一类具抗肿瘤活性的水溶性酚性三萜化合物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种结构式如(I)所示的，具抗肿瘤活性的水溶性酚性三萜化合物，以及以醌甲基三萜化合物为起始原料的制备方法。化合物结构式(I)中，R1为H或C1－C12烷基，M为Na、K、NH4或Ca，R2为H、C1－C12烷基或C1－C12酰基，R3、R4为H或OH，或者R3为H且R4为(＝O)或R3、R4所在的7－8位碳原子间为双键。本发明公开的化合物可制成药学上的各种剂型，包括注射剂，片剂，胶囊剂，颗粒剂和搽剂，特别适合于制备注射剂。

说明书

技术领域

本发明涉及酚性三萜化合物，更具体地说涉及一类具抗肿瘤活性的水溶性酚性三萜化合物及其制备方法。

背景技术

癌症是人类健康的大敌，是疾病导致死亡的头号杀手，目前，中国每年死于癌症的人数为140万到150万，其造成的经济损失，专家估计为每年140亿。抗肿瘤药物治疗是癌症治疗的主要方法之一，天然产物是发现新抗肿瘤药物的宝库，许多抗肿瘤药物的先导化合物都是从天然中获得，如长春碱、长春新碱、喜树碱、紫杉醇等，但这些天然化合物往往由于毒副作用、溶解性、稳定性等，需要进行结构修饰或改造，才能成为临床使用的抗肿瘤药物。

醌甲基三萜化合物是天然存在的一类具有抗肿瘤作用的化合物，由于其A环存在特异的醌甲基结构，使得其具备抗肿瘤活性的同时，也容易发生聚合等反应，在溶液中对PH值高度敏感，在酸性和碱性条件下均不稳定，异发生开环、重排等多种反应[文献1：K.Nakanishi，Y.Takahashi andH.Budzikiewicz，Pristimerin.Spectroscopic Properties of the Dienone-Phenol-Type Rearrangement Products and other Derivatives.J.Org.Chem.30：1729(1965)]。天然产生的醌甲基三萜化合物为酯溶性成分，在水中几乎不溶解，难以直接以静脉注射方式给药。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种6位带磺酸基并成盐的水溶性酚性三萜化合物，以克服醌甲基三萜化合物对PH值高度敏感的缺点，并大大增加水溶性。

本发明的另一目的是提供该化合物的制备方法。

本发明提供了一种具有体内抗癌活性的水溶性酚性三萜类化合物，其结构式如下式所示：

M＝Na、K、NH₄或Ca；

R₁＝H或C₁-C₁₂烷基；

R₂＝H、C₁-C₁₂烷基或C₁-C₁₂酰基等；

R₃、R₄为H或OH，或者R₃为H且R₄为(＝O)，

或R₃、R₄所在的7、8位碳原子间为双键。

本发明还涉及上述化合物(I)的结晶水合物及化合物(I)在药学上可接受的剂型。

本发明化合物(I)的制备方法，包括以下步骤：

a)醌甲基三萜化合物用与水相混溶的有机溶剂溶解后，和亚硫酸氢盐的水溶液混合均匀，在室温下搅拌至反应溶液呈接近无色；40℃以下减压浓缩至干，得粗品，反应式如下所示。

b)步骤a)所得粗品中加入甲醇、无水乙醇或异丙醇使其溶解，过滤，滤液40℃以下减压浓缩至干，所得固体用溶剂于0～4℃重结晶，析出白色结晶，过滤，即得产品。

上述制备方法中，醌甲基三萜化合物是指2位为羰基，1与10位间、3与4位间、5与6位间都为双键，4位为甲基，3位为羟基或烷氧基或酰氧基的三萜化合物。

上述步骤a)中，溶解醌甲基三萜化合物的与水混溶的有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇或四氢呋喃，优选乙醇。亚硫酸氢盐选自亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铵或亚硫酸氢钙，优选亚硫酸氢钠。

上述制备方法中，醌甲基三萜化合物与亚硫酸氢盐的摩尔比为1∶1～1.2，优选1∶1.1。

上述步骤b)中，重结晶所用的溶剂选自甲醇、乙醇、氯仿-甲醇、丙酮-水、甲醇-水、乙醇-水、异丙醇-水或者四氢呋喃-水，优选乙醇-水。

本发明的化合物(I)可以制成药学上的各种剂型，包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂和搽剂等各种剂型，特别适合于制备注射剂。

本发明动物体内药理试验结果显示，对人前列腺癌PC-3裸小鼠移植瘤的生长有明显抑制作用。人前列腺癌PC-3细胞株为抗肿瘤药物普筛的细胞株，本发明涉及的一类化合物对各种实体瘤、腺瘤、血液系统肿瘤均有治疗作用，由于可以静脉注射方式给药，尤其适合于对血液系统肿瘤如：慢性粒细胞白血病，多发性骨髓瘤等的治疗。

本发明的有益效果：

本发明公开的化合物具备优良的水溶性，能配置成稳定的溶液，尤其适合于静脉注射给药方式，并且具有较好的抗肿瘤活性。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1：由南蛇藤素(Celastrol)为原料制备化合物A。

取20.5mg南蛇藤素(Celastrol)用1ml丙酮溶解后，向其中加入0.5ml亚硫酸氢钠水溶液(含亚硫酸氢钠5.66mg)，搅拌下反应至溶液变为无色澄清。40℃下减压浓缩至干，得白色粉末。加异丙醇使溶解，过滤，滤液40℃以下减压浓缩至干，用乙醇-水于0～4℃重结晶，析出白色结晶，减压过滤得白色针状结晶20.8mg。

实施例2：由南蛇藤素(Celastrol)为原料制备化合物A。

取502mg南蛇藤素(Celastrol)用10ml乙醇溶解后，向其中加入5ml亚硫酸氢钠水溶液(含亚硫酸氢钠128mg)，搅拌下反应1小时，溶液变为近无色澄清的溶液。40℃下减压浓缩至干，得白色粉末。加无水乙醇使溶解，过滤，滤液40℃以下减压浓缩至干，用乙醇-水于0～4℃重结晶，析出白色结晶，减压过滤得白色针状结晶516mg。

分析结果：

化合物A的核磁共振光谱数据：

¹HNMR(DMSO-d₆，300M)，δ 12.01(1H，s，-COOH)，8.81(1H，s，-OH)，7.62(1H，s，-OH)，6.58(3H，s，H-1)，5.81(1H，d，J＝6.2Hz，H-7)，4.49(1H，d，J＝6.2Hz，H-6)，2.21(3H，s.23-CH₃)，1.62(3H，s，25-CH₃)，1.18(3H，s，26-CH₃)，1.09(3H，s，30-CH₃)，1.05(3H，s，28-CH₃)，0.59(3H，s，27-CH₃)。

¹³CNMR(DMSO，300M)，δ 179.87(C-29)，149.03(C-8)，143.68(C-2)，141.57(C-10)，140.54(C-3)，122.85(C-4)，121.44(C-5)，118.30(C-7)，108.67(C-1)，59.79(C-6)，44.03(C-18)，43.56(C-14)，39.50(C-20)，37.67(C-9)，37.50(C-13)，36.60^*(C-11)，36.60^*(C-16)，34.76^*(C-22)，34.41(C-25)，32.63(C-30)，31.55(C-28)，30.21(C-12)，30.21(C-17)，30.21(C-19)，29.7(C-21)，28.65(C-15)，21.21(C-26)，18.04(C-27)，13.19(C-23)。^*表示可能应互换的归属。

A的质谱数据：ESI-MS(负离子)：m/z 531.7。

实施例3：由南蛇藤素(Celastrol)为原料制备化合物A。

取10.58g南蛇藤素(Celastrol)用100ml乙醇溶解后，向其中加入50ml亚硫酸氢钠水溶液(含亚硫酸氢钠2.64g)，搅拌下反应1小时，溶液变为近无色澄清的溶液。40℃下减压浓缩至干，得白色粉末。加无水乙醇使溶解，过滤，滤液40℃以下减压浓缩至干，加入约170ml无水乙醇和7ml水，超声使溶解，0～4℃放置，析出白色晶体，过滤得11.4克。

实施例4：由扁蒴藤素(Pristimerin)为原料制备化合物B。

取19.5mg扁蒴藤素(Pristimerin)用1ml乙醇溶解后，向其中加入0.5ml亚硫酸氢钠水溶液(含亚硫酸氢钠4.80mg)，搅拌下反应1小时，溶液变为无色澄清的溶液。40℃下减压浓缩至干，得白色粉末。加异丙醇使溶解，过滤，滤液40℃以下减压浓缩至干，用乙醇—水重结晶，过滤，得白色针状结晶19.2mg。

分析结果：

化合物B的核磁共振氢谱数据：

¹H NMR(DMSO-d₆，300M)，δ 8.72(1H，br s，-OH)，7.58(1H，br s，-OH)，6.53(3H，s，H-1)，5.79(1H，d，J＝5.6Hz，H-7)，4.43(1H，d，J＝5.6Hz，H-6)，2.20(3H，s.23-CH₃)，1.62(3H，s，25-CH₃)，1.18(3H，s，26-CH₃)，1.10(3H，s，30-CH₃)，1.06(3H，s，28-CH₃)，0.42(3H，s，27-CH₃)。

实施例5：用相同的方法还可以制备如下的化合物：

实施例6：制备化合物A的注射剂

取化合物A 3.7g，亚硫酸氢钠5g，加水10L溶解。经0.22微米孔径的微孔滤膜过滤，分装于7ml容量的玻璃小瓶，3ml/瓶，加胶塞和铝盖密封。116℃湿压灭菌30min，即得。

实施例7：化合物A注射剂制备过程中稳定性考察。

实验条件：色谱柱为迪马C18，5μ，250×4.6mm柱，Agilent 1100 DAD检测器，检测波长210nm，流动相：乙腈—0.02M KH₂PO₄(含体积比千分之一的四丁基氢氧化铵，并用三乙胺调PH至7.35)(35∶65)，流速1ml/min。进样量：20μl。

样品：实施例6中制备化合物A注射剂过程中各步的溶液。

实验数据：微孔滤膜过滤前的峰面积1084.4，过滤后的峰面积1078.2，湿压灭菌后的峰面积1072.9

试验结果显示：化合物A在制成注射剂的过程中稳定性良好。

实施例8：化合物A的注射剂稳定性考察

实验条件：色谱柱为迪马C18，5μ，250×4.6mm柱，Waters 3487检测器，检测波长210nm，流动相为：乙腈—0.02M KH₂PO₄(含体积比千分之一的四丁基氢氧化铵并用三乙胺调PH至7.35)(35∶65)，流速1ml/min。

实验方法：实施例6所得制剂于0～5℃保存，分别于0天、7天、14天、21天、30天和45天精密移取1ml，用水溶液定容至5ml，即得样品溶液。将样品溶液和对照品溶液各20μl注入色谱仪，记录色谱峰面积，计算样品溶液含量。

实验数据：如下表所示。

表1：化合物A的注射剂稳定性考察

试验结果表明，表明该溶液具有良好的稳定性。

实施例9：化合物A在PH偏酸和偏碱条件下稳定性考察

实验条件：色谱柱为迪马C18，5μ，250×4.6mm柱，Waters 3487检测器，检测波长210nm，流动相为：乙腈—0.02M KH₂PO₄(含体积比千分之一的四丁基氢氧化铵并用三乙胺调PH至7.35)(35∶65)，流速1ml/min。

实验方法：取化合物A用蒸馏水配成约5mg/ml的溶液，分别量取0.1ml加至下列溶液中：a)1ml PH＝2的盐酸稀溶液，b)1ml蒸馏水，c)1ml PH＝10的碳酸钠稀溶液。于室温下放置2小时后，量取上述三种溶液各0.1ml分别加至1ml流动相中，进样20μl注入液相色谱仪，测定峰面积并计算。

实验结果：见下表。

表2：化合物A在PH偏酸和偏碱条件下稳定性的比较

 

化合物APH＝2蒸馏水PH＝10峰面积124738512069261232216百分比^*103.4％100％102.1％

^*以在蒸馏水中的峰面积为100％来计算。

试验结果表明：化合物A在PH偏酸和偏碱条件下稳定性良好。

实施例10：化合物A的动物体内药理活性实验。

化合物A对人前列腺癌PC-3裸小鼠移植瘤的实验治疗作用试验由上海华拓医药科技发展股份有限公司委托中科院上海药物研究所完成。

受试化合物：化合物A。

阳性对照药物：丝裂霉素(MMC)，协和发酵工业株式会社生产，批号：468AEF，2mg/瓶，使用时用生理盐水稀释。

动物和移植瘤：BALB/cA裸小鼠，雌性45-50日龄，体重20±1g。人前列腺癌PC-3裸小鼠移植瘤，由PC-3细胞株接种于裸小鼠皮下而建立。

评价方法：

TV(mm³)为肿瘤体积，计算公式为：TV＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长、宽。d₀为分笼给药时测量所得肿瘤体积，d₂₄为试验第24天时测量所得肿瘤体积。RTV为相对肿瘤体积，计算公式为：RTV＝V_t/V₀。其中V₀为分笼给药时(即d₀)测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：

T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100

TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。

疗效评价标准：T/C(％)>60％为无效，T/C(％)<＝60，并经统计学处理p<0.05为有效。

药理试验结果：见下表。

表3：化合物A对人前列腺癌PC-3裸小鼠移植瘤的实验治疗作用

试验结果表明：化合物A对人前列腺癌PC-3裸小鼠移植瘤的生长有明显抑制作用。