甘蓝型油菜杂交种种子纯度快速鉴定方法

摘要

本发明公开了一种甘蓝型油菜杂交种种子纯度快速鉴定方法，具体包括以下步骤：将种子压扁用2－氯乙醇溶液浸泡2～3h提取醇溶蛋白，然后用分离胶和浓缩胶进行电泳分离，电泳结束后进行固定、染色、脱色显带，最后通过读带计算出油菜杂交种种子的纯度。本发明的鉴定方法具有操作简单、成本低、效率高、准确性高等优点。

说明书

技术领域

本发明属于油菜育种与应用技术领域，具体涉及油菜杂交品种种子纯度的鉴定方法。

背景技术

杂交油菜作为我国推动油菜生产发展的主要育种技术近年取得了快速发展，显著特征是育成品种越来越多，应用范围越来越广。随着杂交油菜的日益普及，种子的纯度质量控制则显得越来越重要，尤其是对以细胞质雄性不育为主体的杂交种类型，该不育类型的母本对温度反应敏感，在低温下易产生微量花粉，并以自交方式产生不育母本型假杂种，严重时可造成杂交油菜的大幅度减产。因此，在油菜杂交种应用于生产以前，必须进行严格的纯度鉴定。

种子纯度鉴定仍是目前困扰油菜种子检验工作的一个难题。目前我国油菜杂交种纯度鉴定大多采用异地异季种植鉴定，然而异地异季鉴定的缺陷也日益突出：一则鉴定周期长，满足不了生产销售的时间要求；二则冬性强的品种可能会因春化受阻不能进行鉴定；再则，异季鉴定要求及时播种，需要在种子未完全成熟时进行取样，样品种子的发芽率低，极有可能造成鉴定结果与真实值不符。因此，快速、可靠的杂交油菜纯度鉴定方法在油菜生产应用中显得极为紧迫和必要。

生化标记具有简便、廉价、高效等优点，特别是以同工酶、贮藏蛋白电泳技术为代表的生化标记，目前已经被广泛应用于农作物的种子纯度鉴定工作，并取得了较好的效果。随着生化技术的不断发展，国内外学者不断致力于各种生化标记电泳检测技术的标准化研究，技术得到了不断地完善。近几年，同工酶已开始被应用于油菜的品种纯度鉴定，例如利用酯酶同工酶谱分析鉴定杂交油菜秦优2号种子的纯度结果与种植鉴定吻合，还有利用酯酶同工酶和AFLP(扩增片段长度多态性)标记鉴定甘蓝型油菜“中油杂2号”种子纯度的结果和种植鉴定、AFLP均很吻合。然而，同工酶鉴定方法需要对油菜育苗，从发芽到出苗需要几天的时间，并且同工酶电泳谱带较模糊，易错读而造成鉴定结果出现偏差，给纯度鉴定带来诸多不便。醇溶蛋白电泳技术直接以种子为材料进行分析，不需要育苗，作为一种贮藏蛋白电泳技术已在小麦、玉米、水稻等禾本科作物的种子纯度鉴定中得到应用，但是甘蓝型油菜种子醇溶蛋白含量很少，利用目前禾本科作物上广泛应用的电泳、染色方法较难进行检测，而其他生化鉴定及分子标记方法操作步骤复杂、成本较高、检测周期较长。迄今为止，尚未有成功利用醇溶蛋白电泳技术鉴定杂交油菜种子纯度的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、成本低、效率高且能有效鉴定杂交种子纯度的甘蓝型油菜杂交种种子纯度快速鉴定方法。

为解决上述技术问题，本发明的要点在于利用已有的禾谷类作物上的醇溶蛋白提取技术和油菜的同工酶电泳技术，组合并研制了一套适合于甘蓝型油菜醇溶蛋白的电泳检测技术，并应用到甘蓝型油菜杂交品种纯度的鉴定工作中。为此，本发明提出的技术方案为一种甘蓝型油菜杂交种种子纯度快速鉴定方法，具体包括以下步骤：

(1)醇溶蛋白提取：将甘蓝型油菜杂交种样品种子(数量可以为150～250粒)及其父母本的种子(例如5～10粒)压扁，每粒种子用35～40μl的2-氯乙醇溶液浸泡2～3h，所述2-氯乙醇溶液中溶质的体积分数为20～30％；

(2)电泳分离：选用双夹芯式垂直平板电泳槽(可外购，按商品说明书组装)，往所述电泳槽的胶室中灌分离胶至离胶室的后玻璃板顶端3～4cm处，待分离胶凝固后，再往胶室中灌浓缩胶至胶室的后玻璃板顶端，插好点样梳，光照下静置待浓缩胶凝固；拔出点样梳，取每粒种子的浸泡液30～35μl上样于点样孔中，上样完毕后将电泳槽注满pH值为8.0～8.5的电极缓冲液，并往电极缓冲液里滴加溴酚蓝溶液作指示剂；在20～40mA条件下稳流电泳，电泳过程中低浓度的醇溶蛋白经过浓缩胶后被浓缩成薄层，以便于提高分辨率；待指示剂溴酚蓝由浓缩胶顶端向下移动至分离胶顶部时，调电流至50～70mA继续稳流电泳，在分离胶中各种醇溶蛋白将根据不同的电荷效应和分子筛效应分别聚集于分离胶的不同位置，待溴酚蓝下移至分离胶底部时结束电泳；

(3)染色显带：电泳结束后，从电泳槽中取出分离胶，并将其置于固定液中固定20～30min，然后用染色液染色30～40min，最后在脱色液中脱色至肉眼可见的谱带出现；

(4)读带：将上述脱色后的分离胶置于观片灯上读带，对比油菜杂交种及父、母本种子的谱带特征，统计出油菜杂交种种子样品中具有母本谱带特征的种子数量，根据计算公式计算出油菜杂交种种子的纯度，所述计算公式为：

油菜杂交种种子纯度＝(1-具有母本谱带特征的种子数量/杂交种种子样品检测数量)×100％。

上述鉴定方法主要是利用了甘蓝型油菜亲本间醇溶蛋白具有差异性的特点，在实施本发明方法的读带过程中，具有父、母本双方谱带特征的个体为真杂种，只具有母本谱带特征的个体为假杂种，据此便可计算出送检杂交种种子样品的纯度。

上述鉴定方法所用到的分离胶中，丙烯酰胺的质量浓度为7～10％；浓缩胶中丙烯酰胺的质量浓度为2.3～2.5％；所述溴酚蓝溶液中溶质的质量浓度为0.1～0.2％。

上述鉴定方法的电泳分离步骤中，分离胶凝固所需的时间优选30～40min；浓缩胶凝固所需的时间优选20～30min。

上述鉴定方法中用到的固定液由三氯乙酸、甲醇和双蒸水配制而成，其中三氯乙酸的质量浓度为10～15％，甲醇的体积分数为20～40％；所述染色液由乙醇、冰乙酸、考马斯亮蓝R-250、考马斯亮蓝G-250和双蒸水配制而成，其中乙醇的体积分数为20～30％，冰乙酸的体积分数为5～15％，考马斯亮蓝R-250的质量浓度为0.01～0.02％，考马斯亮蓝G-250的质量浓度为0.04～0.05％；所述脱色液由乙醇、冰乙酸和双蒸水配制而成，其中乙醇的体积分数10～15％，冰乙酸的体积分数为5～10％。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中的醇溶蛋白提取步骤不需研磨和离心，可大大减少工作量，提高工作效率；本发明筛选并改良的电泳分离工艺及染色显带技术，具有操作简便、分辨率高、带纹清晰等技术优势。利用本发明方法与田间种植鉴定、简单重复序列(SSR)鉴定对同一批样品进行纯度分析，分析结果显示本发明具有与其它现有鉴定技术同等的准确性和可靠性，更重要的是本发明的鉴定方法操作更为简单、成本更低、效率更高，有效地克服了油菜种植鉴定方法周期长的缺陷，又比SSR鉴定方法简单可行、易于推广，这为降低甘蓝型油菜杂交品种推广应用中的风险提供了技术保障。

附图说明

图1为油菜杂交品种“丰油701”的母本、父本和真杂种的醇溶蛋白电泳图谱，其中泳道A、B、C分别代表母本、父本和真杂种。

图2为本实施例中“丰油701”杂交种部分样品种子的检测结果，其中泳道P1代表母本，具有图示的a、b两条谱带；泳道P2代表父本，具有a、b、c三条谱带；泳道F为检测到的假杂种，只有a、b两条谱带。

具体实施方式

实施例：

利用本发明方法对湖南省作物研究所选育的甘蓝型油菜杂交品种“丰油701”进行检测，以下为检测方法的具体操作流程：

1、主要试剂的配制

(1)醇溶蛋白提取液：取25ml 2-氯乙醇，用双蒸水(ddH₂O)定容到100ml，4℃保存；

(2)贮备液I：取30g丙烯酰胺和0.8g亚甲基双丙烯酰胺，用ddH₂O定容至100ml，4℃保存；

(3)贮备液II：取10g丙烯酰胺和2.5g亚甲基双丙烯酰胺，用ddH₂O定容至100ml，4℃保存；

(4)分离胶缓冲液(pH＝8.9)：取36g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、48ml 1mol/L的盐酸和0.46ml四甲基乙二胺(TEMED)，用ddH₂O定容至100ml，4℃保存；

(5)浓缩胶缓冲液(pH＝6.8)：取5.9g Tris、48ml1 mol/L的盐酸和0.46ml TEMED，用ddH₂O定容至100ml，4℃保存；

(6)电极缓冲液(pH＝8.3)：取6g Tris和28.8g甘氨酸，ddH₂O定容至1L，4℃避光保存(用时稀释10倍)；

(7)蔗糖溶液：取40g蔗糖，用ddH₂O定容至100ml，4℃保存；

(8)核黄素溶液：取4mg核黄素，用ddH₂O定容至100ml，4℃保存；

(9)过硫酸铵溶液：取1.4g过硫酸铵，用ddH₂O定容至100ml，4℃保存；

(10)固定液：取12.5g三氯乙酸和30ml甲醇，用ddH₂O定容至100ml，4℃保存；

(11)染色液：取27ml乙醇、10ml冰乙酸、0.015g考马斯亮蓝R-250和0.045g考马斯亮蓝G-250，用ddH₂O定容至100ml，常温下保存；

(12)脱色液：取120ml乙醇和70ml冰乙酸，用ddH₂O定容至1L，常温下保存；

(13)保存液：取7ml冰乙酸，用ddH₂O定容至100ml，常温下保存。

2、醇溶蛋白提取

取甘蓝型油菜杂交品种“丰油701”的杂交种种子样品200粒及其父、母本种子各10粒，将所取的种子用平头玻璃棒轻轻压扁，置于PCR板(聚碳酸酯材料，96孔)中，每孔中添加醇溶蛋白提取液35μl，常温下密封浸泡2h得浸泡液。浸泡液在4℃条件下可保存7天。

3、电泳分离

(1)凝胶的制备：选用北京六一仪器厂生产的DYCP-37B型双夹芯式垂直平板电泳槽，将配套的前、后玻璃平板夹在胶框内形成胶室，用70℃(50～75℃范围内均可)的质量浓度为1.5％的琼脂糖溶液密封玻璃平板底部；将体积比分别为18∶9∶2∶40的贮备液I、分离胶缓冲液、过硫酸胺溶液和ddH₂O混合均匀配制成40ml的分离胶，将分离胶灌入胶室，灌入体积达到离后玻璃板顶部3cm处，加一层蒸馏水覆盖，静置聚合30min，倒掉蒸馏水；将体积比分别为2∶1∶4∶1的贮备液II、浓缩胶缓冲液、蔗糖溶液和核黄素溶液混合均匀配制成10ml的浓缩胶，将配制的浓缩胶灌入已装有分离胶的胶室至后玻璃板顶端，并迅速插好点样梳，阳光下静置聚合20min；

上述配制成的分离胶中含有质量浓度为7.5％的丙烯酰胺(一般优选在7～8％)、质量浓度为0.2％的亚甲基双丙烯酰胺(一般优选在0.2～0.3％)、质量浓度为5％的Tris、体积分数为6％的盐酸(1M)、体积分数为0.09％的四甲基乙二胺(一般优选在0.09～0.15％)和质量浓度为0.04％的过硫酸铵(一般优选在0.04～0.06％)，余量为ddH₂O；

上述配制成的浓缩胶中含有质量浓度为2.5％的丙烯酰胺(一般优选在2.3～2.5％)、质量浓度为0.6％的亚甲基双丙烯酰胺(一般优选在0.5～0.7％)、质量浓度为0.7％的Tris、体积分数为6％的盐酸(1M)和体积分数为0.19％的四甲基乙二胺(一般优选在0.15～0.25％)，余量为蔗糖、核黄素及ddH₂O；

(2)电泳检测：小心拔出点样梳，吸干点样孔内残留的蒸馏水，每粒种子取30μl浸泡液上样于点样孔；上样完毕后，先用pH值为8.3的电极缓冲液小心覆盖浸泡液，防止倾倒电极缓冲液时冲动浸泡液，然后用电极缓冲液将电泳槽注满，并往电极缓冲液中加1滴质量浓度为0.2％的溴酚蓝溶液作指示剂；4～15℃条件下，先30mA稳流电泳，醇溶蛋白在电压的作用下自上而下泳动，在浓缩胶中被浓缩成高浓度的醇溶蛋白薄层；待指示剂溴酚蓝由浓缩胶顶端向下移动至分离胶顶端时，调电流至60mA继续稳流电泳，在分离胶中各种醇溶蛋白将根据不同的电荷效应和分子筛效应分别聚集于分离胶中的不同位置，待溴酚蓝至分离胶底部时结束电泳。

4、染色显带

电泳结束后，将中间夹有浓缩胶和分离胶的前、后玻璃板从电泳槽中取出，用刀片小心将后玻璃板与韧性较强的分离胶分开，并将分离胶转移至固定液中固定30min，然后转移至染色液中染色30min，最后在脱色液中脱色至肉眼清晰可见的谱带出现。若需保存分离胶，可置于4℃保存液中最长保存6个月。

5、读带

将上述脱色后的分离胶置于观片灯上读带，对比油菜杂交种及父、母本种子的谱带特征，统计出“丰油701”油菜杂交种种子样品中具有母本谱带特征的种子数量，并根据计算公式计算出油菜杂交种种子的纯度为81.9％，计算公式为：

油菜杂交种种子纯度＝(1-具有母本谱带特征的种子数量/杂交种种子样品检测数量)×100％。

6、技术效果检验

将上述“丰油701”杂交种种子样品同时进行种植鉴定和SSR鉴定，其中种植鉴定利用盛花期育性表现调查纯度，纯度计算结果83.8％；SSR鉴定利用母本与杂交种间PCR扩增片段差异进行鉴定，纯度计算结果为81.2％。种植鉴定的杂交种种子纯度计算公式为：杂交种种子纯度＝(1-不育株数/总调查株数)×100％；SSR杂交种种子纯度的计算公式为：杂交种种子纯度＝(1-具母本谱带特征的个体数量/总检测数量)×100％。

可见，三种方法检测的纯度结果非常吻合，表明了本发明方法在油菜杂交种种子纯度鉴定上具有很好的可靠性；并且从鉴定周期的长短上考虑，种植鉴定的周期至少为100天，SSR鉴定的周期至少为4天，而本发明方法的鉴定周期最短可为1天，这又充分说明本发明方法在达到相同鉴定效果的前提下，检测效率大大提高。