。细 胞凋亡是一种在胚胎发生期间发挥基本作用的过程。

凋亡中的细胞或凋亡的细胞会将它们自己与其他细胞分离开。细 胞凋亡通常涉及组织中的个体细胞，不会导致炎症。细胞凋亡的一个 特征性的形态学重点是细胞核和细胞质的显著凝缩，诱导细胞体积显 著减小。然后细胞核破碎，每个碎片被双层膜所包围。然后释放出凋 亡小体(细胞质和细胞核成分)，并由邻近的细胞通过吞噬作用而吸收。

可以以不同的方法诱导细胞凋亡。例如，辐射、化学品或激素的 存在是刺激物，可以在细胞中导致凋亡事件的级联。细胞内的信号例 如不完全的有丝分裂或DNA损害也可以诱导细胞凋亡。

在遗传毒物的作用后或在疾病期间也会发生细胞凋亡。某些病状 的特征在于异常的细胞凋亡，导致某些细胞群的缺失，例如肝脏毒性、 视网膜病、心脏毒性。

因此生理性细胞凋亡和病理性细胞凋亡之间是有差别的。本发明 主要关注的是病理性细胞凋亡。

还存在其他的细胞死亡机制，例如坏死性细胞凋亡，其具有细胞 坏死和细胞凋亡的特征。由于坏死性细胞凋亡而死亡的细胞具有与由 于细胞坏死而死亡的细胞类似的特征，但是该机制的生化步骤更类似 于细胞凋亡的步骤。这种细胞死亡的机制是例如在局部缺血中发生的。

因此，本发明的一个目的也是制备新的能够用于预防和/或治疗细 胞坏死和/或病理性细胞凋亡和/或坏死性细胞凋亡的药物(抗坏死和/ 或抗细胞凋亡和/或抗坏死性细胞凋亡药物)。

细胞变性过程可以特别地是由统称为变性疾病或感染、创伤或暴 露在各种因素下的病理性情况而导致的。

这些创伤和因素可以是例如暴露在辐射(UV、γ辐射)下、缺氧或 少氧、缺乏营养素、缺乏生长因子、毒药、细胞毒素、废物、环境毒 素、自由基、活性氧或者甚至某些医药事件和/或方法例如手术创伤包 括细胞、组织和器官的移植。化学或生物学试剂也可以在医学治疗范 围内用作治疗剂，例如细胞抑制剂或抗炎剂。

本发明的目的不是治疗病理性或变性过程的细胞外原因，所述原 因会导致细胞死亡，但实际上是在所述病理性过程或所述病状的细胞 水平上的结果，特别是保护细胞免于产生所述的结果。

在特征在于变性过程的最显著的病理性情况中，本发明不涉及神 经性或神经变性疾病，发现是下列疾病：

骨、关节、结缔组织和软骨的疾病，例如骨质疏松症，骨髓炎， 关节炎包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎和牛皮癣关节炎，无血管 性坏死，进行性骨化性纤维发育不良、佝偻病、库兴综合征；

肌肉的疾病例如肌营养不良，例如Duchenne’s肌营养不良、强 直性肌营养不良、肌病和肌无力；

皮肤疾病，例如皮炎、湿疹、牛皮癣、老化或者甚至瘢痕改变；

心血管疾病，例如心脏和/或血管缺血、心肌梗塞、缺血性心脏病、 慢性或急性充血性心力衰竭、心律失常、心房颤动、心室颤动、 paroxystic心动过速、充血性心力衰竭、肥厚型心脏病、缺氧、少氧、 由于用抗癌剂治疗而导致的继发效应；

循环疾病，例如动脉粥样硬化、动脉硬化和外周血管病、脑血管 卒中、动脉瘤；

血液和血管疾病，例如：贫血、血管淀粉样变、出血、镰状细胞 病、红细胞分裂综合征、嗜中性白细胞减少症、白血球减少症、髓发 育不全、各类血细胞减少症、血小板减少症、血友病；

肺部疾病包括肺炎、哮喘；肺的阻塞性慢性疾病例如慢性支气管 炎和肺气肿；

胃肠道的疾病，例如溃疡；

肝的疾病例如肝炎，特别是病毒性或有其他感染因子作为致病因 子的肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、暴发性肝炎、某些遗传性 代谢性障碍、Wilson’s病、肝硬化、酒精性肝病(ALD)、由于毒素和 药物而发生的肝病；皮脂腺病例如：

-非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，或酒精、药物、病毒或中毒性肝 炎伴随的外源性中毒，外科操作的并发症、代谢性疾病(例如糖尿病、 葡萄糖不耐受综合征、肥胖、高脂血症、下丘脑-垂体轴的功能障碍、 血β脂蛋白缺乏症、半乳糖血症、糖原病、Wilson’s病、 Weber-Christian’s病、Refsum’s综合征、肉毒碱缺乏症)，

-消化道的炎症疾病的肝并发症，

-自身免疫性肝炎。

通过不管何种原因的对皮脂腺病的作用或对肝细胞凋亡的作用， 该化合物可以对于发生肝纤维化具有预防作用并且可以预防肝硬化的 发生。

-胰脏疾病，例如急性或慢性胰腺炎；

-代谢性疾病，例如糖尿病和insipid糖尿病、甲状腺炎；

-肾的疾病，例如急性肾障碍或肾小球肾炎；

-由化学品、毒素或药物导致的重度中毒；

-与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)有关的变性疾病；

-与老化有关的障碍，例如加速老化的综合征；

-牙齿疾病，例如由组织变性导致的那些，例如牙周炎；

-眼科疾病或障碍，包括包括糖尿病性视网膜病、青光眼、上睑 下垂、视神经萎缩、慢性进行性外眼肌麻痹、黄斑变性、视网膜变性、 色素性视网膜炎、视网膜裂孔或撕裂、视网膜剥离、视网膜缺血、与 创伤有关的急性视网膜病、炎性变性、手术后并发症、医学视网膜病、 白内障；

-听觉道的疾病，例如耳硬化和抗生素诱发的耳聋；

-与线粒体(线粒体病状)有关的疾病，例如脊髓小脑共济失调、 线粒体结构异常的先天性肌营养不良症、某些肌病(MELAS综合征、 MERFF综合征、Pearson’s综合征)、MIDD(线粒体性糖尿病和耳聋) 综合征、Wolfram’s综合征、张力失常。

本发明也关注保护细胞、组织和/或移植的器官，不管是在移植之 前、期间(去除、运输和/或再移植)或之后。

药理活性的化合物仍然寻求控制上述的变性过程。

本发明满足了对细胞保护性化合物的需求。实际上，申请人发现 了胆甾-4-烯-3-酮衍生物，特别是胆甾-4-烯-3-酮肟具有显著的细胞 保护性质。

这就是为什么本发明的目的是至少一种满足式I的化合物

其中X代表＝N-OH基团，

和R代表选自下列的基团

A代表氢原子或与B一起代表碳-碳键，

B代表氢原子、羟基或与A一起代表碳-碳键，

C代表氢原子或与D一起代表碳-碳键，

D代表氢原子或与C一起代表碳-碳键，

E代表氢原子或与F一起代表碳-碳键，

F代表氢原子或与E一起代表碳-碳键，

或其与药学可接受的酸的加成盐中的一种，或其酯中的一种或与 所述酯的药学可接受酸的加成盐中的一种，

在制备除神经保护药物以外的细胞保护药物中的用途。

如上定义的式I的化合物是已知的(WO2004/082581)。

与药学可接受的酸的加成盐可以是例如与盐酸、氢溴酸、硝酸、 硫酸、磷酸、乙酸、甲酸、丙酸、苯甲酸、马来酸、延胡索酸、琥珀 酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、乙醛酸、门冬氨酸、烷-磺酸例如甲或乙 磺酸、芳基磺酸例如苯或对甲苯磺酸或羧酸。

根据本发明，肟基代表纯或混合的顺式和反式异构体，与相对于 C＝N双键的N-O键的方向有关。

在上述的化合物中，特别优选的上述化合物是，其中：

- A与B一起代表碳-碳键，C、D代表氢原子，E、F代表氢原子 或一起代表碳-碳键，且R具有R1的含义，

- A与B一起代表碳-碳键，C、D代表氢原子，E、F代表氢原子， 且R具有R2或R3或R4的含义，

- A与B一起代表双键，C与D一起代表碳-碳键，E、F代表氢原 子，且R具有R1或R6的含义，

- A与B一起代表双键，C与D一起代表碳-碳键，E与F一起代 表碳-碳键，且R具有R1的含义，

- E与F一起代表双键，C、D、A、B代表氢原子，且R具有R1 的含义，

以及它们与药学上可接受的酸的加成盐。

有利地，根据本发明，使用至少一种式I的化合物，选自

-胆甾烷-3-酮肟，

-胆甾-4-烯-3-酮肟，

-胆甾-1，4-二烯-3-酮肟，

或其与药学可接受的酸的加成盐中的一种，或其酯中的一种或与 所述酯的药学可接受酸的加成盐中的一种。

优选地，使用胆甾-4-烯-3-酮肟或胆甾-1，4-二烯-3-酮肟，或其 与药学可接受的酸的加成盐中的一种，或其酯中的一种或与所述酯的 药学可接受酸的加成盐中的一种。

式I的化合物的令人感兴趣的细胞保护性质为下列用途提供了理 由：制备细胞保护药物，特别是打算用于治疗或预防坏死、和/或病理 性细胞凋亡和/或坏死性细胞凋亡(抗坏死和/或抗细胞凋亡和/或抗坏 死性细胞凋亡药物)或其他疾病例如

骨、关节、结缔组织和软骨的疾病，

肌肉疾病，

皮肤疾病，

心血管疾病，

循环疾病，

血液和血管疾病，

肺的疾病，

胃肠道的疾病，

肝的疾病，

胰脏的疾病，

代谢性疾病，

肾的疾病，

重度中毒，

与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)有关的变性疾病，

与老化有关的障碍，

牙齿疾病，

眼科疾病或障碍，

听觉道的疾病，

与线粒体(线粒体病状)有关的疾病。

本发明同时感兴趣的是保护细胞、组织和/或移植的器官，不管是 在移植之前、期间(去除、运输和/或再移植)或之后。

有利地，式I的化合物可以用于制备用于保护心脏细胞的药物(心 脏保护药物)，保护肝脏细胞的药物(肝保护药物)或用于治疗或预防与 线粒体有关的疾病。

根据本发明，式I的化合物有利地以生理有效剂量存在于细胞保 护药物中；所述药物特别地包含有效细胞保护剂量的至少一种式I的 化合物。

作为药物，满足式I的化合物，它们的酯，它们的与药学可接受 的酸的加成盐以及与所述酯的药学可接受的酸的加成盐可以配制成用 于消化或胃肠外途径。

根据本发明的药物可以进一步包含至少一种其他治疗活性成分， 其对于相同病理或不同病理具有活性，用于同时、分别使用或顺序使 用，特别是当治疗受前述病状中的一种影响的患者的时候。

根据本发明，式I的化合物可以在药物中使用，与一种或多种惰 性，即，药理无活性和无毒性的赋形剂或载体混合。所提及的例子是 由与药学用途相容并且本领域技术人员已知的盐水、生理溶液、等张 溶液、缓冲溶液等等制成。该组合物可以包含一种或多种选自分散剂、 增溶剂、稳定剂、防腐剂等等的试剂或载体。可以在制剂(液体和/或 注射剂，和/或固体制剂)中使用的试剂或载体特别是甲基纤维素、羟 甲基纤维素、羧甲基纤维素、环糊精、聚山梨酯80、甘露醇、明胶、 乳糖、植物或动物油、阿拉伯胶等。优选地，使用植物油。该组合物 可以配制成可注射的混悬液、凝胶剂、油、片剂、栓剂、粉末剂、明 胶胶囊、胶囊等等，可以通过盖伦制剂或装置产生延长和/或延迟释放。 对于这种类型的制剂，有利地使用试剂例如纤维素、碳酸酯或淀粉。

可以通过本领域技术人员已知的任意方法来进行施用，优选口服 或注射，典型地，通过腹膜内、大脑内、鞘内、静脉内、动脉内或肌 内途径。优选口服。如果是长期治疗，优选的施用途经是舌下、口服 或经皮。

对于注射，该化合物一般包装成液体混悬液，其可以通过例如注 射器或灌注装置来注射。应当理解的是，流速和/或注射剂量或一般的 给药剂量可以是本领域技术人员根据患者、病状、施用方法等等来调 节。应当理解的是，可以与其他活性成分或任何药学可接受的载体(在 稳定剂存在下缓冲剂、盐水、等张溶液等等)组合进行重复施用。

本发明可以在哺乳动物，特别是人中使用。

一般地，该化合物的每日剂量是获得期望的治疗效果的最小剂量。 上述化合物，例如胆甾-4-烯-3-酮肟的剂量一般是，对于人每日0.001 到100mg/kg。

如果需要，可以将每日剂量以每日2，3，4，5，6或更多次或在 全天以适当间隔以多次亚剂量施用。

所选择的量将取决于多种因素，特别是施用途径、施用持续时间、 施用的时点、化合物的清除率、与化合物联合施用的不同产品、患者 的年龄、体重和身体情况，以及他/她的医疗史和医学已知的任何其他 信息。

主治医师的处方可以以小于一般使用量的剂量开始，然后逐渐增 加剂量以更好地控制可能的继发效应的发生。

实施例1：胆甾-4-烯-3-酮肟的抗细胞凋亡效果

在心肌细胞上，通过多柔比星诱导的收缩机能障碍分析胆甾-4- 烯-3-酮肟的抗细胞凋亡性质。

使用浓度为10mM的胆甾-4-烯-3-酮肟的100％DMSO母液。不依赖 于所使用的分子浓度，在所有实验点，在DMSO中的最终浓度都是相同 的。测定在Tyrode的溶液(组合物的组成mmol/L：NaCl 135，KCl 5.4， NaH₂PO₄ 0.33，CaCl₂ 1.2，MgCl₂ 1.0，Hepes 10；用NaOH将pH调节 为7.4)中稀释成浓度为0.3，1和3μM的胆甾-4-烯-3-酮肟。

方法

兔心室心肌细胞的收缩和凋亡

A.1 获得兔心室心肌细胞的分离细胞

如A.d’Anglemont de Tassigny等人，Fund.Clin.Pharmacol.， 18：pp.531-38，2004所述，从新西兰雄兔的心脏获得分离的心室细 胞。简言之，用戊巴比妥(50mg/kg)溶液麻醉兔子(2.0-2.5kg)，然 后接受肝素(200IU/kg)。切除心脏，并立即通过Langendorff装置用 氧化(无钙)的tyrode等张溶液(95％，2-5％ CO₂)(单位mM：NaCl 135， KCl 5.4，Na₂PO₄ 0.33，MgCl₂ 1.0，Hepes 10，在37℃下用NaOH将 pH调节为7.4，280-300mOsmol/kg H₂O)灌注10-15分钟，而无再循 环。接着，在“再循环”模式下，在加入1mg/mL的II型胶原酶和 0.28mg/mL的XIV型蛋白酶的相同的无钙Tyrode溶液(冠状流速， 10-15mL/分钟)灌注所有心脏3分钟。最后，在无再循环的模式下， 用补充有0.3mM CaCl₂的相同Tyrode溶液灌注所有心脏10分钟。去 除左心室，切成小片；通过温和的机械搅拌实现细胞分离。通过每15 分钟增量来加入细胞外的钙，以使生理学浓度达到1.0mM。将所分离 的肌细胞保持在没有血清的介质中，该介质包含(mM)NaCl 110，KCl 5.4，Na₂PO₄ 0.33，NaHCO₃ 25，葡萄糖5，MgCl₂ 0.8，CaCl₂ 1，pH 调节为7.4，在实验前维持1.5小时。所有细胞都是杆状的，具有淡 白色的交叉纹，并且在光学显微镜下它们的表面上没有任何载体。

A.2 用膜联蛋白V标记

通过使用MiniMacs细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch， Gladbach，Germany)将用膜联蛋白V标记的磷脂酰丝氨酸用作测定细 胞凋亡的定量方法。简言之，用膜联蛋白V微珠通过磁力标记暴露着 磷脂酰丝氨酸的细胞，然后使其通过位于磁场中的柱。将标记的细胞 (其具有磁力标记的磷脂酰丝氨酸)保存在柱中，而未标记的细胞(坏 死的细胞和未凋亡的细胞)不保存。从磁场中移出该柱；洗脱磁力保持 的暴露着磷脂酰丝氨酸的细胞作为阳性部分，并用Mallassez细胞计 数器进行计数。然后计算相对于细胞初始数目的凋亡细胞的百分比。

A.3 半胱天冬酶-3活性的测定

使用半胱天冬酶-3活性用作测定细胞凋亡的定量方法。简言之， 细胞溶解，通过使用AK-005试剂盒(Biomol Research Labortories， Plymouth Meeting，PA，USA)将上清液用于半胱天冬酶-3活性的测定。 用荧光染料，7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)标记用于测定半胱天冬酶-3 活性的荧光产生底物(DEVD)，其中AMC在360/460nm处在UV光下产 生210分钟的可检测的黄-绿荧光。通过半胱天冬酶-3的分离，AMC 从底物中释放出来，酶的表达表示为fmol/分钟。

A.4 收缩性的测定

在37℃下将肌细胞转移一个室中，连续灌注并放置在倒置显微镜 台上。用生理缓冲液灌注该室，该缓冲液包含(mM)：NaCl 140；KCl 5.4； CaCl₂ 1；MgCl₂ 0.8；Hepes 10和葡萄糖5.6(pH＝7.4；290mOsmol/ kgH₂O)。

用放置在该室中并与模拟器连接的铂场电极每秒1次(1Hz)诱导 肌细胞收缩。用x 20物镜连续捕捉图像，并以240个样品/s的速度 传送到CCD照相机中。将CCD照相机的图像投射到视频屏幕上。

根据下列标准选择用于研究的肌细胞：杆状外形，具有非常明显 的纹，没有细胞内空泡，当用1mM Ca²⁺刺激时没有自发性收缩，具有 恒定的静息长度和收缩幅度。通过视频图像分析程序测定sarcomers 的长度，以240个样品/s的速度捕捉数据。将照相机图像转变成 sarcomer长度的测量值。根据sarcomers长度的这些数据计算收缩的 百分比。

A.5 数据分析

所有数据都表示为平均值±标准误差。通过ANOVA，然后Student 检验来进行不同组之间的数据比较，将显著性差异设定为p<0.05。

■实验方法

通过将心肌细胞暴露在加入到等张溶液的1μM多柔比星中3到 8小时来诱导其凋亡，其中该等张溶液包含(mM)：NaCl 110，KCl 5.4， Na₂PO₄ 0.33，NaHCO₃ 25，葡萄糖 5，MgCl₂0.8，CaCl₂ 1，pH调节为 7.4。在开始暴露于多柔比星3小时后开始进行膜联蛋白V标记，因为 此现象在细胞凋亡级联中出现的非常早。在开始暴露于多柔比星8小 时后开始进行半胱天冬酶-3活性的测定，因为该现象在凋亡现象中发 生的较晚。在暴露于多柔比星的8小时期间，每小时测量心肌细胞的 收缩性。在所有的处理后，将该细胞与未暴露于多柔比星的对照心肌 细胞进行比较。

在暴露于多柔比星前，用胆甾-4-烯-3-酮肟预处理该心肌细胞15 分钟。在该研究期间测定三种浓度的化合物：0.3μM，1μM和3μM。

■结果

在各组中，该研究所使用的细胞的sarcomers的平均长度并没有 显著地差异。

多柔比星对于心肌细胞的收缩性和凋亡的作用

暴露于多柔比星导致sarcomers的缩小量随着时间而减小。在前 3个小时，多柔比星峰的缩小与对照组类似，在暴露4小时后，其显 著减小(分别相对于多柔比星和对照组的基线为-53.20±7.70％对 -19.49±2.06％，p<0.05，n＝5)。

用1μM的多柔比星处理诱导了细胞凋亡，同时膜联蛋白V标记和 半胱天冬酶-3活性显著增强。

在多柔比星诱导的收缩水平上，胆甾-4-烯-3-酮肟对机能障碍 和细胞凋亡的作用

用1μM的多柔比星处理导致心室心肌细胞的峰的缩小量显著减 小，而在胆甾-4-烯-3-酮肟存在下(0.3μM，1μM和3μM)消除了这种 现象。确实，在暴露4小时后，相对于基线在多柔比星下峰的缩小 (-53.20±7.70％)在0.3μM(-25.35±0.18％)，1μM(-15.66± 5.72％)和3μM(-13.95±3.17％)的该化合物存在下显著减小.

此外，由于0.3μM，1μM和3μM的胆甾-4-烯-3-酮肟阻断了多 柔比星，因此膜联蛋白V标记和半胱天冬酶-3活性增强。

用暴露于多柔比星3小时后膜联蛋白V标记的改变％来评价细胞凋 亡，得到下列结果：对照组：100％；多柔比星：291％±32；多柔比 星+0.3μM胆甾-4-烯-3-酮肟：130％±12.43；多柔比星+1μM胆甾 -4-烯-3-酮肟：121％±4.74；多柔比星+3μM胆甾-4-烯-3-酮肟： 115.5％±16.35。测定半胱天冬酶-3活性的结果如下：对照组：18 ±9fmol/分钟；多柔比星：120±15fmol/分钟；多柔比星+0.3 μM胆甾-4-烯-3-酮肟：33±9fmol/分钟；多柔比星+1μM胆甾-4- 烯-3-酮肟：18±8fmol/分钟；多柔比星+3μM胆甾-4-烯-3-酮肟： 11±4fmol/分钟.

■注释和结论

对于分离的兔心肌细胞，胆甾-4-烯-3-酮肟化合物对于多柔比星 诱导的收缩机能障碍和对细胞凋亡显示了心脏保护效果。当以适当剂 量使用时，该分子可以确实地保护心脏免于多柔比星诱导的心脏毒性 的损害，人们已知这种毒性是用该蒽环类抗生素治疗癌症的限制性因 素。因此，胆甾-4-烯-3-酮肟化合物可以用于在这些患者中限制多柔 比星的心脏毒性。

实施例2：胆甾-4-烯-3-酮肟在急性肝毒性的体内模型中的效果

像许多其他细胞一样，肝细胞在它们的细胞质膜上具有Fas/CD95 受体。通过激活半胱天冬酶级联，刺激Fas途径会诱导细胞死亡。

单次注射Jo2抗-Fas抗体可以诱导急性肝损害模型(Ogasawara 等人，Nature，1993年8月)，产生了严重的肝损害，类似于病毒性、 自身免疫性或药物诱导性肝炎。

丙氨酸氨基转换酶(ALAT)也称作血清谷丙转氨酶(SGPT)，是一种 存在于肝细胞中的酶。在肝脏溶解后其活性在血浆中显著增强，因此 是评价肝损害的良好标志。

所进行的实验包括，用Jo2麻醉动物，然后进行ALATs的测定， 并测定胆甾-4-烯-3-酮肟保护肝细胞的能力。

物质和方法

动物

使用来自培养者“Elevage Janvier”(Le Genest-Saint-lse， France)的雄性成年CD1小鼠。分别鉴定这些动物，并自由摄取水和食 物。

将装置维持在可控的明亮循环(7:00am-7:00pm)中，温度为 20±2℃，湿度为50±2％。

Jo2抗体的制备

单克隆仑鼠抗-小鼠CD95受体(Fas)抗体称作Jo2，其来自于 Pharmingen(BD Biosciences，ref.554254批次66081)，其母液是浓 度为1mg/mL的水溶液。在0.9％氯化钠的水溶液中制备所使用的稀释 液。

受试化合物的制备

称取需要量的胆甾-4-烯-3-酮肟，并研磨成精细粉末，然后悬浮 在玉米油中(60mg/mL)。口服(通过强制喂食)浓度为5ml/kg的化合 物。

方法

在施用Jo2抗体前，以300mg/kg口服来进行胆甾-4-烯-3-酮肟 的预治疗。以5mL/kg体重的体积，以125μg/kg的剂量，通过腹膜 内注射来施用Jo2抗体。

在施用抗体前，让动物接受用于制备受试化合物相同体积而没有 该化合物的玉米油口服预治疗4小时，用该动物获得对照。

测定ALATs

在施用Jo2后24小时，从麻醉的小鼠中取血样。根据IFCC(国际 化学家联合会)的标准化方法，通过使用具有分光光度计(Hitachi Modular)的试剂盒(Roche Diagnostics)进行ALATs的测定。

结果和结论

在注射后24小时内，在对照组的19只小鼠中，以125μg/kg 腹膜内施用Jo2导致3只小鼠死亡。

300mg/kg的受试化合物显著降低了ALAT活性。

表1：在施用Jo2 24小时后测定的ALAT活性

 

治疗 ALAT活性(U/L) 平均值+/-SEM(n)对照2,586±474(16)胆甾-4-烯-3-酮肟(300mg/kg)1,136±175(20)**

**：p＝0.0037，相对于对照组进行t-检验

在施用Jo2抗体4小时前施用300mg/kg的胆甾-4-烯-3-酮肟， 可以：

-预防接受Jo2抗体的小鼠在注射后24小时内死亡；

-限制不致命剂量的抗体诱导的细胞死亡；用胆甾-4-烯-3-酮肟治 疗的小鼠中，血浆中ALAT活性作为肝细胞溶解的生物标记显著低于未 治疗的对照小鼠。

结论

在通过抗-Fas(Jo2)抗体诱导的小鼠急性肝毒性模型中，可以证明 胆甾-4-烯-3-酮肟的肝保护性质。

由于这些显著的效果，可以关注式I的化合物在制备一般的细胞 保护药物中的用途。

毒理学研究

通过每日施用的治疗方法，以高达300mg/kg/天的剂量范围，经 口服、皮下、腹膜内和静脉内途径在小鼠中施用，特别是胆甾-4-烯-3- 酮肟，可以延长至最长28天，都没有显示任何明显的毒性。

在猴子中，在10天时间中，口服逐渐增加的每日剂量，最高达 1,500mg/kg，没有显示任何毒性。