漆酶诱导物和其在提高微生物产漆酶能力中的应用

摘要

一种提高微生物菌株产漆酶能力的组合诱导物，包含蔗渣、乙醇及硫酸铜溶液，利用此组合诱导物对白腐菌菌株XG8进行产漆酶比较研究表明，发酵液中漆酶活性与未添加组合诱导物相比，提高了10倍。本发明的诱导物很适合应用于大规模的工业化漆酶的生产。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及漆酶诱导物，及其在提高微生物产漆酶能力中的应用。

背景技术

白腐真菌是自然界最重要的木素降解菌，其产生和分泌一系列能降解木质素及其异生物质的酶类，它们主要包括木素过氧化物酶，锰过氧化物酶和漆酶。漆酶主要是由引起木材白色腐朽的担子菌分泌，是重要的木素降解酶，属于含铜的一类多酚氧化酶，它可以通过分子氧使酚化合物氧化，脱除木材、纸浆中的木素，使纸浆和造纸工业中的流出物脱色和降解，能显著减少排放到环境中的有毒污染物。

据报道，酚类底物、乙醇和某些金属离子对漆酶的产生和分泌有诱导作用。酚类底物通常都含较多的-OH，-NH₂，木质素是由香豆醇、松柏醇及芥子醇等苯丙烷单体构成的聚合体作为底物类似物，可以在一定的程度上诱导漆酶的产生。醇类对漆酶的产生也有一定的诱导作用，乙醇的诱导机制主要分为以下三点(i)增加了膜的渗透性，促进蛋白的分泌；(ii)防止单个芳香化合物聚合；(iii)通过氧化作用间接诱导漆酶的合成。金属离子的诱导作用有很多报道，其中CuSO₄是使用最多、诱导最好的重金属诱导剂，Cu²⁺的加入从两方面提高了漆酶的活性，促进了漆酶的合成，增强了漆酶在细胞外环境中的稳定性。

根据国内外文献报道，不同的培养条件对漆酶活力有显著的影响。试验表明，静止培养有利于XG8菌株产酶，这可能与有些白腐真菌分泌的漆酶对振荡产生的机械剪切力敏感有关，可见振荡培养并不适合部分白腐真菌漆酶的产生。

迄今，现有技术中没有利用蔗渣、乙醇及CuSO₄溶液组合成的漆酶诱导物的报道。

发明内容

本发明旨在为白腐菌产漆酶开发新型诱导物提供一种新的配方。此外利用蔗渣诱导漆酶的产生将有利于漆酶降解蔗渣中所含大量木素分子，从而将被木素分子粘连的蔗渣纤维相互分离，实现蔗渣的脱木素处理，对蔗渣造纸工业有重要应用价值。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

漆酶诱导物，包含蔗渣、乙醇及硫酸铜溶液。

漆酶诱导物，在100ml液体培养基中诱导物成分为：蔗渣干重：10-15g.L^-1，CuSO₄：5-50mg.L^-1，乙醇：20-50g.L^-1。

漆酶诱导物，在100ml液体培养基中诱导物成分为：蔗渣干重：10-15g.L^-1，CuSO₄：20-30mg.L^-1，乙醇：40-50g.L^-1。

漆酶诱导物用于提高微生物产漆酶能力。

漆酶诱导物用于微生物产漆酶能力的培养方法：

(1)种子培养物的制备：

将微生物菌株菌苔接种到葡萄糖液体培养基中，于25℃静止培养10天收获菌体，将菌体断裂，作为种子培养物；

(2)菌株的诱导培养：

将种子培养物接种液体基础培养基中，静止培养，培养4天后添加漆酶诱导物到培养液中，进行诱导培养15天检测并提取漆酶。

所述的方法中，种子培养基组成为：MgSO₄·7H₂O，0.5g，NaCl 0.5g，KH₂PO₄1.0g，NH₄SO₄ 1.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖15g，加水定容至1升，调pH5～6。

诱导物的配制和采用：

CuSO₄溶液：配制1g.L^-1的CuSO₄原始溶液，115℃灭菌20min；分别向100ml的培养液中加入1g.L^-1的CuSO₄溶液，使培养液中CuSO₄终浓度为5-50mg.L^-1；

乙醇溶液：无水乙醇用0.2μm的滤膜过滤除菌；分别向100ml的培养液中加入2.5ml，3.875ml，5.375ml，6.25ml无水乙醇，使培养液中乙醇终浓度为乙醇：20-50g.L^-1；

固体蔗渣：称取1g长约2cm的蔗渣(干重)于115℃灭菌20min。

培养条件为：将菌苔接种到100ml葡萄糖液体培养基中，于25℃静止培养10天收获菌体，将菌体破碎，等量接种到100ml液体基础培养基中，分别在静止、振荡及添加诱导物等不同条件下进行培养，在菌体培养4天后添加诱导物蔗渣干重：10-15g.L^-1，CuSO₄：5-50mg.L^-1，乙醇：20-50g.L^-1于培养液中，进行诱导培养15天提取漆酶并检测。

本发明的优益效果在于：

木素是漆酶的作用底物之一，在培养液中添加一定量的木素溶液有利于漆酶的产生，本试验采用了木素、蔗渣、乙醇及CuSO₄溶液这几种廉价的诱导物，试验结果表明，蔗渣的诱导效果最好，蔗渣具有一定的诱导效果可能和其中含有一定量的木素及酚类诱导物如阿魏酸、香豆酸的诱导作用有关。和国内外文献报道的用昂贵的ABTS及2，5-二甲苯胺作为诱导剂，蔗渣的诱导效果更具有工业化应用的优势。

食用菌白腐酶XG8菌株自身的产漆酶能力不及目前报道的朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)、毛栓菌(Trametes trogii)等，但其添加蔗渣、乙醇及硫酸铜后，漆酶诱导效果显著，可为其它白腐菌菌株产漆酶开发新型诱导物的提供一种新的配方。此外利用蔗渣诱导漆酶的产生将有利于漆酶降解蔗渣中所含的大量木素分子，从而将被木素分子粘连的蔗渣纤维相互分离，实现了蔗渣的脱木素处理，对蔗渣造纸工业有重要的应用价值。提高食用菌湘高8号菌株(侧耳属)产漆酶能力，此组合诱导物既可应用于其它白腐菌菌株用于提高其产漆酶能力。

附图说明

图1为木素、蔗渣诱导下的漆酶酶活比较；

图2为不同浓度铜离子诱导的漆酶活性比较；

图3为不同浓度乙醇诱导的漆酶酶活比较；

图4为组合诱导物协同作用的漆酶酶活比较。

具体实施方式

下面结合附图，用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明。

实施例1：

1.菌株

食用菌XG8菌株：购于云南省昆明市昆明食用菌研究所。

2.培养基、诱导物及培养条件

2.1培养基

培养基组成：MgSO₄·7H₂O，0.5g，NaCl 0.5g，KH₂PO₄ 1.0g，NH₄SO₄ 1.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖15g，加水定容至1升，调pH5～6。该培养基主要用于保藏菌种及在诱导试验中作为基础培养基。

2.2诱导物

CuSO₄溶液：配制1g.L^-1的CuSO₄原始溶液，115℃灭菌20min。在诱导试验中，待菌丝体培养四天后，分别向100ml的培养液中加入1g.L^-1的CuSO₄溶液，使培养液中CuSO₄终浓度分别为5mg.L^-1，8mg.L^-1，10mg.L^-1，20mg.L^-1，50mg.L^-1。

乙醇溶液：无水乙醇用0.2μm的滤膜过滤除菌。在诱导试验中，待菌丝体培养四天后，分别向100ml的培养液中加入2.5ml，3.875ml，5.375ml，6.25ml无水乙醇，使培养液中乙醇终浓度分别为20g.L^-1，31g.L^-1，43g.L^-1，50g.L^-1。

固体蔗渣：称取1g长约2cm的蔗渣(干重)于115℃灭菌20min。在诱导试验中，待菌丝体培养四天后添加入培养液中。

2.3培养条件

将适量菌苔接种到100ml葡萄糖液体培养基中，于25℃静止培养10天收获菌体，后用30粒已灭菌的玻璃珠(直径2mm)将菌体破碎，将破碎的菌体等量接种到装有100ml液体基础培养基的250ml的三角瓶中，分别在静止、振荡及添加诱导物等不同条件下进行培养，其中诱导物在菌体培养4天后添加到培养液中，进行诱导培养。

在培养白腐菌菌株的液体培养基中加入组合诱导物，以提高其产酶能力，添加组合诱导物的成分比例为：蔗渣干重：10-15g.L^-1，CuSO₄：5-50mg.L^-1，乙醇：20-50g.L^-1。

优选：蔗渣(干重)：10-15g.L^-1，CuSO₄：20-22mg.L^-1，乙醇：43-45g.L^-1

添加组合诱导物后继续培养15天左右检测并提取漆酶。

3漆酶活力测定

漆酶测定以2，2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(简称ABTS)为底物，反应体系中含有0.15mmol.L^-1 ABTS，0.1mol.L^-1醋酸钠缓冲液(pH5.2)和适量的粗酶液，于30℃下反应5min，测定反应液在420nm处吸光值的增加值(ε₄₂₀＝36 000M^-1·cm^-1)。定义每分钟使1μmol ABTS转化所需的酶量为1个活力单位(U)。