多孔树脂珠的制备方法

摘要

本发明提供一种多孔树脂珠的制备方法。本发明涉及一种用于制备包含芳香族乙烯基化合物－羟基苯乙烯－二(甲基)丙烯酸酯共聚物的多孔树脂珠的方法，所述方法包括：在有机溶剂中溶解单体混合物和聚合引发剂以获得包含所述单体混合物和所述聚合引发剂的溶液，所述单体混合物包含芳香族乙烯基化合物、酰氧基苯乙烯和二(甲基)丙烯酸酯化合物；在分散稳定剂的存在下在水中悬浮所述溶液；进行悬浮共聚，从而获得芳香族乙烯基化合物－酰氧基苯乙烯－二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物；以及水解所述共聚物中酰氧基苯乙烯单体组分的酰氧基基团。通过本发明的所述方法制备的多孔树脂珠可被适当地用作例如固相合成用载体。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可适当地用作例如固相合成用载体的多孔树脂珠的制备方法。

背景技术

通常，对于聚苯乙烯基多孔树脂珠，有羟基苯乙烯-多烯共聚物(参见专利文献1和2)和通过使烷氧基苯乙烯、芳香族多乙烯基和芳香族乙烯基化合物共聚而获得的共聚物树脂(参见专利文献3)。这些多孔树脂珠主要被用作离子交换树脂、吸附剂等。因此，在这些应用中，迄今为止一个重要的目标是通过将尽可能多的官能团赋予多孔树脂珠或尽可能大地增加多孔树脂珠的比表面积，从而增强单位体积多孔树脂珠的物质吸附能力。

另一方面，近来这类多孔树脂珠也已经被用作固相合成用载体，所述载体是使化学合成反应有效进行的反应位点。在这种情况下，认为化学合成反应开始的位置将是分布在多孔树脂珠交联网络结构中的官能团。因此，强烈需要这样的多孔树脂，该多孔树脂具有适当尺寸的交联网络结构，以及根据化学合成物质种类或数量的官能团的适当分布。

专利文献1：JP-A-52-023193

专利文献2：JP-A-58-210914

专利文献3：JP-A-05-086132

专利文献4：JP-A-2005-097545

发明内容

本发明已在这些情况下完成，并且本发明的目的是提供一种制备多孔树脂珠的方法，所述多孔树脂珠可适当地用作可使化学合成反应有效进行的固相合成用载体，特别是用作能够以高产率固相合成具有高纯度的寡核苷酸的固相载体。

根据本发明，提供一种用于制备包含芳香族乙烯基化合物-羟基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯共聚物的多孔树脂珠的方法，所述方法包括：在有机溶剂中溶解单体混合物和聚合引发剂以获得包含所述单体混合物和所述聚合引发剂的溶液，所述单体混合物包含芳香族乙烯基化合物、酰氧基苯乙烯和二(甲基)丙烯酸酯化合物；在分散稳定剂的存在下在水中悬浮所述溶液；进行悬浮共聚，从而获得芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物；以及水解所述共聚物中酰氧基苯乙烯单体组分的酰氧基基团。

在本发明中，二(甲基)丙烯酸酯化合物优选为选自二(甲基)丙烯酸(聚)乙二醇酯和二(甲基)丙烯酸烷二醇酯中的至少一种。

此外，在本发明中，所述单体混合物优选包含比例为80～800μmol/g的酰氧基苯乙烯以及比例为200～2,000μmol/g的二(甲基)丙烯酸酯化合物。

此外，在本发明中，所述有机溶剂优选为选自烃和醇的至少一种，并且该有机溶剂以基于所述单体混合物0.5～2.5的重量比使用。

根据本发明，如上所述，芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物通过悬浮共聚单体混合物而制备，所述单体混合物包含各自预定比例的芳香族乙烯基化合物、酰氧基苯乙烯和二(甲基)丙烯酸酯化合物，然后水解所述共聚物中酰氧基苯乙烯单体组分的酰氧基基团，由此获得包含芳香族乙烯基化合物-羟基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯共聚物的多孔树脂珠。

因此，通过本发明的方法获得的多孔树脂珠具有适当的交联密度和羟基分布。因此，当该珠被用作固相合成寡核苷酸的载体时，在该载体上进行的反应不会相互抑制，所以可以高的合成速率通过固相合成制备具有高纯度的寡核苷酸。特别地，根据本发明，可以高的合成产率获得寡核苷酸，同时保持高的全长寡核苷酸比例。

具体实施方式

所述用于制备包含芳香族乙烯基化合物-羟基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯共聚物的多孔树脂珠的方法包括：在有机溶剂中溶解单体混合物和聚合引发剂以获得所述单体混合物和所述聚合引发剂的溶液，所述单体混合物包含芳香族乙烯基化合物、酰氧基苯乙烯和二(甲基)丙烯酸酯化合物；在分散稳定剂的存在下在水中悬浮所述溶液；进行悬浮共聚，从而获得芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物；以及水解所得共聚物中酰氧基苯乙烯单体组分的酰氧基基团。

在本发明中，芳香族乙烯基化合物的实例包括但并不限于苯乙烯，环核被烷基取代的苯乙烯，诸如邻-甲基苯乙烯、间-甲基苯乙烯、对-甲基苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯、乙基苯乙烯以及对-叔丁基苯乙烯，α位被烷基取代的苯乙烯，诸如α-甲基苯乙烯和α-甲基-对-甲基苯乙烯，以及核环被卤代的苯乙烯，诸如氯代苯乙烯。根据本发明，其中优选使用苯乙烯作为芳香族乙烯基化合物。

在本发明中，除了酰氧基基团之外，酰氧基苯乙烯可具有在芳香核上的一个或多个任意的取代基，只要其不会对悬浮共聚产生不利的影响或者当所得多孔珠用作固相合成用载体时不会引起有害的作用即可。这类取代基的实例包括碳数为1～5的烷基或烷氧基、卤素原子和硝基。

在本发明中，酰氧基苯乙烯的芳香核上酰氧基相对于乙烯基的位置并没有特别的限制，但是优选为对位。即，在本发明中酰氧基苯乙烯优选为对-酰氧基苯乙烯。此外，酰基中的烷基优选碳数为1～5。在本发明中，特别优选对-乙酰氧基苯乙烯作为酰氧基苯乙烯。

在本发明中，二(甲基)丙烯酸酯化合物指二甲基丙烯酸酯或二丙烯酸酯，并且优选为选自二(甲基)丙烯酸(聚)乙二醇酯和二(甲基)丙烯酸烷二醇酯中的至少一种。

所述二(甲基)丙烯酸(聚)乙二醇酯的具体实例包括二(甲基)丙烯酸乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸二乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸三乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸四乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸聚乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸丙二醇酯、二(甲基)丙烯酸二丙二醇酯、二(甲基)丙烯酸三丙二醇酯、以及二(甲基)丙烯酸聚丙二醇酯。

在本发明中，二(甲基)丙烯酸烷二醇酯中的烷优选碳数为4～10。因此，二(甲基)丙烯酸烷二醇酯的具体实例包括二(甲基)丙烯酸1，2-丁二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，3-丁二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，4-丁二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，5-戊二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，6-己二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，9-壬二醇酯、二(甲基)丙烯酸1，10-癸二醇酯、二(甲基)丙烯酸2-甲基-1，8-辛二醇酯、以及二(甲基)丙烯酸1，4-环己二醇酯。

根据本发明，在芳香族乙烯基化合物、酰氧基苯乙烯和二(甲基)丙烯酸酯化合物的单体混合物中，该单体混合物用于所述悬浮共聚，酰氧基苯乙烯优选以80～800μmol/g的比例，并且更优选以200～500μmol/g的比例被包含。如果酰氧基苯乙烯在所述单体混合物中的比例小于80μmol/g，则获得的多孔树脂珠中羟基的量低，并且当该多孔树脂珠用作固相合成用载体时，获得的合成反应产物的量少。另一方面，如果酰氧基苯乙烯在所述单体混合物中的比例超过800μmol/g，由于在获得的多孔树脂珠中羟基密度高，所以在所述载体上相互邻近发生的化学反应相互抑制，导致获得的合成反应产物的纯度降低。

在所述单体混合物中，二(甲基)丙烯酸酯化合物的比例优选为200～2,000μmol/g，并且更优选为300～1,500μmol/g。如果二(甲基)丙烯酸酯化合物在所述单体混合物中的比例小于200μmol/g，则获得的多孔树脂珠的比表面积过小，并且当该多孔树脂珠用作固相合成用载体时，获得的合成反应产物的量少。另一方面，如果二(甲基)丙烯酸酯化合物在所述单体混合物中的比例超过2,000μmol/g，由于获得的多孔树脂珠在有机溶剂中的溶胀度低，所以获得的合成反应产物的量少。

在本发明中，包含芳香族乙烯基化合物、酰氧基苯乙烯和二(甲基)丙烯酸酯化合物的单体混合物的悬浮共聚可通过常规已知的普通方法进行。例如，将所述单体混合物和聚合引发剂溶解在有机溶剂中，将分散稳定剂单独溶解在水中，在氮气流中混合这两种溶液，搅拌该混合溶液使得通过将所述单体混合物和聚合引发剂溶解在有机溶剂中而获得的溶液可作为小液滴被分散在水中，并且通过升高温度在搅拌下进行所述聚合反应。所述悬浮共聚反应可通常于60～90℃的反应温度在搅拌下进行0.5～48小时，但共聚的反应条件并不仅限于此。

在本发明中，选自烃和醇的至少一种作为有机溶剂。在本发明中，烃包括脂肪烃和芳香烃，并且脂肪烃可以是饱和或不饱和的，但优选烷基苯或碳数为5～12的饱和脂肪烃。碳数为5～12的脂肪族饱和烃的实例包括正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、十一烷以及十二烷。所述烷基苯的实例包括甲苯。

另一方面，醇优选为脂族醇，更优选碳数为5～12脂族醇。其具体优选的实例包括2-乙基己醇、叔戊醇、壬醇、2-辛醇、癸醇、月桂醇以及环己醇。在本发明中，这些烃和醇的一种可单独使用，或者烃和醇可组合使用。

在本发明中，所述有机溶剂通常以0.5～2.5、优选以1.0～2.0的有机溶剂/单体的重量比被使用。如果有机溶剂/单体的重量比小于或超过上述的范围，在这两种情况下，获得的多孔树脂珠的比表面积都会变小，并且例如当该多孔树脂珠用作固相合成用载体时，通过化学反应的合成反应产物的量减少。

分散稳定剂没有特别限制，并且可使用任意的分散稳定剂，只要其在悬浮共聚中通常用作分散稳定剂即可。分散稳定剂的实例包括亲水性保护胶体剂，诸如聚乙烯醇、聚丙烯酸、明胶、淀粉和羧甲基纤维素；以及难溶解的无机粉末，诸如碳酸钙、碳酸镁、磷酸钙、硫酸钡、硫酸钙和膨润土。虽然没有特别限制，但基于在悬浮共聚中使用的水，分散稳定剂的用量优选为0.01～10重量％。基于在悬浮共聚中使用的水，如果分散稳定剂的用量小于0.01重量％，则悬浮共聚的稳定性被削弱并且产生大量聚集。另一方面，基于在悬浮共聚中使用的水，如果分散稳定剂的量超过10重量％，则产生大量过于细小以致不能作为固相合成用载体的粒子。

此外，对于用在悬浮共聚中的聚合引发剂没有特别限制，并且可使用任意的聚合引发剂，只要其在悬浮共聚中通常用作聚合引发剂即可。所述聚合引发剂的实例包括过氧化物，例如过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化硬脂酰、1，1-二(叔丁基过氧)-2-甲基环己烷、1，1-二(叔己基过氧)-3，3，5-三甲基环己烷、1，1-二(叔己基过氧)环己烷、1，1-二(叔丁基过氧)环己烷、二叔己基过氧化物、叔丁基枯基过氧化物、二叔丁基过氧化物、过氧化(2-乙基己酸)1，1，3，3-四甲基丁酯、过氧化(2-乙基己酸)叔己酯、过氧化(2-乙基己酸)叔丁酯以及单碳酸叔丁基过氧异丙酯；以及偶氮化合物，例如2，2-偶氮二异丁腈、2，2′-偶氮二-2-甲基丁腈和2，2′-偶氮二-2，4-二甲基戊腈。

如上所述，将其中溶解了单体混合物和聚合引发剂的有机溶剂悬浮在水中，并且进行悬浮共聚以使共聚物沉淀。其后，通过洗涤净化所述共聚物，以除去残留在该共聚物中的单体和诸如有机溶剂、分散稳定剂以及聚合引发剂的杂质。对于洗涤用溶剂没有特别限制，只要其为对除去那些杂质有用的溶剂即可，但通常使用水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、甲苯、己烷、四氢呋喃等。对于洗涤所得的共聚物，可通过下述方法实现：例如，在悬浮共聚后吸滤所述共聚物的液态分散体，在洗涤用溶剂中用搅拌洗涤所得共聚物，并且以同样的方式重复对所述共聚物的吸滤和随后的洗涤操作。在该洗涤过程中，如果需要，可加热该体系以除去所述共聚物中的挥发性杂质。

根据本发明，首先以这种方式获得芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物，并且然后水解所述共聚物中酰氧基苯乙烯单体组分的酰氧基基团，由此可获得目标多孔树脂珠，所述珠包含芳香族乙烯基化合物-羟基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯共聚物。

对于水解芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物中酰氧基苯乙烯单体组分的酰氧基基团，可采用常规已知的方法和条件。然而，在本发明中，不需要水解所得芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物中的所有酰氧基苯乙烯单体组分的酰氧基团，并且即使部分酰氧基被水解通常也是充分的。

在本发明中，用于水解芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物中酰氧基苯乙烯单体组分的酰氧基的催化剂可以是酸性催化剂，诸如盐酸和氢溴酸；或碱性催化剂，诸如肼、氢氧化钠、四甲基氢氧化铵以及氨水。用于水解的反应溶剂的优选实例包括但并不限于四氢呋喃、乙醇、甲醇、二氧六环和水。

在本发明中，可适当地设置水解的反应条件。例如，在使用含乙醇的氢氧化钠水溶液进行水解的情况下，氢氧化钠的使用量为芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物中酰氧基苯乙烯单体组分的1～10当量，乙醇的使用量为水使用重量的1～10倍，并且该反应在50～80℃下进行1～12小时。优选地，氢氧化钠的使用量为酰氧基苯乙烯单体组分的1～5当量，并且该反应在50～80℃下进行1～6小时。如果氢氧化钠的使用量过大或反应时间过长，则得自二(甲基)丙烯酸酯的酯水解并且多孔树脂珠耐溶剂性受到损害。通过使用酸或碱将水解后的反应混合物调节至接近中性，并且接着以与上述同样的方法洗涤以除去杂质。

如上所述，根据本发明，可通过悬浮共聚单体混合物而获得芳香族乙烯基化合物-酰氧基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物，所述单体混合物包含芳香族乙烯基化合物、酰氧基苯乙烯和二(甲基)丙烯酸酯化合物，以及可通过水解所得共聚物中酰氧基苯乙烯单体组分的酰氧基而制备包含芳香族乙烯基化合物-羟基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯化合物共聚物的多孔树脂珠。此后，如果需要的话，可对多孔树脂珠进一步进行诸如干燥或分级的处理。

由此获得的多孔树脂珠可被适当地用作固相合成用载体以合成例如寡核苷酸。附带地讲，使用根据本发明的多孔树脂珠作为固相合成用载体合成寡核苷酸可通过传统已知的方法进行。例如，连接剂被键合到本发明多孔树脂珠的羟基上，然后亚酰胺(amidite)单元被逐一键合从而得到从该连接剂末端开始的预定的碱基序列。可使用自动合成装置进行该合成反应。例如，将键合连接剂的多孔树脂珠填充在所述装置的流式反应器中，依次向其中填充各种有机溶剂例如乙腈和亚酰胺溶液，并且重复该反应。最后，所述连接剂部分由于水解等而断开，从而获得目标寡核苷酸。对于所述连接剂，可适当地使用常规已知的连接剂。例如，寡核苷酸可通过将具有如下所示结构的核苷连接剂与本发明的多孔树脂珠键合而合成。

在本文上述结构式中，圆代表包含芳香族乙烯基化合物-羟基苯乙烯-二(甲基)丙烯酸酯共聚物的多孔树脂珠，其可通过本发明的方法获得，DMT代表在5′-位的保护性二甲氧基三苯甲基，以及B₁代表碱基。

实施例

在下面通过参考实施例对本发明进行描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

(悬浮共聚)

将配备有冷凝器、搅拌器和氮气入口管的容积为500mL的可拆式烧瓶浸在恒温水浴中，并且将2.5g聚乙烯醇和250g蒸馏水加入到其中并在300rpm下搅拌溶解，以制备聚乙烯醇水溶液。

单独地，将50g of苯乙烯、3.5g对-乙酰氧基苯乙烯(在单体混合物中的比例：369μmol/g)、5g二甲基丙烯酸乙二醇酯(在单体混合物中比例：431μmol/g)、85g的2-乙基己醇、25g异辛烷以及1g过氧化苯甲酰(25％含水的产品)混合以制备溶液。将该溶液加入到上述制备的聚乙烯醇水溶液中，并且于室温下在氮气流中以500rpm的搅拌速率搅拌后悬浮在水中，通过将温度升高至80℃进行悬浮共聚8小时。

(洗涤)

使用蒸馏水和丙酮通过过滤洗涤所得共聚物，并且然后将其分散到丙酮中使总量为约1L。

(分级)

然后放置由此获得的液态分散体直到珠状共聚物沉淀，使得即使当容器倾斜时，容器底部的沉淀物也不会受干扰，并且然后除去浮在上层的丙酮。再次将丙酮加到容器中使总量为约500mL，使所述液态分散体静置，并且然后将丙酮的除去重复10次以上，由此进行所述分级。过滤由此获得的液态分散体，并且在减压下干燥残留物以获得由苯乙烯-对乙酰氧基苯乙烯-二甲基丙烯酸乙二醇酯共聚物组成的粉末状多孔树脂珠。

(水解)

将配备有冷凝器、搅拌器和氮气入口管的容积为500mL的可拆式烧瓶浸在恒温水浴中，并且将20g由苯乙烯-对乙酰氧基苯乙烯-二甲基丙烯酸乙二醇酯共聚物组成的上述粉末状多孔树脂珠，以及100g乙醇加到其中并在搅拌下分散。随后，加入通过将1g氢氧化钠溶解在50g蒸馏水中而制备的水溶液，然后通过升高温度至75℃而进行水解反应3小时。反应完成后，用盐酸中和所得反应混合物并且使用蒸馏水和丙酮通过过滤而洗涤。最后，过滤所获得的液态分散体并且在减压下进一步干燥，以获得由苯乙烯-对羟基苯乙烯-二甲基丙烯酸乙二醇酯共聚物组成的粉末状多孔树脂珠。

(分析)

对所获得的多孔树脂珠进行以下分析。

(1)中值粒径

中值粒径用激光衍射/散射法测量(激光衍射/散射粒度分布分析仪，LA-920，由Horiba有限公司制造)。

(2)平均孔径

平均孔径用压汞法测量(压汞仪，PoreMaster60GT，由Quantachrome Instruments(康塔仪器公司)制造)。

(3)羟基的量

羟基的量通过根据JIS K 0070的滴定法测量。即，待被测量的多孔树脂珠的羟基用已知量的乙酰化试剂(乙酸酐/吡啶)乙酰化，以及通过使用氢氧化钾滴定测量在该乙酰化中没被消耗的乙酸酐的量，由此计算在所述样品中羟基的量。更具体地，如下所述进行该步骤。

通过将吡啶加到25g乙酸酐中使总量为100mL而制备所述乙酰化试剂，将0.5～2g测量样品(干燥的多孔树脂珠)放在烧瓶中称重，并且将0.5mL乙酰化试剂和4.5mL吡啶全部加入烧瓶中。将烧瓶中的混合物在95～100℃下保持2小时，然后冷却到室温，并且向其中加入1mL蒸馏水。加热10分钟后，在乙酰化作用中没被消耗的乙酸酐分解。将烧瓶中的全部内容物转移到烧杯中，用蒸馏水稀释到总量为150mL，然后用0.5N的氢氧化钠水溶液滴定。

单独地，用与上述相同的操作测量未加入测量样品的空白值。根据下列公式(1)计算所述测量样品中羟基的量，其中A(μmol/g)为所述测量样品中羟基的量，B(mL)为测量空白时氢氧化钾水溶液的滴定度，C(mL)为测量所述测量样品时氢氧化钾水溶液的滴定度，f为氢氧化钾水溶液的系数，以及M(g)为所述测量样品的重量。

A＝(B-C)×0.5(mol/L)×f×1000÷M  (1)

所述多孔树脂珠的中值粒径为80μm、平均孔径为29nm、以及羟基的量为491μmol/g。

实施例2

(多孔树脂珠的制备)

以与实施例1中相同的方式获得由苯乙烯-对羟基苯乙烯-二甲基丙烯酸三乙二醇酯共聚物组成的粉末状多孔树脂珠，与实施例1中不同的是使用40g苯乙烯、3.5g对-乙酰氧基苯乙烯(在单体混合物中的比例：369μmol/g)、15g二甲基丙烯酸三乙二醇酯(在单体混合物中的比例：897μmol/g)、80g1-十一烷醇以及1g过氧化苯甲酰(25％含水的产品)。

以与实施例1中相同的方式分析获得的多孔树脂珠，结果，中值粒径为75μm、平均孔径为34nm、以及羟基的量为393μmol/g。

(核苷连接剂与多孔树脂珠的键合)

将上述获得的多孔树脂珠(1g)、0.18g的DMT-dT-3′-琥珀酸盐(由Beijing OM Chemicals(北京欧艾姆化工有限公司)制备)、0.09g的HBTU(由Novabiochem制备)、0.084mL的N，N-二异丙基乙基胺以及10mL乙腈混合并且于室温中在搅拌下反应12小时，以及通过使用乙腈过滤来洗涤反应混合物并干燥。另外，将2.5mL的CapA(20％乙酸酐/80％乙腈)、2.5mL的CapB(20％N-甲基咪唑/30％吡啶/50％乙腈)、0.025g的4-二甲基氨基吡啶以及5mL乙腈混合并且于室温中在搅拌下反应12小时，以及在减压下通过使用乙腈过滤来洗涤反应混合物并且然后干燥，从而获得DMT-dT-3′-琥珀酸盐键合的多孔树脂珠。通过测量DMT基团的吸光率(412nm)而测定的DMT-dT-3′-琥珀酸盐的加入量在表1中示出，所述DMT基团用对-甲苯璜酸/乙腈脱保护。

(寡核苷酸的合成)

将上述获得的DMT-dT-3′-琥珀酸盐键合的多孔树脂珠填充在柱中，将该柱固定在Applied Biosystems(应用生物系统公司)3400DNA合成器(由Applied Biosystems制造)中，并且在合成规模为1μmol和DMT截去的条件下合成寡核苷酸dT20。将合成后的柱干燥，以及通过重量测量测定所得寡核苷酸的重量产率(mg/μmol)在表1中示出。

通过将使用浓氨水的反应在55℃下进行12小时，寡核苷酸从所述多孔树脂珠裂解和脱保护。通过紫外线吸光率测量法(260nm)测量所获得寡核苷酸的OD产率在表1中示出。

通过HPLC测量法(由Waters Corp.(沃特世有限公司)制造的Alliance UV System，由YMC制造的Hydrosphere C18)测定的所得核苷酸中dT20(全长)的比例在表1中示出。

实施例3

(多孔树脂珠的制备)

以与实施例1中相同的方式获得由苯乙烯-对羟基苯乙烯-二甲基丙烯酸1，6-己二醇酯共聚物组成的粉末状多孔树脂珠，与实施例1中不同的是使用40g苯乙烯、3.5g对-乙酰氧基苯乙烯(在单体混合物中的比例：369μmol/g)、15g的二甲基丙烯酸1，6-己二醇酯(在单体混合物中比例：1,008μmol/g)、75g的1-癸醇以及1g过氧化苯甲酰(25％含水的产品)。

以与实施例1中相同的方式分析获得的多孔树脂珠，结果，中值粒径为72μm、平均孔径为26nm、以及羟基的量为446μmol/g。

实施例4

(多孔树脂珠的制备)

以与实施例1中相同的方式获得由苯乙烯-对羟基苯乙烯-二丙烯酸1，9-壬二醇酯共聚物组成的粉末状多孔树脂珠，与实施例1中不同的是使用48g苯乙烯、2.5g对-乙酰氧基苯乙烯(在单体混合物中的比例：264μmol/g)、8g二丙烯酸1，9-壬二醇酯(在单体混合物中的比例：510μmol/g)、90g1-壬醇以及1g过氧化苯甲酰(25％含水的产品)。

(核苷连结基和多孔树脂珠的键合以及寡核苷酸的合成)

以与实施例2中相同的方法进行DMT-dT-3′-琥珀酸盐键合的多孔树脂珠的制备与寡核苷酸dT20的合成。DMT-dT-3′-琥珀酸盐的键合量、寡核苷酸的重量产率、寡核苷酸的OD产率、以及dT20(全长)的比例均在表1中示出。

对比例1

(多孔树脂珠的制备)

以与实施例1中相同的方式获得由苯乙烯-对羟基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物组成的粉末状多孔树脂珠，与实施例1中不同的是使用48g苯乙烯、3.5g对-乙酰氧基苯乙烯(在单体混合物中的比例：369μmol/g)、7g二乙烯基苯(55％)(在单体混合物中的比例：506μmol/g)、52g2-乙基己醇、23g异辛烷以及1g过氧化苯甲酰(25％含水的产品)。

以与实施例1中相同的方式分析获得的多孔树脂珠，结果，中值粒径为86μm、平均孔径为33nm、以及羟基的量为422μmol/g。

(核苷连结剂与多孔树脂珠的键合以及寡核苷酸的合成)

以与实施例2中相同的方法进行DMT-dT-3′-琥珀酸盐键合的多孔树脂珠的制备与寡核苷酸dT20的合成。DMT-dT-3′-琥珀酸盐的键合量、寡核苷酸的重量产率、寡核苷酸的OD产率、以及dT20(全长)的比例均在表1中示出。

对比例2

(多孔树脂珠的制备)

以与实施例1中相同的方式获得由苯乙烯-对羟基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物组成的粉末状多孔树脂珠，与实施例1中不同的是使用48g苯乙烯、3.5g对-乙酰氧基苯乙烯(在单体混合物中的比例：369μmol/g)、7g二乙烯基苯(55％)(在单体混合物中的比例：506μmol/g)、75g的1-癸醇以及1g过氧化苯甲酰(25％含水的产品)。

以与实施例1中相同的方式分析获得的多孔树脂珠，结果，中值粒径为116μm、平均孔径为68nm、以及羟基的量为432μmol/g。

(核苷连结剂与多孔树脂珠的键合以及寡核苷酸的合成)

以与实施例2中相同的方法进行DMT-dT-3′-琥珀酸盐键合的多孔树脂珠的制备与寡核苷酸dT20的合成。DMT-dT-3′-琥珀酸盐的键合量、寡核苷酸的重量产率、寡核苷酸的OD产率、以及dT20(全长)的比例均在表1中示出。

表1

 

实施例2实施例4对比例1对比例2中值粒径(μm)758386116平均孔径(nm)34753368羟基的量(μmol/g)393350422432DMT-dT-3′-琥珀酸盐的键合量(μmol/g)       207184200198寡核苷酸的重量产率(μmol/g)          6.76.65.75.4寡核苷酸的OD产率(OD/μmol)       197191162150dT20(全长)的比例(％)95949392

表1中的结果表明，当使用根据本发明实施例2～4的多孔树脂珠时，与对比例1和2的多孔树脂珠相比，可增加寡核苷酸的合成产率，同时维持高的全长百分比。

虽然已结合具体实施方式对本发明进行了详细地描述，但对本发明的技术人员来说，在不脱离其范围的前提下对其进行各种改变和修改是显然的。

本申请是基于2007年11月5日提交的日本专利申请No.2007-286835，其全部内容以引用的方式并入本文。

此外，本文引用的所有参考文献也全部并入。