牛磺酸转运蛋白基因

摘要

本发明提供了能够很方便地生产天然型蛋白质或重组蛋白的方法。包括对高表达牛磺酸转运蛋白的，且导入了编码所期望的多肽的DNA的细胞进行培养，使所期望的多肽产生的多肽的制备方法。另外还提供仓鼠牛磺酸转运蛋白、编码该蛋白的DNA、重组载体以及转化细胞等。

说明书

技术领域

本发明涉及到仓鼠牛磺酸转运蛋白和编码编码仓鼠牛磺酸转运蛋白的基因以及利用高表达牛磺酸转运蛋白的细胞制备多肽的方法。

背景技术

当利用基因重组技术生产作为医药有用的蛋白质时，如果使用动物细胞，为了能够进行原核细胞所不能进行的复杂的翻译后修饰或折叠，动物细胞常被用作用于重组蛋白质生产的宿主细胞。

近年来，抗体或生理活性蛋白质等许多生物药品被投放市场，使重组蛋白在动物细胞更有效地生产的技术关系到生物药物的低成本化，制约对患者的稳定供给。

因此，期望生产效率更高的蛋白质的制备方法。

牛磺酸是水产类和软体动物中富含的一种氨基酸，是对哺乳动物的成长非常重要的营养素。虽然不用于蛋白质合成，但具有使高胆固醇血症正常化、降低血压、解毒作用、维持免疫功能、稳定生物膜、调节神经兴奋性、抗氧化等作用。就培养细胞来说，已知对渗透压调节和细胞膜的稳定有贡献(非专利文献1)。然而在牛磺酸转运蛋白发挥作用的星形细胞原代培养细胞的培养基中即使添加牛磺酸，但牛磺酸向细胞内的并没有增加(非专利文献2)，所以在培养基中只添加牛磺酸是不够的。

一方面，借助于牛磺酸转运蛋白向培养细胞内掺入牛磺酸或其它的氨基酸是否有助于提高所期望的重组蛋白质在培养细胞中的产生还一无所知。

虽然已经知道了有关几种牛磺酸转运蛋白(人：非专利文献3，小鼠：非专利文献4，大鼠：非专利文献5)以及其它的牛磺酸转运蛋白与牛磺酸和β-丙氨酸等氨基酸掺入细胞有关(非专利文献6)，但有关仓鼠的牛磺酸转运蛋白包括它存在与否还不清楚。

非专利文献1：Ian Henry Lambert，Neurochemical Research(2004)29(1)，27-63

非专利文献2：Journal of Neurochemistry(2000)，75(3)，919-924

非专利文献3：Uchida，S.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(1992)89(17)，8230-8234

非专利文献4：Liu，Q.R.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(1992)89(24)，12145-12149

非专利文献5：Smith，K.E.et.al.，Mol.Pharmacol.(1992)42(4)，563-569

非专利文献6：Ryo Shioda.et.al.，InvestigativeOphthalmology & Visual Science(2002)43(9)，2916

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于提供能够廉价地生产天然型蛋白质或重组蛋白的方法。

用于解决课题的方法

本发明人等为了解决上述课题进行了锐意努力，结果发现通过使用高表达牛磺酸转运蛋白的细胞，能够使所期望的多肽的产量增加，直至使本发明完成。

本发明的主要内容如下所示。

(1)多肽的制备方法，其包括对高表达牛磺酸转运蛋白的，且导入了编码所期望的多肽的DNA的细胞进行培养，使所期望的多肽产生。

(2)(1)所述的制备方法，其中高表达牛磺酸转运蛋白的细胞是导入了编码牛磺酸转运蛋白的DNA的细胞。

(3)(2)所述的制备方法，其中细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

(4)(1)～(3)中任一项所述的制备方法，其中所期望的多肽是抗体。

(5)(2)～(4)中任一项所述的制备方法，其中编码牛磺酸转运蛋白的DNA是以下(a)～(e)中的任一个：

(a)编码具有序列号2、4、6或8的氨基酸序列的多肽的DNA，

(b)编码具有在序列号2、4、6或8的氨基酸序列中取代、缺失、附加或/和插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的，且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA，

(c)编码与序列号2、4、6或8的氨基酸序列具有70％以上的同源性，而且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA，

(d)具有序列号1、3、5或7的碱基序列的DNA，

(e)在严格条件下可与具有序列号1、3、5或7的碱基序列的DNA互补的DNA杂交的，且编码具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA。

(6)(1)～(5)中任一项所述的制备方法，其包括用牛磺酸浓度为0g/L～100g/L的培养基进行培养。

(7)制备医药品的方法，其中所述药物含有用(1)～(6)中任一项所述的方法制备的多肽。

(8)以下(a)～(e)中任一个编码牛磺酸转运蛋白的DNA(但不包括具有序列号3、5和7的碱基序列的DNA)：

(a)编码具有序列号2的氨基酸序列的多肽的DNA，

(b)编码具有在序列号2的氨基酸序列中取代、缺失、附加或/和插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的，且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA，

(c)编码与序列号2的氨基酸序列具有97％以上的同源性的，且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA，

(d)具有序列号1的碱基序列的DNA，

(e)在严格条件下可与具有序列号1的碱基序列的DNA互补的DNA杂交的，且编码具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA。

(9)以下(A)～(E)中的任一个多肽(但不包括具有序列号4、6和8的氨基酸序列的多肽)：

(A)具有序列号2的氨基酸序列的多肽，

(B)具有在序列号2的氨基酸序列中取代、缺失、附加或/和插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列，而且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽，

(C)与序列号2的氨基酸序列具有97％以上的同源性，而且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽，

(D)由具有序列号1的碱基序列的DNA编码的多肽，

(E)由在严格条件下可与具有序列号1的碱基序列的DNA互补的DNA杂交的，且编码具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA编码的多肽。

(10)含有(8)所述的DNA的重组载体。

(11)导入了(8)所述的DNA的细胞。

(12)高表达牛磺酸转运蛋白的，且导入了编码所期望的多肽的DNA的细胞。

(13)导入了编码牛磺酸转运蛋白的DNA的细胞。

发明的效果

利用本发明已经能够廉价地生产所期望的多肽。

本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请、专利申请2006-110467的说明书和/或图所记述的内容。

附图的简单说明

图1表示来自新克隆的CHO细胞的仓鼠牛磺酸转运蛋白基因的碱基序列和氨基酸序列。

图2根据由来自新克隆的CHO细胞的仓鼠TauT的氨基酸序列通过TMpred程序预测的跨膜区域和方向，参考Proc，Natl.Acad.Sci.USAVol.89，pp.8230-8234，September 1992，Shinichi Uchida et.al.的FIG.5.而制备的牛磺酸转运蛋白膜拓扑图。◎是仓鼠TauT特异性氨基酸残基，在第2环(EX：细胞膜外区域)、12个跨膜区域(TM)和C末端(IC：细胞内区域)存在着多个与人TauT不同的氨基酸。

图3是使仓鼠TauT(622个氨基酸)表达的质粒。

图4是在50ml摇瓶分批培养第7天的活细胞密度图。pHyg/TauT导入细胞的活细胞密度相对于pHyg导入细胞占优势(P<0.05)。

图5是在50ml摇瓶分批培养第7天的乳酸产量图(n＝7)。pHyg/TauT导入细胞乳酸产生量低，相对于pHyg导入细胞占优势(t检验P<0.05)。

图6是在50ml摇瓶分批培养第7天的抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体产量图(n＝7)。7株pHyg/TauT导入细胞中的4株具有pHyg导入细胞的最高值以上的抗体产量。

图7是在50ml摇瓶补料分批培养第7天的抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体产量图(n＝7)。pHyg/TauT导入细胞的抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体相对于pHyg导入细胞占优势(P<0.01)。

图8是表示作为在通过静置培养的扩大过程中增殖能力高的pHyg/TauT导入细胞T10在经1L广口瓶的补料分批培养中的存活率的图。T10的存活率在培养的第32天已达80％以上。而亲本株在第19天时下降了80％。

图9是表示作为在通过静置培养的扩大过程中增殖能力高的pHyg/TauT导入细胞T10在经1L广口瓶的补料分批培养中的抗体产生量的图。在培养第35天的抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体产量为2.9g/L。

图10是表示导入TauT的T10细胞细胞膜上表达TauT分子的流式细胞仪分析的结果。使用兔抗大鼠牛磺酸转运蛋白抗体(Alphadiagnostics公司，U.S.)(抗体±)作为一次抗体，作为二次抗体用藻红蛋白缀合物(Abcam公司，U.K.)标记驴抗兔IgG抗体。

图11是表示1L广口瓶补料分批培养中的细胞内氨含量(浓度比)的图。相对于亲本株，pHyg/TauT导入株的氨抑制显著。

图12是表示牛磺酸掺入到细胞内依赖于培养基中的牛磺酸浓度的图。牛磺酸的掺入量在pHyg/TauT导入株和亲本株之间看不到差别。

图13是表示培养基中的谷胺酰胺消耗的图。pHyg/TauT导入株相对于亲本株，平均每个细胞的谷胺酰胺消耗量显著高，不依赖于培养基中的牛磺酸浓度。

图14是表示pHyg/TauT导入株中的抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体产生量不依赖于培养开始时的培养基中的牛磺酸浓度而表现出同等程度的图。

用于实施发明的最好方式

以下就本发明的实施方式进行更详细的说明。

本发明提供了多肽的制备方法，其包括对高表达牛磺酸转运蛋白的，且导入了编码所期望的多肽的DNA的细胞进行培养，使所期望的多肽产生。

在本发明的方法中，细胞可以是能够产生所期望的多肽的天然细胞，也可以是导入了编码所期望的多肽的DNA的转化细胞，优选导入了编码所期望的多肽的DNA的转化细胞。

在本发明的方法中，所期望的多肽没有特别限定，可以是抗体(例如：抗IL-6受体抗体、抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体、抗VLA4抗体等)或生理活性蛋白质(粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素、干扰素、IL-1和IL-6等白介素、t-PA、尿激酶、血清球蛋白、血液凝固因子、PTH等)等任一个多肽，特别优选抗体。抗体可以是天然抗体、Fab、scFv、sc(Fv)2等低分子化抗体、嵌合抗体、人源化抗体等任一抗体。

本发明人等通过使用高表达牛磺酸转运蛋白的细胞，发现借助于高表达的牛磺酸转运蛋白，不仅可特异促进牛磺酸和β-丙氨酸，而且也可促进谷胺酰胺掺入到细胞内。

已知牛磺酸转运蛋白是一个具有可将牛磺酸和β-丙氨酸转运到细胞内的功能的膜蛋白，但并不知道通过使牛磺酸转运蛋白在细胞中高表达可以特异地将谷胺酰胺转运到细胞内。由于已知在杂交瘤中谷胺酰胺与抗体产生有关(文献；Yeon-Ho Jeong et al，Enzyme andMicrobial Technology(1995)17，47-55)，所以认为使牛磺酸转运蛋白高表达的细胞使抗体等蛋白质的产生增强的效果可能是通过该牛磺酸转运蛋白引起的谷胺酰胺特异转运到细胞内的作用导致的。

高表达牛磺酸转运蛋白的细胞只要是与天然细胞比较牛磺酸转运蛋白的表达量增加的细胞，并没有特别限定。天然细胞没有特别限定，如在制备重组蛋白时作为宿主使用的细胞CHO细胞等。

作为高表达牛磺酸转运蛋白的细胞，例如人为地导入了牛磺酸转运蛋白基因的细胞。人为地导入了牛磺酸转运蛋白基因的细胞可以通过业内众所周知的方法制作，例如可以将牛磺酸转运蛋白基因整合到载体中，通过该载体转化细胞来制备。

作为使细胞高表达的牛磺酸转运蛋白基因可以是来自任何生物的牛磺酸转运蛋白，没有特别限定。具体来说，例如来自人、小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类等生物的牛磺酸转运蛋白，优选来自人、啮齿类或与宿主细胞同类的牛磺酸转运蛋白，例如当使牛磺酸转运蛋白高表达的细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)时，优选来自人或仓鼠的牛磺酸转运蛋白。

而作为使细胞高表达的牛磺酸转运蛋白基因可以列举出编码牛磺酸转运蛋白的以下的(a)～(e)中的任一个DNA：

(a)编码具有序列号2、4、6或8的氨基酸序列的多肽的DNA，

(b)编码具有在序列号2、4、6或8的氨基酸序列中取代、缺失、附加或/和插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的，且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA，

(c)编码与序列号2、4、6或8的氨基酸序列具有70％以上的同源性的，且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA，

(d)具有序列号1、3、5或7的碱基序列的DNA，

(e)在严格条件下可与具有序列号1、3、5或7的碱基序列的DNA互补的DNA杂交的，且编码具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA，

高表达牛磺酸转运蛋白的细胞可以是任一种细胞，优选CHO细胞，特别优选CHO dhfr-细胞。

为了制备所期望的多肽，可以通过将编码所期望的多肽的基因导入高表达牛磺酸转运蛋白的细胞，将该细胞于培养基中培养进行制备。

当使用人为地导入了牛磺酸转运蛋白基因的细胞制备所期望的多肽时，牛磺酸转运蛋白基因和编码所期望的多肽的基因的导入顺序没有特别限制，可以在导入牛磺酸转运蛋白基因后再导入编码所期望的多肽的基因，也可以在导入编码所期望的多肽的基因后再导入牛磺酸转运蛋白基因。或者是将牛磺酸转运蛋白基因和编码所期望的多肽的基因同时导入也可以。

在牛磺酸转运蛋白基因和编码所期望的多肽的基因的导入可以通过单一的载体同时导入，也可以使用多个载体分别导入。

高表达牛磺酸转运蛋白的细胞的培养可以使用通常的细胞(优选动物细胞)培养中使用的培养基。其中通常包括氨基酸、维生素类、脂质因子、能源、渗透压调节剂、铁源、pH缓冲剂。这些成分的含量通常氨基酸为0.05-1500mg/L、维生素类为0.001-10mg/L、脂质因子为0-200mg/L、能源为1-20g/L、渗透压调节剂为0.1-10000mg/L、铁源为0.1-500mg/L、pH缓冲剂为1-10000mg/L、微量金属元素为0.00001-200mg/L、表面活性剂为0-5000mg/L、增殖辅助因子为0.05-10000μg/L和核苷为0.001-50mg/L的适当范围，并不限定于这些，可以根据培养的细胞的种类、所期望的多肽的种类等进一步适当决定。

除了上述成分之外，也可以添加例如微量金属元素、表面活性剂、增殖辅助因子、核苷等。

具体来说，例如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷胺酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等，优选L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷胺酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等氨基酸类；i-肌醇、生物素、叶酸、硫辛酸、尼克酰胺、尼克酸、p-氨基苯甲酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、盐酸维生素B₆、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B₁₂、抗坏血酸等维生素类；氯化胆碱、酒石酸胆碱、亚油酸、油酸、胆固醇等，优选氯化胆碱等脂质因子；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等，优选葡萄糖等能源；氯化钠、氯化钾、硝酸钾等，优选氯化钠等渗透压调节剂；EDTA铁、柠檬酸铁、氯化亚铁、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁硝酸铁等，优选氯化铁、EDTA铁、柠檬酸铁等类；碳酸氢纳、氯化钙、磷酸二氢钠、HEPES、MOPS等，优选含有碳酸氢纳等pH缓冲剂的培养基。

除了上述成分之外，还可以添加例如硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、氯化镍、氯化锡、氯化镁、亚硅酸钠等，优选硫酸铜、硫酸锌、硫酸镁等微量金属元素；Tween80、聚丙二醇与环氧乙烷的聚合物(聚醚)F68(Pluronic F68)等表面活性剂；以及重组型胰岛素、重组型IGF-1、重组型EGF、重组型FGF、重组型PDGF、重组型TGF-α、盐酸乙醇胺、亚硒酸钠、视黄酸、盐酸腐胺等，优选亚硒酸钠、盐酸乙醇胺、重组型IGF-1、盐酸腐胺等增殖辅助因子；脱氧腺苷、脱氧胸腺嘧啶核苷、脱氧鸟苷、腺苷、胸腺嘧啶核苷、鸟苷、尿苷等核苷。另外在上述培养基的合适例子中还可以含有链霉素、青霉素G钾和庆大霉素等抗生素和酚盐等pH指示剂。

培养基的pH因培养的细胞而异，一般为pH6.8～7.6，多数场合下pH7.0～7.4合适。

培养基可以使用市售的动物细胞培养用培养基，例如D-MEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、D-MEM/F-12 1：1Mixture(Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12)、RPMI1640、CHO-S-SFM II(Invitrogen公司)、CHO-SF(Sigma-Aldrich公司)、EX-CELL 301(JRH biosciences公司)、CD-CHO(Invitrogen公司)、ISCHO-V(Irvine Scientific公司、PF-ACF-CHO)(Sigma-Aldrich公司)等培养基。

另外培养基可以是无血清培养基。

当高表达牛磺酸转运蛋白的细胞是CHO细胞时，CHO细胞的培养可以使用同行众所周知的方法。例如，通常可以在气相CO₂的浓度为0-40％、优选2-10％的氛围下、30-39℃、优选37℃左右进行培养。

就像下面的实施例所表明的那样，在高表达牛磺酸转运蛋白的细胞中，阻碍细胞生长的乳酸等旧废物的产生被抑制。结果显示出维持高的存活率效果，本发明的细胞进行3个月或3个月以上的培养都是可能的。

另外，当在培养细胞中产生抗体等所期望的多肽时，在培养后期细胞呈现出极高密度的状态(约1×10⁷细胞/ml)，乳酸等老废物的影响变得非常大。如果通过本发明制备所期望的多肽，预期在培养后期不仅可维持高的存活率，而且可提高所期望的多肽的产量。

用于使用本发明的细胞产生所期望的多肽的合适的培养期间通常为1日～3个月，优选1日～2个月，更优选1日～1个月。

另外作为动物细胞培养用的各种培养装置，例如可以使用发酵槽型罐培养装置、空气生液器型培养装置、培养(玻璃)瓶型培养装置、离心瓶型培养装置、微载体型培养装置、流动层型培养装置、空心纤维型培养装置、滚瓶型培养装置、充填槽型培养装置等进行培养。

培养可以使用分批培养(batch culture)、补料分批培养(fed-batch culture)、连续培养(continuous culture)等任一种方法，优选补料分批培养或连续培养，更优选补料分批培养。

当对本发明的细胞进行培养时，为了促进牛磺酸掺入到细胞内，可以在培养基中添加牛磺酸。添加在培养基中的牛磺酸的浓度没有特别限定，通常为0g/L～100g/L，优选0g/L～20g/L，更优选0g/L～10g/L。

当通过本发明方法制备的多肽具有作为医药可利用的生物学活性时，通过将该多肽与医药上容许的载体或添加剂混合后进行制剂，可以制备药物。

作为医药上容许的载体和添加剂的例子，如水、医药上容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、呫吨胶、阿拉伯树胶、乳酪、琼脂、聚乙二醇、一缩二甘油、甘油、丙(撑)二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清清蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、容许作为医药添加物的表面活性剂等。

实际的添加物可以根据本发明的治疗剂的剂型从上述添加物中单独选择一种或选择适当组合，不用说对此没有限定。例如作为注射用制剂使用时，可以使用将纯化的多肽溶解于例如生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等，再加入防止吸附剂、例如Tween80、Tween20、明胶、人血清清蛋白等的溶液。或者为了做成在使用前溶解再构成的剂型，可以是冷冻干燥的样品，作为用于冷冻干燥的赋形剂，可以使用例如甘露糖醇、葡萄糖等糖醇或糖类。

多肽的有效给予量可以根据多肽的种类、作为治疗或预防的对象的疾病的种类、患者的年龄、疾病的严重程度等进行适当选择。例如当多肽是抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖抗体时，抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖抗体的有效给予量按照每次每1kg体重从0.001mg至1000mg的范围选择。或者按照每个患者选择0.01～100000mg/body的给予量。但并不限制于这些给予量。

多肽的给予方法可以是口服、非口服中的任一种，优选非口服给予方式，具体来说，如注射(例如通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部给予)、经鼻给予、经肺给予、经皮给予等。

另外本发明还提供以下的(A)～(E)中任一种新的多肽(但是除去具有序列号4、6和8的氨基酸序列的多肽)：

(A)具有序列号2的氨基酸序列的多肽

(B)具有在序列号2的氨基酸序列中取代、缺失、附加或/和插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的，且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽，

(C)与序列号2的氨基酸序列具有97％以上的同源性，而且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽，

(D)由具有序列号1的碱基序列的DNA编码的多肽

(E)由在严格条件下可与具有序列号1的碱基序列的DNA互补的DNA杂交，而且编码具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA编码的多肽

本发明的新的多肽是仓鼠牛磺酸转运蛋白以及功能上与它同等的多肽。

在本发明中，所谓功能上与仓鼠牛磺酸转运蛋白同等指的是具有与牛磺酸的结合活性、具有牛磺酸向细胞内的输送活性等与仓鼠牛磺酸转运蛋白具有的活性同样的活性。在这样的多肽中包括例如仓鼠牛磺酸转运蛋白的突变体等。

作为用于制备功能上与某个多肽同等的多肽的同行都熟知的方法，已知有向多肽导入突变的方法。例如，如果是同行可以使用位点特异的突变诱发法(Hashimoto-Gotoh，T.et al.(1995)Gene152，271-275、Zoller，MJ，and Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500、Kramer，W.et al.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456、Kramer，W.and Fritz HJ(1987)Methods Enzymol.154，350-367、Kunkel，TA(1985)Proc Natl Acad Sci USA.82，488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，提供在仓鼠牛磺酸转运蛋白的氨基酸中导入适当突变，可以制备功能上与仓鼠牛磺酸转运蛋白同等的多肽。另外，氨基酸的突变也可以在自然界中产生。因此具有在本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列，功能上与仓鼠牛磺酸转运蛋白同等的多肽也包括在本发明的多肽中。

作为功能上与本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白同等的多肽，具体来说如在仓鼠牛磺酸转运蛋白的氨基酸序列中缺失了1个或2个以上、优选缺失1个以上30个以下、更优选缺失1个以上20个以下、进一步优选缺失1个以上10个以下、最好优选缺失1个以上5个以下的氨基酸的多肽，在仓鼠牛磺酸转运蛋白的氨基酸序列中附加了1个或2个以上、优选附加了1个以上30个以下、更优选附加了1个以上20个以下、进一步优选附加了1个以上10个以下、最好优选附加了1个以上5个以下的氨基酸的多肽，在仓鼠牛磺酸转运蛋白的氨基酸序列中取代了1个或2个以上、优选取代了1个以上30个以下、更优选取代了1个以上20个以下、进一步优选取代了1个以上10个以下、最好优选取代了1个以上5个以下的氨基酸的多肽等。

突变的氨基酸残基虽然没有特别限定，但希望突变为保存氨基酸侧链性质的其它氨基酸。作为氨基酸侧链的性质，例如疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、带有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含有羟基的侧链的氨基酸(S、T、Y)、带有含硫原子的侧链氨基酸(C、M)、带有含羧基和胺基的侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、带有含碱基的侧链的氨基酸(R、K、H)、带有含芳香族的侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号内表示任一个氨基酸的单字母缩写)。

另外已知具有对于某一氨基酸序列的1个或多个氨基酸残基进行缺失、附加和/或通过用其它氨基酸取代被修饰的氨基酸序列的多肽可维持原有生物学活性(Mark，D.F.et al.，Proc Natl Acad Sci USA(1984)81，5662-5666、Zoller，M.J.& Smith，M.Nucleic AcidsResearch(1982)10，6487-6500、Wang，A.et al.，Science 224，1431-1433、Dalbadie-McFarland，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(1982).79，6409-6413)。

作为对于本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白进行了附加一个或多个氨基酸残基的多肽，例如含有仓鼠牛磺酸转运蛋白的融合多肽。融合多肽是本发明的蛋白质仓鼠牛磺酸转运蛋白与其它的多肽融合的产物，包括在本发明内。制作融合蛋白质的方法可以使用同行都众所周知的方法，即将编码本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白的基因与编码其它的多肽的基因按照阅读框一致那样连接，然后导入表达载体，使其表达。作为与本发明的多肽融合而附加的其它多肽没有特别限定。

作为与本发明的多肽融合而附加的其它多肽，例如FLAG(Hopp，T.P.et al.，BioTechnology(1988)6，1204-1210)、由6个His(组氨酸)构成的6×His、10×His、流感凝集素(HA)、人c-myc的片段、VSVGP的片段、p18HIV的片段、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原的片段、1ck标签、α-微管蛋白的片段、B-tag、ProteinC的片段、GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、HA(流感凝集素)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合多肽)等。

通过使市售的这些编码多肽的基因与编码本发明的多肽的基因融合，使由此制备的融合基因表达，可以制备融合多肽。

另外作为制备功能上与某一多肽同等的多肽的同行都熟知的其它方法，例如可以利用杂交技术(Sambrook，J et al.，Molecular Cloning2^nd ed.，9.47-9.58，Cold Spring Harbor Lab.press，1989)的方法。即，如果是同行通常都可以以编码本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白的DNA序列或其一部分作为基础，分离与其同源性高的DNA，从该DNA分离功能上与仓鼠牛磺酸转运蛋白等同的多肽。因此作为与由编码本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白的DNA或其一部分构成的DNA杂交的DNA编码的多肽，功能上与本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白同等的多肽也包括在并发明的多肽中。

作为用于分离功能上编码与本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白同等的多肽的DNA的杂交的条件，同行可适当选择。杂交的条件例如可以是低严格条件。所谓低严格条件如42℃、2×SSC、0.1％SDS、优选50℃、2XSSC、0.1％SOS。或更优选例如高严格条件，所谓高严格条件优选65℃、2×SSC、0.1％SDS。在这些条件下，降低温度不仅可得到具有高同源性的DNA，而且也可直至只得到低同源性的DNA。相反，提高温度，可以只得到具有高同源性的DNA。但是作为影响杂交的严格性的要素，除了温度以外，也要考虑盐浓度等多个要素，同行通过适当选择这些要素可以实现同样的严格性。

通过这些杂交技术分离到的DNA编码的多肽通常在氨基酸序列上与本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白具有高的同源性。本发明的多肽在功能上是与本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白等同的，也包括与本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白具有高同源性的多肽。所谓高同源性通常指的是具有97％以上的同源性，优选具有98％以上同源性，更优选具有99％以上的同源性。为了决定多肽的同源性，可以参考文献(Wilbur，W.J.and Lipman，D.J.Proc Natl Acad Sci USA(1983)80，726-730)所述的算法。

本发明的多肽由于下面叙述的产生多肽的细胞和宿主或纯化方法不同，氨基酸序列、分子量、等电点或有无糖链和形态等都不同。但是只要是得到的多肽与本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白具有同等的功能，都包括在本发明内。例如，当使本发明的多肽在原核细胞，例如大肠杆菌中表达时，原来的多肽的氨基酸序列的N末端附加了蛋氨酸残基。而当在真核细胞，例如哺乳动物细胞中表达时，除去了N末端的信号序列。本发明的多肽也包含这样的多肽。

本发明的多肽通过同行众所周知的方法可以制备成重组多肽，或天然多肽。如果是重组多肽，可以通过将编码本发明的多肽的DNA整合到适当的表达载体，再导入适当的宿主细胞，回收得到的转化体，得到提取物后，通过离子交换、反相、凝胶过滤等层析，或通过将抗本发明的多肽的抗体固定在柱子上的亲和层析，或者进一步通过将这些柱子多个组合进行纯化、制备。

另外为了使作为将本发明的多肽与谷胱甘肽S转移酶的融合多肽，或附加多个组氨酸的重组多肽在宿主细胞(例如，动物细胞或大肠杆菌等)内表达，表达的重组多肽可以使用谷胱甘肽柱或镍柱进行纯化。

融合多肽纯化后，根据需要可以通过凝血酶或因子Xa将融合多肽内的目的多肽以外的区域切断、除去。

如果是天然多肽，可以通过同行都知道的方法，例如对于表达本发明的多肽的组织或细胞提取物，使其作用于下面叙述到的结合了可与仓鼠牛磺酸转运蛋白结合的抗体的亲和层析进行纯化分离。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。

另外，本发明提供以下(a)～(e)中任一个编码牛磺酸转运蛋白的DNA(但不包含具有序列号3、5和7的碱基序列的DNA)：

(a)编码具有序列号2的氨基酸序列的多肽的DNA，

(b)编码具有在序列号2的氨基酸序列中取代、缺失、附加或/和插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的，且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA，

(c)编码与序列号2的氨基酸序列具有97％以上的同源性，而且具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA，

(d)具有序列号1的碱基序列的DNA，

(e)在严格条件下可与具有序列号1的碱基序列的DNA互补的DNA杂交的，且编码具有牛磺酸转运蛋白活性的多肽的DNA

本发明的DNA除了在体内或体外用于上述那样的本发明的多肽的生产之外，也可以用于制作高表达仓鼠牛磺酸转运蛋白的细胞。本发明的DNA只要是能够编码本发明的多肽，无论什么样的形态都可以。即无论是由mRNA合成的cDNA，还是基因组DNA，或者化学合成的DNA等都可以。而只要是能够编码本发明的多肽，也包括具有源于遗传密码的简并产生的任意的碱基序列的DNA。

本发明的DNA可通过同行都熟知的方法制备。例如可通过由表达本发明的多肽的细胞制作cDNA文库，对本发明的DNA的序列(例如序列1)的一部分做成探针后进行杂交制备。cDNA文库可以通过例如Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLab.Press，(1989)所述的方法制备，也可以使用市售的基因文库。而由表达本发明的多肽的细胞制备RNA，根据本发明的DNA序列(例如序列号1)合成寡DNA，通过以它作为引物进行PCR反应，使编码牛磺酸转运蛋白的cDNA扩增进行制备。

通过测定得到的cDNA的碱基序列，测定它编码的翻译区域，可以得到本发明的多肽的氨基酸序列。另外，通过以得到的cDNA作为探针筛选基因组DNA文库，可以分离基因组DNA。

具体来说，可以像以下那样进行。首先从表达本发明的多肽的细胞、组织等分离mRNA。mRNA的分离通过众所周知的方法，例如胍超离心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.and Sacchi，N.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制备总RNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等，从总RNA中纯化mRNA。另外，通过使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)也可以直接制备mRNA。

使用逆转录酶由得到的mRNA合成cDNA。cDNA的合成可以使用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(生物化学工业)等进行。另外，使用引物等，根据使用5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech生产)和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；PCR)的5’-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)，可以进行cDNA的合成和扩增。

从得到的PCR产物制备目的DNA片段，与载体DNA连接。再由此制作重组载体，导入大肠杆菌等，选择菌落制备所期望的重组载体。目的DNA的碱基序列可以通过众所周知的方法，例如双脱氧核甘酸链终止法进行确认。

在本发明的DNA中，考虑到表达中使用的宿主的密码子使用频率，可以设计表达效率更高的碱基序列(Grantham，R.et al.，NucleicAcids Res.(1981)9，r43-74)。另外，本发明的DNA可以通过市售的试剂盒或众所周知的方法进行改变。至于改变，例如通过限制酶消化、合成寡核苷酸或插入适当的DNA片段、附加接头、插入起始密码子(ATG)和/或终止密码子(TAA、TGA或TAG)等。

本发明的DNA是在严格条件下与具有序列号1的碱基序列的DNA杂交的DNA，而且包括编码功能上与牛磺酸转运蛋白等同的多肽的DNA。

作为严格条件，同行可适当选择，例如低严格条件。所谓低严格条件如42℃、2×SSC、0.1％SDS、优选50℃、2×SSC、0.1％SDS。更优选高严格条件。所谓高严格条件，65℃、2×SSC、0.1％SDS。在这些条件下，提高温度，可以得到具有高同源性的DNA。上述进行杂交的DNA优选来自天然的DNA，例如cDNA或染色体DNA。

通过这些杂交技术分离的DNA在碱基序列上与编码本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白的DNA具有高同源性。本发明的DNA中也包括编码在功能上与本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白同等的多肽，具有与编码本发明的仓鼠牛磺酸转运蛋白的DNA高同源性的DNA。所谓高同源性，通常指的是具有96％以上的同源性，优选98％以上同源性，更优选具有99％以上同源性。碱基序列的同源性可以通过Karlin and Altschul的算法BLAST(Proc Natl Acad Sci USA 90：5873-5877，1993)决定。根据该算法开发了称之为BLASTN和BLASTX的算法(Altschul etal.J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。当根据BLAST通过BLASTN对碱基序列进行解析时，数据，例如为score＝100、wordlength＝12。这些解析方法的具体手法众所周知(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。

另外，本发明提供插入本发明的DNA的载体。本发明的载体在宿主细胞内保持本发明的DNA，用于使本发明的多肽(即仓鼠牛磺酸转运蛋白和与其功能上同等的多肽)表达。另外可用于使牛磺酸转运蛋白在宿主细胞中高表达。通过使牛磺酸转运蛋白在宿主细胞中高表达，可促进牛磺酸掺入宿主细胞，通过宿主细胞可使所期望的多肽的生产增加。

作为载体，例如以大肠杆菌作为宿主时，为了使载体在大肠杆菌(例如JM109、DH5α、HB101、XL1 Blue)等中大量扩增、大量制备，优选具有用于在大肠杆菌中扩增的「ori」，以及被转化的大肠杆菌的选择基因(例如，通过任一药物(氨苄青霉素和四环素、卡那霉素、氯霉素)能够判别那样的抗药性基因)。作为载体的例子，可例举M13系列载体、pUC系列载体、PBR322、pBluscript、pCR-Scrip等。或目的是进行cDNA的亚克隆、切取时，除了上述载体外，可例举如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。在以生产本发明的多肽为目的中使用载体时，表达载体特别有用。作为表达载体，例如在以在大肠杆菌中表达为目的时，除了载体具有在大肠杆菌中能够扩增那样的上述特征外，用JM109、DH5 α、HB101、XL1-Blue等大肠杆菌作为宿主时，优选带有能够在大肠杆菌中高效表达的启动子，例如lacZ启动子(Ward等，Nature(1989)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)、araB启动子(Better，Science(1988)240，1041-1043)、或T7启动子等。作为这样的载体，除了上述载体外，还有如pGEX-5X-1(Pharmacia公司生产)、「QIAexpresssystem」(Qiagen公司生产)、pEGFP、或pET(此时宿主最好是表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。

载体中可以含有用于多肽分泌的信号序列。作为用于多肽分泌的信号序列，当使多肽产生在大肠杆菌的周质时，可以使用pe1B信号序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379)。载体向宿主细胞的导入可以使用例如氯化钙法、电穿孔法进行。

除了以大肠杆菌作为宿主以外，作为例如用于制备本发明的多肽的载体，如来自哺乳动物的表达载体(例如，pcDNA3(Invitrogen公司生产)、pEGF-BOS(Nucleic Acids Res.1990，18(17)，p5322)、pEF、pCDM 8)、来自昆虫细胞的表达载体(例如，“Bac-to-BAC农杆菌表达系统”(GIBCO BRL公司生产)pBacPAK8)、来自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、来自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、来自逆病毒的表达载体(例如pZIpneo)、来自酵母的表达载体(例如“毕赤表达试剂盒”(Invitrogen公司生产)、pNV11、SP-Q01)、来自枯草杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)等。

当以在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中的表达为目的时，优选带有用于在细胞内表达所必需的启动子、例如SV40启动子(Mulligan等，Nature(1979)227，108)、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)、CMV启动子等，更优选带有用于选拔对细胞进行转化的基因(例如，提供药物(新霉素、G418等)能够判别那样的抗药性基因)。作为具有这样特性的载体，例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

另外，在以使基因稳定表达、而且使基因在细胞内的拷贝数扩增为目的时，如向缺失核酸合成途径的CHO细胞导入具有相辅该途径的DHFR基因的载体(例如pCHOI等)，通过氨甲喋呤(MTX)使其扩增的方法，而在以基因的瞬时性表达为目的时，如使用在染色体上带有表达SV40T抗原的基因的COS细胞，用带有SV40的复制起点的载体(pcD等)进行转化的方法。作为复制起点，可以使用来自多瘤病毒、腺病毒。牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。另外，为了在宿主细胞系中扩增基因的拷贝数，表达载体可以含有作为选择标志的氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。

另外，本发明提供导入了本发明的载体的宿主细胞。作为导入了本发明的载体的宿主细胞没有特别限制，例如可以使用大肠杆菌和各种动物细胞等。本发明的宿主细胞可作为例如用于本发明的多肽的制备和表达的产生系使用。而本发明的宿主细胞抗原高表达牛磺酸转运蛋白，可以促进牛磺酸的掺入，可以使所期望的多肽的生产增加。用于多肽制备的产生系有体内和体外产生系。作为体内的产生系如使用真核细胞的产生系和使用原核细胞的产生系。

使用真核细胞时，可以使用例如动物细胞、植物细胞、真菌细胞作为宿主。作为动物细胞，已知有哺乳类细胞，例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108，945)、COS、3T3、骨髓瘤、BHK(baby hamsterkidney)、HeLa、Vero、两栖类细胞，例如非洲爪蛙卵母细胞(Valle，etal.，Nature(1981)291.358-340)、或昆虫细胞、例如Sf9、Sf21、Tn5。作为CHO细胞，特别适合使用缺失了DHFR基因的CHO细胞dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)和CHOK-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)60，1275)。在动物细胞中，以大量表达为目的时，特别优选CHO细胞。载体向宿主细胞的导入可以使用例如磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、正离子脂质体DOTAP(BoehringerMannheim公司制备)的方法、电穿孔法进、脂转染等方法进行。

作为植物细胞，作为多肽生产系已知有来自烟草(Nicotianatabacum)的细胞，对其进行愈伤组织培养就可以。作为真菌细胞，已知有例如酵母(Saccharomyces)属，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、丝状菌，例如曲霉(Aspergillus)属，例如黑曲霉(Aspergillus niger)。

使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生系。作为细菌细胞，已知有大肠杆菌，例如JM109、DH5α、HB101等，以及枯草杆菌。

用目的基因转化这些细胞，通过在体外对被转化的细胞进行培养，可以得到目的基因编码的多肽。培养按照众所周知的方法进行。例如作为动物细胞的培养液可以使用例如DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此时也可以并用胎牛血清(FCS)等血清补液，也可以进行无血清培养。培养时的pH优选约6～8范围。培养通常在约30～40℃下进行约15～200小时，根据需要可进行培养基交换、通气、搅拌。

而作为在体内使多肽产生的体系，例如使用动物的产生系和使用植物的产生系。将目的基因导入这些动物或植物，使多肽在动物或植物体内产生，回收。本发明中所谓的“宿主”包含这些动物、植物。

使用动物时有使用哺乳动物、昆虫的产生系。作为哺乳动物可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛(Vicki Glaser，SPECTRUMBiotechnology Applications，1993)。另外使用哺乳动物时可以使用转基因动物。

例如，可以将目的基因制备成与编码像山羊β酪蛋白那样的在乳汁中固有产生的多肽的基因的融合基因。然后将含有该融合基因的基因片段注入山羊的胚中，将该胚移植到雌山羊中。可以从收容了胚的山羊产下的转基因山羊或其后代的乳汁中得到目的多肽。为了使含有从转基因山羊产生的多肽的乳汁量增加，对转基因山羊可适当使用激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。

另外，作为昆虫可以使用例如蚕。当使用蚕时，通过使用插入了编码目的多肽的基因的杆状病毒感染蚕，从该蚕中可以得到目的多肽(Susumu，M.et al.，Nature(1985)315，592-594)。

另外使用植物时，可以使用烟草。使用烟草时，通过将编码目的多肽的基因插入到植物表达载体，例如pMON 530，再将该载体插入到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)那样的杆菌中。使该杆菌感染烟草、例如Nicotiana tabacum，从该烟草的叶可得到所期望的多肽(Julian K.-C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。

由此得到的多肽可以从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离，可以纯化成实质上纯粹均一的多肽。多肽的分离、纯化可以使用通常的多肽纯化中使用的分离、纯化方法，并没有任何限定。例如可以从层析柱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、再结晶等适当选择、组合对多肽进行分离、纯化。

作为层析如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤。反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed DanielR.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Lab.press，1996)。这些层析可以使用液相层析，例如HPLC、FPLC等液相层析。本发明也包含使用这些纯化方法高度纯化的多肽。

另外，在纯化前或纯化后通过使适当的多肽修饰酶作用于多肽，可以任意加修饰，或除去部分肽。作为多肽修饰酶，例如可以使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、蛋白激酶、糖苷酶等。

另外，本发明提供可与本发明的多肽结合的抗体。本发明的抗体形态没有特别限制，除了多克隆抗体外，也含有单克隆抗体。将本发明的多肽免疫兔等免疫动物，得到的血清含有所有类型的多克隆抗体和单克隆抗体。

作为致敏抗原使用的多肽可以是完整的多肽，也可以是多肽的部分肽段。作为多肽的部分肽段，如多肽的氨基(N)末端片段和羧基(C)末端片段。本说明书中说的“抗体”指的是对应于多肽的全长或片段的抗体。

将编码本发明的多肽或其片段的基因插入到众所周知的表达载体系中，用该载体转化本说明书中提到的宿主细胞，用众所周知的方法从该宿主细胞内外可以得到目的多肽或其片段，可将它们作为致敏抗原使用。另外，也可以使用表达本发明的多肽的细胞或其溶解物或化学合成的本发明的多肽作为致敏抗原使用。

作为用致敏抗原免疫的动物，没有特别限定，最好是考虑了与细胞融合时使用的母细胞的适合性进行选择，一般来说，可以使用啮齿目、兔目、灵长目的动物。

作为啮齿目的动物，例如可以使用小鼠、大鼠、仓鼠等。作为兔目的动物可以使用例如兔。作为灵长目动物可以使用例如猴。作为猴可以使用狭鼻下目的猴(旧世界猴)，例如食蟹猴(MacacaFascicularis)、恒河猴、狒狒、黑猩猩等。

为了用致敏抗原免疫动物，可以按照众所周知的方法进行。作为一般的方法，将致敏抗原注射到哺乳动物的腹腔内或皮下。具体来说，对于将致敏抗原用PBS(磷酸缓冲盐，Phosphate-Buffered Saline)或生理盐水等稀释到适当量、悬浮的溶液，根据需要适量混合通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂，乳化后给予哺乳动物。另外，注射后将在弗氏不完全佐剂中适量混合的致敏抗原每隔4～21天给予数次最好。另外，在致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。如上那样免疫，通过常规方法可以确认血清中所期望的抗体水平是否上升。

为了得到针对本发明的多肽的多克隆抗体，在确认血清中的所期望的抗体水平上升后，可取出免疫了抗原的哺乳动物的血液。通过众所周知的方法由该血液分离血清。作为多克隆抗体可以使用含有多克隆抗体的血清，也可以根据需要从该血清中进一步分离含有多克隆的级分，使用该级分。例如，通过使用耦联了本发明的多肽的亲和层析柱，得到只识别本发明的多肽的级分。再利用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分，可以制备免疫球蛋白G或M。

为了得到单克隆抗体，在确认免疫了上述抗原的哺乳动物的血清中所期望的抗体水平上升后，从哺乳动物中取出免疫细胞，进行细胞融合。此时作为在细胞融合中使用的优选免疫细胞，特别优选脾细胞。作为可与上述免疫细胞融合的另一方母细胞，优选哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选获得用于通过药物可选择融合细胞的特性的骨髓瘤细胞。

上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合按照例如Milstein等人的方法(Galfre，G.and Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等进行。

通过细胞融合得到的杂交瘤通过用通常的选择培养液HAT(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液)培养进行选择。为了在该HAT培养液中的培养使目的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，需要充分时间，通常要持续进行数日、数周。然后实施通常的有限稀释法，筛选产生目的抗体的杂交瘤和进行克隆。

然后将得到的杂交瘤移植到小鼠腹腔内，从同一小鼠回收腹水，将得到的单克隆抗体经例如硫铵沉淀、蛋白A、蛋白G柱、DEAE离子交换层析、耦联了本发明的多肽的亲和层析柱等纯化可以制备。本发明的抗体可用于本发明的多肽的纯化、检测。

另外，像上述那样获得的单克隆抗体可以使用基因重组技术作为重组型抗体获得(例如，参照Borrebaeck，C.A.K.and Larrick，J.W.，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the UnitedKingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。重组型抗体可以从杂交瘤或产生抗体的致敏淋巴细胞等免疫细胞克隆编码该抗体的基因，整合到适当的载体，将载体导入宿主使其产生。本发明包含该重组型抗体。

另外，本发明的抗体只要是与本发明的多肽结合，可以是该抗体片段或抗体修饰物。作为抗体片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv或H链与L链的Fv用适当接头连接形成的单链可变区片段Fv(scFv)(Huston，J.S.et al.，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。具体来说，用酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理抗体生成抗体片段，或构建编码这些抗体片段的基因，将它们导入表达载体后，用适当的宿主细胞使它们表达(例如，参照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.and Horwitz，A.H.，Methods Enzymol.(1989)178，476-496；Pluckthun，A.and Skerra，A.，Methods Enzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，MethodsEnzymol.(1986)121，652-663；Rousseaux，J.et al.，MethodsEnzymol.(1986)121，663-669；Bird，R.E.and Walker，B.W.，TrendsBiotechnol.(1991)9，132-137)。

作为抗体修饰物，也可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。在本发明的「抗体」中也包含这些抗体修饰物。为了得到这样的抗体修饰物，可以通过对得到的抗体实施化学修饰得到。这些方法在该领域已确立。

像上述那样得到的抗体可以纯化到均一程度。本发明中使用的抗体的分离、纯化可以使用通常多肽中使用的分离、纯化方法。例如可以从亲和层析等层析柱、过滤、超滤、盐析、透析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等适当选择、组合，对抗体进行分离、纯化(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，ColdSpring Harbor Lab.1988)。但并不限定于这些。上述得到的抗体的浓度测定可以通过吸光度的测定或酶结合免疫吸附检验法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)等进行。

作为亲和层析中使用的柱子，如蛋白A柱、蛋白G柱。例如作为使用蛋白A的柱子，如Hyper D，POROS，Sepharose F.F.(Pharmacia)等。

作为除了亲和层析以外的层析，例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for ProteinPurification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Lab.press，1996)。这些层析都可使用HPLC、FPLC等液相层析进行。

另外，作为测定本发明的抗体的抗原结合活性的方法，可以使用吸光度的测定、酶结合免疫吸附检验法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay；ELISA)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测度法)或荧光抗体法。当使用ELISA时，将本发明的多肽添加到固定了本发明抗体的板上，然后加含有目的抗体的样品，例如产生抗体的细胞的培养上清或纯化抗体。再通过添加识别用酶，例如碱性磷酸酶等标记的抗体的二次抗体，对板进行温育，然后洗净后，加p-对硝基苯磷酸等酶底物，测定吸光度可以对抗原结合活性进行评价。作为多肽可以使用多肽的片段、例如由其C末端构成的片段或由N末端构成的片段。在本发明的抗体的活性评价中可以使用BIAcore(Pharmacia生产)。

实施例

以下通过实施例对本发明进行具体说明。这些实施例只是用于说明本发明的例子，并不限定本发明的范围。

实施例1：来自CHO细胞仓鼠牛磺酸转运蛋白基因克隆

从在CHO DXB11细胞导入了抗IL-6受体抗体基因的抗IL-6受体抗体产生细胞(特开平8-99902号公报)提取总RNA后，合成依赖于聚A的cDNA。通过将经SalI、Xho I、EcoR I三种限制酶片段化的cDNA作为模版，通过PCR得到仓鼠牛磺酸转运蛋白(TauT)基因。PCR引物使用设计成在已知的大鼠/小鼠TauT之间含有保存基因序列的5’、3’的序列。通过测定被克隆的基因的碱基序列，根据与已知的生物种的TauT的同源性确认编码仓鼠TauT(图1)。仓鼠TauT氨基酸序列相对于小鼠(96％一致性)、大鼠(96％一致性)、人(93％一致性)具有很高的同源性，预测是具有12个跨膜区域的转运蛋白(图2)。

实施例2：通过导入仓鼠牛磺酸转运蛋白使得活细胞密度增加，乳酸产生量抑制和抗体产量增加

在通过实施例1的克隆得到的仓鼠TauT(以下记为TauT)基因加上Kozak序列，构建CMV启动子表达质粒pHyg/TauT(图3)。通过电穿孔法将除去了pHyg/TauT或TauT基因的对照质粒pHyg导入作为母株的产生抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体的CHO细胞(参照国际公开第WO 2006/006693号小册子)。在有潮霉素(400μg/ml)存在下挑选导入表达质粒的细胞，对所有稳定、增殖的细胞株进行扩大(pHyg/TauT：8株，pHyg：7株)。在制备TauT mRNA中根据TaqMan法将能够确认对母株有优势表达的7株作为pHyg/TauT导入细胞。导入细胞(7株)的mRNA平均表达量约为对照(7株)的40倍。共计14株的细胞以2×10⁵cell/mL的初始密度通过50ml摇瓶进行分批(batch)培养和补料分批(Fed-batch)培养，比较培养后期第7天的活细胞密度、乳酸产生量、抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体产生量。在分批培养中随着细胞增殖培养液中乳酸等阻碍生长的物质蓄积，增殖被抑制，而pHyg/TauT导入细胞的活细胞密度(图4)和乳酸产生量(图5)相对于pHyg导入细胞占优势(t检验P<0.05)。至于抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体产生量，pHyg/TauT导入细胞7株中的4株为pHyg导入细胞的最高值以上(图6)。pHyg/TauT导入细胞的抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体产生量的优越性(t检验P<0.01，图7)由于通过补料分批培养变得清楚了，在上述4株中，增殖能力最高的pHyg/TauT导入细胞(T10)和母株的1L广口瓶进行补料分批培养时，T10在培养第32天存活率维持在80％以上(图8)，乳酸产生被抑制。其结果在培养第35天，抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体产生量达到2.9g/L(图9)。TauT导入T10细胞在细胞膜上表达TauT分子可以通过流式细胞仪分析(图10)确认。以上结果表明通过人为地使仓鼠TauT表达，抗体产生细胞的潜力提高，得到了抗体高产生细胞。

实施例3：仓鼠牛磺酸转运蛋白导入株的氨产生量抑制、牛磺酸掺入、谷胺酰胺消耗量增加、和不依赖于牛磺酸的抗体产生量

将母株和pHyg/TauT导入株以初始2×10⁵细胞/mL进行1L广口瓶补料分批培养，适时从培养槽中采取含有450×10⁵细胞的培养液。通过离心，分离提取培养上清后，向细胞沉淀加含有蛋白酶抑制剂(Complete Mini、Roche Diagnostics公司、Protease inhibitorcocktail tablets)的1mL的冷却灭菌水，置于冰上，使用超声波细胞破碎仪(MISONIX ASTRASON MODEL XL2020)，以5秒脉冲操作后，5秒休止作为一组，反复进行共计12组的处理，将细胞完全破碎。处理后的溶液通过将总量加到离心式过滤单位，制备分子量5000以下的滤液，作为细胞内氨基酸测定用的样品。各个样品再使用茚三酮试剂-L8500试剂盒(和光纯药工业)和日立制全自动氨基酸分析仪(L-8500)的改良型，对570nm的吸光度进行检测、比较，求样品中的各种氨基酸浓度。培养液中的各种氨基酸浓度和氨等的浓度由于是直接测定的值，所以进行μM级浓度比较，一方面细胞内浓度在向细胞沉淀加冷却灭菌水1mL之后，由于进行超声波细胞破碎，将各种氨基酸和氨等的测定值换算为每个细胞的值，对该换算值进行比较。图11的氨浓度比通过将1L广口瓶补料分批培养开始时的每450×10⁵个的母株的氨检测值规定为1，与培养开始时、第6天、第12天、第18天的检测值进行比较，求比值。图12、图13的牛磺酸和谷氨酸都是通过上述氨基酸分析测定的。

其结果可以认为pHyg/TauT导入株在培养后期细胞内氨浓度维持低浓度，对抗体高产生有贡献(图11)。

细胞内的牛磺酸浓度比可以用大致与上述氨同样的方法求出(图12)。不同点在于将50mL摇瓶分批培养第4天的每200×10⁵个的母株的氨检测值规定为1。

其结果表明pHyg/TauT导入株掺入牛磺酸依赖于牛磺酸添加量，其掺入量与母株同等。然而就像图13所示那样，pHyg/TauT导入株的谷胺酰胺的消耗量相对于母株非常显著，不依赖于初始牛磺酸浓度。据报道谷胺酰胺具有改善杂交瘤的细胞增殖和存活率、以及抗体产生能力，提高抗体产生量的作用(Enzyme and Microbial Technology17：47-55，1995)。因此，可以认为pHyg/TauT导入株的抗体产生增强效果有借助于牛磺酸转运蛋白的牛磺酸以外的其它氨基酸(谷胺酰胺等)的掺入导致的可能性。谷胺酰胺的浓度是将对图12的培养第4天的培养液进行氨基酸分析的测定值换算为每1×10⁵细胞的值。

抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3抗体产生量不依赖于50mL摇瓶补料分批培养时的初始牛磺酸浓度(0～500mM(62.575g/L))(图14)，另外关于母株在初始牛磺酸浓度对抗体产生量的影响没有看到优势的差。

以上结果表明即使在培养开始时的培养基中不含有牛磺酸，TauT高表达也具有高的抗体产生能力，认为牛磺酸以外的氨基酸等的掺入也有促进的可能性。

本发明可应用于所有的抗体产生细胞。

本说明书中引用的所有刊物、专利和专利申请都作为参考，纳入了本说明书中。

产业上利用的可能性

本发明可用于多肽的生产。

序列表

<序列1>

序列号1表示编码仓鼠牛磺酸转运蛋白的基因的碱基序列。

<序列2>

序列号2表示仓鼠牛磺酸转运蛋白的氨基酸序列。

<序列3>

序列号3表示编码大鼠牛磺酸转运蛋白的基因的碱基序列。

<序列4>

序列号4表示大鼠牛磺酸转运蛋白的氨基酸序列。

<序列5>

序列号5表示编码小鼠牛磺酸转运蛋白的基因的碱基序列。

<序列6>

序列号6表示小鼠牛磺酸转运蛋白的氨基酸序列。

<序列7>

序列号7表示编码人牛磺酸转运蛋白的基因的碱基序列。

<序列8>

序列号8表示人牛磺酸转运蛋白的氨基酸序列。

序列表

<110>CHUGAI PHARMACEUTICAL CO.，LTD.

<120>牛磺酸转运蛋白基因

<130>FP-079PCT

<150>JP P2006 L 110467

<151>2006-04-13

<160>8

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1869

<212>DNA

<213>中国仓鼠(Cricetulus griseus)

<400>1

<210>2

<211>622

<212>PRT

<213>中国仓鼠

<400>2

<210>3

<21i>1866

<212>DNA

<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400>3

<210>4

<211>621

<212>PRT

<213>褐家鼠

<400>4

<210>5

<211>1866

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>5

<210>6

<211>621

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>6

<210>7

<211>1863

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

<210>8

<211>620

<212>PRT

<213>智人

<400>8