一种防治松突圆蚧的虫生真菌粉剂及其生产方法和用途

摘要

本发明公开了一种防治松突圆蚧的虫生真菌粉剂及其生产方法和用途。防治松突圆蚧的虫生真菌粉剂是采用拟盘多毛孢真菌(Pestalotiopsis olivacea)菌种，通过一级固体菌种培养、二级液体培养和三级固体培养，将培养物加工而成。本发明的生产方法，包括如下步骤：1)一级固体菌种培养；2)二级液体培养；3)三级固体培养；4)经过半成品自然阴干至含水率为10％－14％；5)用粉碎机粉碎，要求粒径为0.2－0.5cm，6)包装。本发明防治松突圆蚧的虫生真菌粉剂主要用于防治松突圆蚧，也可用于防治湿地松粉蚧，对气候干旱和湿润地区均适用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物制剂，具体是一种防治松突圆蚧的虫生真菌粉剂，以及它的生产方法和应用。

背景技术

我国长江以南以马尾松为主的松林面积达3300多万hm²，是我国最主要的植被组成成份之一，同时也是我国人造板、造纸、林产化工等林产工业的最主要原料，松树在我国具有重要的经济、社会和生态效益。然而，目前这一重要的森林资源正面临着松突圆蚧的严重威胁。该虫于1982首先在广东省发现，危害较重的林分3～5年时间可成片枯死，大发生时，可使每公顷松林材积生长量下降2.548m³，是松毛虫为害损失的3.2倍。到2001年，松突圆蚧已扩散到广东省的60个县(市)，有虫面积达132万hm²，其中发生危害面积44万hm²，特别严重濒临死亡的马尾松林5.02万hm²。并且以每年6.7万公顷的速度向周边地区扩展。至今，不仅广东全境的松树受其危害，损失惨重，近年来又在福建、广西等地迅速扩散蔓延，从幼树至二三十年生的大树均可受害，造成大面积的松林枯死，防控形势非常严峻。为了遏制松突圆蚧的蔓延，国内学者对其防治技术进行了研究。

松突圆蚧Hemiberlesia pitysophila Takagi，又名松栉盾蚧，隶属同翅目Homoptera蚧总科Cocoidea盾蚧科Diaspididae灰圆盾蚧亚科Diaspidinae突圆蚧属Hemiberlesia。该虫在国外仅分布于日本，国内分布在广东、福建、广西、香港、澳门、台湾。

松突圆蚧在松属树种中有着广泛的寄主，可寄生马尾松、湿地松、火炬松、加勒比松、卵果松、展松、短叶松、卡西亚松、晚松、光松、沙松、南亚松、黑松和琉球松等。在我国松突圆蚧的发生区，目前主要危害马尾松、湿地松和加勒比松。

目前，控制该虫危害的主要措施有：加强检疫封锁，禁止进口松类苗木和严禁蚧虫发生区内的松苗、松枝、原木向非发生区运输；营造阔叶树林带，缓解松突圆蚧的蔓延；对受害严重濒临枯死的松林，实施林分阶伐改造；加强松突圆蚧疫区松林采脂管理，严禁进行掠夺性采刈。这些措施对减少虫源，控制松突圆蚧的大发生起到了一定的作用。

采用天敌防治松突圆蚧是一项重要的防控措施。松突圆蚧花角蚜小蜂是我国在1986-1988年从日本冲绳引进防治松突圆蚧的天敌昆虫。该小蜂在广东一年发生9-10代，以蛹越冬，雌雄蜂的寄主不同，雌性蜂以松突圆蚧的雌性成蚧为寄主，营内寄生。雄性蜂则是营体外寄生的重寄生蜂，以松突圆蚧雌性僵蚧体内的同种或它种寄生蜂的老熟幼虫，预蛹和蛹作为寄主。至1998年广东省累计放蜂防治面积达103.2万公顷，取得较好效果，寄生率在20％-30％。1999年后，因花角蚜小蜂种源缺乏而使放蜂防治工作中断，致使不少地方松突圆蚧危害又呈上升扩展趋势。此外广东省还开发利用本地天敌，包括黄蚜小蜂、丽蚜小蜂、瓢虫、蓟马等，其中范氏黄蚜小蜂的自然寄生率可达33.24％。

探索微生物防治技术也取得一些可喜的进展。用寄生在甘蔗粉蚧上的寄生曲霉菌对松突圆蚧进行致病力试验，其寄生率为13.9％～64.9％。另据报道，采用板栗红蚧上分离的芽枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)菌粉对3467头松突圆蚧毒力测定，平均死亡率达38.9％；林间试验效果达20.0％以上，最高达57.7％。

以上这些防控措施，存在防控效果不理想或防控寄生率低的不足。因此，必须针对松突圆蚧的定殖特点，研制出有效防治和控制松突圆蚧的应用技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防治松突圆蚧的虫生真菌粉制剂，以及粉剂的生产方法和用途。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

本发明提供一种防治松突圆蚧的虫生真菌粉剂，是采用拟盘多毛孢真菌(Pestalotiopsis olivacea)菌种，通过一级固体菌种培养、二级液体培养和三级固体培养，将培养物加工而成。所述的拟盘多毛孢真菌(Pestalotiopsis olivacea)是发明人从自然染病的松突圆蚧僵虫体上分离并经纯化获得，经形态和rDNA ITS序列分子鉴定为拟盘多毛孢真菌(Pestalotiopsis olivacea)。

本发明防治松突圆蚧的虫生真菌粉剂的生产方法，包括如下步骤：

1)一级固体菌种培养：

一级固体菌种培养：在无菌条件下，将拟盘多毛孢真菌(Pestalotiopsis olivacea)菌种接入用马玲薯过滤液与蔗糖和琼脂制成平板或用试管制成斜面的培养基中，置入恒温培养箱内，在温度为28℃条件下培养4-5d，待菌丝长满培养基表面时备用；

2)二级液体培养，分两步操作：

培养的第一步：在无菌条件下，将1)培养好的一级菌种一个平板或一支斜面接入盛装有500ml培养液的1000ml大三角瓶中，摇床上培养3d，培养温度在15℃～32℃之间，得到菌液；

第二步：将第一步培养好菌液，加入到装有培养液的发酵灌中培养4d，培养温度在15℃～32℃之间，至获得粘稠的液体培养物即菌液；

3).三级固体培养：在无菌培养室内，将发酵灌培养好的菌液与灭过菌的固体培养基按重量比1:1.5的比例混和拌匀，然后铺于培养床上，于15℃～32℃下培养7～10d，至菌丝长满并产生孢子；

4).将3)完成的半成品移至干燥车间自然阴干至含水率为10％-14％；

5).将4)完成的产品用粉碎机粉碎，要求粒径为0.2-0.5cm；

6).将5)粉碎后的产品包装。

其中，步骤1)中所述的平板或用试管制成斜面的培养基成分及其配比为：去皮马玲薯200mg，切碎煮30min，取过滤液，蔗糖10g，琼脂20g，自来水定容至1000ml；步骤2)中所述的二级液体培养的液体培养基成分及其配比为：花生饼粉50g，面粉50g，蔗糖10g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄0.2g，自来水定容至1000ml；步骤3)中所述的固体培养基原料成分为统糠和麸皮，它们的重量比为5:5或4:6。

本发明防治松突圆蚧的虫生真菌粉剂可用于防治松突圆蚧，也可用于防治湿地松粉蚧，对气候干旱和湿润地区均适用。

本产品的使用方法：本产品要求低温、阴凉、干燥处室内保存。保存良好的菌粉，一年四季均可使用。林间施用时，可采用机动喷雾机喷粉、灭火机喷粉、粉炮炸粉、或站在高处徒手撒粉，使菌粉在林冠层扩散。

效果检查：在喷菌后1个月即可检查松突圆蚧死虫率。在喷过菌粉的松树树冠的中、下部位，用高枝剪剪下一小枝桠，摘取枝梢稍老、有蚧虫的针叶1小撮；然后间隔5—10株，再行重复取样。根据防治面积大小，可选择5—10株松树的针叶，混合后，抽出50—100束松针，在解剖镜或手持放大镜下，清点针叶基部松突圆蚧的活虫、死虫数量，按下式计算死亡率：

死亡率＝死虫口数÷总虫口数

在未防治地区按相同方法取样作为对照。防治效果按下式计算：

校正死亡率＝死亡率—对照的自然死亡率

用松突圆蚧的虫生真菌粉剂防治松突圆蚧害虫具有以下优点：

1.本产品为无公害的生物制剂，对人畜无害，不易产生抗性，尤其是其可通过体壁侵染害虫，这种独特的侵染方式可用来防治对化学农药易产生抗性的刺吸式口器害虫(蚜虫、叶蝉、蚧虫等)，有利于维护生态平衡；减少化学农药的使用量，降低防治成本；可降解，减少环境污染；易于生产等。

2.针对松突蚧虫体小、繁殖速度快、寄生部位隐蔽、防治难度大的问题，开发了松突圆蚧虫生真菌粉剂，通过向松突圆蚧发生林区喷洒该菌粉，利用虫生真菌与松突圆蚧的特异识别能力，能准确的寄生于蚧虫虫体并导致蚧虫死亡，死亡率达80％以上，从而有效地解决了松突圆蚧防治难的问题。

3.应用本产品防治松突圆蚧，一年四季均可取得很好的防治效果，对不同季节孵化及不同世代的蚧虫，均可有效感染。突破了白僵菌的季节使用缺陷。

4.人工施用本产品，在局部形成优势菌群落，使蚧虫感染病菌的机会大大增加；菌粉可随气流、水流自然扩散，扩大了感染区域；感病死亡的蚧虫，脱落后可随空气、雨水流动，形成传播，促使流行病发生，有显著的流行潜力，流行病发生可自然控制害虫种群数量，可产生持续控制的良好效果。

5.本发明生产方法简单，工艺条件不苛刻，容易操作，原材料易得，成本低廉，无污染，所得产品防治松突圆蚧效果显著，产品使用方法多样、随意、简便，有广阔的应用前景。

具体实施方式

1.目的菌株的获得

采用踏查和完全随机设置样地调查相结合的方法，对广西境内松突圆蚧发生区中自然死亡率高的林区进行调查和采集死虫，实验室内对典型虫尸进行虫生真菌的分离和纯化，共获得一批松突圆蚧虫生真菌。对分离过程中出现频率较高的菌株进行液体培养，用于接种防治试验，检测各菌株的致病毒力。经室内接种、庭院盆栽幼树接种、野外幼林接种、野外成林接种等一系列水剂试验，从供试菌株中筛选出2号菌株为目的菌株。经形态观察和分子技术分析，该菌株鉴定为拟盘多毛孢属的真菌Pestalotiopsis olivacea。

2.目的菌株对不同培养基的生长适应性

配置A、B、C、D四种培养基制成平板，分别取5mm的供试菌块接种，8次重复，28℃恒温培养，分别于48h、72h、96h测量菌落生长直径，结果见表1。

目的菌株在A培养基上生长速度最快，48h时菌落直径达21.0mm，且在之后的培养中，均以在该培养基上生长最好；在C培养基上生长次之，在D培养基上生长速度居第三，而在B培养基上生长最差。说明目的菌株在不同营养条件下生长速度有一定的差异。

表1菌株在不同培养基上的生长速度(单位：mm)

 

培养时间A培养基B培养基C培养基D培养基平均值径48h21.016.017.516.517.7572h32.021.528.025.026.6396h40.027.038.034.034.75

培养基配方(1000ml水中)：

A培养基：去皮马玲薯200mg，切碎煮30min，取过滤液，蔗糖10g。

B培养基：麸皮50g，蔗糖10g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄0.2g。

C培养基：花生饼粉50g，蔗糖10g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄0.2g。

D培养基：花生饼粉40g，麸皮10g，蔗糖10g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄0.2g。

3.目的菌株对不同温度的生长适应性

在15℃、20℃、28℃、32℃、35℃温度梯度培养中，目的菌株也表现出不同的生长适应性(表2)。在供试的两种培养基上均以20℃生长最好，高温对其生长有不利的影响，但在35℃时仍有弱生长，表现出能适应生长的温度范围较宽。

表2菌株在不同温度下的生长速度(菌落直径，单位：mm)

 

培养基培养时间15℃20℃28℃32℃35℃A培养基48h18.026.021.010.59.296h36.548.540.011.510.5B培养基48h16.527.016.010.09.796h26.052.527.010.010.5

4.目的菌株的产孢量及菌粉含孢率

分别对培养6d、7d、8d、9d三级培养的培养物检测其产孢量，以白僵菌为对照，结果见表3。

表3菌株产孢情况(单位：10⁸个/g)

 

培养天数菌株重复1重复2重复3重复4平均产孢量6d2号16.014.020.016.016.50白僵菌15.016.011.020.015.507d2号24.018.020.020.020.5白僵菌23.019.023.020.021.258d2号26.021.022.023.023.0白僵菌21.020.021.022.021.09d2号21.024.018.025.022.0白僵菌23.027.026.020.024.0成品27d2号58.042.055.050.051.25

由表3可以看出，培养至6d、7d、8d时，目的菌的产孢量略高于白僵菌，9d后产孢量减慢，而白僵菌产孢量增长较快。但在成品时，由于有后熟作用，目的菌的孢子量明显增加，这应该说与其生长适应性较强有很关。

下面结合实施例对本发明的生产方法和应用作进一步的描述：

防治松突圆蚧的虫生真菌粉剂的生产实施例：

实施例1：第一批菌粉生产

2007年10月，月平均气温27℃，最低温14℃，最高温36℃；大气湿度50％-70％，正值广西特旱时期。在实验室内采用马玲薯固体培养基(1000ml水中：去皮马玲薯200mg切碎煮30min取过滤液，蔗糖10g，琼脂20g)接种拟盘多毛孢Pestalotiopsis olivacea菌块(直径为5mm)，28℃培养5d，制成一级菌种。进入生产车间进行二级培养，其中：在盛装500ml的花生饼培养液(花生饼粉50g，面粉50g蔗糖10g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄0.2g，自来水1000ml)的1000ml大三角瓶中接入一级培养的菌种1皿，培养3d；将2瓶三角瓶扩大培养的菌液加入到装有7000ml花生饼培养液的发酵灌中继续培养4d，培养温度在16℃至35℃之间。按液体:固体的重量比为1:1.5，将发酵灌培养好的菌液接种到灭过菌的统糠麸皮固体培养基中拌匀，所用统糠麸皮(二者重量比为4:6)固体培养基1000kg，混合物铺于培养床上培养7d，室温下至菌丝长满后，移至干燥车间自然阴干至含水率为10％～12％。粉碎机粉碎至粒径为0.2cm，获得含孢量46×10⁸个的松突圆蚧虫生真菌粉剂750kg，用编织袋包装。

实施例2：第二批菌粉生产：

2008年3月初，月平均气温19℃，最低温10℃，最高温26℃；大气湿度90％-95％，正值广西特大冰冻后的阴雨时节。在实验室内采用马玲薯固体培养基(1000ml水中：去皮马玲薯200mg切碎煮30min取过滤液，蔗糖10g，琼脂20g)接种拟盘多毛孢Pestalotiopsis olivacea菌块(直径为5mm)，28℃培养5d，制成一级菌种。进入生产车间进行二级培养，其中：在盛装500ml的花生饼培养液(花生饼粉50g，面粉50g，蔗糖10g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄0.2g，自来水1000ml)的1000ml大三角瓶中接入一级培养的菌种1支，培养3d；将2瓶三角瓶扩大培养的菌液加入到装有7000ml花生饼培养液的发酵灌中继续培养4d，培养温度在12℃至26℃之间。按液体:固体的重量比为1:1.5，将发酵灌培养好的菌液接种到灭过菌的统糠麸皮固体培养基中拌匀，所用统糠麸皮(二者重量比为5:5)固体培养基6000kg，混合物铺于培养床上培养10d，室温下至菌丝长满后，移至干燥车间自然阴干至含水率为10％-14％。粉碎机粉碎至粒径为0.2cm，获得含孢量36×10⁸个的松突圆蚧虫生真菌粉剂5000kg，用编织袋包装。

防治松突圆蚧的虫生真菌粉剂的防治应用实施例：

实施例3：

1.冬季对松突圆蚧的防治

2007年11月25日于松突圆蚧蚧虫越冬前，在广西博白林场三育分场白梅林站5林班实施林间防治，使用进口弥雾喷粉机作业，为了保证防治效果，此次防治于清晨6时树叶露水未干时作业，每公顷喷施松突圆蚧虫生真菌菌粉7.5kg，防治面积13.33公顷。分别于2007年12月21日、2008年2月25日、2008年5月8日三次连续采样调查松突圆蚧平均死虫率为：95.68％、96.22％、80.18％。表明研制的拟盘多毛孢Pestalotiopsis olivacea菌粉剂在冬季对松突圆蚧产生了良好的防治效果。

2.春季对松突圆蚧的防治

2008年3月11日于春季松突圆蚧蚧虫孵化阶段，在广西岑溪市归义镇实施林间防治，使用进口弥雾喷粉机作业，每公顷喷施菌粉7.5kg，防治面积20公顷。分别于2008年4月18日、2008年8月1日调查松突圆蚧平均死虫率为：97.9％和84.1％。表明研制的拟盘多毛孢Pestalotiopsis olivacea菌粉剂在春季对松突圆蚧同样产生了良好的防治效果。