检测氯霉素的电导型传感电极及其分子印迹膜的制备方法

摘要

一种生物传感器领域的检测氯霉素的电导型传感电极及其分子印迹膜的制备方法，本发明中，电导型传感电极由两片丝网印刷电极平行设置组成，电导型传感电极中的氯霉素分子印迹膜制备方法如下：将聚合液在一次性丝网印刷电极表面直接原位聚合过程中嵌埋模板分子，然后将模板分子洗脱，使分子印迹膜内部形成具有固定大小和形状的“空穴”及具有确定排列的功能基团，其对模板分子的立体结构具有记忆性，待测样品中的氯霉素分子能够与这种“空穴”特异性结合，改变分子印迹膜的电化学性质，造成分子印迹膜的电导率增大，过膜电导增加。本发明加工方法简便、成本低，用该丝网印刷电极制成的电导型传感器检测氯霉素操作方便，响应时间快、使用寿命长。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种检测技术领域的电极及其制备方法，具体涉及一种检测氯霉素的电导型传感电极及其分子印迹膜的制备方法。

背景技术

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一种高效广谱的抗生素，广泛用于动物各种传染性疾病的治疗，但是，氯霉素有严重的副作用，能引起人的再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，此外，长期微量摄入氯霉素不仅使大肠杆菌、沙门氏菌等产生耐药性，而且会引起机体正常菌群失调，使人们易感染各种疾病，如果氯霉素在食用动物中残留，可通过食物链传给人类，因此，氯霉素在动物性食品中的残留对人类的健康构成了潜在危害，许多国家和地区相继禁止或严格限制使用氯霉素，我国也规定氯霉素在动物性食品中不得检出，但是，由于氯霉素的抑菌效果好，以及相对廉价，目前仍有人将其用于家禽、畜类以及水产品中。为了保障人民的身体健康以及扩大动物性食品的贸易往来，建立灵敏度高、特异性强、简便易行又经济的氯霉素残留的分析方法是很有必要的。

在检测氯霉素方面，国内外学者在热聚合法制备印迹微粒或电化学法制备印迹膜的基础上，建立了检测生物样品中氯霉素残留的新方法。这些分子印迹传感装置的感受器部分，是通过分子印迹微粒或者是电化学方法制备的分子印迹膜组成的，缺点在于利用分子印迹微粒制备的传感仪组装比较复杂，过程繁琐，且不适合对多个样品进行检测，而利用电化学方法制备分子印迹膜目前还仅限于实验室研究阶段，由于制备和检测过程都要在柱状金属电极上进行，很难批量制备并用于重复检测，因此实际推广应用价值比较低。

经对现有技术文献的检索发现，专利申请号为200810016487.7的中国专利，名称为“检测痕量环境内分泌干扰物的分子印迹膜电极制备方法及检测方法”，该专利中提出将EDCs模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按照摩尔比为0.1～1：1：0.5～6：35～65：0.05～0.05：2.0～25配制聚合液，工作电极表面经过打磨、超声波清洗、酸碱清洗、双蒸水清洗以及干燥，然后将处理后的工作电极浸泡于聚合液中，取出进行洗脱处理，重复上述操作4～7次，制得分子印迹膜电极。该方法的缺陷在于在其工作电极为玻璃碳电极，成本较高，在工作电极表面制备分子印迹膜时操作繁琐，电极处理过程复杂，分子印迹膜制备过程中需要进行多次洗脱，因而制备过程耗时较长。总之，该分子印迹膜电极制备成本高、制备时间长，难以实现对大量样品的检测，因而在实际应用中具有很大的局限性。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出了一种检测氯霉素的电导型传感电极及其分子印迹膜的制备方法，电导型传感电极由两片丝网印刷电极平行设置组成，将聚合液在一次性丝网印刷电极表面直接原位聚合过程中嵌埋模板分子，然后将模板分子洗脱，使分子印迹膜内部形成具有固定大小和形状的“空穴”及具有确定排列的功能基团，其对模板分子的立体结构具有记忆性，待测样品中的氯霉素分子能够与这种“空穴”特异性的结合，从而改变分子印迹膜的电化学性质，造成分子印迹膜的电导率增大，过膜电导增加。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明所涉及的检测氯霉素的电导型传感电极，由两片丝网印刷电极平行设置组成，丝网印刷电极包括：电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、绝缘层，接线端子、电极连线与工作电极连成一体组成一条电极基体，电极基体印制在电极基片上，电极连线的表面涂覆一层绝缘体，接线端子是裸露的导电材料薄膜，两片丝网印刷电极中的一片的工作电极反应区上覆盖有氯霉素分子印迹膜，而另一片中的工作电极为空白电极。

所述绝缘材料为PVC(聚氯乙烯)。

所述氯霉素分子印迹膜，其直径为5mm～6mm，厚度为80～100μm。

所述电极基片，其材料为聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、基乙烯四种聚合物的其中之一，上述聚合物为片材或卷材。

本发明所涉及的检测氯霉素的电导型传感电极分子印迹膜的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，氯霉素分子印迹膜片的制备：称取氯霉素模板分子与功能单体溶于溶剂，超声波震荡混合均匀后加入交联剂，再超声波震荡混合均匀后加入粘合剂，再经超声波震荡混合均匀，然后加入引发剂，超声波震荡混合均匀，通氮气除氧，将上述操作所制备的溶液滴加到电导型传感电极中一个丝网印刷电极的工作电极的反应区，盖玻片压盖，然后将该丝网印刷电极平放在培养皿中，在培养皿周围放置冰与干冰的混合物，并在1000W紫外光聚合，形成内含印迹分子的分子印迹膜。

步骤二，氯霉素分子印迹膜内部氯霉素分子的去除：将步骤一所得的氯霉素分子印迹膜用体积比为9：1的甲醇-乙酸混合溶液经索式提取器中反复洗脱氯霉素分子，直到最后一次洗脱时洗脱液中检测不到模板分子存在为止，于双蒸水中保存备用。

所述功能单体为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸胺、丙烯酰胺中的一种。

所述溶剂为四氢呋喃、二甲亚砜、无水乙醇或甲苯中的一种，溶剂体积为350μl～400μl。

所述氮气除氧，其时间为5分钟～10分钟。

所述冰与干冰的混合物，其中冰与干冰的质量比为9～15。

所述紫外光聚合其时间为15分钟～30分钟。

所述氯霉素模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比为1：5：20。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的电导型电极构造简单，不需要价格昂贵的参比电极；采用电导型电极构造的传感器其灵敏度显著高于电流型传感器；操作简单，测试不同样品时仅需要更换带有不同分子印迹膜的电导型电极即可；抗干扰能力强；响应时间短，检测在3min内即可完成；

(2)本发明方法中所用的四氢呋喃、乙二醇二甲基丙烯酸等亲水性溶剂作反应溶剂和制孔剂，所制备的聚合物可直接应用于含水溶剂，降低了分子印迹膜制备过程及使用过程对条件的要求，扩大了材料的应用范围；

(3)本发明方法的反应过程中加入了粘合剂水性聚氨酯，增加了分子印迹膜的柔韧性，防止了在聚合过程中分子印迹膜出现裂痕的现象，并使所制备的分子印迹膜空穴分布均匀，十分有利于检测效果的提高；

(4)本发明方法的聚合过程中采用冰、干冰混合冰浴，控制了聚合过程中温度恒定，聚合反应在低温下进行，避免了热聚合反应的发生，干冰挥发过程中释放大量CO₂气体，CO₂密度大于空气，可在聚合反应区域周围形成隔绝氧气的环境，因而避免了聚合过程中氧化还原反应的干扰，从而提高了分子印迹膜的特异性识别能力。

(5)本发明的方法获得的分子印迹膜片可应用于制备电导型生物传感器，本发明加工方法简便、成本低，用该丝网印刷电极制成的电导型传感器检测氯霉素操作方便，对于不同样品，只需替换附有氯霉素分子印迹膜的丝网印刷电极即可，且具有响应时间快、使用寿命长、重现性良好和特异性识别能力强等优点。

附图说明

图1为本发明的使用检测氯霉素的电导型传感电极的检测原理示意图；

图2为本发明的检测氯霉素的电导型传感电极的平面图；

图3为本发明的检测氯霉素的电导型传感电极的侧视图；

图4为本发明的实施例中使用检测氯霉素的电导型传感电极检测氯霉素的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

图1为使用检测氯霉素的电导型传感电极的检测氯霉素的工作原理示意图，丝网印刷电极上的分子印迹膜上的特异性空穴选择性的与氯霉素分子结合，造成分子印迹膜电化学性质变化，导致高频电压激励下的电导性能变化，电导信号经电导-电压转换器转化为电压信号并放大，再经模数转换器转化为数字信号，经单片机分析处理后，数据在存储器中保存记录并可随时提取，同时氯霉素浓度直接从液晶显示电路读出，数据可通过USB接口传输到计算机作长期储存。

如图2、3所示，下述实施例涉及的检测氯霉素的电导型传感电极，由两片丝网印刷电极平行设置组成，丝网印刷电极包括：电极基片1、接线端子2、电极连线3、工作电极4、绝缘层5，接线端子2、电极连线3与工作电极4连成一体组成一条电极基体，电极基体印制在电极基片1上，电极连线3的表面涂覆一层绝缘体5，接线端子2是裸露的导电材料薄膜，两片丝网印刷电极中的一片的工作电极反应区上覆盖有氯霉素分子印迹膜6，而另一片中的工作电极为空白电极。

所述绝缘层5，其材料为PVC(聚氯乙烯)。

所述工作电极4，为边长5mm的实心矩形。

所述电极基片1，其长度为36mm～40mm、宽8mm～10mm、厚0.4～0.45mm；

所述接线端子2，其长度为9mm～10mm、宽为1mm～1.2mm；

所述电极连线3，其长度为20mm～25mm、宽为1mm～1.2mm；

所述氯霉素分子印迹膜6，其直径为5mm～6mm，厚度为80μm～100μm。

所述电极基片1，其材料为聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、基乙烯四种聚合物的其中之一，其中优先选择聚氯乙烯，上述聚合物为片材或卷材。

下述实施例所涉及的检测氯霉素的电导型传感电极分子印迹膜的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，氯霉素分子印迹膜片的制备：称取氯霉素模板分子与功能单体溶于溶剂，超声波震荡混合均匀后加入交联剂，再超声波震荡混合均匀后加入粘合剂，再经超声波震荡混合均匀，然后加入引发剂，超声波震荡混合均匀，通氮气除氧，将上述操作所制备的溶液滴加到电导型传感电极中一个丝网印刷电极的工作电极的反应区，盖玻片压盖，然后将该丝网印刷电极平放在培养皿中，在培养皿周围放置冰与干冰的混合物，并在1000W紫外光聚合，形成内含印迹分子的分子印迹膜。

步骤二，氯霉素分子印迹膜内部氯霉素分子的去除：将步骤一所得的氯霉素分子印迹膜用体积比为9：1的甲醇-乙酸混合溶液经索式提取器中反复洗脱氯霉素分子，直到最后一次洗脱时洗脱液中检测不到模板分子存在为止，于双蒸水中保存备用。

所述功能单体为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸胺、丙烯酰胺中的一种。

所述溶剂为四氢呋喃、二甲亚砜、无水乙醇或甲苯中的一种，溶剂体积为350μl～400μl。

所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸、3，5-二丙烯酰胺基苯甲酸中的一种。

所述粘合剂，为水性聚氨酯。

所述引发剂，为偶氮二异丁氰。

所述超声波震荡，其时间为5分钟～15分钟。

所述氮气除氧，其时间为5分钟～10分钟。

所述将溶液滴加到电导型传感电极中一个丝网印刷电极的工作电极的反应区，溶液的滴加量为8μl-15μl。

所述冰与干冰的混合物，其中冰与干冰的质量比为9～15。

所述紫外光聚合其时间为15分钟～30分钟。

所述氯霉素模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比为1：5：20。

实施例1

采用丝网印刷技术将导电银浆在电极基片上印刷电极连线和接线端子的基体，电极连线表面涂覆一层PVC绝缘体，下端的工作电极采用溅射石墨法涂覆一层导电石墨。用50％硝酸浸泡处理，再用蒸馏水冲洗3次。晾干，4℃保存备用。

称取0.05g氯霉素和70μl甲基丙烯酸功能单体溶于380μl四氢呋喃溶剂中，超声混合10分钟后加入乙二醇二甲基丙烯酸交联剂，超声混合10分钟，再往反应体系中加入70μl水性聚氨酯粘合剂，超声混合10分钟后加入0.02g的引发剂偶氮异丁氰，超声混合20分钟后，通氮气5分钟，将制好的混合液滴加10μl到丝网印刷电极工作电极区域，盖上盖玻片，冰：干冰质量比为9：1混合物冰浴、1000W紫外光距离18cm照射15分钟，重复两次，得到内含氯霉素的分子印迹膜。

将所制得的承载分子印迹膜的丝网印刷电极用体积比为9：1的甲醇-乙酸混合溶液经索式提取器中反复洗脱氯霉素分子，直到最后一次洗脱时洗脱液中检测不到模板分子存在为止，得到具有氯霉素空间结构空穴的分子印迹膜。通过电镜扫描分析、原子力显微镜来观察分子印迹膜的表征。电镜扫描与原子力显微镜观察显示，该方法制备的印迹膜表面存在大量可以特异性识别模板分子印迹微孔，直径介于0.1μm～0.48μm之间。

作为优选的实施例，冰：干冰质量比9：1混合物冰浴、1000W紫外光照射15分钟，重复两次聚合成膜，印迹键合的效果达到最佳。

检测样品，以检测牛奶样品中氯霉素残留量为例：

制作标准曲线：利用Tris-HCL(10MM、ph7.4)溶液为支持液，将与电导型传感器相连接的分子印迹丝网印刷电极插入到支持液中，使分子印迹膜片完全浸入到支持液中，磁力搅拌器搅拌条件下加入20μL氯霉素标准液(0.01mg/L)，通过电导型传感器进行检测，记录结果并分析，检测结束后，更换带有分子印迹膜片的丝网印刷电极条，采用相同操作方法分别加入40μL、60μL、80μL、100μL氯霉素标准液，进行检测，针对每个浓度梯度重复检测五次，然后根据五次做出的实验结果，建立氯霉素检测的标准曲线，如图4所示。

样品处理：取经高效液相色谱—质谱联用技术确证不含有氯霉素残留的牛奶样品5个，用10ml移液器准确移取分别样品5ml放至10ml离心管中，加入1ml含有60μg/L的氯霉素标准液，振荡混匀15min，再用6ml乙酸乙酯进行萃取，收集含氯霉素的有机相，40℃、240mbar条件下蒸发去除有机溶剂，最后加入5ml乙腈-2M高氯酸水溶液，体积比为3：2，搅拌20s，振荡混合均匀作为待测溶液。

将上述方法制成的丝网印刷电极的分子印迹膜插入电导型传感器，浸入10mL、Tris-HCL溶液(10MM、ph7.4)，滴加20μL处理的样品，测定并记录读数，并计算出氯霉素残留量。针对同一样品，更换丝网印刷电极条，连续检测5次，以所得的平均值作为检测值。在本实施例中，所检测的牛奶样品中氯霉素的标加回收率为94.6％，相对标准差为2.73％，所检样品中氯霉素的平均含量为74ng/g。该方法在牛奶样品中的检测限为3.6ng/g，线性范围介于5ng/g～200ng/g之间，线性方程为：Y＝0.0038+0.00499X，R＝0.99958。将制备好的10个丝网印刷电极上原位合成的氯霉素分子印迹膜在-4℃条件下保存于双蒸水中，经过两个月之后重新检测相同浓度的氯霉素标准溶液，检测的结果表明两次检测结果的相对标准误差值小于2.6％，因此本实施例中的用于快速检测氯霉素的电导型传感电极具有良好的重复性和稳定性。

实施例2

在氯霉素分子印迹膜的制备过程中，紫外聚合时间为连续照射30min，其他条件不变。在检测过程中，标准曲线的制备同实施例1，检测样品采用鸡肉。

样品处理：取经高效液相色谱—质谱联用技术确证不含有氯霉素残留的鸡肉样品5个，取1克肉样，放入组织匀浆机的样品杯中，加入10毫升0.1M pH为7.2的磷酸盐缓冲液，搅碎并均质化，将其转移到15ml离心管中，加入1ml含有40μg/L的氯霉素标准液，再用6ml乙酸乙酯进行萃取，振荡混匀15min，收集含氯霉素的有机相，40℃、240mbar条件下蒸发去除有机溶剂，最后加入乙腈-2M高氯酸水溶液，体积比为3：2，搅拌20s，振荡混合均匀作为待测溶液。在本实施例中，所检测市售鸡肉中氯霉素的回收率为96.2％，所检样品中氯霉素的平均含量为57ng/g。用不同浓度的氯霉素标准品进行标加试，并重复三次，所得的检测值经统计分析，得出该方法检测肉品中氯霉素的检测限为3.3ng/g，线性范围介于1.0ng/g～250ng/g之间，线性方程为：Y＝0.0087+0.0063X，R＝0.986。稳定性及重复性试验同实施例1。

实施例3

在氯霉素分子印迹膜的制备过程中，丝网印刷电极接线端子、电极连线、工作电极均用导电银浆印制，其他与实施例1同。在检测过程中，标准曲线的制备同实施例1，检测样品采用鸡蛋。

样品处理：取经高效液相色谱—质谱联用技术确证不含有氯霉素残留的鸡蛋样品5个，取5ml放至10ml离心管中，振荡混匀15min，加入1ml含有20μg/L的氯霉素标准液，再用3ml乙酸乙酯进行萃取，收集含氯霉素的有机相，40℃、240mbar条件下蒸发去除有机溶剂，最后加入5ml乙腈-2M高氯酸水溶液，体积比为3：2，搅拌20s，振荡混合均匀作为待测溶液。在本实施例中，所检测鸡蛋中氯霉素的回收率为93.4％，所检样品中氯霉素的平均含量为29ng/g。用不同浓度的氯霉素标准品进行标加试，并重复三次，所得的检测值经统计分析，得出该方法检测肉品中氯霉素的检测限为4.2ng/g，线性范围介于20ng/g～300g/g之间，线性方程为：Y＝0.00312+0.00797X，R＝0.973。稳定性及重复性试验同实施例1。