用于预防和消除组织中纤维样和其他病理性沉积的、含GHRP－6的药物组合物

摘要

本发明涉及反复施用的、作为药物组合物的一部分的促分泌素肽的用途，其中所述药物组合物能够预防和根除病理纤维样物质在内部器官的实质组织中产生的沉积，所述的内部器官例如有肝脏、肺、食道、小肠、肾、血管、关节以及由任何发病机理导致上皮组织纤维样变性的其他身体组织形式。此外，所述的多种肽能够预防和根除淀粉样蛋白物质和透明物质以任何其相应的化学形式和组织表现形式在脑、小脑、血管、肝脏、肠、肾、脾、胰腺、关节、皮肤等中产生的沉积。通过所述的方式，使得由所述沉积产生的细胞、组织和器官的功能紊乱得到改善。本发明的多种肽可以被渗透或局部施用，从而有助于预防和根除皮肤中由于烧伤和其他的皮肤损伤产生的后遗症所衍生的瘢痕疙瘩和肥厚的瘢痕。

说明书

技术领域

本发明涉及医药工业领域，更准确地说，本发明涉及使用促分泌素肽来预防和消除实质内部组织中的纤维化结构的病理沉积，其中所述的实质内部组织例如有肝脏、肺、食道、小肠、肾、血管、关节以及由任何发病机理导致上皮组织纤维样变性的其他身体组织形式，其中所述的促分泌素肽以药物组合物的形式反复施用。

背景技术

纤维样变性事件涉及一类单器官或全身器官的病理学现象，该病理学现象可表征为在几乎每种内部器官的实质中或在血管以及皮肤中发生的细胞外基质的异常沉积。纤维样变性被认为是基于自体免疫的复杂事件的结果，或者是对延时模拟的发炎事件发生间质反应的结果。总之，过多的胶原蛋白物质或过多的发生增生的基质细胞物质通过间质效应器细胞而沉积在所述的实质中，其中所述的增生的基质细胞物质会湮灭功能性的组织。介导上述事件的效应器细胞起源于间充质细胞，根据受到影响的组织来看，该效应器细胞似乎是非常独特的。总体而言，产生病理学的纤维样变性涉及肌成纤维细胞。介导纤维样变性形成的机制是复杂的，并且还没有被完全理解。不管怎样，都认为所述这些事件中涉及转化生长因子β(TGF-β)、结缔组织衍生的生长因子(CTGF)以及血小板衍生的生长因子(PDGF)，并且与靶器官无关。通常，长期的纤维样变性是致命的，并且到目前为止没有治愈的可能。现在，我们将提及一些关于在某些器官中的纤维样变性事件的技术情况(Ding J，Yu J，Wang C，Hu W，Li D，Luo Y，Luo H，Yu H.Ginkgobiloba extract alleviates liver fibrosis induced by CCl₄ in rats.Liver International 2005：25：1224-1232.)(Friedman SL.Reversal of hepat ic fibrosis-Fact or fantasy？Hepatology.2006Jan 30；43(S1)：S82-S88)。

肝脏的纤维化

当肝脏被损坏时，炎性反应和重新形成的细胞外基质(EM)使得该器官的正常的功能和构造得以恢复。然而，当这种损坏持续下去时，修护和解决上述问题所涉及的因子发生了失衡，从而改变了EM的调节，并促进了失衡成分的过多合成。肝脏是新陈代谢调节、血液过滤和激素调节所涉及的主要器官。肝星状细胞(HSC)位于内皮细胞和肝细胞之间的间隙内，所述间隙被称为Disse间隙或窦状隙，其以长的细胞质的形式环绕内皮细胞。HSC能够合成和分泌EM成分，并代表了纤维样变性事件的重要来源。HSC能够储存视黄基酯(retynil ester)，从而合成生长因子和其他细胞因子，其另一个作用是调节窦状隙的血液流速。HSC可以从静息状态转变为活化状态，该活化状态可通过促炎细胞因子的旁分泌、活性氧类物质的产生或通过EM结构(其影响了细胞的表型)的改变来诱导。在HSC的活化过程中，其分化成形状伸长的肌成纤维细胞，该肌成纤维细胞表达出α-平滑肌肌动蛋白，并释放所有储存的视黄醇。在这种状态下，HSC获得了新的性质，从而帮助它们保持并放大炎性反应，所述性质为：能够增殖、具有收缩性、产生细胞因子、并且主要的是合成和分泌EM成分。TGF-β为在活化的HSC中促进EM蛋白质生成的主要因子(这些主要因子主要由活化阶段的肝巨噬细胞合成)之一；TGF-β主要由处于持续活化阶段的HSC产生，从而保持持续的活化状态。总之，肝脏中所有的纤维硬化情况都与生存状态相矛盾(肝脏衰竭，最新为2004年9月3日，2004.编辑：David Eric Bernstein，硕士，北岸医学院肝病部门主任，纽约医药大学肝病部国际医药部负责人，副教授；Francisco Talavera，PharmD，博士，资深药学编辑，药物部；Oscar S Brann，硕士，临床副教授，UCSD学院学部；胃肠学项目负责人，国际医学部，圣地亚哥Naval医学中心；Alex J Mechaber，硕士，FACP，临床技术项目负现人，副教授，国际医学部，国际医学总部，迈阿密医学院；和Julian Katz，硕士，教授，国际医学部，胃肠学部，MCP Hahnemann大学)(Sarem M.Hepatic stellate cells：it′s role in normal and pathologicalconditions.Gastroenterol Hepatol.2006 Feb；29(2)：93-101)。

肺纤维样变性

肺纤维样变性是一种进程相对较慢的疾病，其还包括若干种病理学现象。在组织学上，肺纤维样变性可以表征为暂时的异物(主要为成纤维细胞)损伤。即使在肺纤维样变性的发病机理(已经得到充分证实)方面不断取得进展，但是关于调节所述主要损伤的精确的机制仅有很少的信息。其中免疫(主要是自体免疫)因子被认为具有相关性。还涉及遗传因子。从微观上而言，隐含的特性包括肺泡上皮细胞(II型肺泡细胞)在增殖阶段的变化，其中核仁清晰，并且在细胞学上是异常的，类似于普通的模拟病毒感染的情况。可以发现处于细胞核内的超微结构的管状内含物。EM以及(特别是)胶原蛋白物质在肺实体中的沉积过程不知不觉地损害了肺的结构，结果，细支气管和肺泡塌陷，最终导致功能紊乱并损害肺通气。此外，TGF-α为使上述过程相继发生的主要细胞因子之一。肌成纤维细胞为EM产生细胞(Medranda Gomez MA，Paricio Nunez P，Tovar Martinez A，FerrerMarin F，Gonzalez Martinez P，Garcia Puche MJ.Pulmonaryfibrosis.Rev Esp Enferm Dig.2005 Nov；97(11)：843-4)。

系统性上皮细胞纤维样变性或硬皮病

系统性硬化症(SS)是一种特别复杂的疾病。到目前为止，还没有似乎可信的理论来解释系统性硬化症的发病机理。然而，已经证明在成纤维细胞、内皮细胞和免疫系统的细胞(特别是B淋巴细胞和T淋巴细胞)中发生了基本的异常。这些细胞的功能性改变促进了SS中典型的三种病理学变化：上皮和内脏的进行性纤维样变性、小动脉和细动脉的管腔闭塞以及免疫异常。体液和细胞的免疫性的改变引起大量抗体(其中一部分抗体对所述疾病具有极特异性)被分泌出来、单核细胞渗透到所影响的组织中、以及细胞因子和生长因子的产生不受控制。到目前为止，没还没有阐明这些改变中的哪一种改变是所述疾病的主要的引发事件，或者是否这三种改变对于产生进行性SS纤维样变性过程来说是两两相关的。但是，在SS患者的成纤维细胞中，一个重要的致病因素包括编码几种胶质和其他EM蛋白质的基因不受控制并保持持续的活性。这就是在能够进行正常的创伤愈合的正常成纤维细胞与SS的成纤维细胞间的主要差异，其中SS的成纤维细胞会不受控制地产生胶原蛋白，并且这些胶原蛋白发生沉积，从而导致所影响的器官发生病理学的纤维样变性。此外，TGF-β是明显涉及SS的组织纤维样变性的生长因子之一。最重要的结果之一包括合成了多种胶原蛋白和其他EM蛋白质，例如纤连蛋白(31)。患有SS的患者的成纤维细胞在其表面上表达出大量的TCF-β受体，这可能是造成胶原蛋白生成增多以及由TGF-β诱导的信号传递增强的原因(30)。所述疾病还具有无法挽救的致命性(Steen V.Targeted therapy for systemicsclerosis.Autoimmun Rev.2006 Feb；5(2)：122-4)。

糖尿病患者的肾硬化或糖尿病患者的肾病

几乎每一位糖尿病患者在确诊为糖尿病的2至3年后都会发展成肾小球和肾小管的基底膜增厚。其中一些患者还会发展成肾小球系膜细胞和间质的纤维样变性，其为进行性糖尿病患者患肾病的病理学标志。这种肾病在临床上还会形成逐渐发展成的蛋白尿、高血压和肾功能不全。肾小球系膜区的增生程度与间质的纤维样变性的严重程度以及动脉硬化症的严重程度之间具有很好的相关性，此外，肾小球系膜区的增生会减慢肾小球过滤的速度。最终，肾小球系膜增生通过堵塞肾小球毛细血管和减少肾小球的有效过滤区域来减小肾小球的增生程度。与上述方式相同，肾小管间质的纤维样变性改变了肾小管的构造和功能，从而导致肾功能不全。在所述的这些疾病中，已经阐明了TGF-β在配合纤维样变性(发生在糖尿病患者的肾脏中)过程中的作用。这些疾病是进行性的，悄然发生的，并且患者会因肾功能不全而死亡(Cohen，M.P.，Ziyadeh，F.N.，Hong，S.W.，Shearman，C.W.，Hud，E.，Lautenslager，G.T.，Iglesias-de la Cruz，M.C.，& Chen，S.(2002).Inhibiting albumin glycation in vivoameliorates glomerular overexpression of TGF-beta etal.KidneyInt，61：2025-2032)，(Ziyadeh，F.N.，Hoffman，B.B.，Han，D.C.，Iglesias-de la Cruz，M.C.，Hong，S.W.，Isono，M.，Chen，S.，McGowan，T.A.，& Sharma，K.(2000).Long-term preventionof renal insufficiency，excess matrix gene expression andglomerular mesangial matrix expression by treatment withmonoclonal anti-TGF-beta antibody in db/db diabetic mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：8015-8020)。

阴茎纤维样变性或派罗尼病(Peyronie’s disease)

从概念上讲，上述疾病涉及阴茎勃起组织中的弹性覆盖物(白膜)的病理学瘢痕，其可以导致阴茎在安静状态下回缩，以及阴茎在勃起期间弯曲及回缩。虽然很难证明所述疾病的发作情况，但是大部分的研究者一致认为首先发生引发脉管炎的免疫和创伤过程的发炎过程或激活胶原蛋白基因族(collagenopathy)的发炎过程，然后发生白膜的纤维样变性的恶化情况。当纤维化瘢痕悄然形成时，表现为阴茎在勃起或进入时会产生疼痛感，并发生弯曲或回缩，这被描述为疾病入侵的第一阶段。纤维化引起显著的病症。一些患者还可能在耳垂软骨中发生其他的并发的纤维样变性。这种疾病虽不致命，但是却严重地损害了患者的生活质量。此外，TGF-β涉及引发或扩增疾病的分子基础的因子(Jakut M.New discoveries in the basic scienceunderstanding of Peyronie′s disease.Curr Urol Rep.2004Dec；5(6)：478-84)。

脑微血管病变

在患有阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)的患者的脑中，已经鉴定出血管病变，其成为所述疾病及其他痴呆疾病的发病机理的标志。血管病变导致的分层和局部分布与神经原纤维缠结和老年斑的表观有关。100多年以前，曾经有文件记录了在老年人的脑血管中存在生理学异常，包括僵硬、曲折和卷曲。在十几年前，证实了这些现象，又进一步描述了随着主要血管的老化，衰老的海马毛细血管发生扭曲的现象。从超微结构的角度上，可以分辨出以下情况：(a)膜状内含物进入基底膜中；以及(b)形成微血管胶原蛋白沉积(纤维样变性)或基底膜部分增生。毛细血管周细胞随着年龄的增长明显发生退化。在哺乳动物的脑中，观察到胶原蛋白纤维在基底膜内部沉积。这些纤维发生64nm的扭转使得人们可以鉴别出这种微血管纤维样变性中的胶原蛋白组合物，这种胶原蛋白组合物位于内皮与周边细胞之间，或位于基底膜的内表面上。在大鼠和人类中，基底膜增生和胶原蛋白沉积的程度同样地随着的年龄的增长而加重，并且脑微血管的这些纤维硬化的恶化过程通常被认为是导致痴呆的过程的解剖学基础。随着细动脉网络的进行性堵塞，在临床上，这些疾病将恶化，最终废除了每一个群落关联和认知活性。

由于超过50％的痴呆患者显示出具有任意的脑血管病的特征，所以目前，对血管病在痴呆的发病机理中的作用进行了重新定位。发现，存在有其他脑神经的、非阿尔茨海默氏病的痴呆过程来作为引起记忆、学习和普通技巧发生严重衰退的媒介。最相关的实例是伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)。这种疾病还有待在分子水平和细胞水平上进行阐明。但是，由嗜渗性颗粒物质的进行性沉积导致的动脉病随后使得动脉腔被堵塞，从而在脑中形成缺血灶，最后导致梗死发作。由微梗死导致的神经元存活能力的降低使得脑中的主要神经活性恶化，从而导致衰老和痴呆状态(Nakanao I.The function and integrity of the neurovascular unit rests uponthe integration of the vascular and inf lammatory cell systems.Curr Neurovasc Res.2005 Dec；2(5)：409-23.；Mott RT.Neuropathology of Alzheimer′s disease.Neuroimaging Clin N Am.2005 Nov；15(4)：755-65)。

其他的退化过程、β-淀粉样蛋白的沉积

阿尔茨海默氏病是最普遍的痴呆病，并且是65岁以上老年人的主要致死原因。与一种未确知的疾病的起因相同，阿尔茨海默氏病患者的脑中显示出在神经元的内部和外部沉积了多种蛋白质，并且这种沉积与所述疾病具有相关性。β-淀粉样蛋白是在脑和脑干中形成细胞外沉积的蛋白之一。所述的瘢痕是由β-淀粉样蛋白形成的紧实的核构成的，其中所述的β-淀粉样蛋白由其前体蛋白衍生而来。患上痴呆的风险与阿朴脂蛋白E(Apo-E)的多态性密切相关。在脑中，Apo-E与β-淀粉样蛋白相互作用，其方式为Apo-E4与增多的β-淀粉样蛋白沉积连接并且与增多的、大量的神经原纤维缠结相连。

注意、学习和记忆过程是在阿尔茨海默氏病所影响的脑能力的范围内，并且这些状况被建立成为由β-淀粉样蛋白沉积来表征的痴呆疾病的模型。到目前为止，仅有一种FDA认可的药品用于治疗在患有阿尔茨海默氏病期间的认知不足。β-淀粉样蛋白会通过自由基介导而在脑细胞中产生坏死作用。在阿尔茨海默氏病中，β-淀粉样蛋白在脑实质中沉积是独特的发病机理的标志，而在正常的生理学老化的过程中，β-淀粉样蛋白的沉积则以较低的速度进行。

β-淀粉样蛋白的神经毒性蛋白变体的合成的减少可以减缓阿尔茨海默氏病中协助对神经元造成损害的过程。同样，将β-淀粉样蛋白从脑中除去以及β-淀粉样蛋白的进一步排泄会有助于阿尔茨海默氏病患者的主要神经功能的恢复。阿尔茨海默氏病严重地损害了患者的生活品质，并且难以治愈(Gurol ME.Plasma beta-amyloid and whitematter lesions in AD，MCI，and cerebral amyloid angiopathy.Neurology.2006 Jan 10；66(1)：23-9.；Han HS.The function andintegrity of the neurovascular unit rests upon the integrationof the vascular and inflammatory cell systems.Curr NeurovascRes.2005 Dec；2(5)：409-23；Anderson E.The Oorganic BrainSyndrome(OBS)scale：a systematic review.Int J GeriatrPsychiatry.2006 Jan 27)。

发明概述

本发明涉及促分泌素肽在药物组合物中的用途，其中所述的促分泌素肽包括GRHP-6、GRHP-2、海沙瑞林(Hexarelin)和/或生长激素释放肽(Ghrelin)，其中当将所述的药物组合物施用给受体生物体时，该组合物可以预防、控制及根除透明物质、淀粉样蛋白，以及颗粒状的嗜酸性物质和嗜渗性物质在内部器官、外部器官和血管网络器官中形成的细胞内和细胞外的病理学沉积，其中所述的内部器官、外部器官和血管网络器官例如有肝脏、肺、食道、肠、肾、血管、关节以及由任何发病机理导致上皮组织产生纤维样变性变体的其他身体组织形式。本发明的药物组合物为液体、半固体或固体组合物，其可以通过以下方式给药：通过静脉、肌肉、腹膜内、皮下、鞘内、直肠和局部途径给药，通过局部渗透到皮肤或粘膜、上皮细胞或器官中的方式给药，更精确地是通过病灶内给药和/或病灶周围给药。本发明的药物组合物含有肽类和可药用的载体，其中所述的肽类为GHRP-6、GHRP-2、海沙瑞林和/或生长激素释放肽，其用量为5微克至1毫克，更精确地说，每服药剂中含有30微克至500微克的肽类。

附图说明

附图为在使用GHRP-6进行治疗的末期，每组动物中患有肾纤维样变性的动物所占的百分率。注意，在使用生理盐水溶液的安慰剂组与使用GHRP-6的组间存在差异。在对安慰剂组和使用400μg/kg剂量的GHRP-6的一组进行比较时，观察到的差异是最大的，表明治疗效果对剂量的依赖性。肾间质内纤维增生的组织学评价包括纤维化的肾小管包囊，并且还包括纤维化的肾小球包囊。按照这种方法，建立总体的肾纤维样变性的等级，并利用该等级确定在治疗末期受影响的或未受影响的动物所占的百分率。(a)-使用剂量为400μg/kg的GHRP-6的一组与安慰剂组之间具有统计学差异，p<0.001。

实施例

实施例1.使大鼠的肝纤维样变性复原

实施本试验来评价基于GHRP-6的药物组合物对使大鼠肝纤维样变性复原的效果。通过将平均体重为250g的雄性Wistar大鼠的肝外胆管结扎来诱导肝纤维样变性。为了达到所述的目的，用克他命/甲苯噻嗪的组合物来麻醉大鼠，然后剖开该大鼠的腹部，暴露出胆总管。用铬制肠线4-0将胆总管双重结扎。手术后，将大鼠以每组20只随机分成3个试验组，分别为：(1)对照安慰剂组，使用生理盐水溶液，(2)使用剂量为100μg/kg的GHRP-6的组，以及(3)使用剂量为400μg/kg的GHRP-6的组。在诱导出肝实质纤维样变性之后的3个星期中，每天都进行给药治疗。所有的治疗是在呈现出纤维样变性外观之后的3个星期时开始的。在肝损坏之后，每个星期都对所述器官的注射区域进行超声波检测，检测程序为：GOT和GPT的转氨酶在血清中的含量、γ-谷氨酰转移酶(GGT)的含量以及腹水量。通过腹腔给药的方式，每天一次施用GHRP-6或安慰剂来进行治疗。当治疗结束时，处死大鼠，并收集血清和肝脏。将肝脏碎片固定在中性福尔马林中，并采用苏木精/伊红来进行染色，或者采用Masson特殊染色来进行染色，从而评价总体的损坏情况和纤维化硬化的严重程度。将肝脏组织的其他碎片储存在-70℃下，直到通过在1N的HCl中进行酸水解来确定羟脯氨酸的含量，以及确定氧化还原新陈代谢的标志物在肝内的水平。通过采用Bradford方法计算总的蛋白质的含量来进行生物化学测定。

表1.上述过程的评价等级：(0)-*无现象，(1)-轻度，(2)-中度，(3)-重度，(4)极重度

 

试验组0等级1等级2等级3等级4等级安慰剂组(N＝14)0025*7(50％)*剂量I组(N＝16)59200剂量II组(N＝20)811100

*p<0.001。卡方测验。

表2.在三个星期的治疗结束时，对肝脏中羟脯氨酸的含量进行评价

 

试验组羟脯氨酸的含量(总的蛋白质的含量，单位为：μg/g)安慰剂组(N＝14)133.25±21.69**剂量I组(N＝16)56.71±8.11*剂量II组(N＝20)16.15±1.025

**p＝0.00021，安慰剂组与治疗组。*p＝0.001，治疗I组与治疗II组。研究者进行的双尾t检验。

表3.在三个星期的治疗结束时，由所有的组中得到的GOT、GPT和GGT的血清含量

 

试验组GOT(IU/1)GPT(IU/1)GGT(U/1)未经试验大鼠32.56±9.2720.93±7.7423.62±5.21安慰剂组(N＝14)115.84±27.80**155.30±11.63**143.18±25.36**剂量I组(N＝16)61.58±16.10*81.71±30.90*71.53±22.14*剂量II组(N＝20)30.41±6.1160.64±19.8725.56±8.63

** p＝0.0003，安慰剂组与剂量II治疗组和未试验大鼠。*p＝0.0002，剂量I组与剂量II组和未试验大鼠。在未试验大鼠和剂量II组的大鼠之间，没有观察到差异。研究者进行的双尾t检验。

表4.在三个星期的治疗结束时，肝脏样品中氧化应激标志物的水平

 

试验组SODt过氧化氢酶HPTMDA未经试验组28261.08±1260.9416.40±3.9527.25±2.470.06.±0.01生理盐水-安慰剂组573.83±645.93**580.58±57.39**108.66±15.82**0.25±0.04**剂量I组11058.07±744.61*68.50±12.73*43.06±1.83*0.14±0.02*剂量II组21029.87±498.2831.50±4.321.16±1.710.08±0.01

** p＝0.0001，安慰剂组与剂量II的治疗组和未经试验的组。*p＝0.0003剂量I组与剂量II组和未经试验的组。在未经试验的组和剂量II组之间，没有观察到差异。研究者进行的双尾t检验。

使用GHRP-6进行治疗清楚地证明了所述肽根除和控制胶原状且在细胞外的物质在肝脏实质中沉积的能力，其中所述物质的沉积是通过结扎胆总管来实现的。相关的治疗效果是通过汇集形态学和生物化学的数据来证实的，这些数据支持了对严重恶化的静脉周和管周的纤维化状态的治疗作用。重要的是应该注意，安慰剂组的大鼠没有显示出自发缓解的情况。

实施例2.使大鼠的肝纤维样变性复原

实施本试验来评价含有GHRP-6的药物组合物对使大鼠肝纤维样变性复原的效果，其中所述的肝纤维样变性是使用四氯化碳(CCl₄)诱导的。四氯化碳是一种肝毒剂，在长期施用后，可导致慢性肝炎和纤维样变性。在4周内，以每星期2次的频率通过腹膜内施用溶解于橄榄油中的、浓度为50％/50％(v/v)的CCl₄来诱导体重为250g的雄性Wistar大鼠的肝纤维样变性。此后，将25％的大鼠处死，并进行血液生物化学和病理解剖学研究。证实，在所有被研究的大鼠中都发生了肝纤维样变性的过程。将诱导所得的大鼠以每组15只随机分成3个试验组，分别为：(1)对照安慰剂组，使用生理盐水溶液，(2)使用剂量为100μg/kg的GHRP-6的组，以及(3)使用剂量为400μg/kg的GHRP-6的组。在检测到肝实质发生纤维样变性过程之后的4个星期中，每天都进行给药治疗。治疗是在建立纤维样变性并给予CCl₄悬浮液之后立即开始的。当治疗结束时，处死大鼠，并收集血清和肝脏。将肝脏碎片固定在中性福尔马林中，并采用苏木精/伊红来进行染色，或者采用Masson特殊染色来进行染色，从而评价总体的损坏情况和纤维化硬化的严重程度。将肝脏组织的其他碎片储存在-70℃下，直到通过在1N的HCl中进行酸水解来确定羟脯氨酸的含量，以及确定氧化还原新陈代谢的标志物在肝内的水平。通过采用Bradford方法计算总的蛋白质的含量来进行生物化学测定。对使用所述的药物组合物进行治疗的反应可通过测定GOT和GPT的转氨酶在血清中的含量、定量的组织学标准以及一些独特的、一定含量的脂质过氧化反应标志物来表征。

表5.上述过程的评价等级：(0)-无现象，(1)-轻度，达到切片的25％，(2)-中度，达到切片的50％，(3)-重度，达到切片的75％，(4)极重度，超过切片的75％。桥接模式的纤维增生反应的组织学评价包括在区域III处同时坏死。在治疗结束时，根据恶化等级对每组中的大鼠进行评价。

 

试验组(n＝15)0等级1等级2等级3等级4等级安慰剂组0005*10**剂量I组096*00剂量II组8*7000

*p<0.001，卡方测验。0等级：剂量II组与安慰剂组和剂量I组。1等级：剂量I组和剂量II组与安慰剂组。3等级和4等级：安慰剂组与经治疗的大鼠。

表6.在治疗结束时，对肝脏中羟脯氨酸的含量进行评价

 

试验组(N＝15)羟脯氨酸的含量(总的蛋白质的含量，单位为：μg/g)安慰剂组86.19±11.43**剂量I组40.21±3.54*剂量II组10.22±4.33

**p＝0.00021，安慰剂组与经治疗组。*p＝0.001，剂量I组与剂量II组。研究者进行的双尾t检验。

表7.在治疗结束时，由所有的组中得到的GOT和GPT的血清含量

 

试验组GOT(IU/1)GPT(IU/1)未经试验大鼠31.56±6.5518.77±6.53安慰剂组111.97±36.50**274.14±21.75**剂量I组56.31±12.19*77.15±22.66*剂量II组28.18±4.7126.94±12.42

**p＝0.0005，安慰剂组与剂量II治疗组和未经试验的大鼠。*p＝0.001，剂量I组与剂量II组和未经试验的大鼠。在未经试验的大鼠和剂量II组大鼠之间没有观察到差异。研究者进行的双尾t检验。

表8.在治疗的第三个星期结束时，肝脏样品中氧化应激标志物的水平

 

试验组SODt过氧化氢酶HPTMDA未经试验组28261.08±1260.9414.84±1.2418.72±3.220.09±0.02生理盐水-安慰剂组289.2±116.1**560.59±44.28**257.84±86.14**0.56±1.04**剂量I组17632.08±321.55*60.43±11.81*55.11±2.770.16±1.16*剂量II组20187.87±245.1322.67±3.5626.44±2.430.09±0.01

**p＝0.0002，安慰剂组与剂量I治疗组、剂量II治疗组和未经试验的动物。*p＝0.0005，剂量I组与剂量II组、安慰剂组和未经试验的动物。在未经试验的大鼠和剂量II组大鼠之间没有观察到差异。研究者进行的双尾t检验。

使用GHRP-6进行的治疗总体上证明了所述肽根除和控制胶原蛋白和细胞外基质物质在肝脏实质中沉积的能力，其中胶原蛋白和细胞外基质物质的沉积是反复施用CCl₄所导致的。上述治疗还预防了个体的局灶性和肝小叶周(pericentrolobular)的肝细胞死亡。相关的治疗效果是通过汇集形态学、酶学和生物化学的数据来证实的，这些数据支持了这样的结果：在未发生自发缓解的情况下，已经形成的以及恶化的融合性桥接模式的、严重的弥漫性肝脏纤维样变性可复原到几乎无法察觉的程度。此外，安慰剂组的大鼠没有显示出自发缓解的情况。

实施例3.使患有肾硬化的大鼠的肾纤维样变性复原。第三个试验

实施本试验来评价含有GHRP-6的药物组合物对使大鼠肾纤维样变性复原的效果。在这种情况下，通过在8个星期内以每周2次的频率持续施用剂量为2.5mg/kg的抗肿瘤药剂(阿霉素：DX)来诱导大鼠肾纤维样变性。通过对所述器官进行的组织病理学研究证明，25％的使用阿霉素毒化的大鼠在门静脉周、支气管以及在具有囊性-结节性模式的整个肾间质中发生了纤维样变性沉积。然后，中止施用DX，并使用含有GHRP-6的药物组合物开始治疗。在4周内，通过腹腔给药的方式分别以100μg/kg和400μg/kg的剂量每日施用1次1ml的上述药物组合物来进行治疗。将诱导所得的大鼠以每组20只随机分成3个试验组，分别为：(1)对照安慰剂组，使用生理盐水溶液，(2)使用剂量为100μg/kg的GHRP-6的组，以及(3)使用剂量为400μg/kg的GHRP-6的组。当治疗结束时，使用过量的麻醉药剂来处死大鼠，并收集肝脏、肾脏、肺和血清。将所述组织的碎片固定在中性福尔马林中，并采用苏木精/伊红来进行染色，或者采用Masson特殊染色来进行染色，从而评价总体的损坏情况和纤维化硬化的严重程度。将其他碎片储存在-70℃下，直到通过在1N的HCl中进行酸水解来确定羟脯氨酸的含量，以及确定肌酸酐和氧化应激标志物的水平。通过采用Bradford方法计算总的蛋白质的含量来进行生物化学测定。

表9.每组大鼠在纤维化恶化的各种严重程度下的数量。上述肾纤维样变性过程的评价等级：(0)等级-无现象，(1)等级-轻度，肾间质受到损伤但肾小管或肾小球没有发生变形或被包围，(2)等级-重度，整个肾间质受到损伤，肾小管变形，管腔闭塞并且肾小球的外部被包围，(3)等级-极重度，肾小管被包围并塌陷，并且肾小球塌陷。此外，还包括系膜沉积。

 

试验组(N＝20)0等级1等级2等级3等级安慰剂组01415*剂量I组6950剂量II组515*00

*p<0.001，卡方测验。

表10.在治疗结束时，对肾脏中羟脯氨酸的含量进行评价

 

试验组(每组20块碎片)羟脯氨酸的含量(总的蛋白质的含量，单位为：μg/g)安慰剂组65.21±22.16**剂量I组46.15±2.73*剂量II组8.66±1.02

**p＝0.0001，安慰剂组与经治疗组。*p＝0.05，剂量I组与剂量II组。研究者进行的双尾t检验。

表11.在治疗结束时，由所有的组中得到的GOT和GPT的血清含量。就肝实质整体而言

 

试验组GOT(IU/1)GPT(IU/1)安慰剂组124.12±28.3**188.77±16.98**剂量I组64.82±23.71*81.0±10.25*剂量II组26.22±4.128.25±5.66

**p＝0.0005，安慰剂组与经治疗组。*p＝0.042，剂量I组与剂量II组。研究者进行的双尾t检验。

表12.在治疗的第四个星期结束时，肾组织样品中氧化应激标志物的水平

 

试验组SODt过氧化氢酶HPTMDA安慰剂-生理盐水组199.7±6.81**356.2±18.15**287.11±20.02**0.981±1.1**剂量I组665.08±28.42*126.02±12.23*73.2±6.920.56±2.23*剂量II组1287.64±112.6345.38±8.2716.14±3.670.087±0.02

**p＝0.0002，安慰剂组与剂量I治疗组、剂量II治疗组和未经试验组。*p＝0.0005，剂量I组与剂量II组、安慰剂组和未经试验组。在未经试验的大鼠和剂量II组大鼠之间没有观察到差异。研究者进行的双尾t检验。

实施例4.肺纤维样变性的控制

实施本试验来评价含有GHRP-6的药物组合物对使大鼠肺纤维样变性复原的效果。在这种情况下，通过在4个星期内以每周2次的频率持续施用剂量为2.5U/kg的抗肿瘤药剂(争光霉素：Ble)来诱导大鼠肺纤维样变性。通过组织病理学分析证明，25％的使用Ble霉素毒化的大鼠在肺部发生了纤维样变性。然后，暂停施用Ble，并使用含有GHRP-6的药物组合物开始治疗。在4周内，通过腹腔给药的方式分别以100μg/kg和400μg/kg的剂量每日施用1次1ml的上述药物组合物来进行治疗。将上述大鼠以每组10只随机分成3个试验组，分别为：(1)对照安慰剂组，使用生理盐水溶液，(2)使用剂量为100μg/kg的GHRP-6的组，以及(3)使用剂量为400μg/kg的GHRP-6的组。当治疗结束时，使用过量的麻醉药剂来处死大鼠，并收集肺和血清。将所述组织的碎片固定在中性福尔马林中，并采用苏木精/伊红来进行染色，或者采用Masson特殊染色来进行染色，从而评价总体的损坏情况和纤维化硬化的严重程度。将肺组织的其他碎片储存在-70℃下，直到通过在1N的HCl中进行酸水解来确定羟脯氨酸的含量，以及确定氧化还原新陈代谢的标志物在肺内的水平。通过采用Bradford方法计算总的蛋白质的含量来进行生物化学测定。肺内纤维增生反应的组织学评价包括血管周围、支气管周围和隔膜产生纤维样变性的过程。根据这三个部分中纤维样变性过程的发展情况以及强烈程度来建立肺纤维样变性的所有等级，从而确定在使用GHRP-6进行治疗的末期时受影响或未受影响的大鼠的百分率。根据纤维样变性的严重程度，各组中形成纤维化肺的大鼠的数目如下：

0 等级-不存在明显的纤维样变性或者仅存在细小且弥漫的纤维或网状物病灶，并且没有产生呼吸恶化。

1 等级-75％以上的细动脉和毛细血管中存在着占据血管大部分的纤维样变性。

2 等级-75％以上的细动脉和毛细血管中存在着占据血管大部分的纤维样变性，并且额外具有支气管周围恶化。

3 等级-75％以上的细动脉和毛细血管中存在着占据血管大部分的纤维样变性，并且额外具有支气管周围恶化。此外，在肺泡隔中检测到纤维化物质。

表13.在各组中，根据肺纤维样变性的严重程度分级的大鼠

 

试验组(N＝15)0等级1等级2等级3等级安慰剂组00510*剂量I组31020剂量II组8700

*p<0.05，Fisher确切检验。

由上表可以看出，在0等级或1等级中不包含安慰剂组的大鼠。就纤维样变性的严重程度而言，安慰剂组中的大部分大鼠被分到3等级中。与此截然不同的是，剂量II组表明了有效的保护作用，其中50％以上的大鼠被分到0等级中。

表14.在使用生理盐水或GHRP-6的治疗结束时，对肺中羟脯氨酸的含量进行评价

 

试验组(每组中15块碎片)羟脯氨酸的含量(总的蛋白质的含量，单位为：μg/g)安慰剂组178.53±42.77**剂量I组91.24±16.84*剂量II组12.75±3.61

在肺组织的干态样品中测得的羟脯氨酸的含量还表明对根除由Ble引起的肺纤维样变性或使由Ble引起的肺纤维样变性复原的效果，其中所得的羟脯氨酸的含量与上文所述的组织病理学结果一致。

到此为止，在4个独立的试验中已经显示出许多证据，这些证据支持了含有GHRP-6的药物组合物具有有效的抗纤维化效果，其中所述的4个独立的试验分别包括：2个肝脏研究、1个肾纤研究和1个肺部研究。这些研究的结果是可重复的并且是可再现的，表明可在多于1个的内部器官中控制纤维样变性过程的治疗效力，而无需考虑引起这些器官发病的起源。

实施例5.含有GHRP-6的药物组合物在控制和根除脑中β-淀粉样蛋白沉积中的作用

进行本研究来评价长期施用(8周)GHRP-6对转基因小鼠(其表达了β-淀粉样蛋白前体蛋白质)的脑中的生物化学标志物以及形态学标志的影响，这些标志物及标志还指示出了中枢神经系统损坏的进程。

对于本研究而言，获得的是体重为20-25g的雄性APP转基因小鼠，其表达β-淀粉样蛋白前体蛋白质。将小鼠(N＝30)随机分成以下几组：

安慰剂组-使用0.9％的生理盐水溶液。

剂量I组-使用GHRP-6溶解于生理盐水中所形成的溶液，并使得GHRP-6的剂量为50μg/kg体重。

剂量II组-使用GHRP-6溶解于生理盐水中所形成的溶液，并使得GHRP-6的剂量为100μg/kg体重。

通过以下方式进行治疗，所述方式为：在8个星期中，每个星期的5天中以腹腔给药的方式给药1ml，使得小鼠接受40次GHRP-6给药。由之间的探索性初步研究我们知道，这段时间足以改善处于所述应激下的小鼠的认知技巧和运动技巧。

在治疗8个星期后，将小鼠用过量的麻醉药剂处死，并用生理盐水原位灌注。取出脑，将一块脑在干冰中冷冻，另一块脑固定于4％的中性多聚甲醛中。将样品以10μm的厚度进行低温切割，并将所得脑切片用苏木精-伊红或刚果红染色，或者用β-淀粉样蛋白的特异性抗体温育。通过显微成像获取技术，使用与显微镜相连的照相机来实施获取形态的过程，并将取得的图像用DIGIPAT软件进行分析。

所研究的标志物：

刚果红染色呈阳性的β-淀粉样蛋白的纤维状沉积物的数量。

与可鉴别出β-淀粉样蛋白的抗体发生免疫反应的病灶的数量。

脑中β-淀粉样蛋白的大小，以放大200x和400x来识别(μm²)。

作为老化和脑新陈代谢变差的指示剂的肌醇在脑中的浓度(脑组织中的浓度，单位为：μmol/g)。

表15.使用GHRP-6对除去脑中淀粉样蛋白沉积的治疗效果

 

试验组刚果红染色呈阳性的沉积物的数量与β-淀粉样蛋白呈免疫阳性的沉积物的数量淀粉样蛋白瘢痕的大小脑中肌醇的浓度安慰剂组35.64±11.33**31.27±8.9**48.5±2.03**61.28±16.33**GHRP6剂量I组21.78±6.57*15.11±3.2715.51±6.4449.35±10*GHRP6剂量II组14.52±4.1813.58±4.6110.88±4.127.45±8.61

**p＝0.0001。*p＝0.0023。Mann-Whitney U检验。

在上述研究中，相应于参数的所有结果都显示于表15中，这些结果表征出了含有GHRP-6的药物组合物的长期治疗效果。注意，这些结果涉及根据一个脑的数字图像所进行的计算过程。为了克服这种局限性，由3个单独的人摸索地进行这种计算过程，并且所示出的结果相应于由5个滑动的观察点所得到的。表15示出了含有GHRP-6的药物组合物在控制β-淀粉样蛋白和脑生物化学中的作用。由表中可以看出，在使用含有GHRP-6的组合物治疗8个星期后，在所述组合物以其不同的形式来控制β-淀粉样蛋白的累积方面以及在医治所述器官的新陈代谢方面，产生了似乎是可信的积极的效果。由肌醇累积减少来表征的显著效果表明在同化作用能量较高的生物化学途径中以及在神经营养中都得到了改善。这些改善对于控制脑的老化进程具有有利的临床效果。

在下表16中，证实了含有GHRP-6的药物组合物对于控制患有阿尔茨海默氏病的转基因小鼠的脑中发生的脂质过氧化反应具有有利的效果。此外，这些证据表明这种药物组合物对于控制可导致在阿尔茨海默氏病以及老化中的神经组织的退化的过程之一具有有利的效果。

表16.脑组织中的氧化应激标志物

 

试验组SODt过氧化氢酶HPTMDA安慰剂-生理盐水组475.9±60.32**118.6±26.33**105.6±22.1**1.232±1.14**剂量I组611.17±44.79*81.6±15.2554.3±11.87*0.77±1.56*剂量II组863.22±50.360.18±13.6721.25±5.440.4±0.02

**p＝0.00014，安慰剂组与剂量I治疗组和剂量II治疗组。*p＝0.025，剂量I组与剂量II组。Mann-Whitney U检验。

实施例6.基于GHRP-6和其他肽的药物组合物在控制血管源性的痴呆方面的效果。脑皮层中嗜渗性物质的根除。预防和控制脑老化的进程。

实施本试验来评价不确定地含有GHRP-6、GHRP-2、海沙瑞林(hexarelin)或生长激素释放肽(ghrelin)中的一种肽的药物组合物在转基因小鼠的中枢神经功能衰退过程中的功效，其中在所述转基因小鼠的血管平滑肌细胞中一种突变形式的NOTCH3基因过表达。就上文所述的记忆力方面，这些小鼠在几个月的时间里发展成一种与CASADIL病相似的动脉病，并且这种动脉病是作为血管源痴呆的主要原因之一而发生的。在这些动物中，血管损伤还包括视网膜-脑、脑以及耳蜗的血管病变。脑及脑血管中存在的β-淀粉样蛋白物质、脑及脑膜动脉壁上沉积的嗜渗性颗粒物质、以及减小的管腔是具有组织病理学相关性的。在脑及其主要的神经干中出现了灰白区域、微梗塞区域以及出血病灶区域。

在小鼠明显出现所述疾病的症状时，使用18至20个月龄的雄鼠。将这些小鼠随机地分配到以下试验治疗组中：

A-使用生理盐水溶液的安慰剂组。

B-使用剂量为100μg/kg的GHRP-6的组。

C-使用剂量为100μg/kg的GHRP-2的组。

D-使用剂量为100μg/kg的生长激素释放肽的组。

E-使用剂量为100μg/kg的海沙瑞林的组。

在16个星期中，通过腹腔给药的方式每星期进行2次治疗。在治疗结束时，在不考虑大量经治疗的小鼠已经明显表现出临床改善效果的情况下，进行尸体解剖研究。收集包括脑膜组织在内的脑组织样品来用于生物化学和组织病理学测定。使小鼠服下过量的麻醉药剂，并用凉的生理盐水溶液进行心内灌注，从而洗去脑中存在的血液。取出脑，将一块脑在干冰中冷冻，另一块脑固定于4％的中性多聚甲醛中。将样品以10μm的厚度进行低温切割，并将所得的脑切片用苏木精-伊红或刚果红染色，或者用β-淀粉样蛋白的特异性抗体温育。通过显微成像获取技术，使用与显微镜相连的照相机来实施获取形态的过程，并将取得的图像用DIGIPAT软件进行分析。

所研究的标志物：

血管中β-淀粉样蛋白的纤维状沉积物的数量。

皮层下梗塞的数量。

皮层下出血的数量。

作为老化和脑新陈代谢变差的指示剂的肌醇在脑中的浓度(脑组织中的浓度，单位为：μmol/g)。

脑氧化应激标志物。

表17.脑组织中的形态鉴定结果

 

试验组对刚果红呈阳性的血管的数量对Nissl呈阳性的血管的数量皮层下梗塞的数量皮层下出血的数量安慰剂组35.64±11.33**31.27±8.9**48.5±2.03**41.28±16.33**GHRP-616.31±5.3314.22±8.1526.79±4.1919.05±5.14GHRP-218.26±4.5713.8±6.7630.13±5.7211.79±4.25生长激素释放肽17.67±2.2611.27±4.6126.9±4.2713.06±2.77海沙瑞林15.24±1.2411.36±6.427.11±3.5514.61±3.31

**p<0.0002，安慰剂组与使用所述药物组合物进行治疗的其他各组，其中所述药物组合物含有所述的本研究中的各种物质。

由表17可以看出，使用各种促分泌素肽进行治疗可以显著地减少纤维状淀粉样蛋白(对刚果红)呈阳性以及嗜渗性物质形成颗粒状沉积(通过Nissl染色)的动脉、细动脉和毛细血管的数量。因此，在使用所述的药物组合物进行治疗的各组小鼠中，所存在的白质脑病相关的皮层下梗塞以及出血病灶也将显著减少。

表18.脑中氧化应激的标志物

 

试验组SODt过氧化氢酶HPTMDA脑中的肌醇生理盐水组360.9±42.48**274.6±30.14**265.4±18.7**0.984±0.04**44.2±10.08**GHRP-612327.31±55.151.5±16.01101.7±22.090.23±0.0512.36±5.64GHRP-211065.49±46.2948.23±14.25117±13.550.302±0.0114.65±4.38生长激素释放肽12290.9±60.3244.67±11.58142.16±10.010.261±0.0314.04±3.85海沙瑞林10814.68±33.0851.19±7.8454.3±11.870.284±0.0111.88±2.71

**在使用生理盐水溶液的安慰剂组小鼠与使用含有各种肽的独特药物组合物的其他各组小鼠之间表现出了极显著性差异，p<0.01。

当对转基因小鼠(其作为人类CADASIL疾病的模型)的脑中所发生的脂质过氧化反应过程进行研究时，还会非常清楚地证明所述多种肽的作用。如在减少血管损伤和梗塞中所证实的那样，本发明所研究的促分泌素肽显示出了降低或减轻神经毒性的能力，所述这种神经毒性与人类疾病过程中产生的反应性氧类物质的增多有关，而这种反应性氧类物质增多的情况还可以在使用生理盐水溶液的小鼠中得到证实。通过使用所述的物质，其所产生的效果可以将通常的神经保护的概念扩展到这样的情况：脑的老化受到了血管损伤以及过度的脂质过氧化反应的调节。

实施例7.GHRP-6、GHRP-2、海沙瑞林和/或生长激素释放肽这些肽在根除皮肤中生理学物质的病理沉积中的作用

为了研究GHRP-6、GHRP-2、海沙瑞林和/或生长激素释放肽这些肽在根除皮肤中生理学物质的病理沉积中的作用，将人的瘢痕疙瘩碎片以异源器官移植的方式移植到无胸腺小鼠的背部区域。为了使异源移植物的移植和生存能力得到巩固，使其发育72小时，然后将小鼠(N＝6)随机分配到以下试验组中：

A-生理盐水(有效成分的载体)对照组。

B-使用GHRP-6的组。

C-使用GHRP-2的组。

D-使用生长激素释放肽的组。

E-使用海沙瑞林的组。

在7天内每24小时进行1次治疗。使所述物质由植入物的边缘处渗入，针对各种有效成分的局部生物利用度，使得所述物质的剂量为5微克至1毫克。在治疗一段时间以后，处死小鼠，并将植入物取出，从而评价对每种物质的药理学反应。将样品称重，并制成碎片以用于组织学研究和胶原蛋白的生物化学测定。将用于组织学研究的碎片固定在10％的中性福尔马林中，并将用于生物化学分析的那些碎片储存在-70℃下。

所研究的参数为：

a-所收集的移植物的湿重。

b-所述组织中羟脯氨酸的含量。

c-组织中对天狼星红染色和Masson特殊染色呈阳性的微小区域的数量。采用4x和10x的放大倍数来获取图像，并对每个放大倍数所得的数据取平均值。

d-对苯胺蓝染色呈阳性的微小区域中的肥大细胞的数量，采用20X的放大倍数。

如表19所示，当与使用对照载体的小鼠相比时，可以看出本研究中的所有的肽都展现出显著的抗纤维化作用。

表19.皮肤中的抗纤维化治疗作用

 

治疗组湿重(克)羟脯氨酸的含量(μg/g)对特异的胶原蛋白染色呈阳性的区域的数量含有肥大细胞的微小区域的数量(放大20x)生理盐水对照组13.55±2.31258.61±12.5337.2±22.4425.31±6.18GHRP-66.71±1.18a88.27±4.6111.45±5.989.54±2.15GHRP-27.14±1.02a84.17±7.7518.12±6.7511.17±3.33海沙瑞林6.25±1.73a88.59±6.5812.35±8.9410.18±2.98生长激素释放肽6.67±1.53a85.23±4.1111.27±4.6710.71±4.57

(a)在使用各种肽的组与使用对照生理盐水的组间表现出了极显著性差异，p<0.01。研究者进行的双尾t检验。

以上表明，在所建立的试验体系中，所有的肽在所检测的剂量下都展现出有效的抗纤维化作用，该作用可表征为过量的胶原蛋白物质和细胞外基质的急剧快速的减少，以及感受器细胞(肥大细胞)和效应器细胞(成纤维细胞和肌成纤维细胞)减少。值得注意的是，由于第三次渗透，使用了任何肽的移植物都显示出尺寸显著减小，并且变成灰色并失去效力。