稳定甲状腺素运载蛋白和抑制甲状腺素运载蛋白错折叠的组合物和方法

摘要

本发明的名称为稳定甲状腺素运载蛋白和抑制甲状腺素运载蛋白错折叠的组合物和方法。动力学稳定甲状腺素运载蛋白天然状态是防止蛋白错折叠的有效机制。因为甲状腺素运载蛋白错折叠在甲状腺素运载蛋白淀粉样病变中起重要作用，所以抑制所述错折叠可有效地用于治疗和预防所述疾病。本发明公开了治疗方法、筛选方法以及具体的甲状腺素运载蛋白稳定化合物。

说明书

本申请是以下申请的分案申请：申请日2003年12月19日，申 请号200380109736.2(PCT/US2003/040567)，标题“稳定甲状腺素运 载蛋白和抑制甲状腺素运载蛋白错折叠的组合物和方法”。

相关申请的相互参考

本申请要求2002年12月19日提交的美国临时申请60/435,079 的优先权，该临时申请的全部内容都通过引用整体结合到本文中。

关于联邦资助研究项目的声明

本文公开的某些研究所使用的支持资金由NIH(美国国立卫生研 究院)授予的资助号NIH DK 46335提供。政府对本发明拥有一定权 益。

技术领域

本发明一般来说涉及蛋白质错折叠。更具体地说，本发明提供用 于稳定甲状腺素运载蛋白、抑制甲状腺素运载蛋白错折叠以及治疗与 其相关的淀粉样病变的组合物和方法。

背景技术

甲状腺素运载蛋白(TTR)是一种存在于血液和脑脊髓液中的55 kDa同源四聚体蛋白。TTR的功能是转运L-甲状腺素(T₄)和全视黄醇 结合蛋白(RBP)。TTR是超过20种非同源性淀粉样蛋白之一，它们 可转变为导致人体病变的纤维和其它聚集物。这些疾病似乎不是由蛋 白聚集导致的功能缺失引起。相反，聚集似乎通过迄今尚不明了的机 制引起神经元/细胞功能障碍。

在变性条件下，限速的野生型TTR四聚体解离和快速的单体错 折叠可使其错组装成公认为引起老年性系统性淀粉样变性(SSA)的淀 粉样蛋白。80多种TTR变异体中的一种解离和错折叠就会导致家族 性淀粉样多神经病(FAP)和家族性淀粉样心肌病(FAC)。

TTR四聚体具有两个C₂对称的T₄-结合位点。已知T₄的负协同 结合稳定TTR四聚体，并抑制淀粉样蛋白纤维形成。不幸的是，由 于甲状腺结合球蛋白(TBG)与T₄的亲和性比TTR高一个数量级，所 以在人血清中与T₄结合的TTR少于1％。而且，T₄的血清浓度(0.1μM) 比TTR的血清浓度(3.6-7.2μM)低。

发明内容

本发明至少部分基于以下发现：甲状腺素运载蛋白天然状态的动 力学稳定抑制蛋白错折叠。此发现的重要性在于蛋白错折叠在各种疾 病进程包括甲状腺素运载蛋白淀粉样病变中起作用。通过抑制甲状腺 素运载蛋白错折叠，人们可以干预这种疾病、改善病症和/或在某些 情况下预防或治愈疾病。

甲状腺素运载蛋白天然状态的动力学稳定有效抑制错折叠这一 发现可用于开发潜在高特异性和低毒性的治疗性组合物。因此，尽管 本文公开了能够稳定甲状腺素运载蛋白的示例性联芳基试药，但人们 可以设计选择性稳定所述蛋白的其它试药。例如，如本文所述，有可 能设计和制备高选择性结合甲状腺素运载蛋白和稳定甲状腺素运载 蛋白天然状态的多氯化联苯、二氟尼柳类似物或苯并噁唑。

一方面，本发明特征在于一种防止或降低甲状腺素运载蛋白四聚 体解离的化合物的筛选方法。该方法可包括以下步骤：使甲状腺素运 载蛋白四聚体与候选化合物接触；并测定所述候选化合物是否增加与 甲状腺素运载蛋白四聚体解离相关的活化能，由此防止或降低甲状腺 素运载蛋白四聚体解离。所述方法可任选包括检测所述候选化合物抑 制纤维形成的附加步骤。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：测定所述化合物是 否通过使解离过渡态甲状腺素运载蛋白四聚体不稳定而防止甲状腺 素运载蛋白四聚体解离。在另一个实施方案中，所述方法包括以下步 骤：测定所述化合物是否通过使甲状腺素运载蛋白四聚体比解离过渡 态更稳定而防止甲状腺素运载蛋白四聚体解离。

这种方法使用的候选化合物任选为小分子。这种小分子可通过四 聚体结合稳定甲状腺素运载蛋白天然状态，由此通过动力学稳定机制 在变性和生理条件下减慢解离和淀粉样变性。当所述化合物以10.6 μM浓度给予时，其在人血中任选表现出对TTR的结合化学计量超过 0.1。

小分子任选其分子量低于1500，非协同或正协同结合甲状腺素 运载蛋白，赋予的结合能>2.3kcal/mol。小分子可表现为K_d1和 K_d2<100nM(例如<10nM)和/或可具有高血浆浓度，它们对蛋白稳定 的贡献都超过2.0kcal/mol。所述小分子还可以降低淀粉样病变的产 生、降低酸介导或MeOH介导的淀粉样蛋白生成的速率和/或降低尿 素介导的TTR解离速率。

在某些实施方案中，所述小分子包括联苯胺、联苯、肟醚、吲哚 或其它由两个芳环组成的结构，其中一个芳环携带亲水基团，例如酸 或酚，而另一个芳环携带疏水基团，例如卤素或烷基。

在一个实施方案中，所述候选化合物为联芳化合物，其中一个环 携带亲水取代基而另一个环具有疏水取代基，或者两个环都携带至少 一个亲水取代基。所述亲水基团可以为酚、COOH、苄醇、硼酸或酯、 四唑、醛或水合醛，或者为直接或通过水介导H-键用作蛋白的H-键 供体或受体的官能团。所述联芳化合物可为两个环都被亲水官能度取 代的对称联芳化合物，所述亲水官能度包括酚、羧化物和醇，某些情 况下为卤素，以填充TTR中的卤素结合袋，例如具有官能度3-Cl、 4-OH、5-Cl和3′-Cl、4′-OH、5′-Cl的联芳化合物。在一个实施方案 中，所述联芳化合物的至少一个环被以下取代基取代：2，4-二氟或3，5- 二氟或2，6-二氟或3，5-二氯或3-Cl、4-OH、5-Cl或3-F、4-OH、5-F、 3-COOH、4-OH或3-OH或3-COOH或4-COOH或3-CH₂OH或 4-CH₂OH。示例性联芳化合物是多氯化联苯，例如羟化多氯化联苯， 其中至少一个环携带OH和/或Cl取代基，包括3-Cl、4-OH、5-Cl 或2-Cl、3-Cl、4-OH、5-Cl或3，4-二氯，或2，3，4-三氯或2，3，4，5-四氯。 氯之外的其它卤素也可用于所述候选化合物。所述候选化合物可以为 苯并噁唑。

在一个实施方案中，所述候选化合物为二氟尼柳类似物。本文描 述了二氟尼柳及各种二氟尼柳类似物的结构。与二氟尼柳相比，二氟 尼柳类似物可任选具有降低或缺失的NSAID活性。例如，与二氟尼 柳相比，二氟尼柳类似物可具有降低或缺失的环加氧酶抑制剂活性。

在一个实施方案中，所述方法包括测定二氟尼柳类似物是否表现 NSAID活性的附加步骤。例如，所述方法可包括测定二氟尼柳类似 物是否具有环加氧酶抑制剂活性的步骤。

用于筛选方法的甲状腺素运载蛋白可以是野生型甲状腺素运载 蛋白或者突变型甲状腺素运载蛋白，例如与甲状腺素运载蛋白淀粉样 病变(例如家族性淀粉样多神经病或家族性淀粉样心肌病)发病病因 相关的天然存在突变甲状腺素运载蛋白。示例性天然存在突变甲状腺 素运载蛋白包括但不限于V122I、V30M、L55P(突变体命名描述了相 对于野生型在所提及氨基酸位置的取代，参见例如Saraiva等(2001) Hum.Mut.17：493-503)。

本发明还提供在组织或生物体液中稳定甲状腺素运载蛋白并由 此抑制错折叠的方法。一般来说，所述方法包括给予组织或生物体液 含稳定量的本文所述化合物的组合物，其中所述化合物结合甲状腺素 运载蛋白，并通过动力学稳定甲状腺素运载蛋白四聚体的天然状态来 防止甲状腺素运载蛋白四聚体解离。

因此，在患病组织中稳定甲状腺素运载蛋白的方法改善了错折 叠，减轻了相关疾病的症状，并根据疾病的情况可利于治愈疾病。本 发明设想在组织和/或细胞中抑制甲状腺素运载蛋白错折叠。可通过 各种方法，例如实施例中描述的方法，评价错折叠程度以及因此通过 本发明方法达到的抑制程度。

因此，本发明另一方面包括治疗甲状腺素运载蛋白淀粉样病变的 方法，该方法包括给予诊断为具有甲状腺素运载蛋白淀粉样病变的受 试者治疗有效量的化合物，所述化合物通过动力学稳定甲状腺素运载 蛋白四聚体的天然状态来防止甲状腺素运载蛋白四聚体解离。

在一个实施方案中，本发明特征在于一种治疗甲状腺素运载蛋白 淀粉样病变方法，该方法包括给予诊断为具有甲状腺素运载蛋白淀粉 样病变的受试者治疗有效量的二氟尼柳类似物(例如防止甲状腺素运 载蛋白四聚体解离的二氟尼柳类似物)，防止甲状腺素运载蛋白四聚 体解离。与二氟尼柳相比，二氟尼柳类似物可任选具有降低或缺失的 NSAID活性(例如环加氧酶抑制剂活性)。

在另一个实施方案中，本发明特征在于一种治疗甲状腺素运载蛋 白淀粉样病变的方法，该方法包括给予诊断为具有甲状腺素运载蛋白 淀粉样病变的受试者治疗有效量的多氯化联苯(例如防止甲状腺素运 载蛋白四聚体解离的多氯化联苯)，防止甲状腺素运载蛋白四聚体解 离。多氯化联苯可以为羟化多氯化联苯。

在另一个实施方案中，本发明特征在于一种治疗甲状腺素运载蛋 白淀粉样病变的方法，该方法包括给予诊断为具有甲状腺素运载蛋白 淀粉样病变的受试者治疗有效量的苯并噁唑(例如防止甲状腺素运载 蛋白四聚体解离的苯并噁唑)，防止甲状腺素运载蛋白四聚体解离。

甲状腺素运载蛋白淀粉样病变可以为例如家族性淀粉样多神经 病、家族性淀粉样心肌病或老年性系统性淀粉样变性。

本发明方法治疗的受试者可为人类受试者，但要理解的是，本发 明的原理表明本发明对所有哺乳动物都有效。在本文中，“哺乳动物” 应理解为包括任何需要治疗甲状腺素运载蛋白错折叠相关疾病的哺 乳动物物种，特别是农业和驯养的哺乳动物物种。

本文描述的化合物(例如联芳化合物，如二氟尼柳类似物、多氯 化联苯或苯并噁唑)可配制为药物可接受的，以制备含所述化合物的 药物组合物。本文使用的术语“药物可接受的”、“生理耐受的”及其语 法变体当指组合物、载体、稀释剂和试药时可互换使用，表示能够给 予哺乳动物并且不产生不希望的生理作用的物质。

本发明还包括本文描述的任一种化合物或药物组合物在治疗甲 状腺素运载蛋白淀粉样病变(例如家族性淀粉样多神经病、家族性淀 粉样心肌病或老年性系统性淀粉样变性)中的用途。

本发明还包括本文描述的任一种化合物或药物组合物在生产甲 状腺素运载蛋白淀粉样病变(例如家族性淀粉样多神经病、家族性淀 粉样心肌病或老年性系统性淀粉样变性)治疗药物中的用途。

本文描述的化合物和治疗方法相比于目前可用于TTR淀粉样病 变的治疗选择具有明显优势。TTR淀粉样病变通常在10年内致死， 直至最近还被认为不可治愈。因为肝脏通常是促淀粉样变TTR的来 源，所以在家族性病例中，肝移植是一种用野生型等位基因替换疾病 相关等位基因的有效方案。尽管肝移植作为基因治疗的形式是有效 的，但它不是不存在问题。移植是复杂的，在于受体和供体都需侵入 性手术、移植后长期免疫抑制治疗、供体短缺、高成本、以及大量的 TTR淀粉样病变受试者由于其病情发展而不是好的候选者。不幸的 是，由于野生型TTR经常继续堆积，某些家族性受试者的心脏淀粉 样变性甚至在肝移植后继续进展。由于通过脉络丛合成，移植也没有 减轻中枢神经系统(CNS)的TTR堆积。移植对最流行的TTR疾病老 年性系统性淀粉样变性(SSA)不是一个可行的方案，由于野生型TTR 堆积，80岁以上的人约25％患有这种变性。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语都和本发明 所属领域普通技术人员通常理解的含义一致。尽管在本发明的实践或 实验中可以使用类似或等同于本文所述的方法和材料，但优选的方法 和材料如下所述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参 考文献都通过引用整体结合到本文中。在有冲突时，本申请包括定义 有控制权。另外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限 制。

由以下的详述和权利要求书显而易见本发明的其它特征和优势。

附图说明

图1图示甲状腺素运载蛋白的T4结合位点。

图2A和2B图示不同抑制剂存在时甲状腺素运载蛋白解折叠的 时程。

图3A和3B图示不同抑制剂存在时纤维形成的时程。

图4A和4B图示不同抑制剂存在时纤维形成的时程。

图5图示所筛选的用于在血浆中结合甲状腺素运载蛋白的多氯 化联苯的结构。

图6图示羟化多氯化联苯的结构，其在血浆中与甲状腺素运载蛋 白的结合和其体外淀粉样蛋白纤维化抑制特性合在一起评价。

图7图示苯并噁唑化合物对甲状腺素运载蛋白纤维形成的抑制。 苯并噁唑上的羧基位置沿左侧显示，而C(2)苯环沿底部显示。条棒表 示纤维形成(ff)百分比，即存在苯并噁唑化合物(7.2μM)时由甲状腺素 运载蛋白(3.6μM)形成纤维的量相比于没有抑制剂时由甲状腺素运载 蛋白形成的量(此量定义为100％)。

图8图示了在人血浆中孵育后结合甲状腺素运载蛋白的苯并噁 唑的化学计量(s)。使用免疫沉淀(采用树脂结合抗体)捕获甲状腺素运 载蛋白。从树脂上释放甲状腺素运载蛋白后，由HPLC色谱图中其峰 下的面积确定甲状腺素运载蛋白和抑制剂的量。s的最大可能值是2。 沿底部轴线显示了化合物编号。细垂直线表示检测偏差。

图9图示了没有抑制剂或在3.6μM化合物20、21或27或1.8μM 化合物20存在时6M尿素中野生型甲状腺素运载蛋白(1.8μM)解离 的时间(t)函数。

图10图示结合甲状腺素运载蛋白的化合物20的X-射线共晶体 结构。不同亚单位中的相同残基以有撇号和无撇号的残基数区分，成 对的卤素结合袋也是如此。

具体实施方式

至少某些淀粉样疾病看起来象是由20多种非同源蛋白或蛋白片 段中任一种的累积引起，最终产生一种纤维状交联-β-折叠四级结构。 由正常折叠蛋白如甲状腺素运载蛋白形成淀粉样纤维需要蛋白错折 叠，以产生有组装能力的中间体。甲状腺素运载蛋白(TTR)淀粉样变 性的过程似乎引起三种不同的淀粉样病变-老年性系统性淀粉样变性 (SSA)、家族性淀粉样多神经病(FAP)和家族性淀粉样心肌病(FAC)。 SSA与野生型TTR的累积有关，而FAP和FAC由80多种TTR变异 体中一种的淀粉样变性引起。参见例如Colon，W.；Kelly，J.W. Biochemistry 1992，31，8654-60；Kelly，J.W.Curr.Opin.Struct.Biol. 1996，6，11-7；Liu，K.等；Nat.Struct.Biol.2000，7，754-7；Westermark，P. 等；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990，87，2843-5；Saraiva，M.J.等；J. Clin.Invest.1985，76，2171-7；Jacobson，D.R.等；N.Engl.J.Med.1997， 336，466-73；Buxbaum，J.N.；Tagoe，C.E.Ann.Rev.Med.2000，51， 543-569；和Saraiva，M.J.Hum.Mutat.1995，5，191-6，这些文献中的 每一个都通过引用整体结合到本文中。

TTR是一个55kDa的同源四聚体，特征在于2，2，2对称性，在二 聚体-二聚体交界面具有两个等同的漏斗型结合位点，甲状腺激素(T4) 可以在血浆和CSF中结合于此处。TTR结合的全视黄醇结合蛋白通 常小于1当量。TTR错折叠包括四聚体解离为单体，接着单体内三级 结构改变，使得蛋白能够错组装，最终产生淀粉样蛋白。可行的FAP 治疗使用由肝移植介导的基因治疗，以野生型(WT)蛋白替换血液中 的变异TTR。此方法对FAC可能无效，原因是野生型TTR持续堆积， 同样其对于SSA治疗也是无用的，其中野生型TTR堆积的过程似乎 是病因。肝移植治疗对于大约10种在柔脑膜堆积淀粉样纤维导致 CNS病的TTR变异体也无效，因为这些TTR由脉络丛合成。因此， 迫切需要开发基于通用非侵入型药物的治疗策略。理想的药物是非蛋 白、非肽或非核酸型药物。参见例如Blake，C.C.等；J.Mol.Biol.1978， 121，339-56；Wojtczak，A.等；Acta Crystallogr.，Sect.D 1996，758-810； Monaco，H.L.；Rizzi，M.；Coda，A.Science 1995，268，1039-41；Lai，Z.； Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry 1996，35，6470-82；Holmgren，G.等； Lancet 1993，341，1113-6；Suhr，O.B.；Ericzon，B.G.；Friman，S.Liver Transpl.2002，8，787-94；Dubrey，S.W.等；Transplantation 1997，64， 74-80；Yazaki，M.等；Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，274，702-6； 和Cornwell，C.G.III等；Am.J.of Med.1983，75，618-623，这些文献中 的每一个都通过引用整体结合到本文中。

抑制甲状腺素运载蛋白淀粉样纤维形成的二氟尼柳类似物的合成

可以通过T4介导的四聚体稳定化防止导致淀粉样纤维形成的 TTR错折叠。某些结构各异的四聚体稳定物家族结合TTR的一个或 两个T4位点，防止淀粉样变性，且没有激素T4可能存在的副作用。 这些四聚体稳定化合物包括某些非甾族抗炎药物(NSAID)，例如氟芬 那酸、双氟芬酸、氟比洛芬和二氟尼柳，它们似乎通过基态结合和稳 定化增加与四聚体解离相关的动力学屏障起作用。因为TTR在血液 中是T4的第二载体，所以TTR的T4结合能力95％以上未利用，这 使得可以给予靶向这些位点的四聚体稳定化合物。因为二氟尼柳是环 加氧酶-2抑制剂，所以长期给予可能导致胃肠副作用。因此理想的二 氟尼柳类似物应降低或缺失NSAID活性，但在血液中对TTR具有高 亲和性。为此目标的第一步是设计和合成为淀粉样蛋白纤维形成抑制 剂的二氟尼柳类似物。参见例如Miroy，G.J.等；.Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.1996，93，15051-6；Klabunde，T.等；Nat.Struct.Biol.2000，7， 312-21；Baures，P.W.；Peterson，S.A.；Kelly，J.W.Bioorg.Med.Chem. 1998，6，1389-401；Petrassi，H.M.等；J.Am.Chem.Soc.2000，122， 2178-2192；Baures，P.W.等；Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-47； Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nat.Rev.Drug Disc.2002，1，267-275； Oza，V.B.等；J.Med.Chem.2002，45，321-32；Bartalena，L.；Robbins，J. Clin.Lab.Med.1993，13，583-98；Aldred，A.R.；Brack，C.M.；Schreiber， G.Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.1995，111，1-15；和 Mao，H.Y.等；J.Am.Chem.Soc.2001，123，10429-10435，这些文献中 的每一个都通过引用整体结合到本文中。

TTR四聚体的亚单位关系到三条正交C₂-轴。图1图示了TTR 的T4结合位点，表明了抑制剂羧化物参与与Lys 15和15′ε-铵盐的 静电相互作用的正向结合模式(forward binding mode)。由四级结构界 面产生的两个相同T4结合位点与和C₂对称晶轴垂直的两个C₂轴立 体交叉。每个T4结合位点都可分为内部和外部结合腔。参见例如 Blake，C.C.；Oatley，S.J.Nature 1977，268，115-20，该文献通过引用整 体结合到本文中。内部结合腔包含一对卤素结合袋(HBP)，命名为 HBP 3和3′，由Leu 17、Ala 108、Val 121和Thr 119的侧链组成。 每个亚单位的四个Ser 117侧链的会聚限定了最内部区域和两个相同 结合位点之间的分界面。Ser 117羟基可用作氢键供体或受体，以便 和所述化合物(例如淀粉样蛋白形成抑制剂)上的官能团互补或通过 水分子介导与所述化合物的静电作用。外部结合位点由HBP 1和1′ 组成，而HBP 2和2′位于内部和外部结合腔之间的交界面上。Lys 15 和15′ε-铵基限定了外部结合腔的极外区域，使得可以和化合物上的 带负电取代基发生静电作用。许多TTR四聚体稳定化合物以正向结 合模式结合，位于外部结合袋中的亲水苯环上的带负电取代基参与和 Lys 15ε-铵基的静电作用。在正向结合模式中，疏水苯环(通常由卤素 取代)可占据内部结合袋。但是，也观察到以相反方向(反向结合模式) 结合的实例。在反向结合模式中，亲水芳环可位于内部腔，使得羧化 物与Ser 117和Ser 117′以氢键键合。在反向结合模式中，卤素取代的 疏水环可位于外部腔。

二氟尼柳可降低TTR酸-介导的淀粉样蛋白生成。二氟尼柳的结 构(参见实施例2)可用作抑制TTR淀粉样蛋白生成的新化合物的设计 基础。参见例如Verbeeck，R.K.等；Biochem.Pharm.1980，29，571-576； 和Nuemberg，B.；Koehler，G.；Brune，K.Clin.Pharmacokin.1991，20， 81-89。

所述化合物可为下式：

其中Ar¹是芳基或杂芳基，Ar¹任选被以下一种或多种取代：卤 素、-R¹、-OR¹、-OC(＝O)R¹、-OC(＝O)OR1、-OC(＝O)NHR¹、-SR¹、 -S(＝O)R¹、-S(＝O)₂R¹、-C(＝O)R¹、-CO₂R¹、-C(＝O)NHR¹、-NR¹R²、 -NHC(＝O)R¹、-NHC(＝O)NHR¹、-NHC(＝O)OR¹或-NHS(＝O)₂R¹。

Ar²是芳基或杂芳基，Ar²任选被以下一种或多种取代：卤素、-R¹、 -OR¹、-OC(＝O)R¹、-OC(＝O)OR¹、-OC(＝O)NHR¹、-SR¹、-S(＝O)R¹、 -S(＝O)₂R¹、-C(＝O)R¹、-CO₂R¹、-C(＝O)NHR¹、-NR¹R²、-NHC(＝O)R¹、 -NHC(＝O)NHR¹、-NHC(＝O)OR¹或-NHS(＝O)₂R¹。

每个R¹独立地为氢，或为取代或未取代的烷基、环烷基、杂环 烷基、烯基、环烯基、杂环烯基、炔基、芳基或杂芳基。

每个R²独立地为氢，或为取代或未取代的烷基、环烷基、杂环 烷基、烯基、环烯基、杂环烯基、炔基、芳基或杂芳基。

在某些情况下，Ar¹可为取代或未取代的苯基。Ar²可独立地为 取代或未取代的苯基。Ar¹和Ar²可同时为取代或未取代的苯基。所 述取代基可以为氟、氯、羟基、-CO₂H、-CO₂Me、-OMe、-CH₂OH 或甲酰基。R¹可为低级烷基。

所述化合物的使用形式可以为由无机或有机的酸与碱产生的药 物可接受盐。所包括的酸盐如下：乙酸盐、已二酸盐、藻酸盐、天冬 氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑 酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐(digluconate)、十二 烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐(glucoheptanoate)、 甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢 溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、 2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、 3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石 酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。碱盐包括铵盐、碱金属 盐如钠和钾盐、碱土金属盐如钙和镁盐、有机碱盐如二环己胺盐、 N-甲基-D-葡糖胺盐，以及氨基酸盐，如精氨酸盐、赖氨酸盐，等等。 此外，碱性含氮基团可以用以下物质季铵化：低级烷基卤，如甲基、 乙基、丙基和丁基氯、溴和碘；硫酸二烷基酯，如硫酸二甲酯、二乙 酯、二丁酯和二戊酯；长链卤素，如癸基、十二烷基、十四烷基和十 八烷酰氯、溴和碘；芳烷基卤，如苄基和苯乙基溴；等等。由此获得 可溶于或分散于水或油中的产物。

所述化合物可稳定TTR四聚体，并抑制TTR淀粉样蛋白的形成。 所述化合物可为特征在于微细结构改变的二氟尼柳类似物。所述化合 物可用于评价结构-活性的关系，因为它们和TTR淀粉样蛋白抑制有 关。取代模式和取代基(包括卤素、羧化物、酰基、烷氧基和羟基)的 数量可以变化。其它类型化合物的结构-活性数据揭示，羧化物取代 基或类似的阴离子或H-键基团似乎很重要，可能参与与Lys 15和15′ ε-铵基的静电相互作用或与Ser 117和117′的氢键键合相互作用，同 时卤素取代的疏水环填补TTR的卤素结合袋。可评价氟和氯取代芳 基，包括2-氟、4-氟、3，5-二氟、2，4-二氟和2，6-二氟。碘取代芳基可 能不太理想，因为它们具有不稳定性和潜在的甲状腺素激动剂作用。 在某些类似物中可以没有羧化物(阴离子)取代基，以评价其对纤维抑 制和血浆结合选择性的影响。可以合成含醛或醇官能团的化合物，以 评价不带电氢键受体和供体对结合选择性和淀粉样蛋白纤维化抑制 的影响。醛的偕二醇形式可能是主要结合种类。

一般来说，所述化合物可通过本领域已知的方法合成。Suzuki 偶联是制备所述化合物的一种方法：

BY₂＝B(OH)₂、B(OR)₂、9-BBN、B(CHCH₃CH(CH₃)₂)₂

X＝I、Br、Cl、OSO₂(C_nF_2n+1)，n＝0、1、4

R₁＝芳基、烯基、炔基

R₂＝芳基、烯基、苄基、烯丙基、烷基

例如，联苯化合物可由苯基硼酸和溴苯或碘苯进行Suzuki偶联 形成。可能需要合适的保护基，以避免在化合物制备过程中形成副产 物。例如，可用合适的氨基保护基如三氟乙酰基或叔丁氧羰基保护氨 基取代基。其它的保护基和反应条件可见于T.W.Greene，Protective Groups in Organic Synthesis，(第3版，1999，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)。

药物组合物

本文描述的化合物(例如二氟尼柳类似物、多氯化联苯或苯并噁 唑)可配制成药物组合物，可口服、胃肠外、喷雾吸入、局部、直肠、 鼻、口腔、阴道给予或通过植入贮库给予。本文使用的术语“胃肠外” 包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、 病灶内和颅内注射或灌注技术。

所述药物组合物可包括任一种化合物或其药物可接受的衍生物， 以及任何药物可接受的载体。本文使用的术语“载体”包括可接受的 辅料和赋形剂。可用于本发明药物组合物的药物可接受载体包括但不 限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白 蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂 肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢 二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚烯吡酮、纤维 素类物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯聚 氧化丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。

所述药物组合物可为无菌可注射的制剂形式，例如无菌可注射的 水性或油性悬浮液。此悬浮液可按照本领域已知的技术，使用合适的 分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。所述无菌可注射制剂也可以为在无毒 胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在 1，3-丁二醇中的溶液。可用的可接受赋形剂和溶剂是水、Ringer溶液 和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发油通常可用作溶剂或悬浮介质。 为此，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二 酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，可用于制备注射剂，也可 以使用天然的药物可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧 乙烯化形式。这些油性溶液或悬浮液可以包含长链醇稀释剂或分散 剂。

所述药物组合物可以以任何口服可接受的剂型经口给药，所述剂 型包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。当以片剂口服使用 时，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常也可以添加润滑剂， 如硬脂酸镁。以胶囊形式经口给药时，可用的稀释剂包括乳糖和干燥 的玉米淀粉。当需要以水性悬浮液口服使用时，将活性成分与乳化剂 和悬浮剂组合。如有需要，还可以添加某些甜味剂、矫味剂或着色剂。

或者，所述药物组合物可以以栓剂形式直肠给药。可通过将药物 与合适的非刺激性赋形剂混合进行制备，所述赋形剂于室温为固体， 但于直肠温度为液体，因此将在直肠融化释放药物。此类物质包括可 可油、蜂蜡和聚乙二醇。

所述药物组合物还可以局部给药，尤其是在治疗靶位包括局部施 药易于到达的部位或器官时，包括眼睛、皮肤或下肠道的疾病。对于 这些部位或器官的每一种，都容易制备合适的局部制剂。

可以直肠栓剂形式(参见上文)或合适的灌肠剂进行下肠道局部 用药。还可以使用局部给药的经皮贴剂。

对于局部用药，所述药物组合物可配制成包含悬浮或溶解在一种 或多种载体中的活性组分的合适软膏。用于化合物局部给药的载体包 括但不限于矿物油、液体石蜡、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧 丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，所述药物组合物可配制成合适的洗 剂或乳剂，其包含悬浮或溶解在一种或多种药物可接受载体中的活性 组分。合适的载体包括但不限于矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山 梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

对于眼部用药，所述药物组合物可配制为在等渗、pH调节的无 菌盐水中的微粉化悬浮液，或者优选为在等渗、pH调节的无菌盐水 中的溶液，有或者没有防腐剂如苯扎氯铵。或者，对于眼部用药，所 述药物组合物可配制为软膏形式，例如凡士林。

所述药物组合物还可以通过使用喷雾器、干粉吸入器或定量吸入 器以鼻气溶胶或吸入剂给药。所述组合物按照本领域众所周知的药剂 技术制备，可制备为盐水溶液，使用苄醇或其它合适的防腐剂、增强 生物利用度的吸收促进剂、氟代烃和/或其它常规的增溶剂或分散剂。

可与载体物质组合以生产单剂型的活性成分的量根据治疗对象 和具体的给药方式有所变化。但是，应当理解的是，任何特定受试者 的具体剂量和治疗方案取决于各种因素，包括使用的具体化合物的活 性、年龄、体重、身体健康情况、性别、饮食情况、给药时间、排泄 速率、药物组合和主治医师的判断以及要治疗的特定疾病的严重性。 如果有的话，活性成分的量还取决于与所述活性成分共同给予的治疗 或预防的药物。

药物组合物的有效量为对治疗受试者产生治疗效果需要的量，其 取决于多种因素，例如抑制剂性质、受试者大小、治疗目标、要治疗 的病理特征、使用的具体药物组合物以及主治医师的判断。相关文献 参见Freireich等，Cancer Chemother.Rep.1966，50，219和Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardley，New York，1970，537。可用的活 性成分的剂量水平为每天约0.001-约100mg/kg体重、每天约0.1-约 10mg/kg体重。

以下为实践本发明的实施例。不能以任何方式将它们理解为限制 本发明的范围。

实施例

实施例1：通过改变蛋白错折叠能量学预防甲状腺素运载蛋白淀粉样病变

许多的人类疾病，包括淀粉样变性病，都与蛋白错折叠有关。恶 化[例如Val30→Met30(V30M)和Leu55→Pro55(L55P)]或改善 [Thr119→Met119(T119M)]甲状腺素运载蛋白(TTR)淀粉样病变的80 种家族突变提供了有价值的机理理解。迄今为止，所有疾病相关突变 的特征都是使TTR四聚体不稳定，许多突变影响了限速性四聚体解 离的速度，快速率促进淀粉样变性，慢速率延缓淀粉样变性。我们利 用T119M预防V30M化合物杂合子所引起疾病的机制，开发急剧减 缓初始错折叠事件(四聚体解离)的小分子TTR淀粉样蛋白抑制剂，初 始错折叠事件是部分单体变性所需要的，使其能错组装成淀粉样蛋白 或其它聚集物。

分离杂种四聚体，以更好地理解反式抑制机制。增加T119M亚 单位相对于V30M[或L55P]的化学计量将最大的酸介导纤维形成转 移到较低的pH，降低了生理可到达pH(>4.0)时淀粉样蛋白的总产量， 并减慢了酸诱导(pH4.4)和甲醇介导的淀粉样变性的速率。已经发现 了某些小分子TTR淀粉样蛋白纤维化抑制剂，本文研究了其亚类， 包括美国食品药品监督管理局(FDA)批准的两种药物(抑制剂8和 10)(Sacchettini等，Nature Rev.Drug Disvovery 1，267(2002))。小分子 抑制剂结合对野生型(WT)TTR纤维形成的产量和速率的影响类似于 加入T119M亚单位的影响。但是，没有在所有抑制剂中都观察到最 适于纤维形成的pH降低。这些抑制剂的作用是结合至TTR四聚体中 的两个相同的甲状腺素(T4)位点，而不是单体。

通过将缓慢的四级结构变化与解折叠过渡态联系在一起，检测四 聚体解离速率，解折叠过渡态的速率是解离速率的5×10⁵倍 (等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，16427(2002))。变性 检测解离是不可逆的，因为所使用尿素的浓度(>6.0M)不支持重折叠。 增加T119M亚单位相对于V30M[或L55P]的化学计量揭示，TTR(1.8 μM)四聚体解离速率(限速淀粉样变性)在三种不同变性环境(酸性pH、 甲醇水溶液或尿素)中急剧下降，解释了疾病预防的起源。

在抑制剂6-10(1.8和3.6μM)存在时，野生型TTR四聚体(1.8μM) 解离速率的检测结果显示，对所有TTR抑制剂复合物都是剂量依赖 性减慢。四聚体初始解离速率与结合两种抑制剂(T·I₂)的四聚体的摩 尔分数粗略成反比。在抑制剂6、7和9(1.8μM)存在时，单指数振幅 (amplitude of single exponential)主要与未配位四聚体解离相关(较小程 度上与T·I相关)，暗示T·I₂在6M尿素中防止四聚体解离。相反，抑 制剂8和10时形成的T·I和T·I₂在尿素中基本不能保护四聚体免于解 离，说明仅结合还不足。在6、7和9(3.6μM)中观察到的有效抑制的 起因是结合能稳定T·I₂复合物超过2.3kcal/mol的自由能(ΔG1＝RT ln([T·I]/[T])＝RT ln([I]/Kd1)和ΔG2＝RT ln([T·I₂]/[T])＝RT ln{([I]2/(Kd1*Kd2))。T·I₂相比于T稳定2.7kcal/mol将使TTR四聚体 解离速率降低两个数量级。抑制剂8和10(3.6μM)的强负协同结合表 明，结合第二个位点(T·I₂，μM解离常数)相比于结合第一个位点(T·I) 不会进一步稳定TTR。抑制剂6、7和9的nM解离常数(Kd1和Kd2) 确保，基态稳定(>2.3kcal/mol)基本上足以增加TTR四聚体解离的活 化障碍，前提是所述抑制剂不结合并同样稳定解离过渡态。T·I₂和T·I 复合物的抑制剂解离速率也可以在抑制剂6、7和9的效力中起作用。 通过抗体树脂固定化抑制剂饱和的TTR，使水性缓冲液以5.0ml/分 钟经过，以评价6-10的有效解离速率。最好的抑制剂是具有最低表 观解离速率的抑制剂。

尽管淀粉样变性速率(酸性条件)与四聚体解离速率(在尿素中)在 抑制剂存在时一般来说关联很好，但不需要是这种情况。淀粉样变性 需要解离后浓度依赖性错组装。因此，一般来说小分子预防纤维形成 比预防四聚体解离更有效，尤其是在抑制剂可以将单体淀粉样蛋白中 间体浓度保持得较低时(<3.6μM)，此时纤维形成完全无效。有时， 在尿素中检测到的四聚体解离速率不能精确预测酸性条件下抑制剂 效力的排列次序。例如，FDA批准的药物二氟尼柳(8)是比四聚体解 离抑制剂好得多的淀粉样蛋白抑制剂。关于此观察结果的一个可能解 释是Kd1和/或Kd2在酸中比尿素中低(18)。另外，猜测有些抑制剂 在变性条件下比其在生理条件下测定的结合常数要好得多。例如，化 合物9在防止四聚体解离(尿素)和纤维形成(酸)方面比抑制剂7更有 效或等效，尽管抑制剂9的Kd1和Kd2值分别是7的10倍和83倍(在 生理条件下检测)。因此，重要的是在各种变性条件下而不是仅在生 理条件下判断错折叠抑制剂的效力。

通过稳定四聚体基态的程度高于稳定过渡态的程度(此时是使用 小分子抑制剂的情况)和/或使解离过渡态不稳定，使四聚体包含 T119M反式抑制剂亚单位而不是由疾病相关亚单位组成可以降低四 聚体解离速率。为区别这些可能性，我们对比了野生型和T119M同 源四聚体的重构动力学。T119M单体重折叠快速且在野生型TTR单 体折叠速率的误差范围之内。但是，T119M折叠单体的再组装比尿 素稀释启动的野生型TTR单体四聚化慢两个数量级。再组装过程是 双相的，这可由组装途径中存在可观测的中间体(可能是二聚体)得到 解释。在相反方向，T119M四聚体以野生型TTR四聚体解离速率的 1/37解离。这些动力学作用无法影响三级结构稳定性和/或四聚体稳 定性的差异。野生型和T119M单体(使用基因工程单体TTR构建物 (M-TTR))热力学稳定性的直接比较揭示，解折叠的自由能变化ΔG仅 为0.4kcal/mol，远低于分别解释解离和组装速率差异所需的2.1和 2.7kcal/mol。T119M和野生型TTR的热力循环分析表明，T119M通 过以约3.1kcal/mol使解离过渡态不稳定防止四聚体解离，而不是通 过四聚体稳定化。按照此分析结果，与野生型相比，实际上T119M 四聚体不稳定0.9kcal/mol，这进一步支持了动力学稳定机制。野生 型和T119M四聚体解离之间的自由能差异不能通过尿素介导的解折 叠检测，这是因为T119M在尿素中变性需要特别长的诱导周期(数 周)，在此期间TTR被修饰。对比氯化胍(GdmCl)和硫氰酸胍(GdmSCN) 变性曲线表明，野生型TTR比T119M更能抵抗GdmCl变性，而在 GdmSCN中则相反。这些变性中点的差异可能是由于有差别的阴离 子稳定化，提示这些蛋白的真实热力学稳定性非常相似，尽管在这些 离液剂中进行定量分析是不可能的。

T119M反式抑制主要由解离过渡态不稳定介导，与T-119M在 二聚体-二聚体交界面的定位一致。将解离过渡态能增加至3.1 kcal/mol能有效防止四聚体解离，这是因为活化障碍变得不可逾越(解 离半衰期t1/2由约42小时增加至1500小时以上)。小分子结合同样 以剂量依赖方式增加与四聚体解离相关的活化障碍，尽管其通过四聚 体稳定化(相对于过渡态稳定化)介导。小分子解离常数Kd1和Kd2 尽可能低且抑制剂浓度尽可能高时，稳定程度最大。我们实验中基态 稳定使用的浓度与血浆中观测到的众多口服利用药物的浓度相当。

小分子结合和反式抑制增加了与TTR纤维形成的限速步骤四聚 体解离相关的活化能。确立此类推的重要性在于已知反式抑制防止 V30M化合物杂合子引起的疾病。考虑到小分子错折叠寡聚物为神经 毒剂这个新证据，天然状态的动力学稳定是特别吸引人的策略。现在 应当考虑找寻小分子结合剂或开发调节其它容易错折叠的病理相关 蛋白的能量地形面(energy landscape)的反式抑制方法。

实施例2：二氟尼柳类似物稳定甲状腺素运载蛋白天然状态并是甲状腺素运载蛋白淀粉样蛋白纤维形成的抑制剂

二氟尼柳(1)可减少甲状腺素运载蛋白(TTR)淀粉样变性。例如， 在某些条件(例如3.6μM TTR、3.6μM二氟尼柳、pH 4.4、72小时、 37℃)下，二氟尼柳将TTR淀粉样变性减少63％。在这些条件下，加 倍二氟尼柳浓度(至7.2μM)将TTR淀粉样变性减少97％。二氟尼柳 是迄今报道的较好的淀粉样蛋白纤维化抑制剂之一，口服给予的二氟 尼柳具有高度的生物利用度，250mg每日两次的剂量产生100μM以 上的稳定血浆浓度。因为二氟尼柳为环加氧酶-2抑制剂，所以长期给 予可能导致胃肠道副作用。二氟尼柳类似物降低或缺失NSAID活性， 但在血浆中对TTR具有高亲和性，因此是理想选择。故二氟尼柳的 结构可用作抑制TTR淀粉样变性的新化合物的设计基础。参见例如 Verbeeck，R.K.等；Biochem.Pharm.1980，29，571-576；和Nuemberg， B.；Koehler，G.；Brune，K.Clin.Pharmacokin.1991，20，81-89。

使用芳基卤与芳基硼酸间Pd介导的Suzuki偶联合成二氟尼柳类 似物。可通过以下方法合成类似物2-10：用乙酸酐和吡啶乙酰化3- 或4-碘苯酚，接着与合适的氟苯基硼酸在标准Suzuki偶联反应条件 下如流程1所示进行Suzuki偶联。用Na⁰和MeOH(Zemplén条件) 除去酯获得苯酚2-10。参见例如Miyaura，N.；Yanagi，T.；Suzuki，A. Synth.Commun.1981，11，513-519；Sharp，M.J.；Snieckus，V. Tetrahedron Lett.1985，26，5997-6000；Sharp，M.J.；Cheng，W.； Snieckus，V.Tetrahedron Lett.1987，28，5093-5096；Pozsgay，V.；Nanasi， P.；Neszmelyi，A.Carbohydr.Res.1981，90，215-231；Jendralla，H.；Chen， L.-J.Synthesis 1990，827-833；和Kelm，J.；Strauss，K.Spectrochim.Acta， Part A 1981，37，689-692，这些文献的每一个都通过引用整体结合到 本文中。

                 流程1

使用如流程2所示的固相合成法合成二氟尼柳类似物11。将3- 碘苯甲酸经酯键偶联至Wang树脂，产生树脂结合的碘代苯，然后将 其偶联至2，4-二氟苯基硼酸，用1:1的TFA:CH₂Cl₂混合物将其与树脂 切开。参见例如Guiles，J.W.；Johnson，S.G.；Murray，W.V.J.Org. Chem.1996，61，5169-5171，该文献通过引用整体结合到本文中。

         流程2

使用标准的Suzuki偶联条件(参见上文)，如流程3所示，将3- 溴苯甲酸甲酯或4-溴苯甲酸甲酯(都有市售)与合适的氟苯基硼酸偶 联，组装成含羧化物的底物12-22。然后用LiOH·H₂O皂化酯，产生 对应的羧酸。参见例如Bumagin，N.A.；Bykov，V.V.Tetrahedron 1997， 53，14437-14450；Ananthakrishnanadar，P.；Kannan，N.J.Chem.Soc.， Perkin Trans.2 1982，1305-1308；Homis，F.；Nozaki，K.；Hiyama，T. Tetrahedron Lett.2000，41，5869-5872；和Hajduk，P.J.等；J.Med Chem. 1997，40，3144-3150，这些文献的每一个都通过引用整体结合到本文 中。

       流程3

使用TMS-CH₂N₂酯化5-碘代水杨酸，使用MeI将苯酚转变为甲 酯。如流程4所示，将保护的水杨酸与各种氟苯基硼酸偶联，随后通 过LiOH·H₂O皂化和BBr₃脱甲基化去保护，获得水杨酸衍生物23-27。 参见例如Nicolaou，K.C.等；Chem.Eur.J.1999，5，2602-2621；和 Chu-Moyer，M.Y.等；J.Med.Chem.2002，45，511-528。

         流程4

首先通过将市售溴苯酚保护为甲酯(MeI和K₂CO₃)，合成含3′，5′- 二卤代-4′-羟基的类似物28-31。与(甲氧基羰基苯基)硼酸进行Suzuki 偶联形成全保护联苯底物。如流程5所示，BBr₃介导的甲酯剪切和 LiOH·H₂O皂化产生全官能化二氟尼柳类似物28-31。

             流程5

通过用TMS-重氮甲烷酯化羧酸产生32，接着任选用MeI和 K₂CO₃醚化，并用LiOH·H₂O进行酯水解，获得33，合成二氟尼柳的 甲醚和甲酯类似物。参见流程6。

         流程6

如流程7所示，将碘苯和一系列含卤素的硼酸进行Suzuki偶联， 组装成一系列卤化联苯34-38。参见例如Patrick，T.B.；Willaredt，R.P. DeGonia，D.J.J.Org.Chem.1985，50，2232-2235；Kuchar，M.等； Collection of Czechoslovak Chemical Communications 1988，53， 1862-1872；Allen，K.J.；Bolton，R.；Williams，G.H.J.Chem.Soc.， Perkin Trans.2 1983，691-695；Nakada，M.等；Bull.Chem.Soc.Jpn. 1989，62，3122-3126；和Weingarten，H.J.Org.Chem.1961，26， 730-733，这些文献的每一个都通过引用整体结合到本文中。

           流程7

如流程8所示，使用3，5-二氯碘苯和2-、3-或4-甲酰基苯基硼酸 组装氯化联芳醛。类似地制备没有卤素取代的醛42-44。醛39-41用 KMnO₄的丙酮/水溶液氧化，产生流程8对应的羧酸45-47，或者， 用NaBH₄的MeOH溶液还原，产生流程8对应的苄醇48-50。用NaBH₄和MeOH还原非氯化醛42-44，产生联苯苄醇51-53。参见例如Song， X.P.；He，H.T.；Siahaan，T.J.Org.Lett.2002，4，549-552；和Nicolaou， K.C.等；J.Am.Chem.Soc.2001，123，9313-9323；Hashizume，H.等； Chem.Pharm.Bull.1994，42，512-520；Indolese，A.F.Tetrahedron Lett. 1997，38，3513-3516；Pridgen，L.N.；Snyder，L.；Prol，J.J.Org.Chem. 1989，54，1523-1526；Huang，C.G.；Beveridge，K.A.；Wan，P.J.Am. Chem.Soc.1991，113，7676-7684；Wendebom，S.等；Synlett.1998，6， 671-675；Stevens，C.V.；Peristeropoulou，M.；De Kimpe，N.Tetrahedron 2001，57，7865-7870；Tanaka，K.；Kishigami，S.；Toda，F.J.Org.Chem. 1990，55，2981-2983；和Clive，D.L.J.；Kang，S.Z.J.Org.Chem.2001， 66，6083-6091，这些文献的每一个都通过引用整体结合到本文中。

             流程8

如流程9所示，将3，5-二氟苯基硼酸与2-或3-碘苯甲醛进行 Suzuki偶联，合成3′，5′-二氟甲酰-官能化联苯54和55。通过类似的 方法和前述的方法合成所有其它抑制剂。化合物10、21、35、36和 43有市售。

           流程9

试剂和溶剂购自Aldrich、Lancaster、Acros、Combi-Blocks、Matrix 和Pfaltz-Bauer。THF和CH₂Cl₂经Al₂O₃干燥。其它的溶剂和试剂得 自市场供应商，除非另有声明，否则都没有进一步纯化就使用。在硅 胶60F₂₅₄预涂板上进行分析性薄层层析(TLC)，用购自EM Science 的荧光指示剂监测反应。通过UV照射、磷钼酸处理后加热或钼酸高 铈铵处理后加热使TLC板显色。使用EM Science的硅胶60(230-400 目)进行快速层析。通过HPLC测定对本文所得结论必不可少的新化 合物纯度。用Waters 600泵/控制器、Waters 996光电二极管阵列检测 器和Waters NovaPak硅胶柱进行正相HPLC。使用的溶剂系统是己烷 和乙酸乙酯，梯度在30分钟内由50:50己烷:乙酸乙酯至0:100己烷: 乙酸乙酯。用Waters 600泵/控制器、Waters 2847双波长检测器和 Vydac蛋白和肽C18柱进行反相HPLC。溶剂系统A为含0.5％三氟 乙酸的95:5水:乙腈，而溶剂系统B为含0.5％三氟乙酸的5:95水:乙 腈。梯度在20分钟内由100:0A:B至0:100A:B，再以100％ B保持 10分钟。用AVIV Instruments的202SF型光谱仪进行圆二色性光谱 学检测。用Varian FT NMR光谱仪以400MHz质子频率记录NMR 光谱。除非另有说明，否则质子化学位移参照内部化学位移标准品 CHCl₃(7.26ppm)以ppm报告。偶合常数以赫兹(Hz)报道。除非另有说 明，否则碳化学位移参照内部化学位移标准品CDCl₃(77.23ppm)以 ppm报告。所有的质谱都在Scripps研究所质谱中心或伊利诺伊大学 质谱实验室获得。

按照流程1制备化合物2-10。将合适的乙酸-碘苯酯(1.0当量)溶 解在足量甲苯中，得到浓度为0.05M的溶液，向其中加入苯基硼酸 (1.1当量)溶解在EtOH获得的0.6M硼酸溶液。加入2M Na₂CO₃水 溶液，使乙酸-碘苯酯的终反应浓度为0.03M，接着加入Pd(PPh₃)₄(4.0 mol％)。将反应液在氩气中加热回流20小时，一结束就冷却至室温， 用CH₂Cl₂提取(2×)，用盐水洗涤(1×)，经MgSO₄干燥并真空浓缩。 残余物经快速层析(10:1己烷:乙酸乙酯)纯化，获得乙酰化联苯。

向乙酰化联苯的MeOH溶液中加入催化量的Na⁰，以使终反应物 浓度为0.3M。使反应物在氩气中于室温搅拌12小时，此后加入 Dowex 50W-X8阳离子交换树脂，以中和反应混合物。过滤树脂，将 滤过液真空浓缩并快速层析(3:1己烷:乙酸乙酯)，获得为白色固体的 羟基联苯产物，收率为22-75％。

2′，4′-二氟联苯-3-醇(2)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 9.63(br s， 1H)，7.54(td，1H，J＝8.9，6.7Hz)，7.34(ddd，1H，J＝11.1，9.2，2.6Hz)， 7.27(m，1H)，7.17(tdd，1H，J＝8.3，2.6，1.2Hz)，6.92(m，2H)，6.81(ddd， 1H，J＝8.1，2.5，1.0Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 162.8，160.3， 157.4，135.4，131.8，129.7，119.4，115.6，114.9，111.9，104.4。C₁₂H₈F₂O (M-H)的HRESIMS理论值为205.0466，实测值为205.0465。正相HPLC 保留时间：10.5分钟。反向HPLC保留时间：1.3分钟。>99％纯。

2′，4′-二氟联苯-4-醇(3)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 7.49(td， 1H，J＝9.4，8.6Hz)，7.34(AA′XX′，2H，J_AA′＝J_XX′＝2.5Hz，J_XA＝8.7Hz， J_X′A′＝8.5Hz，J_X′A＝0.3Hz，J_XA′＝0.3Hz，v_A＝v_A′＝2934.1Hz，v_X＝v_X′＝2746.2 Hz)，7.28(ddd，2H，J＝11.3，9.4，2.6Hz)，7.13(dddd，1H，J＝8.3，7.5，2.8， 1.0Hz)，6.87(AA′XX′，2H，同上)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 162.3，160.0，157.2，131.4，129.9，124.8，115.4，111.8，104.3。C₁₂H₈F₂O (M-H)的HRESIMS理论值为205.0464，实测值为205.0465。正相HPLC 保留时间：11.2分钟。反向HPLC保留时间：12.6分钟。>98％纯。

3′，5′-二氟联苯-3-醇(8)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 9.65(br s， 1H)，7.34(m，2H)，7.28(t，1H，J＝7.9Hz)，7.19(tt，1H，J＝9.1，2.2Hz)， 7.13(ddd，1H，J＝7.8，1.8，1.0Hz)，7.08(t，1H，J＝2.1Hz)，6.86(ddd，1H， J＝8.0，2.4，1.0Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 162.9，158.0， 144.1，139.1，130.1，117.6，115.7，109.7，102.6。C₁₂H₈F₂O(M-H)的 HRESIMS理论值为205.0465，实测值为205.0468。正相HPLC保留 时间：11.4分钟。反向HPLC保留时间：12.9分钟。>99％纯。

3′，5′-二氟联苯-4-醇(9)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 7.44 (AA′XX′，2H，J_AA′＝J_XX′＝3.0Hz，J_XA＝8.0Hz，J_X′A′＝8.5Hz，J_X′A＝0.7Hz， J_XA′＝0.5Hz，v_A＝v_A′＝2973.8Hz，v_X＝v_X′＝2766.0Hz)，7.05(dtd，2H，J＝6.6， 2.4，0.7Hz)，6.92(AA′XX′，2H，同上)，6.74(tt，1H，J＝8.9，2.4Hz)，5.11 (s，1H)。¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ 164.7，156.1，144.2，131.8，128.6， 116.1，109.6，102.1。C₁₃H₈Cl₂O₂(M-H)的HRESIMS理论值为205.0465， 实测值为205.0465。正相HPLC保留时间：10.8分钟。反向HPLC保 留时间：12.9分钟。>99％纯。

2′，4′-二氟联苯-3-甲酸(11)。按照流程2制备化合物11。将3-碘 苯甲酸(200mg，0.81mmol)、DIEA(140μL，0.81mmol)、EDCI·HCl 和HOBt加入到在CH₂Cl₂(10mL)中溶胀的Wang树脂溶液(265mg， 0.67mmol，2.53mmol/g)中。在肽振荡器上于室温剧烈振荡22小时 后，去除溶剂，用DMF(3×10mL)和CH₂Cl₂(3×10mL)洗涤树脂，并 经真空彻底干燥。

将2，4-二氟苯基硼酸(112mg，0.71mmol)、K₂CO₃(98mg，0.71 mmol)和Pd₂(dba)₃(4mg，0.01mmol)加入到在DMF(2mL)中溶胀的官 能化Wang树脂(140mg，0.35mmol)溶液中。于室温搅拌后，过滤反 应物，用DMF(3×)、H₂O(3×)、CH₂Cl₂(3×)和MeOH(3×)洗涤树脂， 并经真空彻底干燥。

将TFA:CH₂Cl₂(3mL 1:1)溶液加入到官能化树脂(140mg，0.35 mmol)中，在肽振荡器上于室温剧烈振荡13小时。完成后，过滤反应 物，用CH₂Cl₂(3×)洗涤树脂，滤过液真空浓缩，通过快速层析(2:1 己烷:乙酸乙酯，0.5％乙酸)纯化，获得为白色固体的11(81mg，100％)。 ¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 13.19(br s，1H)，8.07(q，1H，J＝1.7Hz)， 7.99(dt，1H，J＝7.9，1.6Hz)，7.78(dq，1H，J＝7.8，1.3Hz)，7.64(m，2H)， 7.40(ddd，1H，J＝11.1，8.8，2.5Hz)，7.22(tdd，1H，J＝8.4，2.8，1.0Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 167.0，160.7，160.4，134.5，133.0，132.0， 131.3，129.4，129.1，128.7，123.9，112.2，104.6。C₁₃H₈F₂O₂(M-H)的 HRESIMS理论值为233.0414，实测值为233.0426。正相HPLC保留 时间：13.7分钟。反向HPLC保留时间：12.5分钟。>99％纯。

按照流程3制备化合物12-22。将合适的溴苯甲酸甲酯(1.0当量) 溶解于足量甲苯中，获得浓度为0.1M的溶液，向其中加入苯基硼酸 (2.0当量)溶解于EtOH中获得的1.0M硼酸溶液。加入2M Na₂CO₃水溶液，使溴苯甲酸酯的终反应浓度为0.06M，接着加入Pd(PPh₃)₄(10.0mol％)。将反应物在氩气中于70℃下搅拌25小时，一结束就冷 却至室温，用CH₂Cl₂(2×)提取，用盐水(1×)洗涤，经MgSO₄干燥， 并真空浓缩。残余物通过快速层析(10:1己烷:乙酸乙酯)纯化，得到甲 酯。

向0.06M浓度的甲酯(1.0当量)的THF:MeOH:H₂O(1:1:1)溶液中 加入LiOH·H₂O(3.0当量)。反应物于室温搅拌4小时，一结束就用 30％ HCl酸化，用乙酸乙酯(3×5mL)提取，经MgSO₄干燥，并真空 浓缩。残余物通过快速层析(CH₂Cl₂，1％ MeOH，0.2％乙酸)纯化，得 到为白色固体的联苯羧酸，收率为6-93％。

2′，4′-二氟联苯-4-甲酸(12)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 13.09 (br s，1H)，8.04(AA′XX′，2H，J_AA′＝J_XX′＝2.0Hz，J_XA＝J_X′A′＝8.0Hz， J_X′A＝J_XA′＝0.7Hz，v_A＝v_A′＝3213.3Hz，v_X＝v_X′＝3056.2Hz)，7.65(AA′XX′， 2H，同上)，7.63(m，1H)，7.38(ddd，1H，J＝11.2，9.0，2.8Hz)，7.21(td， 1H，J＝8.4，2.2Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 167.1，160.8，158.0， 138.6，132.1，130.1，129.6，129.0，123.9，112.2，104.7。C₁₃H₈F₂O₂(M-H) 的HRESIMS理论值为233.0414，实测值为233.0407。正相HPLC保 留时间：13.3分钟。反向HPLC保留时间：12.6分钟。>99％纯。

2′-氟联苯-3-甲酸(15)。¹HNMR(CD₃OD，400MHz)δ 8.18(q，1H， J＝1.4Hz)，8.03(dt，1H，J＝7.8，1.3Hz)，7.76(dq，1H，J＝7.7，1.5Hz)，7.55 (t，1H，J＝7.8Hz)，7.48(td，1H，J＝7.8，1.7Hz)，7.38(dddd，1H，J＝8.3，7.5， 5.1，1.8Hz)，7.26(td，1H，J＝7.6，1.3Hz)，7.20(ddd，1H，J＝11.0，8.2，1.2 Hz)。¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)δ 169.7，161.2，137.5，134.6，132.4， 132.0，131.3，130.1，129.9，129.5，126.0，117.2。C₁₃H₉FO₂(M-H)的 HRESIMS理论值为215.0508，实测值为215.0498。正相HPLC保留 时间：10.6分钟。反向HPLC保留时间：12.1分钟。>99％纯。

2′-氟联苯-4-甲酸(16)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 13.10(br s， 1H)，8.05(AA′XX′，2H，J_AA′＝JXX′＝1.7Hz，J_XA＝J_X′A′＝8.5Hz，J_X′A＝J_XA′＝0.3 Hz，v_A＝v_A′＝3217.9Hz，v_X＝v_X′＝3070.0Hz)，7.67(AA′XX′，2H，同上)， 7.58(td，1H，J＝8.0，1.8Hz)，7.34(m，1H)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100 MHz)δ 167.1，159.1，139.4，130.8，130.3，130.2，129.6，129.0，127.3， 125.1，116.2。C₁₃H₉FO₂(M-H)的HRESIMS理论值为215.0508，实测 值为215.0515。正相HPLC保留时间：12.3分钟。反向HPLC保留时 间：12.2分钟。>99％纯。

3′，5′-二氟联苯-3-甲酸(17)。¹H NMR(丙酮-d₆，400MHz)δ 8.30(td， 1H，J＝2，0.5Hz)，8.10(dtd，1H，J＝7.6，1.1，0.5Hz)，7.97(ddd，1H，J＝7.8， 2.0，1.1Hz)，7.64(td，1H，J＝7.8，0.6Hz)，7.39(m，2H)，7.06(tt，1H，J＝9.3， 2.4Hz)。¹³C NMR(丙酮-d₆，100MHz)δ 167.4，165.6，163.2，144.6， 139.8，132.5，132.4，130.6，130.3，128.9，111.0，103.7。C₁₃H₈F₂O₂(M-H) 的HRESIMS理论值为233.0414，实测值为233.0425。正相HPLC保 留时间：13.5分钟。反向HPLC保留时间：12.7分钟。>99％纯。

3′，5′-二氟联苯-4-甲酸(18)。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 13.15 (br s，1H)，8.02(d，2H，J＝8.2Hz)，7.85(d，2H，J＝8.5Hz)，7.49(m，2H)， 7.26(tt，1H，J＝9.4，2.4Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 166.4， 164.1，161.7，142.6，141.6，130.9，130.0，127.1，110.2，103.5。C₁₃H₈F₂O₂(M-H)的HRESIMS理论值为233.0414，实测值为233.0423。正相HPLC 保留时间：13.0分钟。反向HPLC保留时间：12.8分钟。>99％纯。

2′，6′-二氟联苯-3-甲酸(19)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 8.03 (dt，1H，J＝7.8，1.6Hz)，8.00(m，1H)，7.72(dt，1H，J＝7.8，1.4Hz)，7.64(t， 1H，J＝7.7Hz)，7.53(m，1H)，7.26(t，2H，J＝8.3Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆， 100MHz)δ 167.7，158.7，135.0，132.2，131.4，131.1，129.9，129.5，129.5， 112.8，110.9。C₁₃H₈F₂O₂(M-H)的HRESIMS理论值为233.0414，实测 值为233.0410。正相HPLC保留时间：12.1分钟。反向HPLC保留时 间：12.1分钟。>97％纯。

2′，6′-二氟联苯-4-甲酸(20)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 8.06 (AA′XX′，2H，J_AA′＝J_XX′＝2.0Hz，J_XA＝J_X′A′＝8.0Hz，J_X′A＝J_XA′＝0.7Hz， v_A＝v_A′＝3243.6Hz，v_X＝v_X′＝3018.6Hz)，7.60(AA′XX′，2H，同上)，7.54 (m，1H)，7.27(t，2H，J＝8.3Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 171.0， 164.0，134.1，125.7，122.0，121.9，121.1，103.4。C₁₃H₈F₂O₂(M-H)的 HRESIMS理论值为233.0414，实测值为233.0425。正相HPLC保留 时间：14.5分钟。反向HPLC保留时间：12.1分钟。>99％纯。

联苯-4-甲酸(22)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 13.07(br s，1H)， 8.03(AA′XX′，2H，J_AA′＝J_XX′＝1.8Hz，J_XA＝J_X′A′＝8.3Hz，J_X′A＝J_XA′＝0.3Hz， v_A＝v_A′＝3210.7Hz，v_X＝v_X′＝3122.0Hz)，7.81(AA′XX′，2H，同上)，7.75 (m，2H)，7.51(tt，2H，J＝7.2，1.1Hz)，7.43(tt，1H，J＝7.4，1.2Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 167.2，144.2，139.0，130.0，129.8，129.1， 128.3，127.0，126.8。C₁₃H₁₀O₂(M+)的HREIMS理论值为198.0683，实 测值为198.0683。正相HPLC保留时间：13.8分钟。反向HPLC保留 时间：12.2分钟。>99％纯。

5-碘-2-甲氧基苯甲酸甲酯。将TMS-重氮甲烷(19.25mL，38.50 mmol，2M己烷溶液)加入到5-碘水杨酸(5.08g，19.24mmol)的MeOH (20mL)溶液中，于室温搅拌11小时。一结束就真空浓缩反应物，残 余物不用进一步纯化就进行下一步。

将甲基碘(2.40mL，38.48mmol)和K₂CO₃(10.60g，76.96mmol) 加入到5-碘-2-甲氧基苯甲酸(5.37g，19.24mmol)的DMF(20mL)溶液 中，在氩气中于室温搅拌24小时。一结束就加入乙酸乙酯，用1％HCl (2×20mL)、盐水(1×)洗涤反应物，经MgSO₄干燥并真空浓缩。残余 物通过快速层析(3:1己烷:乙酸乙酯)纯化，获得为白色固体的5-碘-2- 甲氧基苯甲酸甲酯(4.93g，88％)。参见例如Corey，E.J.；Myers，A.G.J. Am.Chem.Soc.1985，107，5574-5576，该文献通过引用整体结合到本 文中。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 7.90(d，1H，J＝2.4Hz)，7.80(dd， 1H，J＝8.8，2.4Hz)，6.96(d，1H，J＝9.0Hz)，3.81(s，3H)，3.79(s，3H)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 164.7，158.0，141.6，138.5，122.2，115.2， 82.1，55.9，52.0。C₉H₉IO₃(M+)的HREIMS理论值为291.9608，实测 值为291.9596。

按照流程4制备化合物23-27。将5-碘-2-甲氧基苯甲酸甲酯(1.0 当量)溶解于足量甲苯中，获得浓度为0.08M的溶液，向其中加入苯 基硼酸(2.0当量)溶解于EtOH中获得的0.8M硼酸溶液。加入2M Na₂CO₃水溶液，使甲氧基苯甲酸酯的终反应浓度为0.06M，接着加 入Pd(PPh₃)₄(10.0mol％)。将反应物在氩气中于60℃下搅拌15小时， 一结束就冷却至室温，用CH₂Cl₂(2×)提取，用盐水(1×)洗涤，经MgSO₄干燥，并真空浓缩。残余物通过快速层析(3:1己烷:乙酸乙酯)纯化， 得到甲基化水杨酸酯。

将BBr₃(2.0当量，1M的CH₂Cl₂溶液)加入到甲基化水杨酸酯(1.0 当量)溶于足量CH₂Cl₂所获得的0.06M浓度溶液中。反应物在氩气中 于室温搅拌4小时，一结束就用H₂O(10mL)猝灭，用CH₂Cl₂(2×)提 取，用盐水(1×)洗涤，经MgSO₄干燥，并真空浓缩。残余物不用进一 步纯化就进行下一步。

向0.06M浓度的甲酯(1.0当量)的THF:MeOH:H₂O(1:1:1)溶液中 加入LiOH·H₂O(3.0当量)。反应物于室温搅拌4小时，一结束就用 30％ HCl酸化，用乙酸乙酯(3×5mL)提取，经MgSO₄干燥，并真空 浓缩。残余物通过快速层析(CH₂Cl₂，1％ MeOH，0.2％乙酸)纯化，得 到为白色固体的联苯水杨酸，收率为12-42％。

4′-氟-4-羟基联苯-3-甲酸(23)。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ 8.01 (d，1H，J＝2.5Hz)，7.65(dd，1H，J＝8.7，2.5Hz)，7.51(m，2H)，7.11(tt，2H， J＝10.0，3.0Hz)，6.97(d，1H，J＝8.7Hz)。¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)δ 173.5，165.0，162.7，137.7，135.1，132.6，129.6，129.3，118.9，116.7，116.6， 114.2。C₁₃H₉FO₃(M-H)的HRESIMS理论值为231.0459，实测值为 231.0457。正相HPLC保留时间：14.2分钟。反向HPLC保留时间： 12.8分钟。>99％纯。

2′-氟-4-羟基联苯-3-甲酸(24)。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ 7.98 (dd，1H，J＝2.2，1.4Hz)，7.59(ddd，1H，J＝8.7，2.4，1.7Hz)，7.36(td，1H， J＝7.8，1.7Hz)，7.26(dddd，1H，J＝9.9，7.4，4.9，1.7Hz)，7.16(td，1H， J＝7.5，1.2Hz)，7.10(ddd，1H，J＝11.1，8.2，1.3Hz)，6.95(d，1H，J＝8.5 Hz)。¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)δ 173.5，162.9，162.4，137.2，131.8， 130.2，130.1，129.1，128.1，125.8，118.5，117.1，114.0。C₁₃H₉FO₃(M-H) 的HRESIMS理论值为231.0457，实测值为231.0446。正相HPLC保 留时间：13.8分钟。反向HPLC保留时间：12.7分钟。>99％纯。

3′，5′-二氟-4-羟基联苯-3-甲酸(25)。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ 8.07(d，1H，J＝2.5Hz)，7.73(dd，1H，J＝8.5，2.7Hz)，7.15(m，2H)，7.01(d， 1H，J＝8.9Hz)，6.86(tt，1H，J＝9.0，2.5Hz)。¹³CNMR(CD₃OD，100MHz) δ173.3，166.3，163.8，145.1，135.2，131.0，129.8，119.2，114.4，110.4， 103.0。C₁₃H₈F₂O₃(M-H)的HRESIMS理论值为249.0363，实测值为 249.0356。正相HPLC保留时间：14.5分钟。反向HPLC保留时间： 13.3分钟。>99％纯。

2′，4′-二氯-4-羟基联苯-3-甲酸(26)。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ 7.83(d，1H，J＝2.2Hz)，7.70(d，1H，J＝2.0Hz)，7.58(dd，1H，J＝8.6，2.4 Hz)，7.48(ABX，1H，J_AB＝8.4Hz，J_AX＝2.2Hz，J_BX＝0.0Hz，v_A＝2989.4Hz， v_B＝2973.0Hz)，7.44(ABX，1H，同上)，7.06(d，1H，J＝8.7Hz)。¹³C NMR (CD₃OD，100MHz)δ 171.6，160.8，137.5，136.4，132.8，132.6，132.4， 130.8，129.2，128.5，127.7，117.2，112.9。C₁₃H₈Cl₂O₃(M-H)的HRESIMS 理论值为280.9772，实测值为280.9782。正相HPLC保留时间：13.1 分钟。反向HPLC保留时间：14.4分钟。>99％纯。

4-羟基联苯-3-甲酸(27)。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ 8.08(d， 1H，J＝2.4Hz)，7.73(dd，1H，J＝8.7，2.3Hz)，7.54(m，2H)，7.41(tt，2H， J＝7.3，1.8Hz)，7.29(tt，1H，J＝7.8，1.7Hz)，7.38(dddd，1H，J＝8.8，6.4 Hz)，7.05(d，1H，J＝8.7Hz)，6.93(m，1H)，6.90(ddd，1H，J＝7.3，1.9Hz)， 7.00(d，1H，J＝8.5Hz)。¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)δ 161.5，140.1， 134.0，132.4，128.7，128.3，126.9，126.3，117.5，112.9。C₁₃H₁₀O₃(M-H) 的HRESIMS理论值为213.0552，实测值为213.0545。正相HPLC保 留时间：12.9分钟。反向HPLC保留时间：12.6分钟。>99％纯。

4-溴-2，6-二氟苯甲醚。将甲基碘(580μL，10.06mmol)和K₂CO₃(2.80g，20.12mmol)加入到4-溴-2，6-二氟苯酚(1.05g，5.03mmol)的 DMF(10mL)溶液中，在氩气中于室温搅拌24小时。一结束就加入 乙酸乙酯，用1％ HCl(2×20mL)、盐水(1×)洗涤反应物，经MgSO₄干燥并真空浓缩。残余物通过快速层析(己烷)纯化，获得为白色固体 的4-溴-2，6-二氟苯甲醚(747mg，67％)。参见例如Chambers，R.D.等；J. Fluorine Chem.2000，102，169-174，该文献通过引用整体结合到本文 中。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 7.06(m，2H)，3.97(q，3H，J＝1.1Hz)。 ¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ 155.8，136.3，116.2，113.8，61.9。 C₇H₅F₂OBr(M+)的LREIMS实测值为223.0。

4-溴-2，6-二氯苯甲醚。将甲基碘(467μL，8.12mmol)和K₂CO₃(2.24g，16.24mmol)加入到4-溴-2，6-二氯苯酚(982mg，4.06mmol) 的DMF(10mL)溶液中，在氩气中于室温搅拌40分钟。一结束就加 入乙酸乙酯，用1％ HCl(2×20mL)、盐水(1×)洗涤反应物，经MgSO₄干燥并真空浓缩。残余物通过快速层析(己烷)纯化，获得为白色固体 的4-溴-2，6-二氯苯甲醚(768mg，74％)。参见例如Li，J.等；J.Med.Chem. 1996，39，1846-1856，该文献通过引用整体结合到本文中。¹H NMR (DMSO-d₆，400MHz)δ 7.75(s，2H)，3.81(s，3H)。¹³C NMR(DMSO-d₆， 100MHz)δ 151.3，131.5，129.6，116.5，60.6。C₇H₅BrCl₂O(M+)的 HREIMS理论值为253.8905，实测值为253.8901。

按照流程5制备化合物28-31。将合适的卤代苯甲醚(1.0当量) 溶解于足量甲苯中，获得浓度为0.25M的溶液，向其中加入苯基硼 酸(2.0当量)溶解于EtOH中获得的1.5M硼酸溶液。加入2M Na₂CO₃水溶液，使卤代苯甲醚的终反应浓度为0.08M，接着加入Pd(PPh₃)₄(10.0mol％)。将反应物于65℃下搅拌17小时，一结束就冷却至室温， 用CH₂Cl₂(2×)提取，用盐水(1×)洗涤，经MgSO₄干燥，并真空浓缩。 残余物通过快速层析(20:1己烷:乙酸乙酯)纯化，获得为白色固体的甲 基化联苯。

将BBr₃(2.0当量，1M的CH₂Cl₂溶液)加入到甲基化联苯(1.0当 量)溶于足量CH₂Cl₂所获得的0.20M浓度溶液中。反应物在氩气中于 室温搅拌3小时，一结束就用H₂O(10mL)猝灭，用CH₂Cl₂(2×)提取， 用盐水(1×)洗涤，经MgSO₄干燥，并真空浓缩。残余物不用进一步纯 化就进行下一步。

向0.04M浓度的甲酯(1.0当量)的THF:MeOH:H₂O(1:1:1)溶液中 加入LiOH·H₂O(3.0当量)。反应物于室温搅拌5小时，一结束就用 30％ HCl酸化，用乙酸乙酯(3×5mL)提取，经MgSO₄干燥，并真空 浓缩。残余物通过快速层析(CH₂Cl₂，1％ MeOH，0.2％乙酸)纯化，得 到为白色固体的联苯产物，收率为14-39％。

3′，5′-二氟-4′-羟基联苯-3-甲酸(28)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz) δ 10.60(br s，1H)，8.14(t，1H，J＝1.7Hz)，7.91(dt，1H，J＝7.7，1.1Hz)， 7.88(ddd，1H，J＝8.0，2.0，1.1Hz)，7.55(t，1H，J＝7.9Hz)，7.41(m，2H)。 ¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 167.3，154.0，151.5，138.4，133.6， 131.6，130.8，129.9，129.4，128.4，127.1，110.3。C₁₃H₈F₂O₃(M-H)的 HRESIMS理论值为249.0363，实测值为249.0358。正相HPLC保留 时间：18.3分钟。反向HPLC保留时间：10.5分钟。>98％纯。

3′，5′-二氟-4′-羟基联苯-4-甲酸(29)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz) δ 7.98(AA′XX′，2H，J_AA′＝J_XX′＝1.7Hz，J_XA＝J_X′A′＝8.2Hz，J_X′A＝J_XA′＝0.5Hz， v_A＝v_A′＝3189.9Hz，v_X＝v_X′＝3122.0Hz)，7.81(AA′XX′，2H，同上)，7.51 (m，2H)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 167.7，154.5，142.5，136.0， 130.5，130.5，130.4，126.9，111.0。C₁₃H₈F₂O₃(M-H)的HRESIMS理论值 为249.0363，实测值为249.0375。正相HPLC保留时间：18.9分钟。 反向HPLC保留时间：10.2分钟。>99％纯。

3′，5′-二氯-4′-羟基联苯-3-甲酸(30)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz) δ 8.13(t，1H，J＝1.6Hz)，7.91(m，2H)，7.70(s，2H)，7.56(t，1H，J＝7.8 Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 167.2，149.0，137.9，132.2，131.6， 130.8，129.3，128.4，127.1，126.8，122.9，123.0。C₁₃H₈Cl₂O₃(M-H)的 HRESIMS理论值为280.9772，实测值为280.9767。正相HPLC保留 时间：16.2分钟。反向HPLC保留时间：11.6分钟。>99％纯。

3′，5′-二氯-4′-羟基联苯-4-甲酸(31)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz) δ 7.98(AA′XX′，2H，J_AA′＝J_XX′＝1.7Hz，J_XA＝J_X′A′＝8.1Hz，J_X′A＝J_XA′＝0.5Hz， v_A＝v_A′＝3189.9Hz，v_X＝v_X′＝3110.0Hz)，7.81(AA′XX′，2H，同上)，7.78(s， 2H)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 167.2，141.8，141.7，134.7，129.9， 129.7，126.9，126.4，123.0。C₁₃H₈Cl₂O₃(M-H)的HRESIMS理论值为 280.9772，实测值为280.9785。正相HPLC保留时间：15.9分钟。反 向HPLC保留时间：11.4分钟。>97％纯。

2′，4′-二氟-4-羟基联苯-3-甲酸甲酯(32)。按照流程6制备化合物 32和33。将TMS-重氮甲烷(5.87mL，11.75mmol，2M己烷溶液)加 入到二氟尼柳(1.03g，4.11mmol)的MeOH(10mL)溶液中，于室温搅 拌5小时。一结束就真空浓缩反应物，残余物经快速层析(10:1己烷: 乙酸乙酯)纯化，获得为白色固体的32(774mg，71％)。¹H NMR(CDCl₃， 400MHz)δ 7.97(dd，1H，J＝2.2，1.3Hz)，7.59(dt，1H，J＝8.8，2.1Hz)， 7.36(dq，1H，J＝7.7，1.5Hz)，7.48(td，1H，J＝7.8，1.7Hz)，7.38(dddd，1H， J＝8.8，6.4Hz)，7.05(d，1H，J＝8.7Hz)，6.93(m，1H)，6.90(ddd，1H， J＝10.6，8.9，2.5Hz)，3.96(s，3H)。¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ 170.6， 163.6，161.3，158.5，136.4，131.2，130.3，126.2，124.2，118.0，112.6，111.8， 104.6，52.6，124.2。C₁₄H₁₀F₂O₃(M+)的HRFABMS理论值为264.0596， 实测值为264.0598。正相HPLC保留时间：6.9分钟。反向HPLC保 留时间：14.7分钟。>99％纯。

2′，4′-二氟-4-甲氧基联苯-3-甲酸(33)。将甲基碘(350μL，1.16 mmol)和K₂CO₃(320mg，2.32mmol)加入到32(152mg，0.58mmol) 的DMF(4mL)溶液中，在氩气中于室温搅拌14小时。一结束就加入 乙酸乙酯，用1％ HCl(2×20mL)、盐水(1×)洗涤反应物，经MgSO₄干燥并真空浓缩，不用进一步纯化就可以进行下一步。

向全甲基化二氟尼柳(140mg，0.50mmol)的MeOH:THF:H₂O (1:1:1)溶液中加入LiOH·H₂O(60mg，1.43mmol)，于室温搅拌4小时。 一结束就用30％ HCl酸化反应物，用乙酸乙酯(3×5mL)提取，经 MgSO₄干燥，并真空浓缩。残余物通过快速层析(2:1乙酸乙酯:己烷， 1％乙酸)纯化，得到为白色固体的33(122mg，93％)。¹H NMR(CDCl₃， 400MHz)δ 10.77(br s，1H)，8.31(dd，1H，J＝2.5，0.9Hz)，7.75(dt，1H， J＝8.6，2.1Hz)，7.41(dt，1H，J＝8.9，6.6Hz)，7.15(d，1H，J＝8.8Hz)，6.94 (m，1H)，4.13(s，3H)。¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ 177.7，161.4，158.2， 135.7，133.9，131.4，129.0，123.5，118.1，112.2，112.0，104.6，56.9。 C₁₄H₁₀F₂O₃(M-H)的HRESIMS理论值为263.0520，实测值为 263.0514。正相HPLC保留时间：21.6分钟。反向HPLC保留时间： 11.9分钟。>99％纯。

按照流程7制备化合物34-38。按照流程8制备化合物39-44。 将芳基碘(1.0当量)溶解于足量甲苯中，获得浓度为0.07M的溶液， 向其中加入合适的甲酰基苯基硼酸溶解于足量EtOH所获得的0.4M 浓度硼酸溶液。加入2M Na₂CO₃水溶液，使芳基碘的终反应浓度为 0.04M，接着加入Pd(PPh₃)₄(3.0mol％)。将反应物在氩气中加热回流 18小时，一结束就冷却至室温，用CH₂Cl₂(2×)提取，用盐水(1×)洗 涤，经MgSO₄干燥，并真空浓缩。残余物通过快速层析(40:1己烷: 乙酸乙酯)纯化，获得为白色固体的联苯醛，收率为40-91％。

3′，5′-二氯-3-甲酰基联苯(39)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 10.09 (s，1H)，8.04(t，1H，J＝1.8Hz)，7.91(dt，1H，J＝7.6，1.3Hz)，7.80(ddd，1H， J＝7.8，2.0，1.3Hz)，7.64(t，1H，J＝7.8Hz)，7.49(d，2H，J＝1.8Hz)，7.38(t， 1H，J＝1.9Hz)。¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ 192.0，142.8，139.7，137.2， 135.8，133.0，130.1，130.0，128.1，128.0，125.9。C₁₃H₈Cl₂O(M+H)的 HRFABMS理论值为251.0027，实测值为251.0027。正相HPLC保留 时间：8.0分钟。反向HPLC保留时间：15.2分钟。>99％纯。

3′，5′-二氯-4-甲酰基联苯(40)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 7.99 (AA′XX′，2H，J_AA′＝J_XX′＝2.1Hz，J_XA＝J_X′A′＝8.5Hz，J_X′A＝J_XA′＝0.7Hz， v_A＝v_A′＝3193.7Hz，v_X＝v_X′＝3077.8Hz)，7.70(AA′XX′，2H，同上)，7.47(t， 1H，J＝1.9Hz)，7.39(d，2H，J＝1.9Hz)。¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ 191.8，144.4，142.9，136.2，135.8，130.6，128.5，127.9，126.1。C₁₃H₈Cl₂O (M-H)的HREIMS理论值为248.9873，实测值为248.9874。正相HPLC 保留时间：7.9分钟。反向HPLC保留时间：15.2分钟。>99％纯。

3′，5′-二氯-2-甲酰基联苯(41)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 9.98 (s，1H)，8.03(dd，1H，J＝7.8，1.3Hz)，7.66(td，1H，J＝7.6，1.5Hz)，7.55(tt， 1H，J＝7.6，1.0Hz)，7.44(t，1H，J＝1.9Hz)，7.39(dd，1H，J＝7.7，1.0Hz)， 7.27(d，2H，J＝1.9Hz)。¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ 191.4，142.9， 141.0，135.3，134.0，133.7，130.7，129.0，128.5，128.4，128.4。C₁₃H₈Cl₂O (M+H)的HRFABMS理论值为251.0030，实测值为251.0029。正相 HPLC保留时间：7.0分钟。反向HPLC保留时间：14.9分钟。>99％ 纯。

按照流程8制备化合物45-47。将联苯醛(1.0当量)溶解于足量甲 苯中，获得浓度为0.07M的溶液，向其中加入KMnO₄(2.0当量)溶 于足量水所获得的0.2M浓度高锰酸钾溶液。将反应物于室温搅拌16 小时，一结束就真空浓缩，将获得的残余物再溶解于10:1 CH₂Cl₂:MeOH中，通过玻璃棉塞过滤。粗产物通过快速层析(10:1 CH₂Cl₂:MeOH)纯化，获得为白色固体的羧酸(58mg，100％)，收率为 82-100％。

2′，4′-二氯联苯-3-甲酸(45)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 8.22 (br s，1H)，8.00(br s，1H)，7.94(d，1H，J＝7.5Hz)，7.76(s，2H)，7.63(s， 1H)，7.60(br s，1H)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 168.0，143.7， 138.1，135.4，131.6，129.9，127.9，126.2。C₁₃H₈Cl₂O₂(M-H)的HRESIMS 理论值为264.9823，实测值为264.9810。正相HPLC保留时间：12.3 分钟。反向HPLC保留时间：14.2分钟。>99％纯。

2′，4′-二氯联苯-4-甲酸(46)。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ 8.11(br s，2H)7.72(m，2H)，7.64(d，2H，J＝1.9Hz)，7.46(t，1H，J＝1.7Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆，100MHz)δ 170.3，140.6，135.2，127.2，126.4，119.3， 118.6，117.4。C₁₃H₈Cl₂O₂(M-H)的HRESIMS理论值为264.9830，实 测值为264.9823。正相HPLC保留时间：12.5分钟。反向HPLC保留 时间：14.4分钟。>99％纯。

2′，4′-二氯联苯-2-甲酸(47)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ 7.75 (br s，1H)，7.56(s，2H)，7.48(m，2H)，7.36(m，2H)。¹³C NMR(DMSO-d₆， 100MHz)δ 170.1，152.5，145.2，133.3，130.0，129.6，128.0，127.2， 126.3。C₁₃H₈Cl₂O₂(M-H)的HRESIMS理论值为264.9823，实测值为 264.9834。正相HPLC保留时间：11.4分钟。反向HPLC保留时间： 13.6分钟。>99％纯。

按照流程8制备化合物48-53。将联苯醛(1.0当量)溶解于足量 MeOH中，获得浓度为0.1M的溶液，向其中加入NaBH₄(2.0当量) 溶于足量MeOH所获得的0.3M浓度硼氢化物溶液。于0℃搅拌反应 物，缓慢温至室温，搅拌16小时后，真空浓缩，通过快速层析(3:1己 烷:乙酸乙酯)纯化，获得为白色固体的联苯醇，收率为94-100％。

3′，5′-二氯联苯-3-基-甲醇(48)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 7.54 (m，1H)，7.46(d，2H，J＝1.8Hz)，7.45(m，2H)，7.39(m，1H)，7.34(t，1H， J＝1.9Hz)，4.77(s，2H)，1.90(br s，1H)。¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ 144.1，141.9，139.0，135.5，129.5，127.4，127.1，126.5，125.8，125.7，65.3。 C₁₃H₁₀Cl₂O(M+)的HREIMS理论值为252.0103，实测值为252.0109。 正相HPLC保留时间：13.9分钟。反向HPLC保留时间：14.0分钟。 >99％纯。

3′，5′-二氯联苯-4-基-甲醇(49)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 7.53 (AA′XX′，2H，J_AA′＝1.9Hz，J_XX′＝3.1Hz，J_XA＝8.7Hz，J_X′A′＝6.4Hz， J_X′A＝J_XA′＝0.5Hz，v_A＝v_A′＝3009.8Hz，v_X＝v_X′＝2977.8Hz)，7.45(AA′XX′， 2H，同上)，7.45(d，2H，J＝1.9Hz)，7.33(t，1H，J＝1.9Hz)，4.75(br d，2H， J＝4.8Hz)，1.81(br t，1H，J＝5.2Hz)。¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ 144.0，141.4，138.0，135.5，127.8，127.4，127.4，125.8，65.1。C₁₃H₁₀Cl₂O (M+)的HREIMS理论值为251.0110，实测值为252.0109。正相HPLC 保留时间：15.4分钟。反向HPLC保留时间：14.0分钟。>97％纯。

3′，5′-二氯联苯-2-基-甲醇(50)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 7.55 (dd，1H，J＝7.5，1.3Hz)，7.43(td，2H，J＝7.5，1.4Hz)，7.38(m，2H)，7.29 (d，2H，J＝1.9Hz)，7.24(dd，1H，J＝7.4，1.4Hz)，4.58(s，2H)，1.79(s， 1H)。¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ 143.7，138.9，137.9，134.9，130.0， 129.0，128.9，128.2，127.9，127.6，63.0。C₁₃H₁₀Cl₂O(M+)的HREIMS理 论值为252.0110，实测值为252.0109。正相HPLC保留时间：11.5分 钟。反向HPLC保留时间：14.0分钟。>99％纯。

按照流程9制备化合物54和55。将合适的碘苯甲醛(1.0当量) 溶解于足量甲苯中，获得浓度为0.07M的溶液，向其中加入3，5-二 氟苯基硼酸(2.0当量)溶解于足量EtOH所获得的1.0M浓度硼酸溶 液。加入2M Na₂CO₃水溶液，使碘苯甲醛的终反应浓度为0.04M， 接着加入Pd(PPh₃)₄(4.0mol％)。将反应物在于60℃搅拌17小时，一 结束就冷却至室温，用CH₂Cl₂(2×)提取，用盐水(1×)洗涤，经MgSO₄干燥，并真空浓缩。残余物通过快速层析(10:1己烷:乙酸乙酯)纯化， 获得为白色固体的联苯醛，收率为78-80％。

3′，5′-二氟-3-甲酰基联苯(54)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 10.06 (s，1H)，8.02(t，1H，J＝1.4Hz)，7.88(dt，1H，J＝7.8，1.4Hz)，7.78(ddd，2H， J＝7.8，2.0，1.2Hz)，7.61(t，2H，J＝7.7)，7.10(m，2H)，6.80(tt，11H，J＝8.8， 2.3Hz)。¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ 192.0，164.8，162.3，143.0，139.8， 137.1，132.9，129.9，127.9，110.4，103.5。C₁₃H₈F₂O(M+H)的HRFABMS 理论值为219.0620，实测值为219.0621。正相HPLC保留时间：8.9 分钟。反向HPLC保留时间：13.7分钟。>99％纯。

3′，5′-二氟-4-甲酰基联苯(55)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 9.98 (s，1H)，8.02(dd，1H，J＝7.8，1.5Hz)，7.65(td，1H，J＝7.3，1.4Hz)，7.54(t， 1H，J＝7.8Hz)，7.40(dd，1H，J＝7.6，1.2Hz)，6.90(m，3H)。¹³C NMR (CDCl₃，100MHz)δ 191.5，164.1，161.6，143.4，141.3，134.0，133.7， 130.6，129.0，128.3，113.3，103.8。C₁₃H₈F₂O(M+H)的HRFABMS理论 值为219.0620，实测值为219.0621。正相HPLC保留时间：7.0分钟。 反向HPLC保留时间：13.4分钟。>99％纯。

可以使用多种体外实验评价所述化合物稳定甲状腺素运载蛋白 四聚体或防止纤维形成的能力。所述实验可包括纤维形成测定、血浆 选择性测定、甲状腺素运载蛋白：化合物复合物三维结构测定(例如通 过X-射线晶体学)、甲状腺素运载蛋白四聚体解离或纤维形成的动力 学，以及通过例如离心或热量测定法测定甲状腺素运载蛋白：化合物 相互作用的化学计量和能量学。以下给出了代表性体外测定的详述。

每种化合物都进行滞止纤维形成测定。化合物经P₂O₅干燥过夜， 并用DMSO溶解至7.2mM终浓度，获得一级原液(10×原液)。用 DMSO将一级原液稀释5倍，至终浓度为1.44mM，获得二级原液(2× 原液)。在抑制剂(1.44mM)存在时如下检测TTR(3.6μM)的酸介导淀 粉样蛋白变性：向一次性UV比色皿中加入495μL的0.4mg/mL野 生型TTR蛋白的10mM磷酸钠、100mM KCl和1mM EDTA溶液(pH 7.6)，以及5μL的1.44mM抑制剂DMSO溶液的二级原液(2×原液)。 涡旋混合物，并温育30分钟(25℃)，此时用500μL的200mM乙酸、 100mM KCl和1mM EDTA溶液(pH 4.2)将pH降低至4.4。涡旋最终 的1mL溶液，在不搅拌的情况下于37℃温育72小时。72小时后， 涡旋比色皿以悬浮存在的任何纤维，使用UV-可见分光光度计于350 和400nm检测悬浮液的浊度。观测的每个TTR加抑制剂样品的浊度 比上以同样方式制备的无抑制剂样品的浊度，乘以100，得到纤维形 成的百分率。使用1×二级原液如上进行使用等摩尔抑制剂和TTR浓 度(3.6μM)的纤维形成测定。用DMSO将7.2mM 10×一级原液稀释 10倍至终浓度为0.72mM，制备1×原液，将其用于如上所述的纤维 形成测定。所有测定都平行进行三次，使用野生型TTR测定全部化 合物。通过测定无野生型TTR时溶液的浊度，发现所有化合物在整 个实验过程中都是可溶的，确保了浊度由TTR淀粉样蛋白形成所产 生。

通过抗体捕获/HPLC法评价潜在抑制剂在血浆中结合TTR的化 学计量。在评价时，将1.0mL人血浆和7.5μL抑制剂的1.44mM DMSO溶液装入1.5mL Eppendorf管中。溶液于37℃温育并温和震 荡24小时。将猝灭琼脂糖的1:1凝胶:TSA(Tris盐水)浆(125μL)加入 溶液中，于4℃温和震荡1小时。将溶液离心(16,000×g)，将上清液 分为400μL两等份，然后将其加入不同的200μL抗-TTR抗体缀合 琼脂糖的1:1凝胶:TSA浆样品中。溶液于4℃温和震荡20分钟，离 心(16,000×g)，去除上清液。用1mL TSA/0.05％皂苷于4℃洗涤凝胶 (3×，各10分钟)，接着用1mL TSA于4℃洗涤凝胶(2×，各10分钟)。 样品离心(16,000×g)，去除最终的洗涤液，加入155μL的100mM三 乙胺(pH 11.5)，将TTR和结合的抑制剂由抗体上洗脱下来。于4℃温 和震荡30分钟后，离心(16,000×g)洗脱的样品，取出145μL含TTR 和抑制剂的上清液。然后通过先前描述的反相HPLC分析上清液。参 见例如Purkey，H.E.；Dorrell，M.I.；Kelly，J.W.Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.2001，98，5566-71，该文献通过引用整体结合到本文中。

以悬滴法用2M硫酸铵平衡7mg/mL蛋白溶液(其100mM KCl、 1mM EDTA、10mM磷酸钠，pH 7.0，0.35-0.50M硫酸铵的溶液)， 由蛋白溶液获得野生型TTR晶体。用10倍摩尔的过量配体浸泡晶体 3周以上，制备TTR-配体复合物。联合使用CCD-PXL-L600检测器 (Bruker instruments)和RU200旋转式阳极X-射线发生器收集20或26 浸泡晶体的数据。使用14-BM-C，BIOCARS，Advance Photon Source 的单色高能源Quantum-4检测器收集1或18浸泡晶体的数据。将晶 体置于冷冻保护剂Paratone油中并冷却，以进行衍射实验(20和26 为120K，1和18为100K)。TTR·配体复合物晶体结构和脱辅基晶 体(apo crystal)为同晶型，晶胞大小接近a＝43，b＝85和c＝66； 空间群为P2₁2₁2，不对称单位含两个单体。使用DENZO和 SCALEPACK简化1和18的数据集。参见Otwinowski，Z.；Minor，W. Macromolecular Crystallography，A部，载于Methods in Enzymology； Carter，C.W.，Sweet，R.M.主编，Academic Press：1997；276卷，307-326 页，该文献通过引用整体结合到本文中。使用SAINT和PROSCALE (Bruker AXS，Inc.)简化20和26的数据集。

在利用EPMR进行分子置换检索的过程中，使用蛋白质数据库 的TTR蛋白原子坐标(登录号1BMZ)作为原型。通过CNS的分子力 学和能量最小化方案精修EPMR的最佳解决方案。获得的差值Fourier 图揭示，TTR四聚体的每个结合袋中都有配体结合(18、20和26的 两个构象，以及1的四个构象)。使用这些图谱，可以清楚定位配体 在密度图中的位置，将其纳入晶体学精修。几轮模拟退火以及随后的 位置和温度因子精修后，定位了差值Fourier图中水分子的位置。使 用根据振动/扭曲偏差去除法计算的无偏差加权电子密度图，进行最 后一轮图形拟合。所有的配体结合构象都与没有抑制剂时定相的无偏 差退火省略图以及振动/扭曲无偏差加权图十分一致。利用Refmac约 束精修法进行最后一轮精修。因为在最终图中没有可解释的电子密 度，所以9个N-端残基和3个C-端残基没有包括在最终模型中。晶 体学分析的总结示于表2。参见例如Kissinger，C.R.；Gehlhaar，D.K.； Fogel，D.B.Acta Crystallogr.，Sect.D 1999，55，484-491；Brunger，A.T. 等；Acta Crystallogr.，Sect.D 1998，54，905-921；Kantardjieff，K.等；Acta Crystallogr.，Sect.D 2002，58，735-743；Bailey，S.Acta Crystallogr.，Sect. D 1994，50，760-763；和Murshudov，G.N.；Vagin，A.A.；Dodson，E.J. Acta Crystallogr.，Sect.D 1997，53，240-255，这些文献的每一个都通过 引用整体结合到本文中。

通过相连的尿素中单体解折叠评价TTR四聚体解离动力学。远 紫外CD分光法未检测到缓慢的四聚体解离，但其与如前所述的远紫 外CD易于检测的快速解折叠步骤(快500,000倍)相连。通过向已加 入127.4μL磷酸缓冲液的69μL野生型TTR(2.90mg/mL，10mM磷 酸钠，100mM KCl，1mM EDTA，pH 7.0)中加入3.6μL 1mM的目 标抑制剂溶液(乙醇溶液)，评价随抑制剂(3.6μM)变化的TTR四聚体 (3.6μM)解离动力学。因为抑制剂浓度(7.2μM)两倍于TTR浓度(3.6 μM)，所以将7.2μL 1mM目标抑制剂溶液(乙醇溶液)加入至已加入 123.8μL磷酸缓冲液的69μL野生型TTR(2.90mg/mL，10mM磷酸 钠，100mM KCl，1mM EDTA，pH 7.0)中。将100μL的目标蛋白- 抑制剂溶液加入到600μL 10.3M尿素和300μL磷酸缓冲溶液中，产 生的最终尿素浓度为6.5M。涡旋溶液，以如下间隔收集圆二色性光 谱：0、5、8、23、46、71、95、118、144和168小时。制备含7.2μL 乙醇而不是抑制剂的对照样品进行对比，并以上文确定的时间点收集 光谱。扫描每0.5nm、平均时间10秒收集220和213nm之间的CD 光谱。每个波长扫描一次。对220和213nm之间的振幅值取平均值， 以测定整个实验中β-折叠的损失程度。

通过浊度监测pH 4.4时酸介导的纤维形成速率。化合物经P₂O₅过夜干燥，并用DMSO溶解至终浓度7.2mM，获得一级原液(10×原 液)。用DMSO将一级原液稀释5倍，至终浓度为1.44mM，制备二 级原液(2×原液)。使用7.2μM浓度抑制剂和3.6μM TTR(四聚体)， 如下进行纤维形成测定：向一次性UV比色皿中加入495μL的0.4 mg/mL野生型TTR蛋白的10mM磷酸钠、100mM KCl和1mM EDTA 溶液(pH 7.6)，以及5μL的1.44mM二级抑制剂原液(2×原液)。涡旋 混合物，并温育30分钟(25℃)。30分钟后，用500μL的200mM乙 酸、100mM KCl、1mM EDTA(pH 4.2)将pH降至4.4。涡旋最终的1 mL溶液，并于37℃不搅拌温育。涡旋溶液，检测350和400nm的 浊度。酸化后以如下间隔收集UV光谱：0、4、8、24、48、72、96、 120、144、168和192小时。制备含5μL DMSO的对照样品进行对 比，并以上述时间点收集光谱。每种抑制剂溶液都制备成10个的组， 以防止读数前存在比色皿干扰。获得UV吸光度后，废弃对应于该时 间点的比色皿。使用1×二级抑制剂原液如上所述进行使用等摩尔(3.6 μM)浓度TTR和抑制剂的纤维形成测定，所述1×二级抑制剂原液制 备方法如下：用DMSO将7.2mM 10×一级原液稀释10倍至终浓度为 0.72mM，将其用于上述纤维形成测定。结果发现所有化合物在整个 实验过程中都是可溶的，确保了浊度由TTR淀粉样蛋白形成所产生。

分析存在抑制剂的情况下pH 4.4时的TTR四级结构。在3.6μM 或7.2μM抑制剂存在时，在滞止纤维形成测定条件下，将蛋白(3.6μM) 温育72小时，评价18和20稳定TTR的机制。72小时后，离心 (14,000×g)样品，从测定中形成的任何固体去除上清液。用Beckman XL-I分析型超速离心机进行平衡和速度超速离心分析。如前述进行 数据的获取和分析。参见例如Lashuel，H.A.；Lai，Z.；Kelly，J.W. Biochemistry 1998，37，17851-64；和Lashuel，H.A.等；Biochemistry 1999，38，13560-73，这些文献的每一个都通过引用整体结合到本文 中。

使用Microcal instrument(Microcal Inc.，Northhampton，MD)，通过 等温滴定量热法，测定为18和20与野生型TTR结合的特征的解离 常数。制备抑制剂溶液(300μM或500μM的25mM tris缓冲液，100 mM KCl，1mM EDTA，12％ EtOH，pH 8.0)，并滴定入含野生型TTR (15μM或25μM的25mM tris缓冲液，100mM KCl，1mM EDTA， 12％ EtOH，pH 8.0)的ITC池中。首先注射2.5μL，接着以每次5.0μL 注射50次(25℃)。扣除本底后对温谱图积分，获得结合等温线，其 与具有负协同性的两个连续结合位点模型拟合得最好。使用Microcal 提供的ORIGIN 2.9版的ITC数据分析模块，利用具有四个可调节参 数(即K₁、ΔH₁、K₂、ΔH₂)的非线性最小二乘法拟合数据。

使用浊度测定评价为TTR淀粉样蛋白纤维化抑制剂的所述化合 物。通过酸化用抑制剂预温育(25℃，30分钟)的TTR，使用加入后将 pH跳至最终值4.4的缓冲液，开始野生型TTR淀粉样变性。每种混 合物温育72小时(37℃)后，使用UV-可见分光光度计检测350和400 nm的浊度。将无抑制剂时的野生型TTR淀粉样变性指定为100％纤 维形成，所有的淀粉样蛋白纤维形成数据都对此值归一化。因此，5％ 纤维形成相当于72小时后化合物抑制野生型TTR纤维形成达95％。 首先对3.6μM浓度TTR四聚体评价7.2μM浓度的每种潜在抑制剂。 以等于TTR浓度(3.6μM)的浓度再评价使纤维形成低于15％的化合 物，以选择高效抑制剂。在这些条件下纤维形成低于40％表征为极好 抑制剂，而40-70％抑制表示为适中化合物。纤维形成数据示于表1。

表1：化合物对纤维形成的作用

根据化合物2-55的抑制剂效力数据，似乎与二卤代官能化疏水 环直接连接的羧基取代亲水环足以获得极佳的活性(表1)。酚取代基 代替羧基(2-10)变成活性低得多的抑制剂，远次于母体化合物1。在 疏水环的邻位或间位具有卤素的抑制剂优于没有卤素或具有单一对 位卤素的化合物。这提示对位卤素不以与间位和邻位卤代联芳化合物 相同的方式填补HBP。完全去除所有卤素得到的抑制剂极差，估计 是没有立体互补来填充卤素结合袋(例如化合物10、21-22、27、42-44 和51-53)。在测试条件下，最好的酚化合物(8)劣于在亲水环上同时具 有酚和羧基官能团的1。以单羧基稳定的联芳化合物(例如11-22)可能 是极佳的淀粉样蛋白纤维化抑制剂，例如化合物11、12、15-20。这 些化合物与二氟尼柳竞争抑制，那些仅含有对位卤素的化合物(例如 化合物13和14)是例外。间位或对位取代的芳基羧酸可能足以赋予极 佳的抑制特性，提示1的羟基取代基不是良好抑制剂活性所必须的。 另外，对位羧基定位似乎产生更好的抑制剂，表明对位羧基能更好地 利用与Lys 15和15′的ε-铵基之间的静电作用(正向结合模式)，如20 的情况，或者能更好地利用与Ser 117和117′羟基的氢键键合作用(反 向结合模式)，如18的情况。疏水环由卤素在对位以外的位置取代且 亲水环具有间位和(特别是)对位羧基的联芳化合物是高效的TTR淀 粉样蛋白纤维形成抑制剂。

向含羧基取代基的环加入羟基取代基(水杨酸取代，例如23-27) 也可以获得类似于二氟尼柳的高活性抑制剂。对于具有水杨酸核的联 芳化合物，卤素的确切位置似乎不是和先前的情况一样至关重要，提 示此环对结合能的贡献不成比例。对位羟基可能参与和Lys 15和15′ 的ε-铵基(正向结合模式)或Ser 117和117′羟基(反向结合模式)的氢键 键合。氯取代1中的氟(26)可获得活性相等或更好的抑制剂，而完全 去除卤素(27)可获得适中的抑制剂。应当指出的是，27在体外仅略优 于对位羧酸22，而它们两个都优于在间位具有羧基的无卤素抑制剂 21和含羟基类似物10。

在含卤素环上包含3′，5′-二卤代-4′-羟基取代基和在对位或间位 具有羧基(28-31)可获得类似于二氟尼柳的高抑制剂活性。包含4-羟基 取代基更精确地模拟TTR的天然配体甲状腺素。这些抑制剂还可以 更精确地模拟甲状腺素激素活性，因此可以作为甲状腺激动剂或拮抗 剂，该作用是不需要的。

将羧基保护为甲酯或将羟基保护为甲醚(32和33)得到的抑制剂 劣于1。结合电荷损失和空间体积增大或许可以解释这些观测结果。 去除所有的亲水取代基(例如34-38)得到的抑制剂极差。仅含间位氯 取代基的联芳化合物(例如38)是适中的抑制剂，提示与含氟联芳化合 物(37)相比，氯增强卤素结合袋中的接触。

合成几种含氯抑制剂，评价其TTR纤维化抑制活性。当此类抑 制剂成员在间位或对位含有羧基(例如45和46)时，它们可具有高活 性，而具有邻位羧基的成员(例如47)可能是较差的抑制剂。此观察结 果提示邻位羧基可能离Lys 15和15′ε-铵基太远，以至于不能产生良 好的静电作用(正向结合模式)，或者离Ser 117和117′羟基太远，以 至于不能进行氢键键合作用(反向结合模式)。苄醇48-50令人惊奇地 证实为极佳的纤维形成抑制剂。一个环上的间位二氯取代似乎由邻 位、间位或对位的苄醇官能团补偿，潜在的原因是氢键键合或水介导 的氢键键合。一系列-CH₂OH基团由醛官能团取代的醛类似物(39-41) 显示出良好的抑制性，对位醛41是例外，这可能是由于醛水合为偕 二醇的作用。醛、苄醇和羧酸可能经不同机制结合在所述袋。但是， 在没有结构信息时，不能排除相似的结合模式。醛也有可能通过半缩 醛共价结合Ser 117(117′)或通过亚胺键共价结合Lys 15(15′)。在醛化 合物情况下由氟取代氯(54和55)获得的抑制剂相当差(39和41)。如 前所述，完全去除卤素获得的抑制剂活性较差(42和44)，只有间位 醛43具有适中活性是个例外。此适中活性可能源自高度的水合作用。 令人惊奇的是，3′，5′-二氟-间位醛(54)劣于没有卤素的醛(42)。

对于以和TTR(3.6μM)相等的浓度保持TTR纤维形成低于50％ 的抑制剂，进一步评价其选择结合TTR超过血浆中所有其它蛋白的 能力。血液中的二氟尼柳在单剂500mg后20小时可超过30μM，或 者在相同剂量后4小时可超过300μM。尽管此高水平的持续血浆浓 度提示极佳的生物利用度，但选择性更强的抑制剂将容许更低的剂量 和潜在更少的副作用；因此，将此抑制剂的亚类以10.8μM终浓度(人 血浆中的平均TTR浓度大约为5μM)与人血浆温育。然后使用树脂结 合抗体捕获TTR，用TSA(tris盐水)/0.05％皂苷溶液洗涤固定化的 TTR三次，接着用TSA洗涤两次。用100mM三乙胺(pH 11.5)将TTR- 抑制剂复合物由树脂上释放下来，通过反向HPLC分析测定存在的抑 制剂对TTR的化学计量。每个TTR四聚体最大可结合2当量抑制剂。 表1总结了洗涤后的血浆结合化学计量，结果显示下限源自与洗涤相 关的损失。

含氯联苯化合物在人血浆中可选择性结合TTR(平均化学计量 为0.8，理论最大化学计量为2.0，参见表1)。观测到的所有测试抑制 剂的平均化学计量为0.4。在含氟抑制剂中，18和20分别表现出非 常好和可接受的TTR结合选择性，优于相似条件下1所显示的0.13 化学计量。表1报告的化学计量值可代表下限，原因是TTR螯合在 多克隆抗体树脂上时抑制剂的洗涤相关损失。39和41的TTR结合选 择性结果应当慎重考虑，因为如上所述这些化合物可能共价连接至 TTR。

这些抑制剂在体外表现出极佳的TTR淀粉样蛋白纤维抑制数 据，还表现出较差的血浆选择性，它们可能优先结合白蛋白中的药物 结合位点和/或血浆中存在的其它蛋白中的相似位点。这样的抑制剂 未必能够在类似于血浆或CSF的复杂环境中防止TTR错折叠和淀粉 样变性。

通过用10倍摩尔过量抑制剂浸泡TTR晶体三周以上，获得结合 TTR的1及其三种类似物26、18和20的高分辨率X射线共晶体结 构。表2概述了晶体学统计数据。

表2：晶体学统计数据

二氟尼柳(1)以正向和反向两种方式结合TTR。在TTR的每个激 素结合位点中都发现二氟尼柳的四个不同结合构象具有大致相同的 占有率—正向和反向结合方式各自都具有两种对称等价结合方式。二 氟尼柳的联苯体系变得远离激素结合袋的中心，并占据两个不同位 置，在TTR的激素结合袋形成电子密度的“V”型锥体。这种结合模 式同时增强了抑制剂和由Leu 17、Ala 108、Leu 110、Thr 119和Val 121 形成的TTR疏水袋之间的疏水作用和范德华作用。羧基和内部结合 袋中的Thr 119侧链氧以及Ala 108主链氧之间的氢键作用增进了二 氟尼柳的反向结合模式。令人惊奇的是，Ser 117既没有参与多个构 象，也没有与抑制剂形成任何静电作用。在反向结合模式中，二氟尼 柳的一个氟取代基在Thr 119侧链氧的氢键键合距离之内(3.3)。在 外部结合袋中，Lys 15′侧链原子的电子密度仅在低∑水平可见，表明 其可能在一个以上的构象中。Lys 15残基的最可能构象被建模在正向 结合模式中二氟尼柳羧基的氢键键合距离内。

化合物20以正向结合模式结合TTR，羧基取代的亲水环朝向外 部结合袋，以和Lys 15和15′产生静电作用。氟化芳环位于内部结合 袋中，其中卤素位于HBP 2和2′。令人感兴趣的是，对两个结合位 点的严格检查表明联苯环方向存在显著差异。苯环平面之间的夹角由 一个结合部位的32.6度变至另一个结合部位的63.8度。该观测结果 可能是20和TTR负协同结合的结果。

化合物18以反向模式结合TTR，羧基取代的亲水芳环朝向内部 结合袋，在Ser 117和Ser 117′的氢键键合距离之内。芳环相互之间旋 转34度，以利用和Leu 17、Ala 108、Val 121和Thr 119的疏水作用。 氟位于卤素结合袋1和1′中。预期反向结合模式不是如此，而是羧基 位于外部结合袋中，以利用与Lys 15和15′的静电作用，氟螯合至卤 素结合袋2和2′中。但是，反向结合模式并不是完全出乎意料，先前 观测到双氯芬酸(联芳胺)和几个双氯芬酸类似物就是如此。

二氟尼柳中氯代替氟导致26与TTR结合的显著差异。化合物 26以反向结合模式结合TTR，羧基取代的芳环朝向内部结合袋，而 氯螯合至卤素结合袋2和2′中。同18和20一样，化合物26也占据 激素结合袋的中心。TTR原体的残基Ala 108、Lys 15、Leu 17、Leu 110、 Lys 17和Thr 119与抑制剂形成范德华作用和疏水作用。在内部结合 袋中，Ser 117的侧链以两种构象存在，以和26的羧基取代基以及其 它单体的Ser 117作用。26的同一个羧基氧也与Ser 117的主链氧形 成氢键。26的另一个羧基氧与Ala 108的主链氧形成氢键。与二氟尼 柳相反，Thr 119残基背向抑制剂，对结合袋的疏水性而不是与抑制 剂的氢键键合起作用。

为进一步探究这些抑制剂的作用机制，评价其稳定TTR抗随时 间变化的尿素诱导解离的能力。将四聚体解离速率与不可逆地、快速、 易于监测、使用单体能再折叠浓度以上尿素浓度的单体解折叠相关 联。在6.5M尿素中以远紫外-CD探测解折叠监测的解离，结果表明 酸介导淀粉样变性的所有优秀抑制剂都以剂量依赖方式减慢四聚体 解离速率(图2A和2B)。某些抑制剂，包括20、46和48，显示出对 淀粉样变性的限速步骤TTR四聚体解离的巨大作用。参见例如 Hammarstrom，P.等；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002，25，16427-32，该 文献通过引用整体结合到本文中。

因为猜想这些化合物抑制TTR纤维形成的模式是通过基态稳定 化剂量依赖性地调整四聚体解离屏障，所以最好的抑制剂应当将四聚 体解离减慢得最多。以最终pH 4.4时的浊度监测192小时内纤维形 成的速率。参见图3A、3B、4A和4B。在低pH能够稳定四聚体TTR 的抑制剂防止四聚体解离、错折叠和错组装成淀粉样蛋白。最好的淀 粉样蛋白纤维形成抑制剂将四聚体解离减慢得最多(图2A和2B)。但 是，关联不完全，因为某些抑制剂在尿素中比在酸性条件下结合得更 好，反之亦然。

为确保抑制剂稳定四聚体形式的TTR(3.6μM)，用平衡和速度分 析性超速离心研究探测TTR的四级结构。测定与18和20(3.6μM或 7.2μM)于pH 4.4温育72小时后的蛋白四级结构。在平衡AUC以及 速度研究中，3.6μM和7.2μM抑制剂浓度时四聚体都是主导形式。

使用等温滴定量热法(ITC)测定18和20与TTR在pH 8.0(25℃) 时的结合常数。二氟尼柳和两种类似物负协同性结合TTR，这是许多 其它配体表现出的特征。对于二氟尼柳和20，第一个部位的结合比 第二个部位的结合强15倍。联芳化合物18的K_d1大约比K_d2低120 倍(表3)。表3概述了通过ITC测定的1、18和20与野生型TTR结 合的第一和第二解离常数。1的结合常数先前已报道，本文提供其是 为了进行对比。参见实施例1。

表3：化合物结合野生型TTR的解离常数

四聚体野生型TTR解离的t_1/2为42小时，解折叠快500,000倍。 因此，通过与在6.5M尿素中的不可逆解折叠相关联，可探测其解离 速率。因为四聚体解离是淀粉样蛋白变性的限速步骤，所以如果推测 的通过选择性结合天然状态而使动力学稳定的作用机制是正确的，那 么所有表现出极佳的体外活性和血浆中的结合化学计量超过0.50的 抑制剂都应当减慢四聚体解离(参见图2A和2B)。

在168小时时程内，在6.5M尿素中，检测随抑制剂浓度变化的 TTR四聚体解离速率。选择的抑制剂，具体地说是18、20、39、41、 45、46、48和49，如振幅变化反映的，证实在160小时内四聚体解 离程度相比于无抑制剂的TTR全面下降。如时程斜率下降反映的， 抑制剂存在时四聚体解离速率也急剧减慢。抑制剂20、45、46和48 较好，推测是由于其在尿素中的高结合性而与TTR·I和TTR·I₂非常缓 慢地解离。基本上对于20、45、46和48来说，由于TTR·I和TTR·I₂这些复合物的K_d低，所以形成TTR·I和TTR·I₂可显著稳定天然状态， 并增加四聚体解离的动力学屏障。即使16和18结合TTR，似乎其亲 和性也不足以影响动力学稳定。可能有意义的是，3.6μM抑制剂浓 度(3.6μM蛋白)时尿素中抑制剂效力的排列顺序是20≈45>46≈48， 这与7.2μM抑制剂浓度不同(20≈46>45≈48)。这可能反映出尿素中 K_d2值的差异。

天然状态的动力学稳定是一种有吸引力的治疗策略，因为有新证 据表明错折叠的寡聚物无论开启还是关闭淀粉样蛋白途径都具有神 经毒性。用抑制剂实现动力学稳定可为SSA、FAP和FAC提供非侵 入性治疗。

给定抑制剂存在时尿素中的四聚体解离速率未必总能预测出抑 制剂在低pH时防止淀粉样变性的能力。因为迄今还不清楚人体中的 淀粉样蛋白怎样和在哪里形成，所以在各种变性环境中发挥功能的 TTR四聚体稳定剂比较理想。在酸性条件下探测随抑制剂浓度变化的 TTR纤维形成速率(图3A、3B、4A和4B)。抑制剂20、45和48在 此环境中预期也表现良好。抑制剂46作为四聚体抑制剂在尿素中比 在酸中更好，而1在酸中比在尿素中好得多。与在给定环境中形成 TTR·I和TTR·I₂复合物相关的稳定自由能决定了基态稳定程度和四聚 体解离活化自由能的相关增加程度。这些数据提示抑制剂在低pH减 慢TTR淀粉样变性远比它们在6.5M尿素中减慢TTR四聚体解离有 效。这可能是因为淀粉样变性需要在解离后浓度依赖性再组装。更有 效的抑制剂可将TTR单体淀粉样变性中间体的浓度保持在足够低的 水平，以使纤维形成基本无效。正如在抑制剂存在时TTR的尿素变 性中观察到的一样，低pH时抑制剂效力的等级排序明显在3.6μM抑 制剂(图3A和3B)和7.2μM抑制剂(图4A和4B)浓度中不同。此观测 结果可能反映出低pH时各种抑制剂K_d2值的差异。最引人注目的实 例是二氟尼柳——由于其K_d2较高，所以3.6μM时它是最有效的纤 维形成抑制剂之一，但7.2μM时其是最低效的抑制剂之一。

二氟尼柳类似物代表着一类有前途的治疗TTR淀粉样变性的化 合物。尽管某些双氯芬酸类似物是非常好的纤维形成抑制剂，但二氟 尼柳类似物提供了另外一类高效TTR四聚体稳定剂。某些双氯芬酸 类似物有能力抑制两种TTR突变体-Val30Met和Leu55Pro的解离和 错折叠导致的纤维形成。X-射线共晶体结构表明双氯芬酸类似物主要 以反向结合模式结合，但是，二氟尼柳类似物结构轻微变化就可以容 许正向或反向结合。另外，二氟尼柳能够以正向或反向结合方式结合， 两种方式的占有率几乎相等。获得的双氯芬酸解离常数(K_d1为60nM， K_d2为1200nM)与获得的二氟尼柳和20的解离常数相当，而18根据 其K_d1值证实其第一结合要牢固接近10倍。另外，两种抑制剂类型 都表现出负协同结合。更值得注意的是，某些二氟尼柳类似物对人血 浆中TTR的选择性很高，具有降低毒性和副作用的潜力。参见Oza，V. B.等；J.Med.Chem.2002，45，321-32。

合成的28种化合物基本可抑制TTR淀粉样变性。其中几种显示 在人血浆中的结合化学计量超过0.50当量。较好抑制剂的氯化和氟 化芳基结构都已在已知药物中发现，因此，有充分理由相信可将这些 化合物或其类似物开发成不表现出1的NSAID活性的药物。氟化化 合物18和20可在6.5M尿素中结合并稳定四聚体TTR，急剧减慢错 折叠和淀粉样变性的第一步TTR四聚体解离。这些化合物以及其它 化合物还急剧减慢酸介导的TTR淀粉样变性。在测试的化合物中， 18、20、39、41、45、46、48和49在尿素和酸性条件下将TTR四聚 体稳定得最好。这些联芳化合物似乎通过基态稳定化增加与淀粉样蛋 白形成的限速步骤四聚体解离相关的活化障碍。

实施例3：口服给予的二氟尼柳稳定甲状腺素运载蛋白抗变性

甲状腺素运载蛋白(TTR)是转运甲状腺素和全视黄醇结合蛋白 的同源四聚体蛋白质。在变性条件下，限速性四聚体解离和快速的单 体错折叠能够将其错组装成引起老年性系统性淀粉样变性、家族性淀 粉样多神经病和家族性淀粉样心肌病的淀粉样蛋白。已知二氟尼柳结 合TTR中两个未被占据的甲状腺素结合位点中的至少一个，以此稳 定TTR四聚体，也增加了体外解离活化障碍。研究了使用二氟尼柳 治疗TTR淀粉样变性的可行性。

方法

在给出知情同意后招收30个健康志愿者(25个男性，5个女性)。 受试者年龄由23-53岁(平均年龄37.6±8.8)，平均体重78.0±12.1kg。 每个受试者用二氟尼柳以125、250或500mg每天两次(每 12小时)的剂量治疗7天(共13剂)。在治疗前1天和第8天、以及摄 入二氟尼柳后第4和12小时采血。该研究设计方案得到Scripps临床 受试者委员会、Scripps绿色医院、Scripps研究所和Scripps综合临床 研究中心的批准。

检测血清二氟尼柳水平。将100μL血清加入900μL乙腈中沉淀 蛋白质。离心后，将100μL上清液加入到900μL的100mM三乙胺 水溶液(pH 11.5)中。过滤后，将100μL的各样品注入Keystone 3厘 米C18反相柱，该柱在10分钟内使用40-100％梯度的溶液B(溶液A： 94.8％水/5％乙腈/0.2％三氟乙酸；溶液B：94.8％乙腈/5％水/0.2％三氟 乙酸)，由Waters 600E多元溶剂传送系统操控。用Waters 486可调吸 光度检测器于280nm完成检测，积分峰，根据标准曲线获得二氟尼 柳浓度。

分析二氟尼柳结合人血清中TTR的化学计量。将Sepharose的 1:1凝胶/10mM Tris·HCl，pH 8.0/140mM NaCl/0.025％NaN₃(TSA)浆 (62.5μL)加入到500μL血清中，并于4℃温育1小时。离心后，将 400μL上清液加入到200μL抗TTR抗体缀合的Sepharose的1:1凝 胶/TSA浆中，于4℃缓慢摇动20分钟。离心后，于4℃用1mL TSA/0.05％皂苷(Fisher Scientific)洗涤凝胶(两次，各10分钟)，再用1 mL TSA洗涤(一次，10分钟)。然后加入155μL的100mM三乙胺水 溶液(pH 11.5)，以将TTR和结合的二氟尼柳从抗体上洗脱下来。于4 ℃温和摇动30分钟后，离心样品，取出145μL上清液。分离出135-μL 注射样品，并如先前所述进行分析(Purkey等，Proc Natl Acad Sci USA 2001；98：5566-71)。

评价血清TTR四聚体对尿素变性的稳定性。10μL血清样品在 90μL含各种浓度尿素的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0；100mM KCl、1 mM EDTA、1mM DTT)中温育(25℃)。用折射率检查尿素浓度，以确 认按据重量制备的浓度。通过加入10μL戊二醛(25％)实现蛋白的戊 二醛交联。交联反应进行4分钟，然后加入10μL NaBH₄(7％的0.1M NaOH溶液)猝灭。将样品与120μLSDS还原性凝胶上样混合物(SDS 终浓度＝2.5％)混合，并煮沸5分钟。使用12％ SDS-PAGE分离样品， 使用抗-TTR抗血清通过免疫印迹分析凝胶(Purkey等，同上)。

评价血清TTR四聚体对酸变性的稳定性。10μL血清样品与90 μL的100mM酸性缓冲液温育(37℃)。当最终pH要求≤3.8时使用 柠檬酸缓冲液；评价时的pH范围为4.2-5.4时使用乙酸缓冲液。交联 后，如上所述通过SDS-PAGE和免疫印迹分析样品。

用含TTR和氨苄青霉素抗性基因的pmmHα质粒转化BL21/DE3 Epicurian gold大肠杆菌(Stratagene)，以该菌株表达重组野生型TTR 和变异体。如前所述(Lashuel等，Biochemistry 1999；38：13560-73)进行 表达和纯化。

用圆二色性光谱法检测TTR四聚体的解离速率。使用重组TTR (3.6μM)样品的6.5M尿素溶液进行四聚体解离速率的评价，6.5M尿 素浓度是位于三级结构变化的过渡后区间中的浓度(等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002；99：16427-32)。通过与快速的三级结 构变化相关联，检测随时间变化的TTR远紫外CD光谱(210-220nm)， 由此评测缓慢的四聚体解离速率。

如下进行纤维形成测定。用100mM酸性缓冲液以1:1稀释重组 TTR原液(7.2μM)。当最终pH要求≤3.8时使用柠檬酸缓冲液；评价 时的pH范围为4.2-6.0时使用乙酸缓冲液，pH 6.5时评价淀粉样变性 使用磷酸缓冲液。样品在酸化后不搅拌于37℃温育72小时。通过于 400nm检测浊度探测纤维形成的程度。

如下检测纤维形成动力学。将重组TTR溶液(7.2μM)与等体积的 100mM乙酸缓冲液混合，获得的最终pH为4.4。样品于37℃温育， 监测168小时时程内的400nm浊度。每个时间点准备单独的样品。

通过将二氟尼柳加入到温育3小时(37℃)的TTR溶液中，然后使 蛋白经受尿素变性或pH介导的淀粉样蛋白变性，以此评价二氟尼柳 对尿素介导的四聚体解离和pH介导的纤维形成的作用。

结果

通过HPLC检测摄入第13剂后4和12小时的平均血清二氟尼柳 浓度，125mg每天两次的组别为20.1±7.1和6.9±3.0μM，250mg每 天两次的组别为233.5±76.0和145.8±38.9μM，而500mg每天两次的 组别为517.0±79.5和421.9±78.1μM。99％以上的二氟尼柳是蛋白结 合的。250mg每天两次和500mg每天两次的组别观测到的这些浓度 比血清中的TTR浓度高很多(3.6-7.2μM)，如果与竞争性蛋白(如对小 分子具有多个结合位点的TBG(0.3-0.5μM)和/或白蛋白(580-725μM)) 的结合不是高亲和性的，则产生的二氟尼柳化学计量接近最大值2。

为观察最大动力学稳定，二氟尼柳优选以至少1、理想值2的化 学计量在血液中结合四聚体TTR。为确定每个受试者二氟尼柳化学计 量的下限，我们如前所述(Purkey等，同上)用含有结合至固相树脂的 多克隆抗体的血清中免疫沉淀甲状腺素运载蛋白。洗涤固定化TTR 3 次，以消除非特异性结合，由树脂解离TTR-二氟尼柳复合物，采用 标准曲线以HPLC测定二氟尼柳化学计量。在摄取后4和12小时在 血清中二氟尼柳结合TTR的化学计量在125mg每天两次的组别为 0.45±0.11和0.31±0.12，250mg每天两次的组别为1.12±0.08和 0.95±0.13，而500mg每天两次的组别为1.51±0.09和1.48±0.08。二 氟尼柳化学计量随其血清浓度(最高约300μM)增加。这比预期的300 μM血清浓度时的最大化学计量1.5低，原因是方法局限(洗涤相关的 损失)和/或二氟尼柳与其它血浆蛋白结合，因此我们用重组TTR进行 二氟尼柳结合化学计量研究。洗涤相关损失解释了最大结合化学计量 1.5主要源自低亲和性位点的解离。二氟尼柳负协同结合TTR，因此 低亲和性位点的解离明显更快。根据由等温滴定量热法测定的解离常 数(K_d1，75nm；K_d2，1.1μM)计算缓冲液中预期的结合化学计量。将 计算的和实验测定的化学计量共同绘图，后者由免疫沉淀(3次洗涤) 和HPLC分析产生，图形使人们估测到250mg每天两次组别的真实 化学计量为1.75-1.91，提示可以使用该剂量。

对比受试者中(0.8-1)与重组TTR(1.5)的二氟尼柳(100μM)结合 化学计量，结果揭示明显结合TTR以外的血清蛋白，这提供了开发 更选择性结合TTR的二氟尼柳类似物的动机。所有组别给予二氟尼 柳后，TTR的血清水平都增加，总T₄和RBP的血清水平下降。这些 发现提示二氟尼柳影响TTR代谢。在研究中或研究后没有观察到明 显的副作用。但是，500mg每天两次组别的白蛋白血清水平显著下 降，BUN和肌酸酐水平略微增加。在250mg每天两次的组别中，白 蛋白的血清水平中度下降，BUN水平略微增加。

开发一种新方法来证明口服给予的二氟尼柳稳定血清TTR抗变 性压力，包括淀粉样蛋白变性。该方法可用作替代指标以鉴别应当预 防TTR错折叠疾病的化合物。通过加入尿素(0-9M)或加入酸(pH 3.8-5.4)使受试者全血清经受变性。因为TTR必须解离才能变性，所 以可使用四级结构变化来监测解折叠程度(等，同上)。 血清经受变性压力后加入戊二醛交联血清中的所有蛋白，以确定何种 TTR组分正常折叠(四聚体或二聚体)和变性(单体)。全血清 SDS-PAGE将交联的TTR四聚体和二聚体(这些表示折叠的TTR)和单 体分离开。免疫印迹能定量比较折叠TTR的量。多克隆抗体几乎不 结合解折叠的TTR单体以及折叠的TTR，因此其对比较有和没有二 氟尼柳时四聚体和二聚体条带的强度最有用。还可以通过该方法评价 二氟尼柳抑制TTR变性的时间相关性。在二氟尼柳存在时几乎不能 看出该过程的时间相关性，这强有力地支持了二氟尼柳稳定基态使四 聚体解离屏障无法逾越的动力学稳定机制(参见实施例1)。预计这些 变性时程中的二氟尼柳效力(250mg每天两次)比检测的化学计量 (0.8-1.2)更好，这提供了进一步的证据证明免疫沉淀法低估了实际的 结合化学计量，尤其当其超过1时。

已知人体中二氟尼柳结合化学计量的范围和在试管中模拟这些 化学计量所需的二氟尼柳浓度，这使得可以进行相关的体外生物物理 学研究，以探测TTR·二氟尼柳和TTR·二氟尼柳₂复合物防止解离和 淀粉样变性的机制。经研究，尿素介导(6.5M)的解离速率和酸介导(pH 4.4)的淀粉样蛋白纤维形成速率随二氟尼柳浓度(5、10、20和60μM) 变化，表现为剂量依赖性减慢。因为四聚体解离是淀粉样蛋白纤维形 成的限速步骤，因而推断尿素中的四聚体解离速率应当可以预示由酸 化介导的淀粉样蛋白纤维形成的程度。二氟尼柳抑制淀粉样变性比抑 制尿素介导的解离更佳，因为淀粉样变性也需要浓度依赖性再组装。 与二氟尼柳结合TTR相关的K_d1和K_d2在酸中也有可能比在尿素中 低。

80多种TTR突变体通过变性能量地形面的序列依赖性改变使个 体倾向于遗传性淀粉样变性。其中，V122I淀粉样蛋白沉积导致3-4％ 的非洲裔美国人患家族性淀粉样心肌病(FAC)，而V30M是家族性淀 粉样多神经病(FAP)的主要突变。二氟尼柳以剂量依赖方式同时抑制 V122I和V30M淀粉样变性的发生，证明该方法具通用性。

高度需要开发一种通用的、非侵入性的、改善TTR淀粉样变性 的治疗策略。本文概述的结果表明，口服给予二氟尼柳可通过结合和 稳定非促淀粉样变性天然状态减慢四聚体解离。根据最近的错折叠寡 聚物而不是淀粉样蛋白纤维化引起神经变性的报告，天然状态稳定是 特别吸引人的策略。二氟尼柳(250-500mg每天两次)对类风湿性关节 炎和骨关节炎的临床应用证明了其长期使用的低毒性。TTR血清半衰 期为12-15小时，因此每天两次给药似乎对已知的二氟尼柳半衰期 8-10小时最佳。二氟尼柳对抗SSA、FAC和FAP应当有效，因为其 同时结合野生型和变异体TTR，达到动力学稳定，类似于使TTR四 聚体包含反式抑制亚单位而不是由疾病相关亚单位组成所使用的、已 知改善人类疾病的机制。二氟尼柳由于其不能通过血脑屏障而可能对 CNS淀粉样变性无效，尽管二氟尼柳类似物(例如本文描述的类似物) 可能具有这种能力。

实施例4：羟化多氯化联苯选择性结合血液中的甲状腺素运载蛋白并抑制淀粉样变性

已知氯化联苯(PCB)是持久的环境污染物，据报道对啮齿类动物 有毒，并可能对人有毒。这些化合物在环境中的长期存在是由于其缓 慢降解和高亲油性，随着它们在食物链中上移而在生物体内累积和浓 缩。羟化PCB(OH-PCB)是P450单加氧酶氧化PCB形成的代谢物。 难以发现单种PCB化合物对人毒性的权威性数据，因为事实上市售 PCB一般是含许多不同异构体以及痕量已知毒素(例如氯化二苯并呋 喃)的混合物。但是，已经用实验动物证实了几种纯化PCB的毒性。 除了OH-PCB的雌激素样作用之外，骨质疏松、免疫毒性、神经毒性 和甲状腺激素水平低也与这些化合物的给予有关。

众多研究证实PCB和OH-PCB体外结合甲状腺素运载蛋白 (TTR)。已经表明，TTR在人血液中是蛋白靶，有助于OH-PCB在接 触个体中的存留。尽管众多的报告提示TTR在体内为PCB结合蛋白， 但没有确切证据表明PCB在血浆中结合甲状腺素运载蛋白。我们开 发的免疫沉淀法可用于评估生物体液中小分子与TTR结合化学计量 的下限。本文评价PCB和OH-PCB与人血浆TTR的TTR结合化学 计量。

需要限速四聚体解离、单体错折叠和错组装的血浆TTR分泌后 淀粉样变性导致老年性系统性淀粉样变性、家族性淀粉样心肌病和家 族性淀粉样多神经病。本文证实几种OH-PCB选择性结合人血浆中的 TTR，并通过导致天然状态部分或全部动力学稳定的四聚体稳定化抑 制淀粉样蛋白纤维形成。用X-射线晶体学鉴定了4种TTR·(OH-PCB)₂复合物，以更好地理解结合的分子基础，并提供最佳TTR淀粉样变 性抑制剂的设计基础。

PCB和OH-PCB对人血浆中甲状腺素运载蛋白的结合选择性

评价8种PCB(化合物1-8，图5)和14种OH-PCB(化合物9-22， 图6)的结合选择性，据报道这8种PCB从TTR上替换甲状腺激素， IC₅₀低于50nM，而这14种OH-PCB据报道是在小鼠或大鼠中结合 TTR或降低甲状腺素水平的已知PCB代谢物。使用共价连接至琼脂 糖树脂的多克隆TTR抗体，将其与用PCB或OH-PCB(10.8μM)预处 理的人血浆混合，以此确定血浆中PCB与TTR结合化学计量的下限。 洗涤后，通过反相HPLC评价PCB或OH-PCB与TTR(≈5μM)的结 合化学计量。

TTR四聚体中的两个相同甲状腺激素结合位点最多可结合两个 PCB。除了PCB 1和3之外，剩余的非羟化PCB显示出相对较低的 血浆TTR结合选择性(表4)。相反，OH-PCB显示出良好至极好的血 浆TTR结合选择性(表5)。某些羟化PCB(例如16和22)的结合化学 计量接近2。全血中OH-PCB的结合选择性非常类似于血浆中观测到 的结果，因此红细胞膜没有明显隔离所研究的OH-PCB。

表4：人血浆中PCB与TTR的结合化学计量

 

化合物结合当量31.50±0.4210.62±0.1260.19±0.1120.18±0.0350.06±0.0440.05±0.047未结合8未结合

表5：人血浆中羟化PCB与TTR的结合化学计量

 

化合物结合当量(血浆)结合当量(血液)161.86±0.14未检测221.67±0.401.69171.63±0.05未检测191.48±0.161.55211.40±0.221.33181.36±0.21未检测121.23±0.241.47111.12±0.221.20201.02±0.090.86100.96±0.090.93130.84±0.240.8690.83±0.190.57140.81±0.290.73150.70±0.170.56

抗体捕获TTR·PCB复合物可能由于5次洗涤步骤中PCB与TTR 的解离而低估了PCB的结合化学计量。PCB和OH-PCB(10.8μM)与 重组TTR(3.6μM)温育，以评价每次洗涤步骤后小分子结合固定化 TTR的化学计量。5次洗涤后PCB 2和OH-PCB 18降低化学计量达 10-17％，而PCB 4降低达45％。洗涤相关损失定量使人们可以估测 血浆中PCB和OH-PCB的真实结合化学计量。此外，OH-PCB结合 重组TTR的最终化学计量和血浆中结合TTR的量之间的良好关联表 明，OH-PCB 18之类的化合物在血浆中是高度选择性的TTR结合剂。 相反，PCB 2和4在缓冲液中比在血浆中具有更高的TTR结合化学 计量，这强有力地表明它们在血浆中结合竞争蛋白以及TTR。

羟化PCB抑制TTR淀粉样蛋白纤维化

评价OH-PCB和PCB 3体外抑制TTR纤维形成的能力，因为这 些化合物在血液中具有良好的TTR结合选择性。由肝脏分泌入血液 中的TTR似乎是全身TTR淀粉样蛋白的来源。尽管还不清楚人体中 的淀粉样蛋白在哪里或如何形成，但酸是细胞中的典型变性剂，其将 几乎所有的淀粉样变性肽和蛋白有效转变为淀粉样蛋白和/或相关的 聚集物。因此，以浊度监测酸介导(pH 4.4)的纤维形成，用此来监测 PCB作为抑制剂的有效性。羟化PCB和PCB 3是高度有效的TTR纤 维化抑制剂。在抑制剂浓度等于野生型TTR浓度(3.6μM)时，在72 小时诱导期后只观察到正常量12-50％的纤维形成。此活性等于迄今 为止发现的最佳纤维化抑制剂(例如氟芬那酸(Flu)，将其作为阳性对 照纳入)所表现的活性。

OH-PCB 18与TTR的结合

先前的质谱实验提示，OH-PCB 18对TTR的两个C₂相关的甲状 腺激素结合位点具有正协同结合性。当将亚化学计量(<1:1)的18加入 至TTR中时，质谱中观察到的主要组分是脱辅基-TTR和TTR·18₂复 合物，这与正协同结合性一致。18的TTR结合特性与负协同结合的 众多其它TTR淀粉样蛋白纤维形成抑制剂所具有的特性相反。在生 理条件下进行的等温滴定量热法研究揭示，OH-PCB 18与野生型TTR 的结合与解离常数为相等Kd(3.2±1.8nM)的模型拟合得最好。该结果 与正协同结合没有冲突，因为基于热量释放不充分的缘故人们不能获 得足够低的TTR浓度来探测正协同性。尝试将收集的数据与正或负 协同结合模型进行拟合，结果拟合得很差。

OH-PCB 12、16、17和18的共晶体结构

通过用10倍过量的抑制剂浸泡TTR晶体4周，获得结合野生型 TTR的OH-PCB 12、16、17和18晶体。然后解析每种复合物的X- 射线结构。晶体学不对称单位中的TTR二聚体形成两个配体结合袋 的一半。因为两个结合位点由同一个二重对称轴两等分，所以通常观 察到所述抑制剂的两种对称等同结合模式。每个TTR结合位点可以 再分为内部和外部腔。这些腔包含三个所谓的卤素结合袋(HBP)，因 为它们由甲状腺素两个芳环上的碘占据。HBP 3和3′处于内部结合腔 的中心，HBP 2和2′确定了内部和外部结合腔之间的边界，而HBP 1 和1′位于外部结合腔的外周附近。共晶体结构揭示，连接OH-PCB 两个芳环的C-C键几乎位于二重对称轴中心，呈现单一结合构象的 表象。两个苯环之间的二面角为：12是59°，16和17都是37°，而 18是44°。所有的OH-PCB都在内部和外部结合袋中占据相似的位置。 联芳环体系的范德华补偿促进了某些内部亚单位的相互作用，该作用 涉及组成每个结合位点的一个亚单位中的残基X、Y和Z以及另一个 亚单位中的残基n′、m′和o′。苯环上的某些取代基位于轴外，可在所 观测到的电子密度图中的多个位置建模。

OH-PCB 18结合TTR

TTR·18₂复合物的射线结构证实，该抑制剂对TTR结合 位点具有极好的立体互配。分子力学(Insight II，Accelrys)表明，18 的未结合构象接近于其结合结构。精修结构明确了有助于18的高亲 和性结合的直接和水介导的静电作用。3-Cl、4-OH、5-Cl等价取代芳 环的其中一个占据内部结合袋，其氯取代基凸出到HBP 3和3′中。 如由无偏差电子密度图识别出的，Ser 117和Thr 119的侧链通过围绕 着其Cα-Cβ键旋转而采用互变构象(alternative conformation)。如根据 电子密度分布识别出的，Ser 117的侧链采用全部三种旋转体构象。 令人感兴趣的是，两个水分子位于二重轴上邻近Ser 117残基之间， 占有率为50％，这有利于连接Ser 117残基、邻近水分子和18的苯酚 官能团的氢键网络。根据结构检查还不清楚为什么18以非协同或正 协同特性结合。其它等价取代环以其卤素凸出到HBP 1和1′中而占 据外部TTR结合袋。

结合TTR的化合物16

16的3-Cl、4-OH、5-Cl三取代基苯酚环朝向TTR内部结合袋， 产生与上述TTR·18₂结构中该环作用相同的与TTR的静电和疏水作 用。3，4-二氯芳环占据外部结合袋，卤素根据所设想的对称等价结合 模式投向HBP-1或1′。16的电子密度与OH-PCB 18一样是对称的， 因此根据电子密度图不可能明确地定位对位OH和对位Cl。无偏差电 子密度图与Ser 117的三个旋转体构象一致，在Ser 117残基之间含有 两个水分子，类似于TTR·18₂结构。

结合TTR的OH-PCB 17

抑制剂17以其朝向内部结合袋的3-Cl、4-OH、5-Cl取代芳环结 合，使用的相互作用与上述TTR·16₂和TTR·18₂结构中该环所用的相 同。2，3，4-三氯化环利用与HBP-1、HBP-1′、HBP-2、HBP-2′的相互作 用以两种对称等价结合模式占据外部结合袋。Ser 117和两个保守水 分子的多种构象也表征了TTR·17₂结构。由无偏差电子密度图可清楚 看出Thr 119侧链的构象改变。

结合TTR的化合物12

联芳化合物12的3-Cl、4-OH取代芳环位于外部结合袋，其两个 氯与HBP-1和1′相互作用。与苯酚位于内部结合袋中的TTR·16₂和 TTR·17₂结构相反。羟基(可能为离子化形式)在Lys 15侧链的氢键键 合距离之内。四氯化环位于内部结合袋中，其中卤素朝向HBP 2和 2′以及3和3′。Ser 117和Thr 119侧链采用的构象与脱辅基-TTR结 构中发现的构象相同，与16、17和18的情况不同。

在本文先前报告的取代T4的IC₅₀低于50nM的8种PCB中， 只有1和3以可接受的化学计量在人血浆中结合TTR。相反，先前报 告的结合TTR的全部14种OH-PCB在血浆中都表现出对TTR的显 著结合选择性。这与OH-PCB主要在血浆中观测到并似乎选择性保留 在血浆中的观察结果一致，与在PCB通常累积在脂质和其它组织中 相反。OH-PCB还选择性结合全血中的TTR，这与它们不能分配入脂 膜的观点一致。

使用重组野生型TTR评价洗涤步骤中由抗体·TTR·PCB复合物 上洗去的PCB(或OH-PCB)的量。洗涤相关的PCB解离是分子特异 性的。某些化合物在洗涤后具有高结合化学计量，这与显著的初始结 合和低洗涤相关损失一致，暗示解离速率慢。具有低结合化学计量的 化合物属于至少两个类别：高初始结合化学计量以及显著的洗涤相关 损失，或低初始结合化学计量及不显著的洗涤相关损失，后种情况适 用于与TTR高亲和性结合但与另一种血浆蛋白以更高亲和性结合的 化合物。PCB 2和4都与重组TTR表现出低洗涤后结合化学计量。 PCB 4由于洗涤损失45％，而PCB 2仅具有很低的初始结合化学计量 以及最小的洗涤相关损失(10％)。洗涤后的选择性值反映出血浆中 PCB初始结合量的下限。类似于具有高洗涤后结合化学计量特征的 PCB 18的化合物，一定具有高结合亲和性和选择性，与观测到的低 解离速率一致。

除了对血浆TTR具有高结合选择性之外，OH-PCB和PCB 3还 在体外表现出极佳的TTR纤维形成抑制性。在等摩尔抑制剂和TTR 浓度(3.6μM)时抑制剂14、15和18的效力是迄今观测到的最高效力 之一。这有可能有助于其高结合亲和性(也与其低解离速率一致)及其 不常见的非协同或正协同TTR结合特性。最好的抑制剂OH-PCB 18 具有nM K_d，表明以>3kcal/mol稳定天然状态的TTR。基态稳定显著 提高了四聚体解离屏障(TTR淀粉样变性的限速步骤)，以至于四聚体 不能以生物相关时标解离。四聚体解离在6M尿素中急剧减慢和在 pH 4.4时缓慢淀粉样变性，这证实了由18与基态结合介导的天然非 淀粉样变性状态的动力学稳定。据信OH-PCB 18(3.6μM)是另人印象 深刻的淀粉样蛋白抑制剂，因为其是极佳的四聚体TTR动力学稳定 剂，即因为TTR·18和TTR·18₂不能形成淀粉样蛋白，所以其在pH 4.4 时防止2/3的3.6μM TTR样品淀粉样变性，TTR残余物(1.18μM)由 于其低浓度而无法形成淀粉样蛋白。最好的OH-PCB抑制剂的解离速 率也可能比预期低，因为OH-PCB周围的TTR结构退火，但对此还 没有和需要的一样仔细评价。这些化合物至少提供了特殊抑制剂的合 成指引，或者依其毒性情况证明其自身可用作抑制剂。

TTR结合OH-PCB 12、16、17和18的结构信息揭示，这些联苯 化合物一般沿着晶体学二重对称轴结合。两个环之间的二面角在约 40-60°的范围内，使两个相邻亚单位上的卤素结合袋(HBP)能同时占 据，导致四聚体四级结构界面稳定化。羟化PCB 18具有最佳的TTR 结构互配性，因为其氯能够同时结合HBP 1和1′以及3和3′。16和 17的情况不是这样，它们需要考虑两种对称等价结合模式，以便将 氯延伸入HBP 1、1′、3和3′。

苯酚环朝向内部结合袋似乎起重要作用，因为其能在其与邻近的 TTR亚单位之间形成水介导的氢键网络，推测这可以进一步稳定TTR 的天然四级结构。氢键网络涉及Ser-117、抑制剂的苯酚基团和两个 保守水分子的三种交叉构象，产生内部连接两个亚单位、形成PCB 结合位点的静电网络。在全部三种结构中，Thr 119还占据多个旋转 体构象。相反，该静电作用网络在12₂·TTR复合物中不存在，在该复 合物中羟基取代苯环朝向外部结合袋，其中Ser 117和Thr 119采用 脱辅基侧链构象。

OH-PCB的毒性在文献中未完全证实。在各种体外和动物研究 中，OH-PCB似乎是轻微雌激素作用或抗雌激素作用。已经阐明了其 它的毒性机制，还报告在接触这些化合物时动物甲状腺激素水平降 低。OH-PCB结合TTR降低T4水平以及T4水平降低反映小分子TTR 结合的观点难以得到直接支持。因为大约一半的T4由白蛋白运载， 所以取代白蛋白结合位点的T4似乎更可能是接触PCB个体T4水平 降低的原因。甲状腺结合球蛋白对甲状腺素的亲和性最高，是人体中 的主要载体，但其在许多低等动物中不存在，包括研究这些化合物的 多种毒理学性质的大鼠和小鼠。因此，在这些物种中，更有可能是结 合TTR的化合物对T4的整体结合和转运有影响。显示PCB与TBG 结合的数据表明它们基本没有相互作用，只有一个或两个微弱结合的 化合物是例外。因此，OH-PCB对人甲状腺素水平的影响应当是最小 的，除非它们结合白蛋白。还报告了这些化合物可能干扰甲状腺激素 活化或增加T4硫酸化速率，因此使T4失活。OH-PCB还可以结合其 它甲状腺激素靶，包括甲状腺激素受体，如果有T4类似结构的话这 似乎是有可能的。

很明显，关于羟化PCB毒性，尤其是在人体中的毒性，基本没 有得到证实。预期对啮齿类动物的毒性更严重，因为TTR主要起甲 状腺激素转运体的作用。清楚的是，羟化PCB作为甲状腺素运载蛋 白纤维形成抑制剂具有极佳活性，提示此类化合物有潜力用于抑制淀 粉样蛋白纤维形成。

材料和方法

甲状腺素运载蛋白抗体纯化和与琼脂糖的缀合

生产、纯化抗体，并将其偶联至琼脂糖。树脂储存为1:1TSA浆 (10mM Tris、pH 8.0/140mM NaCl/0.025％ NaN₃)中。另外，通过用200 mM Tris、pH 8.0代替抗体与树脂偶联制备猝灭琼脂糖。

人血浆制备

按照Scripps综合临床研究中心的标准取血程序从健康志愿者采 集全血，并转移至50mL圆锥管中。用配有甩平转子的Sorvall RT7 台式离心机于25℃对该管以3000RPM(1730×g)离心10分钟。取出 血浆上清液，再以3000RPM离心10分钟，去除残余的细胞。加入 叠氮化钠，获得0.05％溶液。将血浆储存在4℃，直至使用。

免疫沉淀甲状腺素运载蛋白和结合的PCB

在评测时，将1.5mL人血浆和7.5μL PCB的2.16mM DMSO溶 液注入2mL eppendorf管。将该溶液于37℃温育24小时。将猝灭琼 脂糖的1:1树脂/TSA浆(187μL)加入到溶液中，并于4℃温和震荡1 小时。离心溶液(16,000×g)，将上清液分为各400μL的3等份。向其 中各加入200μL抗甲状腺素运载蛋白抗体缀合的琼脂糖的1:1树脂 /TSA浆，并于4℃缓慢震荡20分钟。离心样品(16,000×g)，去除上清 液。用1mL TSA/0.05％皂苷(Acros)于4℃洗涤树脂(3×10分钟)，再用 1mL TSA于4℃洗涤(2×10分钟)。离心样品(16,000×g)，去除最终的 洗涤液，加入155μL 100mM甲状腺素运载蛋白(pH 11.5)，从抗体上 洗脱TTR和结合的小分子。于4℃温和震荡30分钟，离心样品 (16,000×g)，取出145μL含TTR和抑制剂的上清液。

HPLC分析和甲状腺素运载蛋白与结合PCB的定量

将TTR抗体珠的上清液洗脱样品(145μL)加至Waters 71P自动 取样器。在8分钟内使用40-100％ B梯度(A：94.8％ H₂O/5％乙腈/0.2％ TFA；B：94.8％乙腈/5％ H₂O/0.2％ TFA)，采用Waters 600E多元溶剂 传递系统控制，经Keystone 3厘米C18反相柱分离135μL注入的各 个样品。在280nm用Waters 486可调吸光度检测器进行检测，对峰 积分，得到TTR和小分子二者的面积。为了测定各种组分的量，将 已知量的四聚体TTR或PCB注入HPLC。对峰积分，使用Kaleidagraph (Synergy Software)对数据进行线性回归，得到校准曲线。使用校准曲 线测定血浆样品中存在的各种组分的摩尔数。计算小分子对蛋白的比 率，获得小分子在血浆中结合TTR的化学计量。

甲状腺素运载蛋白淀粉样蛋白纤维形成测定

以720μM浓度将化合物溶解在DMSO中。将5μL待评测化合 物溶液加入0.5mL 7.2μM TTR的10mM磷酸盐(pH 7.6)、100mM KCl、1mM EDTA缓冲溶液中，使化合物与TTR温育30分钟。加入 495μL的0.2mM乙酸盐(pH4.2)、100mM KCl、1mM EDTA，获得 的最终蛋白和抑制剂浓度各为3.6μM，pH 4.4。然后将混合物于37 ℃温育72小时，此后涡旋试管3秒，检测400nm的光密度。将无抑 制剂TTR的光密度定义为100％纤维形成，通过对每个光密度归一化， 测定纤维形成程度。还测试了没有TTR时各个化合物的对照溶液， 在400nm没有明显吸收。

PCB 18和TTR的等温滴定量热

使用Microcal MCS等温滴定量热仪(Microcal，Northampton， MA)，将25μM化合物18的溶液(10mM磷酸盐pH 7.6、100mM KCl、 1mM EDTA、8％ DMSO溶液)滴定入1.2μM TTR的相同缓冲溶液中。 最初注入2μL，接着于25℃注入10μL共25次。对等温线积分，扣 除本底获得结合等温线，使用ORIGIN 5.0(Microcal)的ITC数据分析 包其与两个相同结合位点的模型拟合得最好。

结晶和X-射线数据收集

在悬滴实验中，由对2M硫酸铵平衡的5mg/ml蛋白溶液(100 mM KCl、100mM磷酸盐pH 7.4、1mM硫酸铵)获得重组TTR晶体。 将晶体用10倍摩尔过量的配体浸泡2周，以确保两个结合位点都完 全饱和，由此制备TTR·配体复合物。使用1:1的丙酮:水溶液作为浸 泡剂。联合使用DIP2030b成像板系统(MAC Science，Yokohama，Japan) 和RU200旋转阳极X-射线发生器进行数据收集。将晶体置于冷冻保 护剂Paratone油中，冷却至120K进行衍射实验。所有TTR·配体复 合物的晶体都和脱辅基晶型是同晶型，晶胞大小为a＝43、b＝86和c＝65。它们属于空间群P2₁2₁2，在不对称单位中包含一半的同 源四聚体。用DENZO和SCALEPACK简化数据。

结构测定和精修

使用蛋白质数据库的TTR蛋白原子坐标(登录号1BMZ)作为初 始模型，使用程序CNS通过分子动力学和能量最小化精修天然TTR 和TTR-配体复合物。对用PCB浸泡或同时共结晶的TTR晶体收集 衍射数据，由此计算图谱。对于TTR与PCB的复合物，获得的图揭 示了配体在TTR四聚体的两个结合袋中的大概位置，峰高在5-9r.m.s 以上。为进一步提高小分子电子密度和去除模型偏差，对模型实施数 轮扭曲/振动方案，这在图中导致了显著改善，尤其是在抑制剂周围。 随后使用这些图进行模型拟合，确定了配体分子在密度图中的位置。 在全部三种情况中，由程序InsightII(Accelrys)计算的抑制剂最小能量 构象与图谱非常一致。因为二重晶体对称轴在结合通道旁，所以必须 应用统计无序模型，为四聚体TTR两个结合位点的每一个产生两种 配体结合模式。根据无偏差电子密度图置入水分子。因为在最终图谱 中没有可解释的电子密度，所以9个N-末端残基和3个C-末端残基 没有包括在最终模型中。

实施例5：甲状腺素运载蛋白淀粉样蛋白纤维化抑制剂苯并噁唑

甲状腺素运载蛋白的两个甲状腺素结合位点由其四级结构界面 产生。小分子结合这些位点可以稳定四聚体，潜在地提供了用小分子 药物治疗TTR淀粉样蛋白病变的方法。已经发现了许多化合物家族， 其结合将四聚体基态稳定至与小分子解离常数K_d1和K_d2成比例的程 度。这也有效增加了解离活性屏障，并通过动力学稳定化抑制淀粉样 变性。这样的抑制剂通常由两个芳环组成，一个环具有卤素取代基， 另一个环具有亲水取代基。在C(4)-C(7)被羧酸取代并在C(2)被卤化 苯环取代的苯并噁唑似乎也匹配TTR甲状腺素结合位点。因此，如 流程1所示，通过对N-酰基氨基-羟基苯甲酸脱氢环化，制备这些化 合物的小型库。

流程1：苯并噁唑的通用合成方法

试剂：(a)ArCOCl，THF，吡啶(Ar＝苯基、3，5-二氟苯基、2，6-二 氟苯基、3，5-二氯苯基、2，6-二氯苯基、2-(三氟甲基)苯基和3-(三氟甲 基)苯基)；(b)TsOH·H₂O，回流二甲苯；(c)TMSCHN₂、苯、MeOH； (d)LiOH、THF、MeOH、H₂O(4步的收率为8-27％)。

使用一系列严格性增加的分析评价苯并噁唑。将野生型TTR(3.6 μM)与测试化合物(7.2μM)温育30分钟(pH 7、37℃)。因为至少一个 分子的测试化合物必须结合TTR四聚体的每个分子才能够使其稳定， 所以测试化合物的浓度7.2μM仅仅是最小有效浓度的两倍。然后将 pH调节至纤维化的最佳pH值4.4。在测试化合物存在的情况下，通 过400nm的浊度测定72小时后形成的淀粉样蛋白量(37℃)，并表示 为％纤维形成(ff)，100％是只有TTR时所形成的量。在所测试的28 种化合物中，11种将纤维形成降低至可忽略不计的水平(ff<10％；图 7)。

然后评价11种最有活性化合物在血液中相对于所有其它蛋白选 择性结合TTR的能力。将人血浆(TTR浓度3.6-5.4μM)与测试化合物 (10.8μM)于37℃温育24小时。使用结合多克隆TTR抗体的琼脂糖 免疫沉淀TTR和结合的任何抑制剂。以高pH由树脂上释放有或没有 抑制剂结合的TTR，通过HPLC分析确定抑制剂：TTR的化学计量(图 8)。在5-或6-位具有羧酸和在2位具有2，6-二氯苯基(13、20)或2-三 氟甲基苯基(11、18)取代基的苯并噁唑具有最高结合化学计量。特别 是20具有极好的抑制剂活性和结合选择性。因此，进一步特征鉴定 其作用机制。

为证实20通过强结合四聚体抑制TTR纤维形成，用野生型TTR 进行等温滴定量热法(ITC)和沉降速度实验。ITC显示在生理条件下2 当量20结合的平均解离常数为K_d1＝K_d2＝55(±10)nm。这与许多其它 高效TTR淀粉样变性抑制剂的解离常数相当。至于沉降速度实验， 在最佳纤维化条件下(72小时、pH 4.4、37℃)将TTR(3.6μM)与20(3.6 μM、7.2μM、36μM)温育。四聚体(55kDa)是7.2或36μM 20的溶液 中唯一可检测到的组分。3.6μM 20形成某些大聚集物，但保留在溶 液中的TTR是四聚体。

包含T119M亚单位和小分子结合都通过升高四聚体解离的活化 屏障防止TTR淀粉样蛋白纤维化。通过检测抑制剂在严重变性压力 6M尿素中减慢四聚体解离的效力，最严格地测试其在升高四聚体解 离活化屏障方面的能力。因此，对比有和没有20、21或27的情况下 6M尿素中TTR四聚体解离的速率(图9)。在6M尿素中168小时后 TTR(1.8μM)完全变性。相反，3.6μM 20至少在168小时内防止四聚 体解离(>3×血浆中的TTR半衰期)。等摩尔量20时168小时内仅有 27％的TTR变性。化合物27(3.6μM)即使在纤维形成测定中有活性 也基本不能防止四聚体解离(168小时后90％解折叠)。化合物21根本 不能阻止TTR解离。这些结果显示抑制剂结合TTR是必须的，但不 足以在强变性条件下动力学稳定TTR四聚体；解离常数较低(或解离 速率较低)也很重要。此外，20的官能团形态显然对稳定TTR四聚体 最理想；将羧酸由C(6)移至C(7)(如27)或去除氯(如21)严重降低其活 性。

由其与TTR的共晶体结构可明显看出20中取代基的作用(图 10)。化合物20将其两个氯原子朝向卤素结合袋2和2′附近(如此称 呼是因为甲状腺素结合TTR时它们由碘占据)。苯环上的2，6取代模 式迫使苯并噁唑和苯环不在一个平面，最好将羧酸定位于苯并噁唑 上，以氢键键合Lys 15/15′的ε-NH₃⁺基团。20的芳环和Leu 17、Leu 110、 Ser 117和Val 121侧链之间的疏水相互作用额外贡献了结合能。

方法

以下详述苯并噁唑合成和产物鉴定(¹H-和¹³C-NMR以及高分辨 率质谱)的通用方法。

分析性超速离心

使用沉降速度分析性超速离心观测20存在时TTR的四级结构。 将样品与3.6、7.2或36μM的20温育72小时。以温控型Beckman XL-I 分析性超速离心机(配有An60Ti转子和光电扫描器)收集数据。使用 注射器将400-420μL样品上样至配有12mm Epon中心杯和蓝宝石窗 的双区池中。以连续方式于25℃、3000和5000rpm的转子转速收 集数据，使用平均每点1次扫描的0.005cm步长。于280nm进行检 测。使用Philo(Philo，2000；Stafford，1992)开发的程序DCDT+对数据 进行时间导数分析。分析显示溶液中组分的分布以s值范围表示。然 后将该分布拟合不同的模型，以便确定系统中组分的沉降和扩散系 数。以先前报道的方法(Petrassi等，2000)测定每种组分的分子量。测 定的TTR s值显示，在7.2和36μM的20存在时TTR保持为四聚体， 而3.6μM时尽管形成了一些聚集物，但保留在溶液中的TTR仍为四 聚体。

结晶和X-射线数据收集

在悬滴实验中，由对2M硫酸铵平衡的12mg/ml蛋白溶液(100 mM KCl、1mM EDTA、10mM磷酸钠、pH 7.0、0.35mM硫酸铵) 获得野生型TTR晶体。将晶体用10倍摩尔过量的配体浸泡3周，以 确保两个结合位点都完全饱和，由此制备TTR-20复合物。用14-BM-C， BIOCARS，Advanced Photon Source(Argonne National Laboratory)的单 色高能源Quantum-4检测器衍射配体浸泡晶体达将晶体浸泡 在Paratone油中，骤冷至100K进行衍射实验。TTR-20复合物的晶 体和脱辅基晶型同晶型，晶胞大小为和空间群为P2₁2₁2，在不对称单位中包含两个TTR亚单位。用HKL2000 程序组(Otwinowski，1997)的DENZO和SCALEPACK简化数据。

结构测定和精修

使用蛋白质数据库的TTR蛋白原子坐标(登录号1BMZ)作为初 始模型进行分子置换检索。使用CNS的分子动力学和能量最小化方 案对TTR-20复合物结构进行精修。获得的差值Fourier图揭示配体在 TTR四聚体的两个结合袋都结合。使用这些图谱，可以明确地定位配 体在密度图中的位置，将其纳入晶体学精修。由程序Insight II (Accelrys Inc.)计算的抑制剂最小能量构象用作晶体学精修的初始模 型。因为二重晶体对称轴在结合通道旁，所以必须应用统计无序模型， 为每个TTR结合袋生成两种配体结合模式。经过数轮模拟退火和随 后的位置和温度因子精修后，定位水分子在差值Fourier图中的位置。 使用由振荡n′扭曲偏差去除方案计算的无偏差加权电子密度图进行 最后一轮图形拟合。配体的对称相关结合构象与没有抑制剂时定相的 无偏差退火省略图以及振荡n′扭曲无偏差加权图非常一致。因为在最 终图中没有可解释的电子密度，所以9个N-末端残基和3个C-末端 残基没有包括在最终模型中。表6提供了晶体学分析的概述。

表6：X-射线晶体结构的统计结果

苯并噁唑合成-通用方法

除非另有说明，否则所有的反应都使用FirstMate有机合成仪 (Argonaut Technologies)在干氩气氛下于烘干的玻璃器皿中进行。所有 的溶剂(水性)和试剂都购自Aldrich，使用时不用进一步纯化。用 Bruker DRX-500光谱仪于500MHz或用Bruker DRX-600光谱仪于 600MHz检测¹H NMR谱，并参照内标CHD₂-S(O)-CD₃(2.49ppm)。 用Bruker DRX-500于125MHz或用Bruker DRX-600仪器于150MHz 检测¹³C谱，并参照(CD₃)₂SO(39.5ppm)。在玻璃衬底的薄层分析平 板(Kieselgel 60 F₂₅₄，0.25mm，EM Science第5715-7号)上进行薄层色 谱分析。使用UV吸收或10％磷钼酸乙醇溶液完成显色。在离心薄层 色谱(Harrison Research，7924T型，2mm平板)或制备型硅胶平板 (Kieselgel 60 F₂₅₄，1mm，EM Science第13895-7号)上进行色谱。

苯并噁唑合成的一般步骤

用吡啶(500μl，0.6mmol)和所需酰氯(0.2mmol)依次处理氨基羟 基苯甲酸(0.2mmol)的THF(3mL)混合物。于室温搅拌反应混合物10 小时，回流1小时，真空浓缩，不用纯化就用于下一步。

向粗反应混合物的二甲苯溶液(5mL)中加入对甲苯磺酸一水合 物(380.4mg，2.0mmol)，获得的混合物回流搅拌过夜。12小时后，冷 却反应物至室温，用NaOH(2mL，1N)猝灭反应，分离各相。用HCl (1N)酸化水层至pH 2，用EtOAc(4×3mL)提取。合并的有机层经 MgSO₄干燥，过滤并真空浓缩。将得到的残余物溶解在MeOH:苯(2 mL；1:4)混合物中，用TMS-CHN₂(200μL的2.0M己烷溶液，0.4mmol) 于25℃处理，以TLC监测反应进程(通常于0.5小时后完成)。真空浓 缩反应混合物，残余物进行色谱(10-25％EtOH/己烷梯度)，获得所需 的苯并噁唑甲酯。

将苯并噁唑甲酯溶解在THF:MeOH:H₂O(3:1:1，0.07M)中，用 LiOH·H₂O(4当量)处理。于室温搅拌反应物，用TLC监测。一结束 就用1N HCl将混合物酸化至pH 2，用EtOH(4×)提取。合并的有机 层经MgSO₄干燥，过滤并浓缩。残余物经制备型薄层色谱(4.9％ MeOH、95％ CH₂Cl₂、0.1％ HOAc)纯化，获得为白色固体的产物。

4-羧基-2-(3，5-二氟苯基)-苯并噁唑(1)。按照一般步骤由3-羟基邻 氨基苯甲酸制备，得到为白色固体的1(7.0mg，13％)。1的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ 13.70-12.50(br.s，1H，CO₂H)，8.04(AMX， 1H，J＝8.1Hz，Ar)，7.94(AMX，1H，J＝7.3Hz，Ar)，7.84(br.d，2H，J＝5.6 Hz，Ar)，7.62-7.58(m，1H，Ar)，7.56(AMX，1H，J＝7.3，8.1Hz，Ar)；¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)δ 165.8，162.7(d，J＝248Hz)，162.6(d， J＝248Hz)，161.1，151.0，140.3，129.3，127.0，125.8，123.6，115.2，110.8 (d，J＝28Hz)，107.8(t，J＝26Hz)；C₁₄H₇F₂NO₃(MH⁺)的HRMS (MALDI-FTMS)理论值276.0467，实测值276.0463。

4-羧基-2-(2，6-二氟苯基)-苯并噁唑(2)。按照一般步骤由3-羟基邻 氨基苯甲酸制备，得到为白色固体的2(8.2mg，15％)。2的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ 13.00(br.s，1H，CO₂H)，8.06(AMX，1H， J＝8.1Hz，Ar)，7.94(AMX，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.80-7.74(m，1H，Ar)， 7.57(AMX，1H，J＝7.6，8.1Hz，Ar)，7.40-7.38(m，2H，Ar)；¹³C NMR (125MHz，DMSO-d₆)δ 166.1，160.4(d，J＝256Hz)，160.3(d，J＝256Hz)， 154.9，150.6，139.6，134.7(t，J＝10Hz)，126.8，125.8，114.8，112.8(d， J＝22Hz)，105.2(t，J＝16Hz)；C₁₄H₇F₂NO₃(MH⁺)的HRMS (MALDI-FTMS)理论值为276.0467，实测值为276.0461。

4-羧基-2-[(3-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(3)。按照一般步骤由3- 羟基邻氨基苯甲酸制备，得到为白色固体的3(9.5mg，15％)。3的数 据：¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ 13.70-12.80(br.s，1H，CO₂H)，8.50 (ABX，1H，J＝7.8Hz，Ar)，8.43(s，1H，Ar)，8.06(AMX，1H，J＝8.1Hz， Ar)，8.03(ABX，1H，J＝8.1Hz，Ar)，7.94(AMX，1H，J＝7.8Hz，Ar)，7.88 (ABX，1H，J＝7.8Hz，Ar)，7.54(AMX，1H，J＝8.1Hz，Ar)；¹³C NMR(125 MHz，DMSO-d₆)δ 165.8，161.9，151.0，140.6，131.4，130.8，130.0(q， J＝33Hz)，128.7(d，J＝4Hz)，127.2，127.0，125.5，123.8，123.7(q，J＝273 Hz)，123.2，115.2；C₁₅H₈F₃NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值 为308.0529，实测值为308.0535。

4-羧基-2-[(2-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(4)。按照一般步骤由3- 羟基邻氨基苯甲酸制备，得到为白色固体的4(15.2mg，25％)。4的数 据：¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.15(br.s，1H，CO₂H)，8.18(d， 1H，J＝7.6Hz，Ar)，8.06(AMX，1H，J＝0.9，8.2Hz，Ar)，8.02(d，1H，J＝7.9 Hz，Ar)，7.96(AMX，1H，J＝0.9，7.9Hz，Ar)，7.94-7.87(m，2H，Ar)，7.58 (AMX，1H，J＝8.2Hz，Ar)；¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ 165.8， 161.6，151.2，140.0，133.0，132.6，132.3，127.6(q，J＝32Hz)，127.2(q， J＝6Hz)，127.0，125.6，124.9，123.5，123.4(q，J＝273Hz)，115.2； C₁₅H₈F₃NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为308.0529，实测 值为308.0531。

4-羧基-2-(3，5-二氯苯基)-苯并噁唑(5)。按照一般步骤由3-羟基邻 氨基苯甲酸制备，得到为白色固体的5(8.0mg，13％)。5的数据：¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.60-12.60(br.s，1H，CO₂H)，8.16(A₂M， 2H，J＝2.0Hz，Ar)，8.05(AMX，1H，J＝0.9，8.2Hz，Ar)，7.96(A₂M，1H， J＝2.0Hz，Ar)，7.94(AMX，1H，J＝0.9，7.6Hz，Ar)，7.56(AMX，1H，J＝7.9 Hz，Ar)；¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ 165.8，160.8，151.0，140.4， 135.2，131.5，129.4，127.0，126.3，125.9，125.8，123.6，115.2； C₁₄H₇Cl₂NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为307.9876，实 测值为307.9876。

4-羧基-2-(2，6-二氯苯基)-苯并噁唑(6)。按照一般步骤由3-羟基邻 氨基苯甲酸制备，得到为白色固体的6(5.2mg，8％)。6的数据：¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.80-12.50(br.s，1H，CO₂H)，8.07(AMX， 1H，J＝8.2Hz，Ar)，7.95(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.77-7.71(m，3H，Ar)， 7.59(AMX，1H，J＝7.9，8.2Hz，Ar)；¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ 165.8，158.2，150.8，139.3，134.8，134.0，128.7，126.8，126.7，125.9，122.4； C₁₄H₇Cl₂NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为307.9876，实 测值为307.9880。

4-羧基-2-苯基-苯并噁唑(7)。按照一般步骤由3-羟基邻氨基苯甲 酸制备，得到为白色固体的7(10.2mg，21％)。7的数据：¹H NMR(600 MHz，DMSO-d₆)δ 13.50-12.60(br.s，1H，CO₂H)，8.24-8.22(m，2H，Ar)， 8.03(AMX，1H，J＝0.9，8.2Hz，Ar)，7.91(AMX，1H，J＝0.9，7.9Hz，Ar)， 7.68-7.61(m，3H，Ar)，7.51(AMX，1H，J＝7.9，8.2Hz，Ar)；¹³C NMR (150MHz，DMSO-d₆)δ 166.0，163.4，151.0，140.8，132.4，129.4，127.6， 126.7，126.1，125.0，123.0，115.0；C₁₄H₉NO₃(MH⁺)的HRMS (MALDI-FTMS)理论值为240.0655，实测值为240.0656。

5-羧基-2-(3，5-二氟苯基)-苯并噁唑(8)。按照一般步骤由3-氨基-4- 羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的8(10.2mg，19％)。8的数据：¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.60-12.80(br.s，1H，CO₂H)，8.32(ABM， 1H，J＝1.5Hz，Ar)，8.07(ABM，1H，J＝1.5，8.5Hz，Ar)，7.90(ABM，1H， J＝8.5Hz，Ar)，7.86-7.85(m，2H，Ar)，7.60(tt，1H，J＝2.4，9.2Hz，Ar)；¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ 166.8，162.8(d，J＝248Hz)，162.7(d， J＝248Hz)，161.5，153.0，141.2，129.1(t，J＝11Hz)，128.2，127.7，121.4， 111.2，110.8(d，J＝23Hz)，110.7(d，J＝22Hz)，107.8(t，J＝26Hz)； C₁₄H₇F₂NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为276.0467，实测 值为276.0469。

5-羧基-2-(2，6-二氟苯基)-苯并噁唑(9)。按照一般步骤由3-氨基-4- 羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的9(6.8mg，12％)。9的数据：¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.50-12.80(br.s，1H，CO₂H)，8.39(ABM， 1H，J＝0.7，1.6Hz，Ar)，8.10(ABM，1H，J＝1.6，8.7Hz，Ar)，7.95(ABM， 1H，J＝0.7，8.7Hz，Ar)，7.77(m，1H，Ar)，7.40(t，2H，J＝8.8Hz，Ar)；¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ 166.8，160.4(d，J＝257Hz)，160.3(d， J＝257Hz)，155.4，152.6，140.8，134.8(t，J＝11Hz)，128.2，127.7，121.6， 113.0(d，J＝22Hz)，112.9(d，J＝22Hz)，111.2，104.9；C₁₄H₇F₂NO₃(MH⁺) 的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为276.0467，实测值为276.0467。

5-羧基-2-[(3-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(10)。按照一般步骤由3- 氨基-4-羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的10(6.7mg，11％)。10的 数据：¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ 13.30-12.80(br.s，1H，CO₂H)， 8.51(ABX，1H，J＝7.8Hz，Ar)，8.45(s，1H，Ar)，8.35(ABM，1H，J＝1.7 Hz，Ar)，8.08(ABM，1H，J＝1.7，8.6Hz，Ar)，8.04(ABX，1H，J＝7.8Hz， Ar)，7.93(ABM，1H，J＝8.6Hz，Ar)，7.89(ABX，1H，J＝7.8Hz，Ar)；¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)δ 166.8，162.2，153.1，141.4，131.4，130.9， 130.1(q，J＝33Hz)，128.8，128.2，127.5，127.1，123.8(q，J＝4Hz)，123.7 (q，J＝273Hz)，121.3，111.2；C₁₅H₈F₃NO₃(MH⁺)的HRMS (MALDI-FTMS)理论值为308.0529，实测值为308.0530。

5-羧基-2-[(2-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(11)。按照一般步骤由3- 氨基-4-羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的11(10.3mg，17％)。11 的数据：¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.19(br.s，1H，CO₂H)，8.38 (m，1H，Ar)，8.19(d，1H，J＝7.6Hz，Ar)，8.09(dd，1H，J＝1.8，8.5Hz，Ar)， 8.03(d，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.94-7.88(m，3H，Ar)；¹³C NMR(150MHz， DMSO-d₆)δ 166.8，161.6，153.2，141.1，133.1，132.5，132.4，128.2，127.6， 127.5(q，J＝32Hz)，127.2(q，J＝6Hz)，124.7，123.4(q，J＝274Hz)，121.6， 111.2；C₁₅H₈F₃NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为 308.0529，实测值为308.0531。

5-羧基-2-(3，5-二氯苯基)-苯并噁唑(12)。按照一般步骤由3-氨基 -4-羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的12(7.3mg，12％)。12的数据： ¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.14(br.s，1H，CO₂H)，8.33(AMX， 1H，J＝0.6，1.8Hz，Ar)，8.16(AM，2H，J＝1.8Hz，Ar)，8.08(AMX，1H， J＝1.8，8.5Hz，Ar)，7.95(AM，1H，J＝1.8Hz，Ar)，7.91(AMX，1H，J＝0.6， 8.5Hz，Ar)；¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ 166.7，161.1，153.0，141.3， 135.2，131.6，129.2，128.2，127.7，125.9，121.4，111.3；C₁₄H₇Cl₂NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为307.9876，实测值为 307.9879。

5-羧基-2-(2，6-二氯苯基)-苯并噁唑(13)。按照一般步骤由3-氨基 -4-羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的13(10.8mg，18％)。13的数据： ¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.08(br.s，1H，CO₂H)，8.43(AMX， 1H，J＝0.6，1.8Hz，Ar)，8.13(AMX，1H，J＝1.8，8.5Hz，Ar)，7.98(AMX， 1H，J＝0.6，8.5Hz，Ar)，7.77-7.72(m，3H，Ar)；¹³C NMR(150MHz， DMSO-d₆)δ 166.7，158.6，152.8，140.4，134.8，134.2，128.8，128.4，127.8， 126.2，121.8，111.5；C₁₄H₇Cl₂NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论 值为307.9876，实测值为307.9879。

5-羧基-2-苯基-苯并噁唑(14)。按照一般步骤由3-氨基-4-羟基苯 甲酸制备，得到为白色固体的14(11.5mg，24％)。14的数据：¹HNMR (600MHz，DMSO-d₆)δ 13.12(br.s，1H，CO₂H)，8.30(ABX，1H，J＝1.8 Hz，Ar)，8.20(dt，2H，J＝1.5，6.7Hz，Ar)，8.03(ABX，1H，J＝1.8，8.5Hz， Ar)，7.87(ABX，1H，J＝8.5Hz，Ar)，7.67-7.60(m，3H，Ar)；¹³C NMR(150 MHz，DMSO-d₆)δ 166.9，163.6，153.0，141.6，132.4，129.4，127.9，127.5， 127.0，126.0，121.0，111.0；C₁₄H₉NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS) 理论值为240.0655，实测值为240.0656。

6-羧基-2-(3，5-二氟苯基)-苯并噁唑(15)。按照一般步骤由4-氨基 -3-羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的15(10.3mg，19％)。15的数据： ¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.22(br.s，1H，CO₂H)，8.20(ABM， 1H，J＝1.5Hz，Ar)，7.98(ABM，1H，J＝1.5，8.2Hz，Ar)，7.86(ABM，1H， J＝8.2Hz，Ar)，7.79-7.78(m，2H，Ar)，7.57(tt，1H，J＝2.4，9.4Hz，Ar)；¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ 166.7，162.7(d，J＝248Hz)，162.6(d， J＝248Hz)，162.4，150.0，144.7，129.0(t，J＝11Hz)，128.7，126.5，120.0， 112.1，110.9(d，J＝23Hz)，110.8(d，J＝22Hz)，108.0(t，J＝26Hz)； C₁₄H₇F₂NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为276.0467，实测 值为276.0468。

6-羧基-2-(2，6-二氟苯基)-苯并噁唑(16)。按照一般步骤由4-氨基 -3-羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的16(8.5mg，15％)。16的数据： ¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.25(br.s，1H，CO₂H)，8.30(ABM， 1H，J＝0.6，1.5Hz，Ar)，8.04(ABM，1H，J＝1.5，8.2Hz，Ar)，7.96(ABM， 1H，J＝0.6，8.2Hz，Ar)，7.76(m，1H，Ar)，7.39(t，2H，J＝8.8Hz，Ar)；¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ 166.7，160.4(d，J＝257Hz)，160.3(d， J＝257Hz)，156.6，149.7，144.2，134.9(t，J＝11Hz)，128.8，126.4，120.1， 113.1，112.9，112.2(d，J＝5Hz)，105.0(t，J＝16Hz)；C₁₄H₇F₂NO₃(MH⁺) 的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为276.0467，实测值为276.0466。

6-羧基-2-[(3-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(17)。按照一般步骤由4- 氨基-3-羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的17(7.4mg，12％)。17的 数据：¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.20(br.s，1H，CO₂H)，8.48 (ABX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，8.41(s，1H，Ar)，8.28(ABM，1H，J＝1.5Hz， Ar)，8.03(ABX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，8.02(ABM，1H，J＝1.5，8.2Hz，Ar)， 7.90(ABM，1H，J＝8.2Hz，Ar)，7.86(ABX，1H，J＝7.9Hz，Ar)；¹³C NMR (150MHz，DMSO-d₆)δ 168.0，164.6，151.4，146.2，132.8，132.2，131.4 (q，J＝32Hz)，130.2，129.8，128.4，127.8，125.2，125.0(q，J＝272Hz)， 121.2，113.6；C₁₅H₈F₃NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为 308.0529，实测值为308.0530。C₁₅H₈F₃NO₃(MH⁺)的HRMS (MALDI-FTMS)理论值为308.0529，实测值为308.0531。

6-羧基-2-[(2-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(18)。按照一般步骤由4- 氨基-3-羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的18(6.6mg，11％)。18的 数据：¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.22(br.s，1H，CO₂H)，8.30 (ABX，1H，J＝0.6，1.5Hz，Ar)，8.20(d，1H，J＝7.3Hz，Ar)，8.06(ABX，1H， J＝1.5，8.2Hz，Ar)，8.04(d，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.98(ABX，1H，J＝0.6，8.2 Hz，Ar)，7.94(t，1H，J＝7.3Hz，Ar)，7.90(t，1H，J＝7.9Hz，Ar)；¹³C NMR (150MHz，DMSO-d₆)δ 168.0，164.0，151.6，145.9，133.8，130.0，129.0 (q，J＝32Hz)，128.6(q，J＝6)，127.7，126.0，124.7(q，J＝273Hz)，121.6， 113.6；C₁₅H₈F₃NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为 308.0529，实测值为308.0530。

6-羧基-2-(3，5-二氯苯基)-苯并噁唑(19)。按照一般步骤由4-氨基 -3-羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的19(6.0mg，10％)。19的数据： ¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.20(br.s，1H，CO₂H)，8.17(ABX， 1H，J＝0.6，1.5Hz，Ar)，8.00(AB，1H，J＝2.0Hz，Ar)，7.96(ABX，1H， J＝1.5，8.5Hz，Ar)，7.83(AB，1H，J＝2.0Hz，Ar)，7.82(ABX，1H，J＝0.6， 8.5Hz，Ar)；¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ 166.6，161.9，150.0，144.6， 135.1，131.6，129.0，128.7，126.4，125.8，119.9，112.1；C₁₄H₇Cl₂NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为307.9876，实测值为 307.9879。

6-羧基-2-(2，6-二氯苯基)-苯并噁唑(20)。按照一般步骤由4-氨基 -3-羟基苯甲酸制备，得到为白色固体的20(12.7mg，21％)。20的数据： ¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ 13.27(br.s，1H，CO₂H)，8.38(ABX， 1H，J＝0.5，1.5Hz，Ar)，8.09(ABX，1H，J＝1.5，8.3Hz，Ar)，8.02(ABX， 1H，J＝8.3，0.5Hz，Ar)，7.78-7.71(m，3H，Ar)；¹³C NMR(125MHz， DMSO-d₆)δ 166.6，159.8，150.0，143.8，134.8，134.2，129.1，128.8，126.4， 126.3，120.4，112.6；C₁₄H₇Cl₂NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论 值为307.9876，实测值为307.9877。

6-羧基-2-苯基-苯并噁唑(21)。按照一般步骤由4-氨基-3-羟基苯 甲酸制备，得到为白色固体的21(7.0mg，15％)。21的数据：¹H NMR (600MHz，DMSO-d₆)δ 13.16(br.s，1H，CO₂H)，8.27(d，1H，J＝0.9Hz， Ar)，8.25-8.22(m，2H，Ar)，8.01(dd，1H，J＝1.5，8.5Hz，Ar)，7.89(d，1H， J＝8.5Hz，Ar)，7.69-7.62(m，3H，Ar)；¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ 166.8，164.7，150.0，145.2，132.6，129.4，128.0，127.6，126.3，126.0，119.6， 112.0；C₁₄H₉NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为240.0655， 实测值为240.0655。

7-羧基-2-(3，5-二氟苯基)-苯并噁唑(22)。按照一般步骤由3-氨基 水杨酸制备，得到为白色固体的22(8.8mg，16％)。22的数据：¹H NMR (600MHz，DMSO-d₆)δ 13.55(br.s，CO₂H)，8.10(AMX，1H，J＝1.2，7.9 Hz，Ar)，7.97(AMX，1H，J＝1.2，7.9Hz，Ar)，7.80-7.79(m，2H，Ar)，7.63 (tt，1H，J＝2.4，9.2Hz，Ar)，7.55(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)；¹³CNMR(150 MHz，DMSO-d₆)δ 164.5，162.8(d，J＝248Hz)，162.6(d，J＝248Hz)， 160.9，149.2，142.6，129.2，128.0，125.2，124.9，116.1，110.6(d，J＝28Hz)， 107.7(q，J＝25Hz)；C₁₄H₇F₂NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论 值为276.0467，实测值为276.0469。

7-羧基-2-(2，6-二氟苯基)-苯并噁唑(23)。按照一般步骤由3-氨基 水杨酸制备，得到为白色固体的23(7.3mg，13％)。23的数据：¹H NMR (600MHz，DMSO-d₆)δ 13.48(br.s，1H，CO₂H)，8.16(ABX，1H，J＝1.2， 8.2Hz，Ar)，8.00(ABX，H，J＝1.2，7.6Hz，Ar)，7.78(m，1H，Ar)，7.57 (ABX，1H，J＝7.6，8.2Hz，Ar)，7.40(t，2H，J＝8.5Hz，Ar)；¹³C NMR(150 MHz，DMSO-d₆)δ 164.5，160.4(d，J＝256Hz)，160.3(d，J＝257Hz)， 154.9，148.9，142.1，134.8(t，J＝10Hz)，128.0，125.1，125.0，116.0，113.0 (d，J＝22Hz)，112.9(q，J＝21Hz)，105.1(t，J＝17Hz)；C₁₄H₇F₂NO₃(MH⁺) 的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为276.0467，实测值为276.0467。

7-羧基-2-[(3-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(24)。按照一般步骤由3- 氨基水杨酸制备，得到为白色固体的24(7.9mg，13％)。24的数据： ¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.51(br.s，CO₂H)，8.48(ABX，1H， J＝8.2Hz，Ar)，8.40(s，1H，Ar)，8.10(AMX，1H，J＝1.2，7.9Hz，Ar)，8.05 (ABX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.96(AMX，1H，J＝1.2，7.6Hz，Ar)，7.94(ABX， 1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.54(AMX，1H，J＝7.9，7.6Hz，Ar)；¹³C NMR(150 MHz，DMSO-d₆)δ 164.6，161.7，149.3，142.7，131.3，131.0，130.0(q， J＝32Hz)，128.6(d，J＝3Hz)，127.7，127.2，125.0，124.8，123.7(q，J＝272 Hz)，123.5，116.0；C₁₅H₈F₃NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值 为308.0529，实测值为308.0532。

7-羧基-2-[(2-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(25)。按照一般步骤由3- 氨基水杨酸制备，得到为白色固体的25(13.8mg，22％)。25的数据： ¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.46(br.s，1H，CO₂H)，8.18(d，1H， J＝7.6Hz，Ar)，8.14(AMX，1H，J＝1.2，7.9Hz，Ar)，8.03(d，1H，J＝7.9Hz， Ar)，7.98(AMX，1H，J＝1.2，7.6Hz，Ar)，7.94(t，1H，J＝7.3Hz，Ar)，7.89 (t，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.56(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)；¹³C NMR(150 MHz，DMSO-d₆)δ 164.6，161.1，149.3，142.4，133.0，132.4，132.2，127.8， 127.6，127.2(q，J＝6Hz)，125.0，124.9，123.4(q，J＝273Hz)，116.2； C₁₅H₈F₃NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为308.0529，实测 值为308.0534。

7-羧基-2-(3，5-二氯苯基)-苯并噁唑(26)。按照一般步骤由3-氨基 水杨酸制备，得到为白色固体的26(7.0mg，11％)。26的数据：¹H NMR (600MHz，DMSO-d₆)δ 14.00-12.80(br.s，CO₂H)，8.10-8.08(m，3H，Ar)， 7.98-7.96(m，2H，Ar)，7.55(t，1H，J＝7.8Hz，Ar)；¹³C NMR(150MHz， DMSO-d₆)δ 164.5，160.5，149.2，142.6，135.2，131.5，129.4，128.0，125.6， 125.2，124.8，116.2；C₁₄H₇Cl₂NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论 值为307.9876，实测值为307.9874。

7-羧基-2-(2，6-二氯苯基)-苯并噁唑(27)。按照一般步骤由3-氨基 水杨酸制备，得到为白色固体的27(10.3mg，17％)。27的数据：¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ 13.90-13.10(br.s，CO₂H)，8.16(AMX，1H， J＝7.9Hz，Ar)，8.02(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.78-7.72(m，3H，Ar)， 7.60(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)；¹³C NMR(150MHz，DMSO-d₆)δ 164.4， 158.3，149.1，141.7，134.9，134.2，128.8，128.2，126.5，125.3，125.2，116.2； C₁₄H₇Cl₂NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS)理论值为307.9876，实 测值为307.9875。

7-羧基-2-苯基-苯并噁唑(28)。按照一般步骤由3-氨基水杨酸制 备，得到为白色固体的28(13.1mg，27％)。28的数据：¹H NMR(600 MHz，DMSO-d₆)δ 13.48(br.s，1H，CO₂H)，8.20-8.19(m，2H，Ar)，8.05 (AMX，1H，J＝1.2，7.9Hz，Ar)，7.92(AMX，1H，J＝1.2，7.6Hz，Ar)， 7.66-7.62(m，3H，Ar)，7.50(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)；¹³C NMR(150 MHz，DMSO-d₆)δ 164.8，163.1，149.2，142.9，132.2，129.4，127.4，127.2， 126.0，124.7，124.4，115.8；C₁₄H₉NO₃(MH⁺)的HRMS(MALDI-FTMS) 理论值为240.0655，实测值为240.0656。

其它实施方案

应当理解的是，尽管已经连同其详细说明阐述了本发明，但前文 的描述仅具说明作用，不限制本发明的范围。本发明的其它方面、优 势和修改都在下文提出的权利要求书的范围内。