通过扩增和检测核壳RNA序列分析SARS冠状病毒

摘要

本发明公开了来自SARS－CoV核酸的利于检测和/或定量核壳基因的引物和探针。所述公开的序列可用于多种扩增和非扩增形式，用于检测SARS CoV感染。

说明书

本申请要求2003年9月12日提交的美国临时申请系列号60/502,278的优先权，该临时申请完整地并入此处作为参考。

技术领域

本发明涉及通过扩增和检测核壳RNA序列分析严重急性呼吸道综合征冠状病毒的存在的方法。

背景技术

严重急性呼吸道综合征(SARS)是最近出现的与感染患者中的非典型肺炎有关的疾病。该疾病非常严重，并且没有已知的治疗方法。SARS的潜伏期一般为2至10天。Sympathkumar等，Mayo Clin.Proc.78：882-890(2003)。SARS的身体表现包括发烧，之后为无痰干咳及呼吸短促。在大约3％至10％的SARS病例中出现因呼吸衰竭导致的死亡。疾病控制和预防中心(CDC)，Morb.Mortal.Wkly.Report.52：357(2003)。

SARS的临床诊断常常是一个缓慢的过程，因为SARS疑似患者的初步诊断检查包括胸部X光片、脉搏血氧定量、血液培养、痰的革兰氏染色和培养、以及针对其它病毒性呼吸道感染的检查。CDC，Guidelines andRecommendations：Interim Guidelines for Labora tory Diagnosis ofSARS-CoV Infection，Jul.(2003)。这一困难也反映在如下事实上：两种最常用的诊断程序——检测SARS病毒的血清抗体和在细胞培养中从临床标本分离病毒——常常花费数日或甚至数周来完成。CDC，Guidelines and Recommendations：Interim Guidelines for LaboratoryDiagnosis of SARS-CoV Infection，Jul.(2003)。因此，重要的是，需要建立快速的非侵入性SARS检查法以监测和控制该疾病。

在2003年初，一种新的冠状病毒被鉴定为SARS的病原体。Drosten等，N.Engl.J.Med.348：1967-76(2003)。冠状病毒是一组多样的RNA病毒，其在人类和其它动物中引起呼吸道和肠道疾病。它们是最大的RNA病毒，具有大约30,000个核苷酸的基因组。Rota等，Science 300：1394-1399(2003)。SARS-冠状病毒(SARS-CoV)是一种有包膜的、正链RNA病毒。基于序列分析，SARS-CoV是新冠状病毒组中的一个成员(尼多病毒目(Nidovirale)，冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus))。Rota等，同上引文。

核壳(N)基因的位置接近SARS-CoV基因组的3’末端。编码N蛋白的亚基因组RNA在病毒感染后大量表达，为该疾病的检测提供了良好的靶基因。Rota等，同上引文。用于检查该病毒核酸存在的试验将允许快速灵敏地检测SARS-CoV。该试验将提供替代血清学检查、直接荧光抗体染色或尿抗原检查的更灵敏方法。

发明内容

一方面，本发明提供包含第一扩增引物和第二扩增引物的寡核苷酸组，其中第一扩增引物选自SEQ ID NO.：4和18，而第二扩增引物选自SEQ ID NO.：5和19。另一方面，第一扩增引物基本上由SEQ ID NO.：4组成，而第二扩增引物基本上由SEQ ID NO.：5组成。在本发明的再一方面，第一扩增引物基本上由SEQ ID NO.：18组成，第二扩增引物基本上由SEQ ID NO.：19组成。

另一方面，本发明提供包含第一扩增引物和第二扩增引物的寡核苷酸组，第一扩增引物选自SEQ ID NO.：4和18的靶结合序列，第二扩增引物选自SEQ ID NO.：5和19的靶结合序列。另一方面，第一扩增引物基本上由SEQ ID NO.：4的靶结合序列组成，第二扩增引物基本上由SEQID NO.：5的靶结合序列组成。在本发明的再一方面，第一扩增引物基本上由SEQ ID NO.：18的靶结合序列组成，第二扩增引物基本上由SEQID NO.：19的靶结合序列组成。

再一方面，该寡核苷酸组还包含信号引物和报道探针，其中信号引物选自SEQ ID NO.：6，8，20和21的靶结合序列，报道探针选自SEQ IDNO.：13和15。一方面，信号引物基本上由SEQ ID NO.：6的靶结合序列组成，报道探针基本上由SEQ ID NO.：13组成。另一方面，信号引物基本上由SEQ ID NO.：8的靶结合序列组成，报道探针基本上由SEQ IDNO.：15组成。再一方面，该寡核苷酸组还包含第二信号引物和第二报道探针，该第二信号引物基本上由SEQ ID NO.：25组成，该第二报道探针基本上由SEQ ID NO.：14组成。在再一实施方案中，具有第二信号引物和第二报道探针的该寡核苷酸组还包含一个或多个选自SEQ ID NO.：1，2，3和17的缓冲引物(bumper primer)。

在其它实施方案中，信号引物基本上由SEQ ID NO.：20的靶结合序列组成，报道探针基本上由SEQ ID NO.：13组成。在本发明的另一实施方案中，信号引物基本上由SEQ ID NO.：21的靶结合序列组成，报道探针基本上由SEQ ID NO.：15组成。再一方面，该寡核苷酸组还包含第二信号引物和第二报道探针，该第二信号引物基本上由SEQ ID NO.：7组成，该第二报道探针基本上由SEQ ID NO.：16的杂交序列组成。在再一方面，包含第二信号引物和第二报道探针的该寡核苷酸组还包含一个或多个选自SEQ ID NO.：1，2，3和17的缓冲引物。

再一方面，SEQ ID NO.：4，5，18和19的靶结合序列包含扩增反应所需的序列。本发明另一实施方案中，扩增反应所需的序列包含可以被限制性核酸内切酶切割的限制性核酸内切酶识别位点。在再一实施方案中，扩增反应所需的序列包含被RNA聚合酶识别的启动子。在另一实施方案中，SEQ ID NO.：6，8，13，15，20和21的杂交序列还包含可间接检测的标记物。另一方面，该可间接检测的标记物包含衔接序列。

另一实施方案中，本发明提供包含选自SEQ ID NO.：9，10，22和23的SARS-CoV靶序列的寡核苷酸。

另一实施方案中，本发明提供检测样品中SARS-CoV存在与否的方法，该方法包括：(a)在核酸扩增反应中用多个核酸引物处理样品，其中第一引物选自SEQ ID NO.：4和SEQ ID NO.：18的靶结合序列，第二引物选自SEQ ID NO.：5和SEQ ID NO.：19的靶结合序列；和(b)检测任何扩增的核酸产物，其中检测到该扩增产物指示存在SARS CoV。另一实施方案中，第一引物基本上由SEQ ID NO.：4组成，第二引物基本上由SEQ ID NO.：5组成。另一实施方案中，第一引物基本上由SEQ ID NO.：18组成，第二引物基本上由SEQ ID NO.：19组成。再一实施方案中，步骤(a)包括链置换扩增(SDA)反应。在另一实施方案中，SDA反应利用一个或多个选自SEQ ID NO.：1，2，3和17的缓冲引物。在另一实施方案中，SDA反应包括耐热链置换扩增(tSDA)反应。在另一实施方案中，tSDA反应是一种均相荧光(homogeneous fluorescent)实时tSDA反应。在再一实施方案中，步骤(b)包括所述扩增的核酸产物与选自SEQ ID NO.：6，8，20和21的信号引物杂交的步骤。

根据再一方面，本发明提供扩增SARS-CoV的靶核酸序列的方法，包括：(a)使该核酸与(i)选自SEQ ID NO.：4和18的靶结合序列的第一扩增引物；和(ii)选自SEQ ID NO.：5和19的靶结合序列的第二扩增引物杂交；和(b)在靶核酸序列上延伸杂交的第一和第二扩增引物，由此扩增该靶核酸序列。根据该方法的再一方面，第一扩增引物基本上由SEQID NO.：4的靶结合序列组成，第二扩增引物基本上由SEQ ID NO.：5的靶结合序列组成。根据该方法的再一方面，第一扩增引物基本上由SEQID NO.：18的靶结合序列组成，第二扩增引物基本上由SEQ ID NO.：19的靶结合序列组成。

在该方法的另一方面，SEQ ID NO.：4和SEQ ID NO.：5的靶结合序列包含扩增反应所需的序列。在另一实施方案中，扩增反应所需的序列包含可以被限制性核酸内切酶切割的限制性核酸内切酶识别位点。在另一实施方案中，扩增反应所需的序列包含RNA聚合酶所识别的启动子。

在本发明的另一方面，SEQ ID NO.：18和SEQ ID NO.：19的靶结合序列包含扩增反应所需的序列。在再一方面，扩增反应所需的序列包含可以被限制性核酸内切酶切割的限制性核酸内切酶识别位点。在再一实施方案中，扩增反应所需的序列包含RNA聚合酶所识别的启动子。

在再一方面，该方法还包括通过与信号引物杂交，间接地检测扩增的靶核酸。在另一方面，信号引物选自SEQ ID NO.：6，8，20和21。

根据再一方面，靶核酸序列选自SEQ ID NO.：9，10，22和23。

根据再一方面，本发明提供定量靶样品中SARS-CoV核酸的量的方法，包括步骤：a)将靶样品与已知浓度的SARS-CoV内对照核酸混合；b)在扩增反应中扩增靶核酸和内对照核酸；c)检测扩增的核酸；和d)分析扩增的SARS-CoV靶核酸和内对照核酸的相对量。在另一实施方案中，步骤(b)包括链置换扩增反应。在再一实施方案中，SDA反应包括tSDA反应。在再一方面，所述扩增反应利用一个或多个选自SEQ ID NO.：6，7，8，20，21和25的杂交序列的信号引物和一个或多个选自SEQ ID NO.：13，14，15和16的杂交序列的报道探针。在再一方面，SEQ ID NO.：6，7，8，13，14，15，16，20，21和25的杂交序列包括可间接检测的标记物。在另一实施方案中，该可间接检测的标记物包含衔接序列。

实施本发明的具体方式

本发明方法可通过扩增和检测SARS-CoV核壳(N)序列用于分析SARS-CoV的存在。本发明的引物和探针以SARS-CoV核壳基因的部分为基础。本发明还提供可以用于扩增、检测和/或定量N基因的寡核苷酸。该寡核苷酸可以用于所有类型的扩增反应，例如，链置换扩增(SDA)、聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)和QB复制酶介导的扩增。本发明还提供可以足够的特异性和灵敏度用于扩增、检测和/或定量N基因的寡核苷酸。

本发明方法可用于，例如但不限于，检查从SARS疑似患者获得的临床标本。该标本或测试样品可以从怀疑含有SARS核酸的任何来源收集。对于动物，优选哺乳动物，更优选人类，该测试样品的来源可以包括血液、骨髓、淋巴、硬组织(例如，肝、脾、肾、肺、卵巢等)、痰、粪便、尿、上和下呼吸道标本和其它临床样品。其它来源可以包括兽医和环境样品，以及体外培养物。本领域技术人员能够确定可以在SARS-CoV感染诊断中使用的适当临床来源。

定义

为了清楚的目的，提供以下定义，这些定义不应当被认为是限制性的。除非另行指出，本文所用技术和科学术语旨在具有本发明所属领域技术人员通常理解的意义。

“扩增引物”是用于扩增靶序列的寡核苷酸，其中该靶序列通过该寡核苷酸与靶序列杂交后寡核苷酸的延伸得以扩增或通过与靶序列杂交后相邻的多个寡核苷酸的连接得以扩增。扩增引物的至少一部分与靶杂交。该部分称作靶结合序列，其确定引物的靶特异性。除了靶结合序列外，某些扩增方法还需要在扩增引物中存在专门的非靶结合序列。这些专门序列是扩增方法进行所必需的，并且典型地起着将该专门序列添加至靶上的作用。例如，但不限于，SDA中使用的扩增引物包括位于靶结合序列5’的限制性核酸内切酶识别位点，参见美国专利5,455,166和5,270,184，这两份专利并入此处作为参考。NASBA、自动维持序列扩增(3SR)和基于转录的扩增的引物需要与引物的靶结合序列连接的RNA聚合酶启动子。将此专门序列与靶结合序列连接以便在选定的扩增反应中使用，是本领域常规的。相反，在靶的末端不需要专门序列的扩增方法，例如PCR，一般使用仅由靶结合序列组成的扩增引物。

在本文中，术语“引物”和“探针”指寡核苷酸的功能。引物典型地在与靶杂交后通过聚合酶或连接来延伸，而探针可以通过与靶杂交或通过杂交后基于聚合酶的延伸来发挥作用。杂交的寡核苷酸如果用于捕获或检测靶序列则可以作为探针起作用，而如果该寡核苷酸用作扩增引物中的靶结合序列，则其可以作为引物起作用。因此，可以理解，本文公开的用于扩增、检测或定量SARS-CoV的任何靶结合序列都可以用作杂交探针或用作引物中的靶结合序列以进行检测或扩增，并任选地与专门序列连接。

“缓冲引物”或“外引物”是与扩增引物上游(即，5’端)的靶序列退火的引物，这样该外引物的延伸将置换下游引物和其延伸产物，即，置换包含SDA限制性核酸内切酶识别位点的靶序列拷贝。因此，缓冲引物仅仅由靶结合序列组成，并且设计为可以在扩增引物上游退火并在延伸时置换扩增引物。G.Walker等在Nuc.Acids Res.20：1692-1696中将外引物命名为B₁和B₂。外引物的延伸是置换扩增引物的延伸产物的一种方法，但是在某些情况中加热也可能是适宜的。

“逆转录引物”也仅由靶结合序列组成。其在RNA靶序列的3’端杂交以引发靶的逆转录。逆转录引物的延伸产生包含RNA靶和通过逆转录产生的该RNA靶的cDNA拷贝的异源双链体。使cDNA与RNA链分离(例如，通过加热、RNA酶H或链置换)成为单链并可用于扩增。任选地，可以在该cDNA的靶序列3’端杂交第二逆转录引物，以便在扩增前引发第二链的合成。任选地，逆转录引物也可以作为扩增引物或缓冲引物起作用。

术语“靶”和“靶序列”指待扩增、复制或检测的核酸序列(DNA和/或RNA)。这些序列包括待扩增的原始核酸序列和其互补第二链，以及通过扩增或复制该靶序列产生的该原始靶序列的拷贝的任一链。“扩增产物”、“延伸产物”或“扩增子”是包含在扩增或复制靶序列期间产生的该靶序列的拷贝的寡核苷酸或多核苷酸。

术语“聚合酶”指各种在已有核酸模板上催化核酸合成的酶，例如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶。DNA聚合酶从脱氧核糖核苷酸装配DNA，而RNA聚合酶自核糖核苷酸装配RNA。

基于25个SARS-CoV核苷酸序列的比对(alignment)，选择两个区域作为靶序列用于核壳区域的扩增，参见表1和表3所示。

在本发明的一个实施方案中，已经适应性地修改了逆转录酶-链置换扩增(RT-SDA)用于检测基因组和亚基因组RNA序列中的SARS-CoV核壳RNA。SDA是等温的(恒定温度)核酸扩增方法。在SDA中，单链延伸产物的置换、引物与延伸产物(或原始靶序列)的退火和引物的随后延伸同时在该反应混合中发生。常规的SDA(在较低温度，通常大约35-45℃进行)描述于G.Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392-396(1992)和Walker等，Nuc.Acids Res.，同上。通过SDA检测核酸的详细描述参见美国专利5,455,166；5,523,204；和5,916,779，这些专利完整并入此处作为参考。这些专利提供了通过核酸内切酶介导的链置换扩增样品中靶核酸序列(和其互补链)的方法。此外，美国专利5,916,779还适应性地修改了SDA以逆转录扩增RNA靶。

根据本发明，从测试样品提取SARS-CoV靶核壳RNA。可以通过本领域技术人员已知的任何方法分离该SARS-CoV核壳RNA。然后在例如RT-SDA方法中扩增该核壳RNA。RT-SDA可以以一步法或两步法的方式实施。一步法同时产生和扩增SARS-CoV靶序列的cDNA拷贝。

在一个实施方案中，一步RT-SDA法利用设计以允许并入限制性核酸内切酶位点和置换单链cDNA的第一扩增引物和缓冲引物。得到的cDNA随后通过第二扩增引物和任选地一个或多个缓冲引物的退火进行扩增。在另一实施方案中，一步RT-SDA法利用第一反向引物和任选地一个或多个缓冲引物。DNA依赖性DNA聚合酶或逆转录酶允许cDNA扩增产物的延伸。在此一步法的另一实施方案中，逆转录酶用于延伸一个或多个反向引物以及从RNA模板合成cDNA。本领域技术人员将意识到可以在本发明方法中使用的某些常规逆转录酶(即，AMV，MMLV，Superscript II^TM)。

作为一个举例说明性例子，前面描述的一步RT-SDA反应使用SDA扩增引物和缓冲引物。然而，如美国专利5,916,779中所述，逆转录酶能够利用SDA引物或逆转录引物进行链置换。因此，也可以存在逆转录引物，通过逆转录酶用于该反应的逆转录部分。下游逆转录引物作为逆转录引物起作用。上游逆转录引物类似于SDA缓冲引物，因为其延伸可以置换下游逆转录引物的延伸产物(cDNA)。

备选地，RT-SDA可以是两步扩增法，其中在分开的步骤中进行逆转录及之后的SDA。因此，在该反应的第一逆转录步骤中存在逆转录引物。然后将cDNA与RNA模板分开，之后进行第二扩增步骤。加热反应以分开DNA：RNA杂合体，或者通过化学或酶方法分开这两条链。例如，但不限于，可以使用RNA酶H或RNA酶H活性降解RNA链，由此产生单链DNA。此外，可以通过利用缺乏5’→3’活性并能从一条链置换另一链的聚合酶，实现杂合体的分离。SDA引物在反应的第二步中加入，进行SDA扩增以提供可检测的扩增产物。

在此两步法的一个实施方案中，反向引物是SDA引物，RNA酶H活性是逆转录酶的内源活性。此外，反向引物可以是缓冲引物或随机产生的DNA序列。在本发明的再一实施方案中，两步RT-SDA法使用SDA引物和一个或多个缓冲引物用于逆转录反应。正向引物和扩增及检测所需的其它反应成分，例如SDA酶、脱氧核糖核苷酸、信号引物、探针和缓冲液成分，与RT反应产物混合。

近来研发了耐热型SDA反应(tSDA)，该型反应在较高，但仍恒定的温度下使用热稳定聚合酶和限制性核酸内切酶来实施，参见并入此处作为参考的美国专利5,648,211和5,744,311。该反应基本上如常规SDA一样进行，但替代使用热稳定聚合酶和热稳定限制性核酶内切酶。反应温度调整至适于所选耐热酶的较高温度(典型地，大约45℃至60℃)，并用所选热稳定核酸内切酶的适当限制性核酸内切酶识别/切割位点置换常规的限制性核酸内切酶识别/切割位点。此外，与常规SDA不同，实施者还可以在初次的热变性步骤前将酶包括在反应混合物中，只要这些酶在该温度充分稳定即可。

为了以和原位PCR相当的灵敏度和特异性在悬浮液中、载玻片上或组织中于细胞中原位扩增核酸靶序列，已经对SDA进行了适应性的修改。该方法详细描述于美国专利5,523,204中，该专利并入此处作为参考。由于SDA反应在恒定的较低温度下进行，故SDA比PCR对细胞和组织更为温和。此外，还可以保持优良的标本形态。通过SDA实施的原位扩增与免疫化学技术相容，因此，可以在相同的标本上进行靶序列的扩增和免疫学染色。

可以将基于RNA的内对照并入反应混合物中，与本发明的SARS-CoV靶序列一起扩增。可以设计内对照以验证阴性结果和鉴定潜在的抑制性样品。也可以使用该对照在竞争性试验中实现定量目的，参见Nadeau等，Anal.Biochem.276：177-187(1999)。此外，可以将干的逆转录酶与此处所述SDA法联用。干酶可以提供优于液体酶使用时的改良工作流程(workflow)以及延长的保存期。

表1和表3列出的SDA引物、缓冲引物和信号引物被设计用于根据本发明方法的RT-SDA反应中。加下划线的为结合序列。对于SDA引物，该序列的剩余5’部分包含SDA反应进行所需的限制性核酸内切酶识别位点(RERS)和通用非靶特异性尾序列；而对于信号引物，5’尾包含通用非靶特异性序列，该序列与相应报道探针的相同。易于明了的是，SDA引物也可以作为扩增引物用于替代扩增试验中。同样明了的是，靶结合序列也可以单独使用，在不需要专门序列或结构的反应(例如PCR)中扩增靶；以及可以用非RT-SDA的其它扩增反应所需的不同专门序列替代以下所示的含有RERS的序列(例如，RNA聚合酶启动子)。当寡核苷酸用于扩增反应中时SDA引物名中“F”和“R”分别指“正向”和“反向”引物。

表1：用于SARS-CoV试验区域C的引物、探针和序列

引物靶杂交区域以下划线标出。

BsoBI位点以斜体和阴影标出。

相对于天然SARS-CoV共有序列，扩增内对照中的突变以小写字母表示。

^*可以用于引发逆转录的寡核苷酸。

表2：用于SARS-CoV试验C和D的报道探针

与信号引物的互补序列杂交的区域以下划线表示(见美国专利6,316,200；6,743,582；6,656,680)

斜体为BsoBI位点。

ROX：罗丹明。

FAM：荧光素。

表3：用于SARS-CoV试验区域D的引物、探针和序列

引物靶杂交区域以下划线表示。

BsoBI位点以斜体表示。

^*可以用于引发逆转录的寡核苷酸。

在靶扩增后，根据本发明方法产生的核酸可以利用本领域已知的任何用于检测特异核酸序列的方法进行检测。例如，但不限于，可以使用各种用于SDA的检测方法。在美国专利6,316,200中讨论了用于标记SDA产物的几种方法，该专利完整地并入此处作为参考。例如，但不限于，可以通过与寡核苷酸检测探针的特异杂交，检测扩增产物。检测探针是包括可检测标记物(即，产生可检测信号或能够经过处理以产生可检测信号的部分)的短寡核苷酸。可以通过切口平移、末端标记或在探针的化学合成期间将标记物掺入该寡核苷酸探针。本领域已知许多可直接和间接检测的标记物可用于寡核苷酸探针。可直接检测的标记物包括那些无需进一步反应来变得可检测的标记物，例如，放射性同位素、荧光部分和染料。可间接检测的标记物包括那些必须与其它试剂反应以变得可检测的标记物，例如，能够产生有色反应产物的酶(例如，碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶)、生物素、亲和素、地高辛配基(dig)、抗原、半抗原或荧光色素。来自酶标记物的信号一般通过酶与其底物及任何为了产生有色酶反应产物所需的其它试剂反应来生成。生物素(或亲和素)标记物可以通过与标记的亲和素(或标记的生物素)或标记的抗生物素(或标记的抗亲和素)抗体结合来检测。地高辛配基和半抗原标记物通常通过与标记的抗地高辛配基(抗-dig)或抗半抗原抗体特异性结合而检测。一般地，选择检测探针使其与扩增子中位于两个扩增引物的结合位点之间的核苷酸序列杂交。检测探针也可以与扩增引物之任一具有相同的核苷酸序列。通过与检测探针杂交进行体外和原位检测的方法是本领域已知的。

或者，可以通过检测引物的延伸来检测本发明的扩增产物，参见Walker等，Nuc.Acids Res.，同上。在检测引物延伸方法中，包含可检测标记物的寡核苷酸引物与扩增产物杂交并通过添加聚合酶而得以延伸。为了检测，可以在5’末端标记引物，例如，使用³²P或荧光标记。或者，可以在杂交引物延伸时掺入包含可直接或间接检测的标记物的dNTP类似物。例如，但不限于，引物延伸时可以掺入dig-衍生化的dNTP，然后在延伸后通过与AP抗-dig和适宜的AP底物反应来实施检测。此待延伸的引物可以与扩增引物相同或者其可以是能够与扩增子中位于扩增引物的结合位点之间的核苷酸序列杂交的不同引物。

可检测的标记物也可以在靶序列扩增过程中直接地掺入扩增子内。

在本发明的另一实施方案中，通过美国专利6,316,200所述方法检测RT-SDA产物，所述方法利用包含5’衔接序列的未标记的信号引物。报道探针的3’端与该信号引物的5’端的互补序列杂交，产生5’突出端。聚合酶补平此突出端，然后直接或间接地检测该报道探针尾的互补序列的合成，以指示靶的存在。此方法利用荧光能量转移(FET)而不是荧光强度的直接检测来检测杂交。FET允许实时检测SDA产物。

表1至表3中的信号引物和报道探针被设计为利用逆转录酶产物实时检测扩增产物。这些引物和探针的结构和用途描述在例如，但不限于，美国专利5,547,861；5,928,869；6,316,200；6,656,680；和6,743,582中，所有这些专利均并入此处作为参考。表1至表3中的杂交序列以下划线表示。报道探针序列的剩余部分形成典型地被标记以利于按照本领域已知的方式检测扩增产物的结构。正如从美国专利5,935,791；5,846,726；5,691,145；5,550,025；和5,593,867中所知，容易明了的是，靶序列也可以单独用于直接杂交(典型地与可检测标记物连接)，以及可以使用其它的直接和间接标记物替代发夹结构(hairpin)，上述专利的内容均并入此处作为参考。

由于靶结合序列赋予引物或探针的靶特异性，故应当理解，以上示例的用作特定反应中的特定成分的靶结合序列也可以以多种其它方式使用以检测SARS-CoV核壳核酸。例如，但不限于，本发明的靶结合序列可以用作杂交探针，在不经扩增的情况下或作为扩增后的分析试验，直接地检测SARS-CoV。此类杂交方法是本领域熟知的，典型地使用与靶结合序列缔合或连接的可检测标记物以利于检测杂交。此外，上述靶结合序列基本上所有都可以用作无需其它专门序列的扩增反应(例如PCR)中的扩增引物或者添加至专门用于3SR、NASBA、基于转录的或任何其它的引物延伸扩增反应的适当序列上。为扩增产物的检测，可以按本领域已知的方式标记包含本文所述靶结合序列的扩增引物。或者，可以按照美国专利5,547,861；5,928,869；5,593,867；5,550,025；5,935,791；5,888,739；和5,846,726(所有这些专利并入此处作为参考)所述，将包含所公开的靶结合序列的标记的检测引物与扩增引物联用，以实时均相检测扩增。此类检测引物可以包含可直接或间接检测的序列，该序列最初不与靶杂交，但一旦其与靶杂交并被延伸后则利于对检测引物的检测。例如，该可检测序列可以是形成二级结构的序列、含有限制性位点的序列、或可以通过标记的寡核苷酸(有时称作报道探针)与其互补序列的杂交按照本领域已知的方式被检测的线性序列。或者，可以在扩增后，通过与选自本文所公开的任何靶结合序列并位于所选扩增引物对之间的探针杂交，检测扩增产物。

应当理解，由靶结合序列和任选地所选扩增反应所需的序列或所选检测反应所需的序列组成的本发明寡核苷酸也可以包括充当间隔区、接头、用于标记或结合酶的序列等的某些其它序列。一般已知这些其它序列是在所选反应中为了获得该寡核苷酸的最佳功能而必需的，并且这些其它序列旨在通过术语“由......组成”来包括在内。

本发明也涉及在不同严紧杂交条件(即，用于选择性杂交)下与本文所述核苷酸序列杂交的核酸分子。“严紧条件”指确定第一核酸与第二核酸杂交的温育和洗涤条件(例如，温度、缓冲液浓度)。第一和第二核酸可以完全地(100％)互补，或者可以较不完全互补(即，70％、50％等)。例如，可以使用某些高严紧条件区分完全互补的核酸和那些较小程度互补的核酸。用于核酸杂交的“高严紧条件”、“中等严紧条件”和“低严紧条件”在Current Protocols in Molecular Biology中2.10.1-2.10.16页及6.3.1-6.3.6页(Ausubel，F.M.等，John Wiley &Sons(1998)，其完整地并入作为参考)上进行了解释。

本发明另一方面涉及引入了本发明载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本发明核酸分子可以在细菌细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中表达。此类适宜的宿主细胞是本领域技术人员已知的。

本发明还涉及包含装有用于本发明中的一种或多种成分的一个或多个容器的包装(pack)或试剂盒。任选地，这些容器可以伴随具有管理药品或生物产品生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的通知，该通知注明获得了有关生产、使用或销售的行政机关的批准。包装或试剂盒可以是组合物的单次使用形式，或者其可以是多次使用形式。尤其是，试剂可以分开、以任何组合方式混合在一起、或存在于单个瓶中。

提供以下预示性实施例举例说明本发明的某些实施方案，但是这些实施例不旨在限制本发明。

SARS系统D实施例：检测SARS-CoV RNA的RT-SDA

以下实施例举例说明本文公开的引物和报道探针在检测临床标本中的SARS-CoV RNA中的用途。

临床标本例如粪便样品、咽喉拭子和鼻咽吸出物使用QIAGEN QIAampViral RNA Mini试剂盒根据厂商说明书并加上柱上DNA酶处理除去污染DNA，以实施加工。对于粪便标本，包括另一加工前步骤以在上样QIAGEN柱前除去颗粒物。用0.89％盐水1:10稀释粪便，4,000×g离心20分钟。然后倾析上清液，并通过0.22μm滤器以除去颗粒碎屑。

通过QIAamp柱加工140微升样品或粪便过滤物，用DNA酶处理柱子以消化和柱基质结合的污染性非特异DNA。洗涤除去DNA酶后，将纯化的RNA洗脱在体积80μl的水中。将30μl洗脱物加至含有干引物、报道探针和核苷酸的引发(Priming)微量孔中，之后加入20μl含有RNA酶抑制剂、AMV-RT酶和基于RNA的IAC序列的RNA转录物的逆转录缓冲液。最终的逆转录反应条件如下：1500μM dC_sTP；dATP、dGTP和dTTP各300μM；5mM乙酸镁；1500nM缓冲引物SarDB22(SEQ ID NO.：17)；1500nMSDA引物SarDRP(SEQ ID NO.：19)；300nM SDA引物SarDFP(SEQ ID NO.：18)；750nM信号引物SarDAd-MPC(SEQ ID NO.：21)；600nM IAC信号引物；1200nM报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：15)；900nM报道探针MPC2 F/D(SEQ ID NO.：16)；大约1000个拷贝IAC转录物；5％DMSO；5％甘油；43.5mM K_iPO₄；25mM KOH；120mM N-二[羟乙基]甘氨酸；40U RNA酶抑制剂；10U AMV-RT。然后在48℃温育再水化的(rehydrated)微量孔20分钟，之后加入100μl SDA缓冲液并转移至72℃加热块上。同时，含有干SDA酶(Bst聚合酶和BsoBI限制性酶)的扩增微量孔在54℃预热。温育10分钟后，将100μl样品从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并在BD ProbeTec ET读数器中52.5℃温育。最终的SDA反应条件如下：500μM dCsTP；dATP、dGTP和dTTP各100μM；5.7mM乙酸镁；500nM缓冲引物SarDB22(SEQ ID NO.：17)；500nM SDA引物SarDRP(SEQID NO.：19)；100nM SDA引物SarDFP(SEQ ID NO.：18)；250nM信号引物SarDAd-MPC(SEQ ID NO.：21)；200nM IAC信号引物；400nM靶报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：15)；300nM IAC报道探针MPC2 F/D(SEQID NO.：16)；12.5％DMSO；1.67％甘油；24.5mM K_iPO₄；82mM KOH；143mMN-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；45U BsoBI限制性酶。

在1小时温育过程中，在BD ProbeTec ET仪的两个光通道中每分钟读取荧光读数，结果以SARS-CoV靶和IAC的PAT得分报告。荧光读数从未达到过预定荧光阈值的反应被定为PAT得分0。对应于MPC D/R报道探针(SEQ ID NO.：15)，产生ROX PAT得分>0的反应被认为是SARS-CoV阳性；而对应于IAC报道探针MPC2 F/D(SEQ ID NO.：16)，产生FAM PAT得分>0的反应被认为是IAC阳性。FAM和ROX信号均未达到其各自阈值(PAT得分＝0)的那些反应被认为是不确定的。阳性和阴性外对照被包括在每一轮试验中以检验反应性能。

为了通过仪器报告来自患者标本的结果，需要这些对照分别产生阳性和阴性正确结果。

预期结果和结论

来自感染患者、含有足够高于试验检测限的量SARS-CoV的标本将产生阳性结果(即，ROX PAT得分>0)。来自未感染患者或来自临床负荷低于该试验的分析灵敏度的患者的标本将产生阴性结果(即，ROX PAT得分＝0)。IAC的扩增失败(即，FAM PAT得分＝0)将说明试剂污染了RNA酶或程序错误。表4总结了可能的结果。

表4：对BD ProbeTec ET SARS-CoV试验的可能结果的总结

提供以下实验实施例举例说明本发明的某些实施方案，但是这些实施例不旨在限制本发明。

SARS试验系统C实施例

实施例1：使用SARS-CoV特异性引物扩增DNA

使用靶区域(相应于SARS-CoV株BJ03的28494-28619位核苷酸；GenBank登录号AY278490)的基于pUC19的质粒克隆，证明所公开的引物和探针组合扩增SARS-CoV核酸的能力。用限制性酶NarI使质粒DNA线性化，并使用 dsDNA定量试剂(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)定量。扩增前，将定量的质粒储液在10ng/μL鲑精DNA中稀释至工作浓度25拷贝/μL。在6个靶水平之每一个下一式四份运行SDA反应，此外，运行含有水代替靶DNA的对照反应。

简言之，将DNA靶加入SDA缓冲液，在沸水浴中加热5分钟变性。然后将150微升变性样品加入含有干SDA引物、报道探针和核苷酸的引发微量孔。室温20分钟后，将引发微量孔转移至72℃加热块，同时含有干Bst聚合酶和BsoBI限制性酶的相应扩增微量孔在54℃预热。10分钟温育后，将100μl引发混合物从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并放置在52.5℃于BD ProbeTec ET读数器中。监测荧光信号1小时，并使用开发用于该仪器的Passes After Threshold(PAT)算法分析。Wolfe DM，Wang SS，Thornton K，Kuhn AM，Nadeau JG，Hellyer TJ，均相链置换扩增，《DNA amplification-current technologies andapplications》，Demidov VV和Broude NE(编)，Horizon Bioscience，Wymondham，UK。PAT分数表示荧光读数达到预定阈值后剩余的仪器通过次数。最终的SDA反应条件如下：50nM基于pUC19的缓冲引物CD(SEQID NO.：24)；500nM SDA引物SarCRP(SEQ ID NO.：5)；100nM SDA引物SarCFP(SEQ ID NO.：4)；250nM信号引物SarCAd-MPC(SEQ ID NO.：8)；300nM报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：15)；500μM脱氧胞苷5’-O-(1-硫代三磷酸)，S-异构体(dC_sTP)；dATP，dGTP和dTTP各100μM；12.5％ DMSO；24.5mM K_iPO₄；82mM KOH；143mM N-二[羟乙基]甘氨酸；12UBst聚合酶；30U BsoBI限制性酶；5mM乙酸镁。

结果和结论

使用少至每反应6拷贝靶质粒获得了阳性结果，而在任何阴性对照中均未观察到假阳性结果(表5)。这些数据说明，所公开的引物和报道探针组合能够以高度分析灵敏度检测SARS-CoV特异性核酸靶序列。

表5：SARS-CoV特异性靶序列的扩增和检测

PAT得分：>0＝阳性；0＝阴性。

实施例2：分析的特异性

A部分：

所公开的引物和探针的分析特异性通过检查一组51种可能存在于呼吸道和/或胃肠道标本中的细菌和真菌进行验证(表5)。由于所有这些生物都具有由DNA而非RNA组成的基因组，故在这些反应中不包括逆转录步骤。在含有牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐水(PBS/BSA)中以大约10⁷-10⁸个细胞/ml的浓度制备各生物的悬浮液。各15μl悬浮液与150μl SDA缓冲液混合，在沸水浴中加热5分钟。冷却至室温后，将150μl变性的样品加入含有干SDA引物、报道探针和核苷酸的引发微量孔中。在室温温育引发微量孔20分钟，然后转移至72℃加热块，同时在54℃预热相应的扩增微量孔。10分钟温育后，将100μl引发混合物从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并放入设定在52.5℃的BDProbeTec ET读数器中。监测荧光1小时，并使用开发用于该仪器的PAT算法分析。最终的SDA反应条件如下：50nM pUC19缓冲引物CD(SEQ IDNO.：24)；500nM SDA引物SarCRP(SEQ ID NO.：5)；100nM SDA引物Sa rCFP(SEQ ID NO.：4)；250nM信号引物SarCAd-MPC(SEQ ID NO.：8)；300nM报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：15)；500μM dC_sTP；dATP，dGTP和dTTP各100μM；12.5％ DMSO；24.5mM K_iPO₄；82mM KOH；143mM N-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；30U BsoBI限制性酶；5mM乙酸镁。

结果和结论

除了作为阳性对照运行的SARS-CoV靶序列的质粒克隆，未获得阳性结果，由此证明所公开的引物和报道探针检测SARS-CoV的特异性。结果显示在表6中。

表6：用BD ProbeTec ET SARS-CoV试验测试的一组细菌和真菌

物种                                      菌株           PAT得分   结果

醋酸钙不动杆菌                            BD 13339       0         阴性

(Acinetobacter calcoaceticus)

以色列放线菌                              ATCC 10049     0         阴性

(Actinomyces israelii)

嗜水气单胞菌                              ATCC 7966      0         阴性

(Aeromonas hydrophila)

粪产碱杆菌                                ATCC 8750      0         阴性

(Alcaligenes faecalis)

脆弱类杆菌                                ATCC 25285     0         阴性

(Bacteroides fragilis)

皮炎芽生菌                                ATCC 4292      0         阴性

(Blastomyces dermatitidis)

百日咳博德特氏杆菌                        ATCC 9797      0         阴性

(Bordetella pertussis)

粘膜炎布兰汉氏球菌                        ATCC 25238     0         阴性

(Branhamella catarrhalis)

白色假丝酵母                              ATCC 44808     0         阴性

(Candida albicans)

肺炎衣原体                                AR-39          0         阴性

(Chlamydophila pneumoniae)

弗劳地氏柠檬杆菌                          ATCC 8090      0         阴性

(Citrobacter freundii)

产气荚膜梭状芽孢杆菌                      ATCC 13124     0         阴性

(Clostridium perfringens)

白喉棒状杆菌                              ATCC 11913     0         阴性

(Corynebacterium diphtheriae)

杰氏棒杆菌                                ATCC 43734     0         阴性

(Corynebacterium jeikeium)

新型隐球酵母                              ATCC 36556     0         阴性

(Cryptococcus neoformans)

迟钝爱德华氏菌                            ATCC 15469     0         阴性

(Edwardsiella tarda)

啮蚀艾肯氏菌                              ATCC 23834     0         阴性

(Eikenella corrodens)

产气肠杆菌                                ATCC 13048     0         阴性

(Enterobacter aerogenes)

粪肠球菌                                  ATCC 29212     0         阴性

(Enterococcus faecalis)

大肠杆菌                                  ATCC 11775     0         阴性

(Escherichia coli)

核粒梭杆菌                                ATCC 25586     0         阴性

(Fusobacterium nucleatum)

流感嗜血杆菌                              ATCC 33533     0         阴性

(Haemophilus influenzae)

副流感嗜血杆菌                            ATCC 7901      0         阴性

(Haemophilus parainfluenzae)

荚膜组织胞浆菌                            ATCC 12700     0         阴性

(Histoplasma capsulatum)

金氏金氏菌                                ATCC 23330     0         阴性

(Kingella kingae)

肺炎克雷白氏杆菌肺炎亚种(Klebsiella     ATCC 13883     0         阴性

pneumoniae subsp.pneumoniae)

嗜酸乳芽孢杆菌                            ATCC 4356      0         阴性

(Lactobacil lus acidophilus)

侵肺军团杆菌                              ATCC 33152     0         阴性

(Legionella pneumophila)

奥斯陆莫拉氏菌                            ATCC 19976     0         阴性

(Moraxella osloensis)

摩氏摩根氏菌                              ATCC 25830     0         阴性

(Morganella morganii)

结核分枝杆菌                              ATCC 27294     0         阴性

(Mycobacterium tuberculosis)

肺炎枝原体                                ATCC 29342     0         阴性

(Mycoplasma pneumoniae)

脑膜炎奈瑟氏球菌                          ATCC 13077     0         阴性

(Neisseria meningitides)

粘液奈瑟氏球菌                            ATCC 19696     0         阴性

(Neisseria mucosa)

厌氧消化链球菌                            ATCC 27337     0         阴性

(Peptostreptococcus anaerobius)

类志贺邻单胞菌                            ATCC 14029     0         阴性

(Plesiomonas shigelloides)

不解糖卟啉单胞菌                          ATCC 25260     0         阴性

(Porphyromonas asaccharolytica)

奇异变形菌                                ATCC 29906     0         阴性

(Proteus mirabilis)

司徒氏普罗威登斯菌                        ATCC 35031     0         阴性

(Providencia stuartii)

铜绿假单胞菌                              ATCC 27853     0         阴性

(Pseudomonas aeruginosa)

粘质沙雷氏菌                              ATCC 8100      0         阴性

(Serratia marcescens)

金黄色葡萄球菌                            ATCC1 2598     0         阴性

(Staphylococcus aureus)

表皮葡萄球菌                              ATCC E155      0         阴性

(Staphylococcus epidermidis)

嗜麦芽糖寡养单胞菌                        ATCC 13637     0         阴性

(Stenotrophomonas maltophila)

温和链球菌                                ATCC 6249      0         阴性

(Streptococcus mitis)

变异链球菌                                ATCC 25175     0         阴性

(Streptococcus mutans)

肺炎链球菌                                ATCC 6303      0         阴性

(Streptococcus pneumoniae)

化脓链球菌                                ATCC 19615     0         阴性

(Streptococcus pyogenes)

小韦荣氏球菌                              ATCC 10790     0         阴性

(Veillonella parvula)

副溶血弧菌                                ATCC 17802     0         阴性

(Vibrio parahaemolyticus)

小肠结肠炎耶尔森氏菌                      ATCC 27729     0         阴性

(Yersinia enterolitica)

SARS-CoV阳性对照                         不适用          41.4     阳性

SARS-CoV阳性对照                         不适用          43.5      阳性

SARS-CoV阴性对照                         不适用          0         阴性

SARS-CoV阴性对照                         不适用          0         阴性

BD：BD Diagnostics

ATCC：美国典型培养物保藏中心

PAT得分>0被认为是阳性

B部分：

使用完全RT-SDA试验形式，以三个非SARS相关冠状病毒株(非-SARS-CoV)，进行第二实验。从美国典型培养物保藏中心获得非-SARS-CoV的原种(stock vial)，并在PBS/BSA中稀释。使用加入柱上DNA酶处理以去除污染性DNA的改良QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini试剂盒方法，加工140μl病毒悬浮液。平行地加工含有400个SARS-CoV病毒颗粒的悬浮液作为阳性对照。还包括第二阳性对照，该对照含有来源于SARS-CoV靶序列(SEQ ID NO.：9和10)的质粒克隆的体外转录物。将30μL加工后的标本通过移液管加入含有干SDA引物、报道探针和核苷酸的引发微量孔中，之后加入20μL含有RNA酶抑制剂和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)的逆转录缓冲液，进行RT-SDA。含有逆转录反应物的微量孔然后在48℃温育20分钟。最终的反应条件如下：120mM N-二[羟乙基]甘氨酸；25mM KOH；43.5mM K_iPO₄；5％ DMSO；5％甘油；1500μM dC_sTP；dATP，dGTP和dTTP各300μM；5mM乙酸镁；1500nM缓冲引物SARSrtB24(SEQ ID NO.：1)；1500nM SDA引物SarCRP(SEQ ID NO.：5)；300nM SDA引物SarCFP(SEQ ID NO.：4)；750nM信号引物SarCAd-MPC(SEQ ID NO.：8)；600nM扩增内对照(IAC)信号引物SarC-IACAd(SEQ ID NO.：7)；1200nM靶报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：15)；900nM IAC报道探针MPC2 F/D(SEQ ID NO.：16)；40U RNA酶抑制剂和10U AMV-RT(两者均来自Promega Corp.，Madison，WI)。

逆转录反应结束时，向每个微量孔加入100μL SDA缓冲液，然后转移至72℃加热块。同时，在54℃预热含有干SDA酶(Bst聚合酶和BsoBI限制性酶)的扩增微量孔。10分钟温育后，将100μL样品由引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并置于设定在52.5℃的BD ProbeTec ET读数器中。监测荧光1小时，并使用开发用于该BD ProbeTec ET系统的PAT算法分析读数。最终反应混合物中的SDA条件如下：500μM dC_sTP；dATP，dGTP和dTTP各100μM；5.7mM乙酸镁；500nM缓冲引物SARSrtB24(SEQ ID NO.：1)；500nM SDA引物SarCRP(SEQ ID NO.：5)；100nM SDA引物SarCFP(SEQ ID NO.：4)；250nM信号引物SarCAd-MPC(SEQ ID NO.：8)；200nM IAC信号引物SarC-IACAd(SEQ ID NO.：7)；400nM靶报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：15)；300nM IAC报道探针MPC2F/D(SEQ IDNO.：16)；12.5％DMSO；1.7％甘油；24.5mM K_iPO₄；82mM KOH；143mM N-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；45U BsoBI限制性酶。

结果和结论

表7总结了结果。与先前实验中使用的DNA扩增系统一样，除了含有SARS-CoV靶核酸的反应外，未获得其它阳性结果，由此说明所公开的引物和报道探针对该分析具有特异性。在这些反应中未包括IAC靶RNA，由此从MPC2F/D报道探针未检测到高于背景的信号(数据未显示)。

表7：用BD ProbeTec ET SARS-CoV试验测试的一组非SARS-CoV

^*体外来源于SARS-CoV靶区(SEQ ID NO.：9和10)的质粒克隆。

PAT得分>0被认为是阳性。

实施例3：分析的检测极限

通过测试SARS-CoV靶序列(SEQ ID NO.：9和10)的体外转录物，确定BD ProbeTec ET SARS-CoV试验的分析检测极限(LOD)。从含有插入SP6RNA聚合酶启动子下游的多克隆位点中的SARS-CoV靶拷贝的基于pUC19的质粒，产生转录物。在作为载体的10ng/μL酵母RNA中稀释纯化的转录物，在6个靶水平之每一个水平下测试总共24个重复试验。简言之，将30μL稀释的靶加入含有干引物、报道探针和核苷酸的引发微量孔，之后加入20μL含有RNA酶抑制剂、AMV-RT和1000个拷贝基于RNA的IAC(SEQ ID NO.：12)的逆转录缓冲液。逆转录条件如下：1500μM dC_sTP；dATP，dGTP和dTTP各300μM；5mM乙酸镁；1500nM缓冲引物SARSrtB24(SEQ ID NO.：1)；1500nM SDA引物SarCRP(SEQ ID NO.：5)；300nM SDA引物SarCFP(SEQ ID NO.：4)；750nM信号引物SarCAd-MPC(SEQ ID NO.：8)；600nM IAC信号引物SarC-IACAd(SEQ IDNO.：7)；1200nM靶报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：15)；900nM IAC报道探针MPC2 F/D(SEQ ID NO.：16)；1000个拷贝的IAC转录物(SEQ IDNO.：12)；5％DMSO；5％甘油；43.5mM K_iPO₄；25mM KOH；120mM N-二[羟乙基]甘氨酸；40U RNA酶抑制剂；10U AMV-RT。

在48℃温育再水化的微量孔20分钟，之后加入100μL SDA缓冲液并转移至72℃加热块。同时，在54℃加热块上预热含有干SDA酶(Bst聚合酶和BsoBI限制性酶)的微量孔。10分钟温育后，将100μL样品从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并放入设定在52.5℃的BDProbeTec ET读数器中。最终的SDA反应条件如下：500μM dC_sTP；dATP，dGTP和dTTP各100μM；5.7mM乙酸镁；500nM缓冲引物SARSrtB24(SEQID NO.：1)；500nM SDA引物SarCRP(SEQ ID NO.：5)；100nM SDA引物SarCFP(SEQ ID NO.：4)；250nM信号引物SarCAd-MPC(SEQ ID NO.：8)；200nM IAC信号引物SarC-IACAd(SEQ ID NO.：7)；400nM报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：15)；300nM IAC报道探针MPC2 F/D(SEQ IDNO.：16)；12.5％ DMSO；1.7％甘油；24.5mM K_iPO₄；82mM KOH；143mM N-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；45U BsoBI限制性酶。

在1小时温育期过程中，在BD ProbeTec ET仪器的两个光通道中每分钟读取荧光读数，结果以SARS-CoV靶和IAC的PAT得分报告。荧光读数从未达到过预定荧光阈值的反应被定为PAT得分0。对应于MPC D/R报道探针(SEQ ID NO.：15)，产生ROX PAT得分>0的反应被认为是SARS-CoV阳性的；而对应于IAC报道探针MPC2 F/D(SEQ ID NO.：16)，产生FAM PAT得分>0的反应被认为是IAC阳性的。FAM和ROX信号均未达到其对应阈值(PAT得分＝0)的那些反应被认为是不确定的。阳性和阴性外对照被包括在每轮试验中以验证反应性能。为了通过仪器报道来自患者标本的结果，需要这些对照分别产生阳性和阴性正确结果。

使用由包装在抗核酸酶的大肠杆菌噬菌体蛋白质外壳中的SARS-CoV靶RNA序列克隆拷贝组成的Armored RNA粒子(Ambion，Inc.，Austin，TX)，进行了类似的LOD研究。简言之，Armored RNA粒子稀释在TSMG缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.0；100mM NaCl；1mM MgCl₂；0.1％明胶)中，使用QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini试剂盒加工。为了模拟对临床标本的处理，加入柱上DNA酶处理步骤以便从样品中除去污染性DNA。将纯化的RNA稀释在体积80μL水中，使用30μL稀释的样品如上所述执行该试验。使用BD ProbeTec ET仪器收集1小时的荧光读数，用PAT算法分析结果。

结果和结论

BDProbeTec ET SARS-CoV试验的分析灵敏度被确定为每个反应201拷贝体外转录物或149拷贝Armored RNA(表8)。尽管在Armored RNA实验中一个未加靶(unspiked)的样品可能由于标本加工过程中的样品交叉污染而产生了阳性结果，但是未观察到不确定的结果。

表8：BD ProbeTec ET SARS-CoV RT-SDA试验对体外转录物和ArmoredRNA粒子的分析LOD

^a 阳性结果：PAT得分>0

^b 95％的时间可检测到的最低水平(95％置信区间)

^c 可能由于标本加工过程中的实验室交叉污染导致的一个假阳性结果

实施例4：临床性能

在香港Queen Mary医院微生物系实施的临床研究中评价用于SARS-CoV的半优化RT-SDA试验，该研究使用2002-2003年冬SARS爆发期间获得的回顾标本(retrospective specimens)。

该研究的具体目的如下：

1.就如下方面，估计使用BD ProbeTec ET SARS-CoV试验检测SARS-CoV的可行性：

●疾病控制和预防中心(CDC)和/或世界卫生组织(WHO)的病例定义(针对参考阳性患者，组合的病例定义和分开的可能和疑似病例定义)(WHO.2003.用于监督严重急性呼吸道综合征(SARS)的病例定义：http://www.who.int/csr/sars/casedefinition/en/print.html；CDC.2003.修订的严重急性呼吸道综合征(SARS)US监督病例定义和SARS病例更新——美国和世界，2003年12月，MMWR52：1202-1206)

●CDC实验室标准

●RT-PCR结果

2.估计从抑制性标本得到不确定结果的比率

在开始试验前，从研究地点的Institutional Review Board获得方案的批准。通过测试一组接种了含有克隆的SARS-CoV核壳靶序列拷贝的Ambion Armored RNA粒子的模拟标本，也证明该试验点能够熟练地加工样品和实施试验程序。表8列出了标本入选的标准。使用BD ProbeTec ET系统的所有分析以盲检方式进行，操作者对RT-PCR或其它判定性测试方法的结果无先验知识。

使用QIAamp Viral RNA Mini试剂盒基本上按照厂商的说明——除了加入柱上DNA酶处理以除去污染性DNA之外——加工标本。对于粪便试样，包括一个额外的加工前步骤以在上样QIAGEN柱子前除去颗粒物。将粪便样品用0.89％盐水1:10稀释，4,000Xg离心20分钟。然后倾析上清液，并通过0.22μm滤器以除去颗粒碎屑。

简言之，将140μL临床标本或粪便过滤物通过QIAamp柱子加工，其中使用DNA酶处理柱子以消化结合在柱子基质上的污染性非特异性DNA。洗涤除去DNA酶后，将纯化的RNA洗脱在80μL体积的水中。将30μL洗脱物加入含有干引物、报道探针和核苷酸的引发微量孔中，之后加入20μL含有RNA酶抑制剂、AMV-RT酶和1000拷贝IAC RNA转录物(SEQ ID NO.：12)的逆转录缓冲液。逆转录的最终反应条件如下：1500μM dC_sTP；dATP，dGTP和dTTP各300μM；5mM乙酸镁；1500nM缓冲引物SARSrtB24(SEQ ID NO.：1)；1500nM SDA引物SarCRP(SEQ ID NO.：5)；300nM SDA引物SarCFP(SEQ ID NO.：4)；750nM信号引物SarCAd-MPC(SEQ ID NO.：8)；600nM IAC信号引物SarC-IACAd(SEQ IDNO.：7)；1200nM靶报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：15)；900nM IAC报道探针MPC2 F/D(SEQ ID NO.：16)；1000个拷贝的IAC转录物(SEQ IDNO.：12)；5％ DMSO；5％甘油；43.5mM K_iPO₄；25mM KOH；120mM N-二[羟乙基]甘氨酸；40U RNase抑制剂；10U AMV-RT。在48℃温育再水化的微量孔20分钟，之后加入100μL SDA缓冲液并转移至72℃加热块。同时，在54℃预热含有干SDA酶(Bst聚合酶和BsoBI限制性酶)的扩增微量孔。10分钟温育后，将100μL样品从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并放入设定在52.5℃的BD ProbeTec ET读数器中温育。最终的SDA反应条件如下：500μM dC_sTP；dATP，dGTP和dTTP各100μM；5.7mM乙酸镁；500nM缓冲引物SARSrtB24(SEQ ID NO.：1)；500nM SDA引物SarCRP(SEQ ID NO.：5)；100nM SDA引物SarCFP(SEQ ID NO.：4)；250nM信号引物SarCAd-MPC(SEQ ID NO.：8)；200nM信号引物SarC-IACAd(SEQID NO.：7)；400nM报道探针MPC D/R(SEQ ID NO.：15)；300nM报道探针MPC2 F/D(SEQ ID NO.：16)；12.5％ DMSO；1.7％甘油；24.5mM K_iPO₄；82mM KOH；143mM N-二[羟乙基]甘氨酸；12U Bst聚合酶；45U BsoBI限制性酶。

在1小时温育过程中，在BD ProbeTec ET仪器的两个光通道中每分钟读取荧光读数，结果以SARS-CoV靶和IAC的PAT得分报告。荧光读数从未达到过预定荧光阈值的反应被定为PAT得分0。对应于MPC D/R报道探针(SEQ ID NO.：15)，产生ROX PAT得分>0的反应被认为是SARS-CoV阳性的；而对应于IAC报道探针MPC2 F/D(SEQ ID NO.：16)，产生FAMPAT得分>0的反应被认为是IAC阳性的。FAM和ROX信号均未达到其对应阈值(PAT得分＝0)的那些反应被认为是不确定的。阳性和阴性外对照被包括在每轮试验中以验证反应性能。为了通过仪器报道来自患者标本的结果，需要这些对照分别产生阳性和阴性正确结果。

结果和结论

表9和表10总结了从30个粪便标本和30个NP吸出物的分析得到的结果以及相对的来自经验证的RT-PCR方法的结果。Pieris JSM等，Lancet361：1767-1772(2003)；Poon LLM等，Clin Chem 49：953-955(2003)；Poon LLM等，Clin Chem 50：67-72(2004)；Poon LLM等，J ClinVirol 238：233-238(2003)。在SARS样症状出现后于第8天和13天之间(平均＝11天)收集粪便标本，而对于NP吸出物，则于第3至7天收集(平均＝5天)。BD ProbeTec SARS-CoV试验对粪便样品的灵敏度、特异性和不确定率分别为100％、100％、3.3％，而对于NP吸出物，灵敏度和特异性均为100％但未记录到不确定结果。对于两种标本类型的组合，灵敏度、特异性和不确定率因此分别为100％(32/32)、100％(27/27)和1.6％(1/60)。

此处给出的数据说明，BD ProbeTec ET试验能够灵敏且特异地检测临床标本中的SARS-CoV。此RT-SDA系统的临床灵敏度被证实与经验证的RT-PCR方法的灵敏度相当，该基于RT-SDA的系统的另一优点是该系统并入了基于RNA的IAC以监测该试验所受到的抑制和/或污染RNA酶。

在感染早期检测NP吸出物中的SARS-CoV，很好的预示了BDProbeTec ET试验在病毒于社区中散布之前实行快速治疗性干预和/或感染控制措施而对患者进行管理。

表8：试样入选标准

^*指从QIAGEN或其它核酸纯化方法获得的经加工的标本。

表9：相对于RT-PCR，利用BD ProbeTec ET SARS-CoV试验对粪便标本的分析

^*RT-PCR方法中未并入IAC用于监测试验抑制。

表10：相对于RT-PCR，使用BD ProbeTec ET SARS-CoV试验对NP吸出物的分析

^*RT-PCR方法中未并入IAC用于监测试验抑制。

^**一个标本来自符合CDC/WHO的SARS病例定义的患者。

SARS试验系统D实施例

实施例1：使用SARS-CoV特异性引物扩增DNA

使用基因组靶区域(相应于SARS-CoV株BJ03的28996-29076位核苷酸；GenBank登录号AY278490)的基于pUC19的质粒克隆，证明所公开的引物和探针组合扩增SARS-CoV核酸的能力。用限制性酶NarI线性化该质粒DNA，使用PicoGreen dsDNA定量试剂定量。在三个靶水平之每个水平下运行一式四份SDA反应，以及阴性对照。

简言之，将DNA靶加入基于N-二[羟乙基]甘氨酸的SDA缓冲液中，并沸水浴中加热变性。然后将110微升变性的样品加入含有40μL如下混合物的引发微量孔中：37.5mM K_iPO₄；188ng/μL BSA；1900μM dC_sTP；dATP，dGTP和dTTP各375μM；375nM SDA引物SarDFP(SEQ ID NO.：18)；1875nM SDA引物SarDRP(SEQ ID NO.：19)；938nM信号引物SarDAd-TBD16(SEQ ID NO.：20)；1875nM报道探针TBD16 D/R(SEQ ID NO.：13)；3.75mM乙酸镁。室温20分钟后，将引发微量孔转移至72℃加热块，同时在54℃预热含有干Bst聚合酶和BsoBI限制性酶的相应扩增微量孔。10分钟温育后，将100μL引发混合物从引发微量孔转移至扩增微量孔，然后密封并放入52.5℃的BD ProbeTec ET读数器中。监测1小时荧光信号，并使用开发用于该仪器的PAT算法分析。此SDA反应中最终的引物和探针浓度如下：500nM SDA引物SarDRP(SEQ ID NO.：19)；100nM SDA引物SarDFP(SEQ ID NO.：18)；250nM信号引物SarDAd-TBD16(SEQ ID NO.：20)；500nM报道探针TBD16 D/R(SEQ ID NO.：13)。

结果和结论

从所有含有SARS-CoV靶DNA的反应均获得了阳性结果(表11)。相反，阴性对照无一产生阳性结果，说明所公开的引物和探针组合能够以高度的分析灵敏度检测所靶向的SARS-CoV特异性核酸靶序列。

表11：扩增和检测SARS-CoV特异性靶序列

PAT得分>0＝阳性。

序列表

<110>BECTON，DICKINSON AND COMPANY

<120>通过扩增和检测核壳RNA序列分析SARS冠状病毒

<130>020187.0229PTWO

<140>

<141>

<150>60/502,279

<151>2003-09-12

<160>25

<170>PatentIn Ver.3.2

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>2

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>3

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>4

<210>5

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>5

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>6

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>7

<210>8

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>8

<210>9

<211>126

<212>DNA

<213>人严重急性呼吸道综合征冠状病毒

<400>9

<210>10

<211>126

<212>RNA

<213>人严重急性呼吸道综合征冠状病毒

<400>10

<210>11

<211>126

<212>DNA

<213>人严重急性呼吸道综合征冠状病毒

<400>11

<210>12

<211>126

<212>RNA

<213>人严重急性呼吸道综合征冠状病毒

<400>12

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的探针

<400>13

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的探针

<400>14

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的探针

<400>15

<210>16

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的探针

<400>16

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>17

<210>18

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>18

<210>19

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>19

<210>20

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>20

<210>21

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的引物

<400>21

<210>22

<211>111

<212>DNA

<213>人严重急性呼吸道综合征冠状病毒

<400>22

<210>23

<211>111

<212>RNA

<213>人严重急性呼吸道综合征冠状病毒

<400>23

<210>24

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：合成的引物

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<210>25

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<213>人工序列

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<223>人工序列描述：合成的引物

<400>25