实时细胞电子分析系统及其在细胞毒性检测和化合物分析上的应用

摘要

本发明包括用细胞－基底阻抗测量分析细胞的器件、系统和方法。一方面，本发明提供细胞－基底阻抗测量器件，由绝缘基底上电极阵列组成。在整个阵列中，每个电极阵列有近似均匀的电阻。另一方面，本发明提供细胞－基底阻抗测量系统，包含一个或多个细胞－基底阻抗测量器件(器件包含多个孔，每个孔都有一个电极阵列)、一个阻抗分析仪、一个器件工作台(连接每个孔的电极阵列到阻抗分析仪)和控制工作台和阻抗分析仪的软件。另一方面，本发明可以用阻抗测量作细胞分析，来检测细胞行为或细胞状态的变化。本方法可以用于测试化合物对细胞的作用，例如细胞毒性分析。本发明还提供分析化合物的细胞毒性的方法。

说明书

本申请为美国专利申请号10/987,732(于2004年11月12日递交)的部分延续，专利申请10/987,732的题目为“实时细胞电子分析系统及其在基于细胞的检测中的应用”(Real Time Electronic Cell SensingSystems and Applications for Cell-based Assays)，该申请享有如下专利申请的优先权申请日期：美国专利临时申请60/519,567，于2003年11月12日递交。专利申请号10/987,732本身是美国专利申请10/705,447(于2003年11月10日递交)的部分延续，专利申请10/705,447的题目为“基于阻抗的检测装置和方法”(“Impedance Based Devices andMethods for Use in Assays”)，该申请享有如下专利申请的优先权申请日期：美国临时专利申请号60/397,749于2002年7月20日递交；美国临时专利号60/435,400，于2002年12月20日递交；美国临时专利申请号60/469,572，于2003年5月9日递交；PCT申请号PCT/US03/22557，于2003年7月18日递交。在本段中所提及的所有专利申请都以参考文献的方式整合到本专利申请中。

上一级美国专利申请号10/987,732亦为美国专利申请10/705,615的部分延续，专利申请10/705,615的题目为“基于阻抗，检测细胞和微粒的装置和方法”(“Impedance Based Apparatuses and Methods forAnalyzing Cells and Particles”)，于2003年11月10日递交，该申请享有如下专利申请的优先权申请日期：美国专利临时申请号60/397,749，于2002年7月20日递交；美国临时专利申请号60/435,400，于2002年12月20日递交，美国临时专利申请号60/469,572，于2003年5月9日递交；PCT申请号PCT/US03/22537，于2003年7月18日递交。在本段中所提及的所有专利申请都以参考文献的方式整合到本专利申请中。

本申请也享有如下专利申请的优先权申请日期：美国临时专利申请号60/542,927(于2004年2月9日递交)、美国临时专利申请号60/548,713(于2004年2月27日递交)和美国临时专利申请号60/614,601(于2004年9月29日递交)。在本段中所提及的所有专利申请都以参考文献的方式整合到本专利申请中。

发明背景

技术领域

本发明涉及基于细胞的分析和检测的领域。具体说，本发明提供了基于阻抗检测细胞的器件装置、微电极板、和系统，以进行细胞分析和基于细胞的检测。

背景技术

生物电子学是正在发展的涉及生物材料和电子仪器的跨学科的研究领域。生物电子方法已经运用于细胞分析以及生物分子和细胞的检测。一种生物电子学的应用是将细胞培养在含有微电极结构的表面，并测量细胞-电极阻抗(cell-electrode impendence)以观察细胞状态的改变。

在PCT申请PCT/US03/22557，题为“基于阻抗的检测装置和方法”(“IMPEDANCE BASED DEVICES AND METHODS FOR USEIN ASSAYS”)，于2003年7月18日递交中，公开了一种用于检测放置于电极表面的细胞和/或分子的装置。此装置通过测量由细胞/分子与电极表面的结合导致电极阻抗的变化来检测细胞和/或分子.此专利申请还揭示了多种此装置的实例以及用于基于细胞的检测的装置、系统。

在抗肿瘤药物开发过程中，研究药物时间相关的毒性作用和药物对细胞增殖的抑制作用是在临床药物开发中获得药物剂量信息的重要方法。尤其是获得时间相关的IC50和观察IC50的不同时间依赖性模式。(例如，见参考文献Hassan SB，Jonsson E，Larsson R and KarlssonMO in J.Pharmacology and Experimental Therapeutics，2001，Vol.299，No.3，pp 1140-1147；Levasseur LM，Slocum HK，Rustum YMand Greco WR，in Cancer Research，1998，vol.58，pp 5749-5761)。一般来说，这些研究使用终点测量的分析方法。在每个时间点，以不同药物浓度处理培养的细胞，需要不同的实验。这就限制了研究细胞毒性的时间点的分辨率和时间点数量。因此，需要有新的技术或方法，提供更高的时间分辨率，并可提供多个时间点的测量。

本发明进一步扩展了以下专利申请的发明：申请号为PCT/US03/22557，题为“基于阻抗的检测装置和方法”，递交于2003年7月18日的PTC申请；美国专利申请号10/705,447(于2003年11月10日递交)，题为”基于阻抗的检测装置和方法”(IMPEDANCEBASED DEVICES and Methods for use in assays)(专利代理人编号为ACE-00101.P.1.1-US)的申请。本发明进一步提供了一种使用测量细胞-基底阻抗的实时细胞电子分析系统，以进行基于细胞的检测，并提供了使用此系统进行基于细胞检测的一种方法。

发明概述

一方面，本发明提供了一种器件(device)来检测细胞-基底阻抗(cell-substrate impedance)，这个器件包括：a)一个绝缘的基底(nonconducting substrate)；b)两个或多个加工于基底的电极阵列(electrode array)，其中每个电极阵列包括两个电极结构(electrodestructure)；c)至少两个连接盘(connection pad)，各个连接盘位于基底的边缘部位。器件的各个电极阵列在整个阵列上的电阻分布是近似均匀的。器件的基底有适于细胞贴附与生长的表面，细胞在所述的基底的表面上的贴附或生长可引起各个电极阵列上的电极结构之间的可被检测的阻抗变化。在优选实例中，在本发明部件的基底的各个电极阵列上连接有一个不渗液的容器。

再一方面，本发明提供了一种细胞-基底阻抗测量系统(a cell-substrate impedance measurement system)包括：a)至少一个多孔器件可检测细胞-基底阻抗，其中多孔(multiple-well)中至少有两个孔带有孔底电极阵列；b)一个阻抗分析仪(impedance analyzer)；c)用于放置一个或多个多孔器件和用于将孔中的电极阵列电子连接于阻抗分析仪的器件检测台(device station，或称器件工作台)；d)用于控制器件检测台(或称器件工作台)和从阻抗分析仪测得的阻抗值获得数据并进行数据分析的软件系统。在本发明的一种优选实例中，多孔器件的每个电极阵列是可以单个选通的(意即单个电极阵列可独立地连通到阻抗分析仪)。

另一方面，本发明提供了一种利用本发明器件测量细胞的基底阻抗的方法。此方法包括：提供本发明的多阵列器件；将上述多阵列器件连接于阻抗分析仪(impedance analyzer)；添加细胞于器件的两个或多个阵列上的至少一个阵列中；并检测器件上的一个或多个电极阵列上的细胞-基底阻抗。

另一方面，本发明提供了细胞变化指数(Cell Change Index)的计算方法，以定量和比较细胞-基底阻抗。

另一方面，本发明提供了一种计算连接于细胞-基底仪器上阵列和连接盘之间的电传导线的电阻的方法。这个电传导线的电阻被用于计算细胞指数(Cell Index)。

另一方面，本发明提供了使用本发明的细胞-基底阻抗测量系统来测量细胞-基底阻抗(cell-substrate impedance)的方法。这个方法包括：提供本发明的细胞-基底阻抗测量系统；将细胞添加于带有电极阵列的多孔器件的至少一个孔中；检测一个或多个添加有细胞的孔的细胞-基底阻抗。阻抗可在规则或不规则的时间间隔被测量。在一种优选实例中，在多孔器件上的至少两个孔进行细胞-基底阻抗检测。

另一方面，本发明提供了一种基于细胞的实时检测方法，可检测一种或多种化合物对细胞所产生的影响。该方法包括：提供上述的细胞-基底阻抗测量系统；将细胞置于带有电极阵列的至少一个或多个孔中；在有细胞的一个或多个孔中加入一种或多种化合物；在加入化合物之前和加入化合物之后检测一个或多个孔上电极阵列的细胞-基底阻抗。优选的是，在一个或多个加有细胞的孔中加入一种或多种化合物后，在规则的或不规则的时间间隔上检测细胞-基底阻抗。与时间相关的阻抗值的变化可提供加入化合物前的与时间相关性的细胞状态的信息，以及与化合物反应时与时间相关的细胞状态的信息。这些信息可用以确定化合物对细胞的作用。

在另一方面，本发明提供一种对至少一种化合物的细胞毒性进行实时检测的方法，包括：提供上述的细胞-基底阻抗测量系统；将细胞置于带有电极阵列的至少一个或多个孔中；在一个或多个有细胞的孔中加入一种或多种化合物；在加入化合物之前和加入化合物之后检测一个或多个孔上电极阵列的细胞-基底阻抗，此与时间相关的阻抗变化提供了化合物时间依赖性的毒性作用的信息。优选的是，在一个或多个有细胞的孔中加入一种或多种化合物后，在规则的或不规则的时间间隔检测细胞-基底阻抗。时间相关的阻抗值的变化可提供化合物的任何可能存在的毒性作用。

在上述方法的一个优选实例中，在多个孔中加入相同类型细胞，在带有相同细胞的不同孔中加入不同浓度的化合物。此方法可提供与时间相关的和与浓度相关的毒性作用信息。

另一方面，本发明提供了一种分析和比较两种化合物对某种细胞产生的与时间相关的毒性反应的方法。该方法包括：a)用上述方法实时检测第一种化合物对一种细胞的毒性作用；b)用上述方法实时检测第二种化合物对上述细胞的毒性作用；c)比较两种化合物与时间相关的细胞毒性反应。

在这种方法的一个实例中，与时间相关的细胞毒性反应是在第一种化合物的多个浓度的条件下测得。在另一个实例中，与时间相关的细胞毒性反应是在第二种化合物的多个浓度条件下测得。在另一个实例中，与时间相关的细胞毒性反应是在第一种化合物和第二种化合物的多个浓度条件下测得。

另一方面，本发明提供一种化合物对多种细胞类型的细胞毒性的检测方法，包括：a)用上述方法实时检测化合物对不同种类细胞的细胞毒性作用；b)分析不同类型细胞对该化合物的实时细胞毒性反应，以获得化合物的细胞毒性图谱。在另一个实例中，上述方法应用于检测多种化合物对多种类型的细胞的毒性作用。

附图说明

图1是本发明细胞-基底阻抗测量器件(或称装置)的图示。A)显示基底上安置有2行8列共16个电极阵列(或者16个电极结构单位)。B)图显示器件装置的单个电极阵列。C)是电极阵列的图示，要求在整个电极阵列上的电阻分布是近似均匀的。

图2是使用本发明的细胞-基底阻抗电子检测系统实时检测置于检测器件上的不同细胞数目的H460细胞的增殖状况。每隔15分钟检测并记录细胞增殖状况，持续检测125小时。细胞生长曲线被绘制成对数值，显示细胞处于对数生长期或是静止期.

图3是使用本发明的细胞-基底阻抗电子检测系统实时检测NIH3T3细胞贴附和伸展过程.在包被有多聚赖氨酸或纤连蛋白的检测器件(板)上接种细胞。细胞在不同的包被上贴附和伸展的过程被实时地每隔3分钟检测，共测量3小时以上。

图4是使用本发明的细胞-基底阻抗电子检测系统实时检测置于检测器件(板)上的Cos-7细胞的形态学改变。细胞血清饥饿8小时后用50ng/mL EGF刺激。每隔3分钟测量细胞的形态学变化，测量2小时，然后每隔1小时测量一次，共测量14小时。经EGF处理的细胞出现的最初的波峰是由于细胞膜的收缩和肌动蛋白对EGF的反应。箭头所指处为EGF刺激点。

图5是用抗肿瘤药物paclitaxel(紫杉醇)处理的H460细胞的细胞指数随时间变化的曲线。不同孔中的H460细胞在对数生长期加入不同浓度的paclitaxel，并用本发明细胞-基底阻抗电子检测系统实时检测细胞在加入药物后对不同剂量浓度的paclitaxel的动态反应，每隔15分钟测一次，持续50小时。加入67nM到500nM之间浓度的paclitaxel后，H460细胞的细胞指数表现出缓慢的下降。然而，细胞指数在某一时间点会达到一个最小值。这个时间点取决于药物的浓度，一般在加入药物后15到20个小时。在这个时间点之后，细胞指数表现出缓慢的上升。33nM药物处理后的细胞，在加药15个小时内，表现出几乎衡定的细胞指数。在加药15个小时后，细胞指数表现出缓慢的上升。

图6是用抗肿瘤药物AC101103处理的H460细胞的细胞指数随时间的变化曲线。不同孔中的H460细胞在对数生长期加入不同浓度的AC101103。用本发明细胞-基底阻抗电子检测系统实时检测细胞在加入药物后对不同剂量浓度的AC101103的动态反应，每隔30分钟测一次，持续20小时。图6中细胞指数随时间的变化曲线与图5显示的有很大的不同。药物浓度在3.125ug/ml、6.25ug/ml和12.5ug/ml时，细胞指数分别在加药5个小时、15个小时和20个小时后几乎不变.药物浓度为25ug/ml时，加入药物后细胞指数呈现缓慢的下降。药物浓度为50ug/ml时，加药后十个小时的时间内，细胞指数几乎维持在一个水平，十个小时以后则稳定下降。

图7是经doxorubicin处理的A549细胞的药物动态反应曲线.在16孔细胞-基底阻抗检测器件(或称检测板)中，每孔接种10000个A549细胞。在药物处理前用本发明的细胞-基底阻抗电子检测系统检测细胞的贴附和生长。当细胞处于对数生长期时，在细胞中加入不同浓度的doxorubicin。另外，在某个孔中加入等量用来溶解药物的溶剂，作为溶剂对照。此图实时记录细胞对药物Doxorubicin的时间、药物浓度依赖性曲线。

图8定量本发明的器件上培养的NIH3T3细胞。接种给定细胞数的细胞到加工有电子传感阵列(图1B)的微孔检测器件(板)中。电子传感阵列事先由纤连蛋白包被。接种细胞两个小时后，用本发明的细胞-基底阻抗电子检测系统检测细胞指数。

图9A和B用本发明的细胞-基底阻抗检测系统检测不同细胞(表1列出)对doxorubicin处理的反应。接种所示的细胞系到加工有电子传感阵列(图1B)的微孔检测器件(板)中。在加入doxorubicin之前和之后，以15、30或60分钟的间隔，持续检测细胞的反应。

图10A和B用本发明的细胞-基底阻抗检测系统检测不同细胞(表1列出)对olomoucine处理的反应。接种所示的细胞系到加工有电子传感阵列(图1B)的微孔检测器件(板)中。在加入olomoucine之前和之后，以15、30或60分钟的间隔，持续检测细胞的反应。

图11A和B用本发明的细胞-基底阻抗检测系统检测不同细胞(表1列出)对paclitaxe处理的反应。接种所示的细胞系到加工有电子传感阵列(图1B)的微孔检测器件(板)。在加入paclitaxe之前和之后，以15、30或60分钟的间隔，持续检测细胞的反应。

图12A用本发明的细胞-基底阻抗检测系统检测MV522细胞对doxorubicin处理的反应。接种MV522细胞到加工有电子传感阵列(图1B)的微孔检测器件(板)，并用DMSO或者doxorubicin在指示的时间用指示的浓度处理细胞。

图12B显示MV522细胞对doxorubicin处理的细胞生物学效应的检测结果。细胞用FACS分析细胞周期，或者用CFDA和Cy3-Annexin V处理，估计细胞的存活率。另外，细胞被固定后用pahlloidin染色，检查细胞形态。并用配有CCD照相机的荧光显微镜拍照，显示细胞的存活率和细胞形态。

图13A用本发明的细胞-基底阻抗检测系统检测A549细胞对olomoucine处理的反应。接种A549细胞到加工有电子传感阵列(图1B)的微孔检测器件(板)，并用DMSO或者doxorubicin在指示的时间用指示的浓度处理细胞。

图13B显示MV522细胞对olomoucine处理的细胞生物学效应的检测结果。细胞用FACS分析细胞周期，或者用CFDA和Cy3-Annexin V处理，估计细胞的存活率。另外，细胞被固定后用pahlloidin染色，检查细胞形态。并用配有CCD照相机的荧光显微镜拍照，显示细胞的存活率和细胞形态。

图14A用本发明的细胞-基底阻抗电子检测系统检测A549细胞对paclitaxel处理的反应。接种A549细胞到加工有电子传感阵列(图1B)的微孔检测器件(板)，并用DMSO或者paclitaxel在指示的时间用指示的浓度处理细胞。

图14B显示A549细胞对paclitaxe处理的细胞生物学效应的检测结果。细胞用FACS分析细胞周期，或者用CFDA和Cy3-Annexin V处理，估计细胞的存活率。另外，细胞固定后用pahlloidin染色，检查细胞形态。并用配有CCD照相机的荧光显微镜拍摄细胞照片，观察细胞的存活率和细胞形态。

图15是指示的细胞系经化合物(15A：Doxorubicin；15B：Paclitaxel；15C：Olomoucine；15D：Tamoxifan)处理的IC50值的时间相关曲线。用本发明的细胞^-基底阻抗检测系统，获得细胞指数曲线。对于这样的细胞指数曲线，每隔5个小时作一次分析，以得到IC50值.

图16A显示HT29细胞在各种化合物处理之前和之后的细胞指数曲线。此图也是细胞指数理论上的指数增长曲线(用“对数增长模式”标记)和细胞用DMSO溶媒对照处理的细胞指数曲线(用“HT29对照”标记)。

图16B显示从图16A细胞指数曲线中获得的细胞变化指数(CCI)曲线。图中还展示了基于图16C定义的“黑白阴影图”，各种黑白阴影用于显示不同的细胞反应。

图16C是表示CCI曲线所用图形的定义。如果DT是细胞在培养基上指数增长两倍所需的时间，那么CCI相对于0.7/DT有不同的值，表示细胞不同的变化状态。如果CCI远远大于0.7/DT(CCI曲线中用矩形表示)，细胞指数增长比预期的指数增长(或对数增长)快。如果CCI接近0.7/DT(CCI曲线中用矩形表示)，细胞指数与预期的指数增长有相同的增长率。如果CCI比零大，但是比0.7/DT小(CCI曲线中用矩形表示)，那么细胞指数的增长率比预期指数增长慢.如果CCI接近于零(CCI曲线中用矩形表示)，那么细胞指数几乎是一个稳定值。如果CCI是负值，那么细胞指数随着时间变化而减小(CCI曲线中用矩形表示)，显示细胞离开电极表面，去脱壁，或者改变它们的形态。如果CCI是负的且绝对值很大(CCI曲线中用矩形表示)，那么随着时间变化，细胞指数下降很快，显示细胞失去与电极表面的贴附，或者改变它们的形态。去掉CCI值中短暂的、快速的噪音，这样，整体CCI曲线用一个、两个或三个黑白阴影矩形表示。

图17显示每个被测细胞系中的细胞对指示的化疗试剂的反应。对于每个细胞系和化合物，在某个IC50浓度下，用它们相应的RT-CES系统(实时细胞电子检测)检测到的细胞反应，来计算时间相关的细胞指数变化指数(CCI)(IC50与时间有关，我们使用加入药物30个小时时的IC50浓度，或者最接近这个的浓度)。根据图16C所示的定义，画出与特定细胞反应相关的特定CCI曲线，并将具有有相似作用机理的化合物的反应画成一组。DOX表示doxorubicin；5-F表示5-Fluorouracil；COL表示Colcemid；TAXOL表示paclitaxel；VIN表示vinblastin；OLOM表示Olomoucine；ROS表示Roscovitine；STAU表示Staurosporine；TAMO表示Tamoxifan；RIFA表示Rifampicin；ACEA-1表示艾森(ACEA)测试的一种化合物。

图18细胞增殖的动态监测。在艾森(ACEA)96孔电子检测器件(板)上接种以下细胞：HT1080纤维肉瘤细胞、H460肺癌细胞、HepG2肝癌细胞和NIH3T3小鼠纤维原细胞系，接种密度为每孔2500和10000个细胞。用本发明的细胞-基底阻抗检测系统，每隔30分钟动态检测细胞的贴附、伸展和增殖。

图19细胞-基底阻抗度量(在此，即指细胞指数)和接种的细胞数的相互关系，以及细胞指数得到的细胞数与MTT分析得到的细胞数的比较。(A)接种NIH3T3细胞到本发明的检测器件(板)中，细胞数目从每孔100个到10000个变化，检测十个小时的细胞变化，获得十个小时时的细胞指数，以作细胞指数与细胞数的关系图。(B)实验结束时用MTT分析法分析图19A中所描述的细胞，作590nm时的光密度值与细胞数的关系图。

图20用本发明的细胞-基底阻抗检测系统动态检测药物与靶细胞的相互作用。(A)在本发明的检测器件(板)上以每孔10,000个细胞的密度接种A549细胞，并持续检测细胞，直到24个小时，加入指示浓度的paclitaxel。(B)A549细胞用DMSO或者12.5nMpaclitaxel处理20小时后，用Annexin V染色，用荧光显微镜观察细胞，并用附带的数码相机拍摄细胞。

图21用本发明的细胞-基底阻抗检测系统动态监测细胞周期停滞。在本发明的检测器件(板)上以每孔10,000个细胞的密度接种A549细胞，并用RT-CES系统持续检测细胞。细胞用下列方法之一处理：(A)DMSO或者100μM Olomoucine处理；(B)A549细胞在组织培养皿上生长20个小时，用DMSO或者100μM Olomoucine处理。用流式细胞计数仪来做细胞周期分析。

图22用本发明的细胞-基底阻抗检测系统动态检测细胞毒性化合物和靶细胞的作用。在本发明的检测器件(板)上接种A549细胞，并用RT-CES系统持续检测细胞。细胞用指示的最终浓度的(A)staurosporine、(B)Viblastine(长春碱)和(C)5-flourouracil(5氟脲嘧啶)处理。

发明的详细阐述

A.定义

为了清楚地阐述，而不是为了做某种限制，本发明以下的详细阐述将分为多个章节.

除非有另外的定义，在此使用的技术和科学词汇都与本发明所属技术领域内的词汇具有相同的意义.在此所提及的所有专利、论文、出版物都以参考文献的形式被完整地结合到本发明申请中。如若在本章内对词汇的定义与参考文献中的专利，论文、论文出版物或其他出版物中的词义出现矛盾或不一致，则优先以本章的定义为准。

在此使用的“一个”指“至少一个”或“一个或更多”。

在此使用的“膜”，是指材料薄片。

在此使用的“生物兼容性膜”指对细胞活性，贴附，伸展，运动，生长，分裂等功能无毒无害的膜。

当含有活的，未受损害的，上皮细胞或内皮细胞的悬浮液被加入器皿中，器皿的表面“适于细胞贴附”是指12小时内有测量意义的一定比例的细胞贴附于器皿表面。优选的是(Preferably)，在12小时内至少50％的细胞贴壁(贴附于器皿表面)。更优选的是(Morepreferably)，一个适于细胞贴附的表面具有的表面性质使得12小时内(在细胞加入器皿后)，至少70％的细胞贴壁。或更加优选的是，适于细胞贴附的表面性质使得12小时内使得至少90％细胞贴壁。最优选的是，表面性质使得8，6，4，2小时内至少90％细胞贴壁。器皿表面为了达到所需的细胞贴附要求，表面须经化学处理(如：用酸和/或碱处理)和/或物理处理(如：用血清处理)，和/或生物处理(如：用一种或多种有利于细胞贴附的生物分子包被(coated)。在此发明中，一个生物兼容的表面(例如膜)，优选地，是适宜让在检测中所使用的细胞贴附.最优选的是保证在检测中，至少90％的与生物兼容表面接触的细胞可贴附于其上。

“生物分子包被”(biomolecular coating)是指在表面的分子包被，这些分子为天然生物分子或生物化学分子，或由天然生物分子或生物化学分子衍生(derived)而来的分子。例如，生物分子包被可包括胞外基质成分(如纤连蛋白，胶原)，或其衍生物(derivative)，也可包括生化分子，如多聚赖氨酸(polylysine)或多聚鸟氨酸(polyornithine)，它们是天然赖氨酸和天然鸟氨酸的多聚物.基于天然生化分子如氨基酸的多聚分子，可利用天然生化分子的异构体和对映异构体而构成多聚分子。

“胞外细胞基质成分”是指存在于动物中的细胞外基质分子。它可以是来源于任意物种和任意组织类型的细胞外基质成分。细胞外基质的成分包括但不局限于层粘连蛋白(laminins)，胶原(collagens)，纤连蛋白(fibronectins)，糖蛋白(glycoproteins)，肽(peptides)，糖胺聚糖(glycosaminoglycans)，粘蛋白(proteoglycans)等。细胞外基质成分还包括生长因子。

“电极”是指一种高导电性的结构，它的导电率远远高于周围物质。

在此所指的“电极结构”(electrode structure)是指单个电极，特别是一个具有复杂结构的电极(如一个螺旋型的电极结构)，或者是至少两个电连通的电极部件的结合体。所有在一个“电极结构”中的部件都是电连通的。

在此所指的“电极部件”(electrode element)是指电极结构中的单个构造，例如，相互交错电极结构中的指状突起结构。

在此所指的”电极阵列”(“electrode array”)或“电极结构单元(electrode structure unit)”是指两个或多个电极结构所形成具有一定尺寸和间隔的结构，当连接于信号源时，可作为一个单元在电极结构周围产生电场。本发明中优选的电极结构单元可测量当细胞贴附在电极表面时的阻抗变化。电极结构单元包括，但不局限于相互交错电极结构单元和同心圆电极结构单元。

电极总线(electrical bus)是电极的一个部分，连接于各个电极部件(electrode element)或电极子结构。一条电极总线是由各个电极部件或各个电极子结构通到另一个电极连接点的导电线路。在本发明的器件中，每个电极总线都连接于一个电极结构的各个电极部件，是电极部件连接到“电传导线”(electrode traces)的导电通路，电传导线会连结至连接盘(connection pad)。

“电传导线”(electrode traces或＂electrically conductive traces＂或＂electrical traces＂，)是指由电极或电极部件或电极结构通向器件或装置末端或周边的一个导电通路，以将电极，电极部件或电极结构与信号源连接起来。器件的末端或周边可对应于器件或装置上的连接盘。

“连接盘(connection pad)”是本发明的器件或装置上的一个区域，它电连接到至少一个电极或至少一个电极结构所有电极部件上，并且可以在使用时被连接到外部的电路上(例如：阻抗检测电路或一个信号发生装置).连接盘和阻抗检测电路或信号发生装置之间的电连接可以是直接或间接的，可通过任何适当的导电线路例如导线或金属线来实现。这种导电线路也可以经过器件或装置上其他区域的电极或电传导途径来实现。

“相互交错”(interdigitated)是指来源于一个方向的突起结构与来自另一个方向的突起结构相互错开形成一种交叠手指状的结构(这样电极部件之间不会相互接触)。

在此提及的“接触电极部件的可能性大”是指当细胞被随意的放到本发明的装置或器件传感器的任一位置，细胞接触电极部件的可能性(概率)由在仪器内放置的细胞的平均直径，电极部件的大小，电极部件的间隙大小计算而来，应大于约50％，优选的情况下应大于约60％，更优选的情况下应大于约70％，甚至大于约80％，约90％，或约95％。

“在所述的基底上加工的至少两个电极”是指至少两个电极被加工或制作或生产在基底上。该至少两个电极可以处于基底的同一面或基底的不同面。基底可以有多个层面，该至少两个电极可以处于基底的同一层面或基底的不同层面上。

“在所述的基底上的同一面上加工的至少两个电极”是指至少两个电极被加工在基底的同一个面上。

“在所述的基底上的同一个层面上加工的至少两个电极”是指，如果绝缘基底是多层的，那么至少有两个电极被加工于基底的同一层面上。

“所述...电极(或电极结构)具有大致相同的表面积”是指任意两电极的面积没有很大的差别，从而，细胞在所述的一个电极(或电极结构)上贴附或生长引起的阻抗变化将与细胞在另一个电极(或电极结构)上贴附或生长引起的阻抗变化在总体的可检测的阻抗变化中占有具有相同或相似分量.换句话说，当电极(或电极结构)具有大致相同的表面积时，任一电极上的细胞贴附或生长都会引起总体的阻抗变化。一般说来，最大的电极和最小的电极间的面积比率小于10.优选的是，最大的电极和最小的电极间的面积比率小于5，4，3，2，1.5，1.2或1.1.更优选的是，所述的至少两个电极有近于等同或等同的面积。

“所述的器件具有适宜细胞贴附或生长的表面”是指装置上电极和/或非电极的区域具有合适的物理，化学或生物特性，感兴趣的细胞可以贴附于该表面上，并且在细胞培养生长后，新生成的细胞可以继续贴附在器件的表面上。然而，在器件或其表面包含细胞生存或生长必要的物质不是非必须的条件。这些必须的物质是指核苷酸或生长因子，可以由培养液中提供。更适合的是，当活的，未受损伤的，上皮细胞或内皮细胞悬液加入到“适宜于细胞贴附的表面”上时，12小时内至少有50％的细胞贴附到表面上了。更加合适的是，一种适应细胞贴附的表面具有表面性质，12小时内至少有70％的细胞贴附到表面上了(加入细胞到包括上述器件中的培养室或培养板算起).更加适应的是，适宜细胞贴附表面的性质将导致12小时内至少有90％的细胞贴附到表面上。最适应的是，适宜细胞贴附的表面将会使至少有90％的细胞在加入细胞后的8，6，4，2小时内贴附到表面上。

“所述的电极间的可测量的阻抗变化”或”所述的电极结构间的可测量的阻抗变化”是指当分子结合反应，在电极(或电极结构)表面发生时，将导致电极产生足够大的阻抗变化，该阻抗变化可被阻抗分析仪或阻抗测量电路测得。阻抗变化指在电极表面上有分子结合反应与没有分子结合反应时阻抗值之间的差别。或者，阻抗变化指当有细胞在电极表面贴附时的阻抗和无细胞在电极表面贴附时的阻抗值之间的差别，或者是当贴附到装置上含有电极的表面的细胞数目、种类、活性、或形态发生变化时阻抗的变化。一般说来，阻抗改变超过0.1％即是可测量的。优选的是，可测量的阻抗值变化超过1％，2％，5％，8％。更优选的是，可测量的阻抗值变化超过10％。电极间的阻抗通常是所施加的电场频率的函数。“在电极之间可测量的阻抗变化”并不要求在所有频率点有可测得的阻抗变化，而只须阻抗的变化在一个或多个频率点可被测得.阻抗有两个分量，分别称为电阻和电抗(电抗可分成两类，电容性电抗和电感性电抗)。“在电极之间可测量的阻抗变化”仅要求电阻或电抗，在一个或多个频率上，有一个可测量的变化。在本申请中，阻抗是电或电子阻抗。检测这种阻抗的方法是，(1)在所述电极之间提供一种特定频率的电压(或多频率，或具有特殊的电压波形)，并且测量在特定频率下通过上述电极的电流(或多频率。或具有特殊的电压波形)，将电压振幅值除以电流振幅值来获得阻抗；(2)提供一种单频率成分电流(或多频率，或具有特殊的波形)通过上述的电极，测量在特定频率下，上述电极之间的电压，将电压振幅值除以电流振幅值来获得阻抗值；(3)可以检测或测定阻抗的其它方法.注意，在上述的“将电压振幅值除以电流振幅值来获得阻抗”，“除以”用作于相同的频率下的电流振幅值和电压振幅值。测量这种阻抗是一种电子过程，它不需使用任何试剂。

“所述的至少两个电极具有明显不同的表面积”是指任何电极的表面积彼此之间都是不相同的，由此，在大电极上细胞贴附或生长造成的阻抗变化，与在小电极上细胞贴附(贴壁)或生长造成的阻抗变化，在总体上可测得的阻抗变化中所占有的分量是不同的。更优选的是，在大电极上细胞贴附或生长造成的任何阻抗变化会明显的小于小电极上细胞贴附或生长造成的阻抗变化。一般说，最大电极和最小电极的面积的比率大于10。优选的是，最大电极和最小电极的面积的比率超过20，30，40，50或100。

“多组电极对或电极结构对按照一个多孔微板上的孔位置进行空间排列”是指器件或装置上的多组电极对或电极结构对，是依空间排列与多孔微板上的孔配对，由此，器件可以被插入到，结合到，或附着到多孔板(例如，一个无底的孔板)，以使得微孔板中的多孔将包括电极或电极结构。

“按行列结构排列”是指，就电连接来说，电极的位置，电极阵列的位置或一个可开关的电路位置是由一个行位置和一个列位置所确定的。

“每个孔都包含大致(大体上)一样的数目...的细胞”是指孔中细胞数目的最少值至少为孔中细胞数目最高值的一半。优选的是，孔中数目的最少值至少为细胞数目最高值的60％，70％，80％，90％，95％或99％.更为优选的是，每孔都包含相同的细胞数量。

“每个孔都包含同样种类的细胞”是指，就特定的目的来说，每孔包含同样种类的细胞，但不必要每孔包含完全同一种类细胞.例如，如果特定的目的是每孔包含同一种类的哺乳动物细胞，那么，一个孔可以包含相同种类的哺乳动物细胞，如人类细胞或不同种类的哺乳动物细胞如人类细胞，及其它非人类的哺乳动物细胞例如大鼠，羊或猴细胞等。

“每孔包含...一系列不同浓度的测试化合物”是指每孔包含的测试化合物的浓度是系列稀释的，如一个以10分之一比例稀释的浓度为1M，0.1M，0.01M等。

“剂量反应曲线(does-response curve)”是指细胞反应对测试化合物浓度的依赖关系。细胞的反应可以通过许多的参数进行检测。例如，测试化合物被怀疑具有细胞毒性，会导致细胞死亡，那么，细胞在测试化合物处理后的反应可以通过不存活(或存活)的细胞百分率来测得。作细胞存活(或不存活)百分率随测试化合物剂量浓度的变化的图线，建立剂量反应曲线。在本专利申请中，细胞存活(或不存活)百分率可以用测量的阻抗值，或者由阻抗得到的细胞指数，或者细胞变化指数来表示。例如，对于给定的细胞类型，在特定的细胞生理条件下(比如，特定的细胞培养基质)，细胞指数显示与一个孔中可存活的细胞数有线性或者正相关关系，细胞指数由阻抗得到.从而，在本申请中，我们可以将细胞指数作为被测化合物剂量浓度的函数，建立一条“剂量反应曲线”。注意到，一般情况下，细胞指数不仅与检测孔中可存活细胞数有关，而且与细胞形态和细胞贴附有关。所以，细胞指数与剂量浓度曲线提供的信息不仅仅是细胞数量，还包括它们的生理状态(比如，细胞形态和细胞贴附)。更进一步，这个系统和检测器件(板)提供的一个重要优点是，在一个单独的试验中，人们可以获得多个时间点的“剂量反应曲线”，因为这个系统允许对细胞进行连续监测，并且提供一个时间段内多个时间点的阻抗值。这个时间段可以短到几分钟，也可以长到几天或几星期。

“电极沿着微通道的长轴所具有的长度要比所分析的颗粒的最大一维尺寸小得多”是指电极在沿着微通道的长轴方向上的长度，要小于所分析颗粒最大一维尺寸的90％。优选的是，电极在沿着微通道的长轴方向上的长度要小于所分析颗粒的最大一维尺寸的80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，5％。

“微电极贯穿(span)微通道的整个高度”是指微电极至少贯穿微通道的整个高度的70％。更适合的是，微电极至少贯穿微通道的整个高度的80％，90％，95％.更加适合的是，微电极至少贯穿微通道的整个高度的100％。

“孔具有相当于或稍大于所述微粒的孔径”是指这个孔的孔径应至少等于微粒的大小，并且这个孔径小于微粒大小的300％。这里孔径和微粒的大小尺寸的测量仅限于一维数值。

“微电极条带或电极条带”是指一种绝缘基底条带，在它上面有加工的电极或电极结构单元。绝缘基底条带包括但不局限于聚合物膜，玻璃，塑料薄片，陶瓷，绝缘体-在-半导体上，光纤玻璃(象那种用于制造印刷电路板的材料)。电极结构单元具有不同的几何形状，可以通过任意的微加工、微机械、或其他方法加工或制作在基底条带上。电极几何形状包括但不局限于相互交错的电极，“圆在线上”的电极，“菱形在线上”的电极，城堡式电极或正弦形电极。这些电极的几何形状的特征尺寸可以小到少于5微米，或少于10微米，到大到大于200微米，大于500微米，大于1毫米。电极几何形状的特征尺寸是指电极部件的最小宽度，或邻近电极部件间的最小间隙，或电极几何形状上反复出现的一个特征尺寸。在本发明中，微电极条带可以是任何几何形状的。其中一个例子是矩形，条带的宽度在小于50微米到大于10毫米之间，条带的长度在小于60微米到大于15毫米之间。例如，一种电极条带可以具有200微米宽，20毫米长的几何图形。一个单一的微电极条带可以具有两个电极作为一个测量单元，或多个这种电极组作为多个测量单元。在一个实例中，当多个电极结构单元被加工在一个单一的微电极条带上，这些电极结构单元是沿着条带的长方向定位的。电极结构单元可以是正方形，矩形，或圆形.每个电极结构单元可能具有的尺寸从小于50um X 50um(微米)，到大于2mm X 2mm(毫米)。

“样本”是指可用本发明所述的装置，微孔板或方法进行分离、操作、测量、定量、检测分析的任何物质。样本可为生物样本，如生物体液或组织，生物体液包括尿，血，血浆，血清，唾液，精液，粪便，脑脊液，泪液，粘液，羊膜液或类似物。生物组织是细胞的聚集体，通常是指在人体，动物，植物，细菌，真菌或病毒中一类共同结构的细胞及细胞间物质的总称，包括结缔组织，上皮组织，肌肉组织，和神经组织。生物组织也包括器官，肿瘤，淋巴结，动脉，和单个细胞。生物样本也可进一步包括细胞悬液，包含生物分子的溶液(如蛋白质，酶，核酸，碳水化合物，结合到和生物分子的化学分子)。

“液体样本”为天然以液体形态存在的样本，如生物体液。“液体样本”也可指天然以非液体状态，即固体或气体存在的样本，但被制成含固体或气体物质的液体溶液或悬浮液。如，液体样本可为含生物组织的液体，溶液，或悬浮液。

“被测化合物”是任意一种在任意一次分析中，对细胞的直接或间接作用的被研究的化合物。一种被测化合物可以是任何化合物，包括但不局限于小分子、大分子、复合分子、有机分子、无机分子、生物分子(例如，但不局限于，脂质、类固醇、碳水化合物、脂肪酸、氨基酸、肽、蛋白质、核酸，或者这些物质的任意结合等)等.一种被测化合物可以是合成化合物、天然化合物、天然化合物衍生物等。被测化合物的结构可以是已知的也可以是未知的。

“已知化合物”是至少有一种活性已知的化合物。在本发明中，已知化合物优选的是一种或多种对细胞的直接或间接的作用已知的化合物.更优选的是已知化合物的结构是已知的，但并不要求如此。更优选的是，已知化合物对细胞的作用机理已知.比如(但不局限于这些例子)已知化合物对细胞的作用可以是影响细胞存活率、细胞粘附、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞形态、细胞周期、IgE介导的细胞激活或抑制、受体-配体结合、细胞数量、细胞质量、细胞周期等等.

“阻抗值”是一个孔中有细胞或没有细胞时，电极测得的阻抗。阻抗通常是频率的函数，比如阻抗值依赖于测量阻抗值的频率.在本申请中，阻抗值指用单个或多个频率测得的阻抗。更进一步，阻抗有两个部分，电阻和电抗。本发明中的阻抗值指电阻部分、电抗部分、或者两者都是。所以，测量或者监测“阻抗值”时，我们指测量或者监测电阻、电抗、或者两者都是。在本申请的很多方法例子中，阻抗值也可以用由原始测得的阻抗数据导出的参数表示。比如，细胞指数，或者归一化细胞指数，或者Δ细胞指数，可以用来表示阻抗。

“细胞指数”或“CI”可以从测得的阻抗值获得，并可以用来反映阻抗值的变化。获得或计算细胞指数的方法很多。

在给定时间点的“归一化细胞指数”通过将给定时间点的细胞指数除以参考时间点的细胞指数计算得到。所以参考时间点的归一化细胞指数为1。

给定时间点的“Δ细胞指数”通过将给定时间点的细胞指数减去标准时间点的细胞指数得到。所以，Δ细胞指数是细胞指数从初始时间(标准时间点)到测量时间的绝对改变量。

“细胞变化指数”或者“CCI”是由细胞指数导出的参数。某个时间点的“CCI”等于细胞指数对时间的一阶导数除以该时间点的细胞指数。换句话说，CCI可以由此计算：

$>\mathrm{CCI}\left(t\right)=\frac{\mathrm{dCI}\left(t\right)}{\mathrm{CI}\left(t\right)·\mathrm{dt}}---\left(1\right)$>

B.检测细胞-基底阻抗的器件和系统

检测细胞-基底阻抗的器件

本发明用于测量细胞-基底阻抗的器件包括一个绝缘的基底；加工于基底上的两个或多个电极阵列，两个或多个电极阵列中的每个电极阵列包括两个电极结构；以及至少两个连接盘，每个连接盘位于基底的一个边缘.器件的各个电极阵列在整个阵列上有近似均匀的电阻。器件的基底有适合于细胞贴附和生长的表面；细胞在所述基底上的贴附和生长可引起各个电极阵列上的电极结构间的可测量的阻抗改变。

电极阵列是两个或多个电极结构所构成的，电极结构有它们自己的大小和间距，当电极阵列连接于一个信号源时，能作为一个单元在电极结构周围区域产生电场。一个电极结构指一个单个电极，尤其是单个结构复杂的电极。(例如，一个电极结构可包括两个或多个电连接的电极部件。)在本发明的器件中，每个电极结构包括多个电极部件，或亚结构。在本发明的优选例中，器件的两个或多个电极阵列的每个电极阵列包括表面积大致相同的两个电极结构.在本发明的优选例中，器件的两个或多个电极阵列的每个阵列包括两个电极结构，每个电极结构包括多个电极部件。每个电极阵列的两个电极结构连接于位于基底边缘的单独的连接盘。

这样，在本发明的器件中，器件的所有的两个或多个电极阵列中的任一个阵列，两个电极结构的第一个连接于两个或多个连接盘中的一个，两个电极结构中的第二个连接于两个或多个连接盘中的另一个。更优选的，器件的各个阵列是可单个选通的，意指电传导线和阵列的连接盘的布置可使当电极阵列与阻抗分析仪连接时，通过开关的控制(如电子开关)，可使得测量电压在一个给定时间点仅施加到单个电极阵列。

器件的各个电极阵列的电阻在整个电极阵列上的分布是近似均匀的。阵列中均匀电阻分布是指当测量电压被加到电极阵列的电极结构上时，位于电极阵列的任一位置的电阻与该电极阵列的另一位置的电阻是近似相同的。优选的，在一个器件阵列的第一个位置的电阻和同一阵列的第二个位置的电阻阻值相差不超过30％。更优选的，在一个器件阵列的第一个位置的电阻和同一阵列的第二个位置的电阻阻值相差不超过15％。更优选的，在器件阵列的第一个位置的电阻和同一阵列的第二个位置的电阻阻值相差不超过5％。更优选的，在一个器件阵列的第一个位置的电阻和同一阵列的第二个位置的电阻阻值相差不超过2％。

本发明器件上的电极部件、电极阵列上电极总线和电极间的间隙的优选的放置方法是，使所有细胞，无论细胞位于何处，贴附在电极表面的哪个位置，它所引起的阻抗改变是相同的。这样，要求当测量电压加于电极阵列时，器件上的任一个阵列的任意两个位置的电场强度是近似的。在阵列的任意位置，电场强度与阵列的第一个电极结构最近点和阵列的第二电极结构最近点之间的电势差有关。因此要求对一个电极阵列来说，经过电极部件和电极总线的电势差是相似的。基于这个要求，优选的是在整个阵列上电阻分布是近似均匀的.在一个感兴趣的位置的电极电阻等于在第一个电极结构最近点(指位于第一个电极结构上的一点，它与感兴趣的位置最近)和连接到第一个电极结构的连接盘之间的电阻，加上在第二个电极结构最近点和连接到第二个电极结构的连接盘之间的电阻。

本发明的器件设计为器件的阵列具有近似均匀分布的电阻。当电极结构和电极总线有特定的间隔和尺寸(长度，宽度，厚度，和几何形状)时，在阵列的任一位置的电阻和另一位置的电阻相同。在多数实例中，一个阵列中的电极部件(或电极结构)有相同的厚度和宽度，一个阵列中的电极总线有相同的厚度和宽度，由一个阵列导出至一个连接盘的电传导线有相同的厚度和宽度。这样，在这些优选例中，电极阵列的设计是通过电极部件或结构的长度和几何形状，通过电传导线的长度和几何形状，通过电极总线的长度和几何形状，使得在阵列中的电阻分布是均匀的。

在一些细胞-基底阻抗检测器件的优选例中，电极结构包括多电极部件，每个电极部件直接连接于电极总线。第一个电极结构的电极部件连接于第一个电极总线，第二个电极结构的电极部件连接于第二个电极总线.在这些实例中，两个电极总线分别经电传导线连接于连接盘。尽管电传导线参与了阵列在一个位置的电阻，但是对于阵列的任何两个位置，从第一个电极总线到第一个连接盘的电传导线是相同的，而且从第二个电极总线到第二个连接盘的电传导线是相同的。这样一来，在这个优选例中，电传导线的电阻在设计电阻分布均匀的电极阵列时无需计算在内。

在本发明的一个优选实例中，用于细胞-基底阻抗测量的器件，有两个或多个电极阵列共用一个连接盘。优选的是，器件的至少一个电极阵列上的一个电极结构连接于连接盘，同时连接于器件的至少另一个电极阵列上的一个电极结构。更优的是，器件的至少两个电极阵列，其中每个电极阵列有一个电极结构经连接盘连接于至少另一个电极阵列的一个电极结构，而每个电极阵列有另一个电极结构连接于连接盘但不连接于器件的其他电极阵列或电极结构.这样在器件的优选设计中，至少两个电极阵列中的每个电极阵列有一个电极结构连接于共用连接盘，而另一个电极结构连接于一个独立的连接盘。

在本发明的一个优选实例中，一个电极阵列的每个电极结构与一个电极总线相连，而电极总线经电传导线连接于器件上的两个或多个连接盘中的一个连接盘.在一个优选例中，两个电极结构中的每个都连于一个电极总线，这样，每个电极阵列连于两个电极总线，每个连于一个电极结构.在这样的设计中，两个电极总线的每一个连接于基底上分开的连接盘。

连接于总线的电传导线可由任何导电材料制成.电传导线可处于基底的表面，也可有选择性地被绝缘层覆盖。另一方面，电传导线也可放置于基底上的另一个层面。阻抗测量器件(装置)上电传导线的安排和设计发表于US专利申请号为10/705,447，在此将该专利申请中说明基底上电传导线的安排，放置和设计的内容以参考文献的方式整合到本专利申请中。

合适的电子连接是指诸如安装在基底上和印刷线路板连接盘上的金属夹，可用于连接器件上的连接盘和外部电路(例如阻抗测量仪)之间的通路。细胞-阻抗检测器件(装置)的设计和装配制造方法的详细描述见U.S.专利申请10/705,447，在此将其中关于带有电极阵列的阻抗器件的设计、特性、和制造专利的描述以参考文献的方式整合到本申请中。

优选的绝缘底板是平整或近似平整的。可做底板的物质包括但不限制于二氧化硅在硅上，硅-在绝缘晶片(SOI)上，玻璃(如石英玻璃，铅玻璃或硼酸盐玻璃)，蓝宝石，陶瓷，聚合体，塑料，如聚酰亚胺(如Kapton，DuPon提供的聚酰亚胺薄膜)，聚苯乙烯，聚碳酸脂，氯化聚乙烯，聚脂，聚丙烯和尿素树脂。优选的是，基底和基底的表面将不干扰发生在基底表面的分子结合反应。对于细胞-基底阻抗检测，绝缘基底的任何暴露于细胞的表面，在优选的情况下是生物兼容的。生物不兼容的基底材料可以通过覆盖其他材料，例如聚合体或生物分子包被层，变成生物兼容的。

基底的全部表面或部分表面可被化学处理，包括但不限制于，在表面上修饰使其带有功能团，或极性或疏水功能团.

可用在本发明器件的阻抗测量中的一些电极阵列已被详细描述于美国专利申请10/705,447中。在此将其中所有有关电极阵列(或结构单位)、电极结构、电极物质、电极形状、和电极在基底上的制作方法的描述以参考文献的方式整合到本申请中。

优选的本发明器件中的电极阵列包括带有两个电极结构的阵列，例如，螺旋型的电极阵列和相互交错电极阵列.在本发明的一些优选例中，电极阵列加工在基底上，阵列包括两个电极结构，每个电极结构包括多个圆在线上(circle-on-line)电极部件，其上一个电极结构的电极部件与对侧的电极结构的电极部件轮流出现。

优选的是，本发明器件中的电极阵列的电极部件(或电极结构)有大致相同的宽度。优选的电极部件或电极结构的宽度大于30微米，更优选的宽度在50到300微米之间，更优选的宽度约为90微米。

优选的是，本发明器件中的电极阵列的电极部件(或电极结构)大致均匀地分布开的。

优选的是，阵列的电极部件(或电极结构)之间间隙小于50微米，更优选的是在5到30微米之间，更优选的是间距为20微米。

本发明器件包括一个或多个不漏液的液体容器。这种容器可以是可逆地或不可逆地结合到，或构成在，基底或基底的一部分上(例如，形成微滴定孔板的孔)。在另一例中，本发明器件包括的微电极条带是可逆地或不可逆地结合到塑料壳架上，该壳架具有与位于微电子条带上的电极结构单元相对应的开口。合适的液体容器材料包括塑料，玻璃，或塑料覆盖的材料(例如陶瓷，玻璃或金属等)。包含有液体容器的器件的详细描述见美国专利申请10/705,447，在此将其中关于液体容器和液体容器结构结合阻抗测量用的带有电极的基底上，包括其形状、设计、位置和制作方法的描述以参考文献的方式整合到本申请中.

在一个优选例中，位于本发明器件基底上的每个电极阵列都与一个不漏液的容器相连。优选的，本发明的器件被组装到一个无底的，多孔的且可密封的塑料板。器件如此组装之后，基底上单个阵列位于一个容器或孔的底面。更优的是，器件的每个阵列连接于多孔板的一个孔上。在一些优选例中，用于细胞-基底测量的多孔器件带有“无阵列”孔，它们也贴附于基底但孔内不带有电极阵列。这样的孔可有选择性地用于进行非基于阻抗的检测，如用于显微镜下细胞的观察。

关于多孔阻抗测量器件的设计和组装的描述见美国专利申请10/705,447和美国专利申请号10/987,732。在此将其中关于多孔阻抗测量器件，包括其设计、位置和制造方法的描述以参考文献的方式整合到本申请中。本发明的器件介于2孔至1536孔，优选的是介于4孔到384孔。更优选的是，介于16孔到96孔.所有的孔或少于所有的孔上有电极阵列。

在一些优选实例中，市场出售的组织培养板可用于本发明的器件，亦可定制所需形状的无底板。优选的是，孔径在1厘米到20厘米之间，更优的是，孔底(与基底相接触面)的孔径在2厘米到8厘米之间。孔可有上下均一的直径，也可为锥形，锥底面朝向基底，使孔连接于基底的孔径小于另一头的孔径.

使用方法

本发明也提供了用本发明的带有电极阵列及其上液体容器的器件进行细胞-基底阻抗测量的方法。这个方法包括：提供本发明的带有在电极阵列及其上液体容器的器件，连接一个阻抗测量仪到本发明的器件上，在器件的液体容器中加入细胞，以及测量在器件上的一个或多个电极阵列上的阻抗.使用阻抗测量器件进行细胞检测的方法见美国专利号申请10/987,732和美国专利号申请10/705,447，在此将其中关于使用阻抗测量器件测量方法的描述，以及其中的D和E章节以参考文献的方式整合到本专利申请中。

细胞-阻抗测量系统

另一方面，本发明的一个细胞-基底阻抗测量系统包括A)至少一个多孔的细胞-基底阻抗测量器件，其上至少两个孔的孔底有电极阵列；B)一个连接到多孔细胞-基底阻抗测量器件的阻抗分析仪；C)一个器件检测台(器件工作台)，能与一个或多个多孔器件相连，并包括可选择并连接多孔中任一孔的电极阵列到阻抗分析仪的电子线路；D)一个连接到器件检测台和阻抗分析仪的软件系统，用于控制器件检测台和阻抗分析仪，进行数据收集和数据分析。

在本发明的细胞-基底阻抗测量系统中，阻抗分析仪连接于一个或多个多孔板的连接盘，以测量阻抗。在上述系统的一个优选实例中，阻抗分析仪能够测量0.1ohm到10⁵ohm之间，频率范围为1Hz到1MHz之间的阻抗。阻抗分析仪最好能够测量阻抗的电阻分量和电抗分量(容性电抗和感性电抗)。在上述系统的一个优选例子中，阻抗分析仪能够测量0.1ohm到10³ohm之间，频率范围为100Hz到100kHz的阻抗.

细胞基底测量系统可以有效地同时用于多种分析，它通过以下过程实现，器件检测台电路可数字化地从记录测得的一个孔的阻抗转换到测量另一个孔的阻抗。在上述系统的一个实例中，软件控制下的系统能够在少于十秒的时间内完成单个孔的单个频率的阻抗测量。在另一个实例中，系统一次性完成单个孔单个频率的阻抗测量的平均时间少于一秒。

本发明系统中的一个多孔细胞-基底阻抗测量器件，可以是满足下列条件的任何多孔细胞基底阻抗测量器件，其上多孔中至少有两孔的孔底有一个电极阵列，且多孔中至少两个孔有可独立选通连接(到阻抗分析仪)的电极阵列.在上述系统的一个例子中，多孔器件以专门的微滴定板的形式出现，微滴定板的孔底整合有微电子传感器阵列.

本发明系统所用的器件，当其连接于阻抗分析仪，可测量因细胞状态不同而引起的阻抗变化.例如，此细胞-基底阻抗测量器件可测量细胞贴附于电极阵列时的阻抗，和无细胞贴附于电极阵列时的阻抗之间差别，也可测量因不同数量、类型、活性、贴附性，或不同形态的细胞贴附于电极表面时的阻抗变化。

可成为细胞-基底阻抗测量系统的一个部分的优选的器件，可以是在美国专利申请10/705,447和美国专利申请10/987,732所描述的器件。在此将其中包括电极阵列的器件的描述，包括其设计、成分、制造的描述以参考文献的方式整合到本申请。可成为细胞-基底阻抗测量系统的优选器件也可以是本申请描述的器件。

优选的是，本发明系统的多孔器件包括4-1536孔，其中部分或全部的孔可带有电极阵列。在一些优选例中，器件检测台可包括一个或多个平台或一个或多个槽以便放置一个或多个多孔器件。这些平台或槽可包括插座、针或其它用于器件和器件检测台间电子连接的电子器件。它可连接置于细胞培养箱外的阻抗分析仪和计算机。

器件检测台(器件工作台)包括连接测量阻抗器件到阻抗分析仪的的电路电子开关。电子开关可接通或断开与多孔器件上的两个或多个电极阵列的连接。器件检测台上的电子开关由软件系统控制。软件系统控制器件检测台阵列与阻抗分析仪的连接并检测一个或多个电极阵列的阻抗。在阻抗测量中，阻抗分析仪可在一个或多个频率下检测阻抗。优选的是，在一个实验分析中检测多于一个时间点的阻抗。更优选的是，检测超过3个时间点的阻抗。器件检测台可连接于器件的单个阵列到阻抗分析仪，以检测在一个时间点的，器件上的一个、多个或所有阵列的阻抗。对一个所需的检测时间点，器件检测台(器件工作台)的开关可使被选择的阵列得到快速测量。事实上每个检测的时间点是一个很短的测量时间段(例如少于1秒或1分钟)，在此期间进行阻抗测量.在本发明的一些优选实例中，器件检测台软件可程序控制在任何选定的时间间隔上测量器件上每一个带有阵列的孔的阻抗。

阻抗测量系统软件也可储存和显示数据，数据可显示在屏幕上或打印出来，可两者兼有。优选的是，软件可允许输入和显示试验参数，例如包括细胞种类，化合物浓度，检测时间间隔等信息。

优选的是，软件可分析阻抗数据。在一个优选例中，软件可在一个或多个时间点计算多孔器件的一个或多个孔中的细胞指数。在一些优选例子中，软件可以通过多孔板的一个或多个孔的阻抗来计算细胞变化指数(CCI).更优的，软件可以将阻抗数据和阻抗值作图，比如(但不局限于)，CI或者CCI，相对于时间作图。软件也可以做其他分析，比如通过CI计算细胞数；基于阻抗数据产生剂量反应曲线；基于阻抗值计算IC值；或基于阻抗或阻抗曲线计算细胞生长或行为的动力学参数.阻抗监测系统的软件也可以储存和显示数据分析，比如计算阻抗值和动力学参数，数据可以显示在一个屏幕上，或者打印出来，或者两者都是.

C.计算细胞指数(CI)和细胞变化指数(CCI)的方法

细胞指数

基于测得阻抗，细胞数目(更确切的说，活细胞数目，或贴附细胞数目)和细胞贴附状态之间的互相依赖关系，可由测得的阻抗频谱推得一种称做“细胞数目指数”(cell number index)或“细胞指数”的参数，以定量和比较本发明的基于阻抗测量方法中的细胞的状态。在本发明一些应用中，本申请的“细胞指数”(cell index)和以下专利申请中的细胞数目指数(cell number index)含义相同：PCT专利申请PCT/US03/22557(于2003年7月18日递交)，题为“基于阻抗的检测装置和方法”；美国专利申请10/705,447(于2003年11月10日递交)，题为“基于阻抗的检测装置和方法”(专利代理人编号为ACE-00101。P.1.1-US)；美国专利申请10/987,732(于2004年11月12日递交)。在此将在美国专利申请10/705,447和PCT专利申请PCT/US03/22557中关于细胞指数或细胞数目指数的讨论和描述以参考文献的方式整合到本申请中。

不同的方法可用于计算这种细胞指数。此处描述的某些方法是新的。

本发明提供了几种计算细胞指数的方法，这些方法适于细胞贴附在一个细胞-基底阻抗器件的两个或多个基本相同的电极阵列上，以用于检测细胞引起的阻抗变化.在本发明的优选例中，这些方法可以比以往的计算(在一个细胞-基底阻抗器件上的细胞的)细胞指数的方法提供更好精度的细胞指数。在一些优选的方法中，计算细胞指数的方法依赖于一种计算从两个或多个基本相同的阵列引出的电传导电阻的新型方法。因此，本发明也包括了一种计算方法，可用于计算一个基底上的两个或多个基本相同阵列的电传导线的电阻。

基本相同的电极阵列或基本相同的阵列指的是：所指阵列上的电极尺寸及布置，电极结构、电极部件都有是相同的。所以，两个基本相同的电极阵列将有相同尺寸的电极结构(长、宽、厚度)，电极结构将有相同数目的电极部件。每个阵列上电极部件和电极结构的布置是相同的。这里的“布置”是指结构或部件间的距离(间隔宽度)，它们相互间物理位置，它们的几何形状(角度、弯曲度、园在线上或城堡式的形状等)，也包括连接于电极结构或电极部件的任何电极总线的特征等。基本相同阵列的电极也包含相同的材料。就计算电传导线电阻或细胞指数而言，一基底上可以有任意数目的基本相同阵列.

以下的讨论提供了崭新方法，可计算贴附在一个细胞-基底阻抗检测器件上阵列的细胞的细胞指数。也提供了崭新方法用于计算从一个细胞-基底检测器件的两个或多个电极阵列上引出的电传导线的电阻。

阻抗(Z)由两个成分组成，即阻抗Rs和电抗Xs。在数学上，阻抗Z表示如下，

Z＝Rs+j Xs             (2)

在此，$>j=\sqrt{-1},$>指串联电抗成分Xs加在其上的电压与通过的电流有90度相差。对于串联电阻，加在其上电压与通过的电流具有相同的相位。作为在电子学和电子工程学中的通用原理，阻抗也可如下由并联阻抗Rp和并联阻抗Xp来表示，

Z＝Rp*(jXp)/(Rp+jXp)，          (3)

在此，$>j=\sqrt{-1}.$>然而，这些表达式(串联电阻和串联电抗，或并联电阻和并联电抗)是等价的。那些对电子或电力工程学熟悉的人可以容易地从一种表达式的参数指推导出另一种表达式。为了表达清楚性与一致性，在本发明中的描述和讨论使用串联电阻和串联电抗表达式。串联电阻和串联电抗简称为电阻和电抗。

如美国专利申请10/705,447(于2003年11月10日递交)，题为”基于阻抗的检测装置和方法”和PCT专利申请PCT/US03/22557，题为”基于阻抗的检测装置和方法”(于2003年7月18日递交)中所描述，检测细胞基底阻抗时可在适合的频率范围测量阻抗的改变.在此将该两专利申请关于细胞-基底阻抗检测以及在任意合适的频率范围测量阻抗以检测阻抗变化的描述以参考文献的方式整合到本专利申请中。例如，可在频率范围介于1Hz至100MHz之间测量和阻抗。在另一例中，可在频率范围介于100Hz至2MHz之间测量和阻抗。阻抗是频率的函数，即阻抗值随频率值变化。细胞-基底阻抗检测既可在单个频率也可在多个频率下测量。如果在多频率下进行阻抗测量，即可获得一个频率相关的阻抗频谱，即在每个频率点获得一个阻抗值。如上所述，阻抗由两部分构成，电阻和电抗.无论电阻或电抗值改变或两者都改变，都会引起阻抗的变化。

美国专利申请10/705,447(于2003年11月10日递交)，题为“基于阻抗的检测装置和方法”和PCT专利申请号PCT/US03/22557，题为”基于阻抗的检测装置和方法”(于2003年7月18日递交)中揭示了测量阻抗的方法。在此将该两个专利申请以参考文献的方式整合到本专利申请中。检测这种阻抗的方法是，(1)在所述电极之间提供一种特定频率的电压(或多频率，或具有特殊的电压波形)，并且测量在特定频率下通过上述电极的电流(或多频率。或具有特殊的电压波形)，将电压振幅值除以电流振幅值来获得阻抗；(2)提供一种单频率成分电流(或多频率，或具有特殊的波形)通过上述的电极，测量在特定频率下，上述电极之间的电压，将电压振幅值除以电流振幅值来获得阻抗值；(3)可以检测或测定阻抗的其它方法。注意，在上述的“将电压振幅值除以电流振幅值来获得阻抗”，“除以”的是相同的频率下的电流振幅值和电压振幅值。如那些对电子或电力工程学熟悉的人所知，在这个计算中(即上述的除法)，电流振幅和电压振幅表达为复数，复数的表达可考虑电压和电流值大小，以及电流和电压正弦波形的相差。相似的，阻抗值也由复数表达式来表达，包括如上述方程式中所示电阻和电抗成分。

如美国专利申请为10/705,447(于2003年11月10日递交)题为“基于阻抗的检测装置和方法”和PCT专利号为PCT/US03/22557(于2003年7月18日递交)，题为”基于阻抗的检测装置和方法”所描述，细胞-基底阻抗的测量可用于计算细胞指数或细胞数目指数的参数。在此将两专利申请中涉及细胞指数或细胞数目指数的描述以参考文献的方式整合到本专利申请中.多种方法可基于当有细胞贴附或无细胞贴附于电极结构上时引起电抗或阻抗的变化来计算这个细胞数目指数。有时，将电极结构上无细胞贴附但有相同的培养基的电极上阻抗值(电阻和电抗)作为基线阻抗。基线阻抗可由下列一种或多种方法获得：(1)测量有电极结构的孔里加有不带细胞的培养基条件下的阻抗，该培养基与测量细胞贴附阻抗时用的培养基相同；(2)在有电极结构的孔上加入带有细胞的培养基短时间后(约10分钟)的阻抗(加入带细胞的培养基后短时间内，细胞没有足够时间贴附到电极表面。这段时间的长度依赖于细胞种类和/或电极表面处理方法)；(3)当孔中所有细胞被某种处理方法(如高温处理)或者药物杀死(如，洗涤剂)，测量电极结构的阻抗(使用这种方法时，处理方法或药物不能影响电极上的培养基的电介质特性).

在例(A)中，细胞指数或细胞数目指数可如下计算：

(A1)在每个测量频率，用当细胞贴附于电极表面时电极阵列的电阻，除以基线电阻计算得到电阻比率；

(A2)在全部频率频谱中确定电阻比率的最大值，

(A3)电阻比率的最大值减1.

细胞指数可由下列数学公式获得：

>

其中N是测量阻抗的频率点的数目。例如，用于测量的频率是10kHz，25kHz和50kHz，则N＝3，f₁＝10kHz，f₂＝25kHz，f₃＝50kHz。R_cell(f_i)是在频率f_i时有细胞贴附在电极表面时电极阵列或电极结构的电阻(细胞-基底电阻)，R_b(f_i)是在频率f_i时电极阵列或电极结构的基线电阻。

一个给定孔的细胞指数反映了(1)该孔中有多少细胞贴附在电极上；(2)该孔中的细胞与电极表面的贴附程度。在这种情况下，一个零或近似于零的”细胞指数或细胞数目指数”表示没有细胞或仅有很少细胞数目贴附于电极表面。换句话说，如果电极上没有细胞，或者细胞不能很好地贴附在电极上，R_cell(f_i)与R_b(f_i)几乎一样，导致细胞指数CI＝0。一个较高的“细胞数目指数”指对于相同的细胞类型或者细胞在相似的生理条件下，有更多的细胞贴附于电极表面，R_cell(f_i)值越大，导致较大的细胞指数值。所以，细胞指数代表孔中的细胞数。一个较高的”细胞数目指数”也指对于相同类型和相同数目的细胞，细胞在电极表面能更好地贴附(比如，细胞伸展更快，细胞贴壁更强)。

因此，对于相同的细胞数，细胞状态的改变也会导致细胞指数的改变。比如说，细胞粘附或者细胞伸展增加，会导致更大的细胞/电极接触面，导致R_cell(f)增加，细胞指数更大。另一方面，细胞死亡或者细胞毒性导致细胞去粘附，细胞聚集，导致R_cell(f)减小，于是细胞指数变小。

在例(B)中，细胞指数或细胞数目指数可用如下方法计算：

(B1)在每个测量频率，用由当细胞贴附于电极表面时，电极阵列的电抗除以基线电抗计算得到电抗比率。

(B2)在全部频率频谱中确定电抗比率的最大值，

(B3)电抗比率的最大值减1。

在这种情况下，一个零或近似于零的”细胞指数或细胞数目指数”表示没有细胞或仅有很少细胞数目贴附于电极表面。一个较高的”细胞数目指数”指对于相同的细胞类型或者细胞在相同的生理条件下，有更多的细胞贴附于电极表面。

在例(C)中，细胞指数或细胞数目指数可用如下方法计算：

(C1)在每个测量频率，用当细胞贴附于电极上时，电极阵列的电阻减去基线阻，以确定有细胞时电阻和基线电阻之间的电阻改变；

(C2)确定电阻改变的最大值。

在这种情况下，“细胞数目指数”在测量的频率范围内，当有细胞存在时相对于基线电阻的电阻最大改变值。细胞指数的单位是ohm。

在例(D)中，细胞指数或细胞数目指数可用如下方法计算：

(D1)在每个测量频率，计算阻抗的模(magnitude)(等于其中R_s和X_s分别是串联电阻和电抗)。

(D2)从当细胞贴附于电极时电极阵列阻抗的模减去基线阻抗的模，以确定当有细胞时相对于基线阻抗的阻抗的模的变化。

(D3)确定阻抗的模变化的最大值。

在这种情况下，“细胞数目指数”是在所测频率范围内，有细胞存在时相对于基线阻抗的阻抗模的最大变化。此细胞指数的单位是ohm。

在例(E)中，细胞指数或细胞数目指数可用如下方法计算：

(E1)在每个测量频率，用当电极表面有细胞贴附时测得的电阻除以基线电阻，计算得到电阻比率，

(E2)电阻率减去1得到每个测量频率时电阻的相对改变。

(E3)将所有的相对改变值积合到一起(即将不同频率时所有相对改变值相加)。

在这种情况下，“细胞数目指数”获得是基于多频率点，而不是如上例中单个频率峰点中获得。一个零或近似于零的“细胞指数或细胞数目指数”表示没有细胞或仅有很少细胞数目贴附于电极表面。一个较高的”细胞数目指数”指对于相同的细胞类型或者细胞在相同的生理条件下，有更多的细胞贴附于电极表面。

在例(F)中，细胞指数或细胞数目指数可如下计算：

(F1)在每个测量频率，当细胞贴附于电极上时，电极阵列的电阻减去基线电阻，以确定有细胞时和基线电阻之间的电阻改变；(在频率f_i时电阻的可用如下公式：ΔR(f_i)＝R_s-cell(f_i)-R_s-baseline(f_i)获得，R_s-cell和R_s-baseline分别为细胞在电极阵列上的串联电阻和基线串联电阻。)；

(F3)分析电阻改变的频率依赖性来获得某个参数来定量此依赖性。在一个例子中，可由计算。在另一个例子中，此参数可由计算。此参数可作为细胞指数或细胞数目指数。

在这种情况下，“细胞数目指数”是基于频率频谱中电阻改变的分析获得的.细胞指数的单位为ohm。

在另一例(G)中，细胞指数或细胞数目指数可如下计算：

(G1)在每个测量频率，计算阻抗的模(等于其中R_s和X_s分别为系列电阻和电抗)。

(G2)从当细胞贴附于电极时电极阵列阻抗的模减去基线阻抗的模，以确定当有细胞时相对于基线阻抗的阻抗的模的变化。(在频率是f_i时，阻抗的模由公式ΔZ(f_i)＝|Z_cell(f_i)|-|Z_baseline(f_i)|获得。$>\left|Z_{\mathrm{cell}}\left(f_i\right)\right|=\sqrt{R_{s-\mathrm{cell}}{\left(f_i\right)}^2+X_{s-\mathrm{cell}}{\left(f_i\right)}^2},$>R_s-cell和X_s-cell分别为细胞贴附在电极阵列上时的串联电阻和电抗。|Z_cell(f_i)|为细胞贴附在电极阵列上时的阻抗的模。|Z_baseline(f_i)|为电极阵列的基线阻抗的模。

(G3)分析阻抗的模改变的频率依赖性来获得某个参数来定量此依赖性.在一个例子中，可由计算。在另一个例子中，此参数可由计算。此参数可作为细胞指数或细胞数目指数。

在这种情况下，“细胞指数(细胞数目指数)”是基于频率频谱中阻抗模改变的分析获得的。细胞指数的单位为ohm。

如美国专利申请10/705,447(于2003年11月10日递交)题为“基于阻抗的检测装置和方法”和PCT专利PCT/US03/22557(于2003年7月18日递交)，题为“基于阻抗的检测装置和方法”中所描述的，可以用不同的方法，从测得的细胞-基底阻抗(电阻或电抗)来计算细胞指数或细胞数目指数。该两专利申请的描述细胞指数或细胞数目指数的计算方法将以参考文献的形式整合到本文中。细胞指数或细胞数目指数作为在细胞-基底阻抗测量时孔中细胞的定量测量。

值得指出的是在利用阻抗信息来监测电极上的分子状态推倒计算“细胞数目指数”，不是绝对必要的。事实上，也可直接用阻抗值(在单个固定频率，或最大相对改变频率，或多个频率上)作为在电极上细胞状态的指示标志。如果测量的阻抗值直接用于监测细胞状态，那么电阻，或者电抗，或者两者都可以使用。

然而，使用“细胞指数”或“细胞数目指数”或这类指数来监测细胞状态，如细胞生长/或贴壁/或活力状态，有很多优点。

首先，可以用细胞数目指数比较不同几何结构的电极的测量结果。

第二，对于一种给定的几何结构的电极，可以通过测量不同数目的细胞被放到电极上时得到的阻抗值，建立“标准曲线”，以显示细胞数目和细胞数目指数之间的相互关系(在这种情况下，要确保接种的细胞已很好地贴附到电极表面)。用这样的标准曲线，当进行新的阻抗测量时，可以从新测得的细胞数目指数而估计细胞数目。

第三，细胞数目指数也可用于比较不同的电极表面条件。对于相同几何结构的电极和相同的细胞数目时，有较大细胞数目指数的表面，说明细胞在此电极表面有更好的贴附和此电极表面更适于细胞贴附。

如上所示，对于计算细胞指数或细胞数目指数的方法来说，重要的是知道有或没有细胞时电极结构上的阻抗(电阻和/或电抗)。基于等式(1)，电极阵列的阻抗(电极上有或没有细胞)如下式：

Z_{electrode-array＝}Z_total-Z_trace-Z_switch      (5)

其中Z_switch是电子开关的阻抗，Z_trace是基底连接盘和电极导线之间电传总线的阻抗，Z_total是阻抗分析仪测得的总电阻。通过选择质量优良的开关，所有的电子开关可以有固定的状态为“开”的阻抗(主要为电阻)。例如，电子开关的状态为“开”的电阻可约为3ohm(+/-10％)，状态为“开”的电抗可忽略不计(例如，在频率范围内小于0.2ohm)。这样，如果可以计算得到电传导线阻抗，公式(5)可用于计算有细胞或无细胞状态时电极阵列的阻抗。

本发明提供了一个基于细胞-基底检测器件上的两个或多个基本相同的阵列的相互关系，确定电传导线(主要是导线电阻，对于非常薄的导线层，电抗很小)阻抗的方法。图1A展示了四个电极阵列A，B，C，D来说明本方法。电子开关的电抗(串联电抗)和电导线的电抗(串联电抗)小于相应的电阻(串联电阻)。因此，我们着重分析电传导线电阻的分析。由阻抗分析仪器测得的阻抗包括电阻(串联电阻，R_total)和电抗(串联电抗)。对于电极阵列A-D，测得的总电阻R_total，电传导线电阻(R_trace)，开关电阻(R_switch)，和电极阵列的电阻(R_e-array)符合下式：

R_e-orray-A＝R_total-A-R_trace-A-R_switch-A     (6A)

R_e-array-B＝R_total-B-R_trace-B-R_switch-B     (6B)

R_e-array-C＝R_total-C-R_trace-C-R_switch-C     (6C)

R_e-array-D＝R_total-D-R_trace-D-R_switch-D     (6D)

通过电子开关的选择可获得恒定的“开”状态电阻R_switch-A，R_switch-B，R_switch-C和R_switch-D，它们有非常相似的值可视为相同值R_switch。这样一来，在上述等式中，已知参数为R_total-A，R_total-B，R_total-C，和R_total-D，以及R_switch-A，R_switch-B，R_switch-C和R_switch-D。有8个未知参数R_e-array-A，R_e-array-B，R_e-array-C和R_e-array-D和R_trace-A，R_trace-B，R_trace-C和R_trace-D。当四个方程等式有8个未知数时，不能被求解这些方程。需要增加这些变量之间的关系来求解方程。各个电传导线电阻(R_trace-A，R_trace-B，R_trace-C和R_trace-D)取决于所使用的金属层的类型，电传导线的几何形状如电传导线有多少矩型片段，片段的膜厚度，片段的宽度，和长度等。例如

$>R_{\mathrm{trace}-A}=\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}\rho \frac{L_{A-i}}{t_{A-i}*d_{A-i}}---\left(7\right)$>

其中N是导线A的片段数，t_A-i，、d_A-i和L_A-i是电极阵列A的电传导线的第i段导线片段的厚度，宽度和长度，ρ是薄膜的电阻系数。此处提供的等式适于膜为单金属层类型。等式可经变型后用于多金属层的膜(如金层上覆盖铬层)。

如果整个基底上金属层的厚度是相同的(例如，厚度差小于10％)，电传导线电阻之间的关系仅取决于它们的几何形状(即片段的长度，宽度)。例如，可直接计算电极阵列A电传导线的电阻和电极阵列D电传导线的电阻的比率α_A-D，这里假设导线各处膜的厚度和导线各处的电阻系数都是相同的。

$>{\alpha }_{A-D}=\frac{R_{\mathrm{trace}\_A}}{R_{\mathrm{trace}\_D}}=\frac{\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}\rho \frac{L_{A-i}}{t_{A-i}*d_{A-i}}}{\underset{i=1}{\overset{M}{\Sigma }}\rho \frac{L_{D-i}}{t_{D-i}*d_{D-i}}}=\frac{\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}\frac{L_{A-i}}{d_{A-i}}}{\underset{i=1}{\overset{M}{\Sigma }}\frac{L_{D-i}}{d_{D-i}}}.---\left(8\right)$>

相似地，基于预定的电极阵列B、C和D的电传导线几何关系，可推导出α_B-D和α_C-D。值得注意的是，上述等式加以变形也可用于有多层金属膜的导线类型。这样基于这些等式

R_switch-A＝R_switch-B＝R_switch-C＝R_switch-D＝R_switch，(9A)

R_trace-A＝α_A-D·R_trace-D，                      (9B)

R_trace-B＝α_B-D·R_trace-D，                      (9C)

和R_trace-C＝α_C-D·R_trace-D                      (9D)

等式(6A)-(6D)可变为下列等式：

R_e-array-A＝R_total-A-α_A-D·R_trace-D-R_switch        (10A)

R_e-array-B＝R_total-B-α_B-D·R_trace-D-R_switch        (10B)

R_e-array-C＝R_total-C-α_C-D·R_trace-D-R_switch        (10C)

R_e-array-D＝R_total-D-R_trace-D-R_switch-D            (10D)

对于等式(10A)到(10D)，其中有5个未知数R_e-array-A，R_e-array-B，R_e-array-C和R_e-array-D和R_trace-D。数学上这些未知数不能由上述等式计算得出。需要增加信息来解出这些未知数R_e-array-A，R_e-array-B，R_e-array-C和R_e-array-D和R_trace-D。

在此描述所发明一个方法。在此方法中，相同的生物或化学溶液或悬浮液置于电极阵列A-D上。因为电极阵列A到D有相同的电极结构，当所有的电极阵列都置于相同的生物或化学溶液或悬浮液下，电极阵列电阻R_e-array-A，R_e-array-B，R_e-array-C和R_e-array-D是相同的，或有非常接近的值，即R_e-array-A≈R_e-array-B≈R_e-array-C≈R_e-array-D.如果我们假设平均电极阵列电阻为R_e-array，则如下的近似式成立：R_e-array-A≈R_e-array-B≈R_e-array-C≈R_e-array-D≈R_e-array.因此，等式(10A)-(10D)可变形为：

R_e-array≈R_total-A-α_A-D·R_trace-D-R_switch      (11A)

R_e-array≈R_total-B-α_B-D·R_trace-D-R_switch      (11B)

R_e-array≈R_total-C-α_C-D·R_trace-D-R_switch      (11C)

R_e-array≈R_total-D-R_trace-D-R_switch-D          (11D)

我们需要找到尽可能满足上列等式的R_trace-D和R_e-array，使上述近似式两边最接近。

一种找到R_trace-D和R_e-array的数学方法为，使下列近似式求得最小值，该近似式用来定量描述近似式(11A，11B，11C，11D)两边的差：

F(R_trace-D，R_e-array)＝[R_e-array-(R_total-A-α_A-DR_trace-D-R_switch)]²+

[R_e-array-(R_total-B-α_B-DR_trace-D-R_switch)]²+

[R_e-array-(R_total-C-α_C-DR_trace-D-R_switch)]²+

[R_e-array-(R_total-D-R_trace-D-R_switch)]²           (12)

F(R_trace-D，R_e-array)是近似等式(11A，11B，11C和11D)两差的平方的和。F(R_trace-D，R_e-array)越小，则近似等式(11A，11B，11C和11D)两侧越接近。这样，R_trace-D和R_e-array的值可通过使F(R_trace-D，R_e-array)取得最小值而被确定。数学上的方法涉及到计算F(R_trace-D，R_e-array)对R_trace-D和R_e-array的一阶导数，使这个导数为0。一阶导数表达式如下：

$>=0;---\left(13A\right)$>

$>=0.---\left(13B\right)$>

等式(13A)和(13B)可变形为：

$>{\alpha }_{A-D}·[R_{\mathrm{total}-A}-R_{\mathrm{switch}}]+{\alpha }_{B-D}·[R_{\mathrm{total}-B}-R_{\mathrm{switch}}]+$>

$>{\alpha }_{C-D}·[R_{\mathrm{total}-C}-R_{\mathrm{switch}}]+[R_{\mathrm{total}-D}-R_{\mathrm{switch}}]---\left(14A\right)$>

4·R_e-array+R_trace-D·[α_A-D+α_B-D+α_C-D+1]＝

[R_total-A-R_switch]+[R_total-B-R_switch]+[R_total-C-R_switch]+[R_total-D-R_switch]

                                          (14B)

这样可解出R_trace-D：

$>R_{\mathrm{trace}-D}=\frac{4·S_1-A_{11}·S_2}{4·A_{12}-A_{11}·B_{12}}---\left(15\right)$>

其中A₁₁＝[α_A-D+α_B-D+α_C-D+1]；

S₁＝α_A-D·[R_total-A-R_switch]+α_B-D·[R_total-B-R_switch]+

α_C-D·[R_total-C-R_switch]+[R_total-D-R_switch]：

B₁₂＝[α_A-D+α_B-D+α_C-D+1]；

S₂＝[R_total-A-R_switch]+[R_total-B-R_switch]+[R_total-C-R_switch]+[R_total-D-R_switch]。

随着得出R_trace-D，导线电阻R_trace-A，R_trace-B和R_trace-C可由等示(9B)，(9C)和(9D)求出。而且电极阵列电阻R_e-array-A，R_e-array-B，R_e-array-C和R_e-array-D可分别用等式(10A)，(10B)，(10C)和(10D)由求得的电阻R_total-A，R_total-B，R_total-C和R_total-D得出。

这样，本发明的一个方面是提供一个方法，从测得的总电阻中，计算两个或多个基本相同电极阵列(例如，图1A中的阵列A-D)的电传导线的电阻，包括下列步骤：

(1)将相同或相似的溶液或悬浮液置于电极阵列上；

(2)用一个阻抗测量仪或阻抗测量电路，测量每个电极阵列的电阻(串联电阻)，这个电阻为电子开关电阻，连接盘和电极结构之间电传导线电阻(例如如图1A所示电极结构，位于连接盘和电导线之间)，和上有溶液或悬浮液的电极阵列的电阻之和；

(3)用等式(15)和等式(9B)，(9C)和(9D)求出电传导线的电阻值。注意在计算等式(15)时，电极阵列之间的几何关系用以确定因子α_A-D，α_B-D和α_C-D。

本发明的另一个方面是提供一个方法，从测得的总电阻中计算两个或多个基本相同电极阵列(例如，图1A中的阵列A-D)电阻，包括下列步骤：

(1)将相同或相似的溶液或悬浮液置于电极阵列上；

(2)用一个阻抗测量仪或阻抗测量电路，测量每个电极阵列的电阻(串联电阻)，这个电阻为电子开关电阻，连接盘和电极结构之间电传导线电阻(例如如图1A所示电极结构，位于连接盘和电导线之间)，和上有溶液或悬浮液的电极阵列的电阻之和；

(3)用等式(15)和等式(9B)，(9C)和(9D)求出电传导线的电阻值。注意在计算等式(15)时，电极阵列之间的几何关系用以确定因子α_A-D，α_B-D和α_C-D；

(4)用等式(10A，10B，10C和10D)计算电极阵列的电阻。

在一些应用中，用于放置在电极阵列上的溶液或者悬浮液(例如细胞悬液)有不同的成分。例如，使用不同细胞数目的细胞悬液，放置于每个电极阵列上的细胞悬液是非常不同的。在这种情况下，确定有细胞的电极阵列的电阻就要求通过进行一次“基准测量”或“较准测量”，先确定一个电传导线的电阻。在进行“基准测量”时，电极阵列上放置相同的基准溶液。电传导线的电阻可以“基准测量”的结果确定。在另一个单独实验中，电极阵列上放置有所感兴趣的溶液或细胞悬浮液，并使用阻抗测量仪或阻抗测量线路测量电极阵列的总电阻。有细胞时的电极阵列的电阻可由测得的总电阻减去电子开关电阻和电传导线电阻之和得到(或连续不断地得到)。

这样，本发明的另一个方面是提供一个方法，从阻抗测量仪器测得的两个或多个上有不同溶液或者所测悬浮液的相同电极阵列(例如，图1A中的阵列A-D)的总电阻上，计算电极阵列的电阻。它包括下列步骤：

(1)将相同或相似的溶液或悬浮液(基准溶液)置于电极阵列上；

(2)用一个阻抗测量仪或阻抗测量电路，测量每个电极阵列的总电阻(串联电阻)，这个电阻为电子开关电阻，连接盘和电极结构之间电传导线电阻(例如如图1A所示电极结构，位于连接盘和电导线之间)，和上有参考溶液的电极阵列的电阻之和；

(3)用等式(15)和等式(9B)，(9C)和(9D)求出电传导线的电阻值。注意在计算等式(15)时，电极阵列之间的几何关系(如：图1)用以确定因子α_A-D，α_B-D和α_C-D；

(4)在每个电极阵列上放置所需测量的溶液或悬浮液；用一个阻抗测量仪器或阻抗测量线路，测量每个电极阵列的总电阻(串联电阻)，这个电阻为电子开关电阻，连接盘和电极结构之间电传导线电阻，和上面放置有溶液或所需悬浮液的电极阵列的电阻之和；

(5)用等式(10A，10B，10C和10D)计算电极阵列的电阻，即从步骤(4)测得的总电阻中减去电子开关的电阻和电传导线的电阻。

注意在上述方法中，在电极阵列上放置基准溶液以确定电传导线阻抗的步骤(步骤(1)，(2)和(3))，可在在电极阵列上放置所需测量溶液或悬浮液步骤和测量总电阻(步骤(4))之前或之后进行。例如，可先做步骤(4)，然后将所需测量溶液或悬浮液从电极阵列上移开。再在电极阵列上加入溶液(步骤(1))。再进行步骤(2)和(3)以确定电传导线的电阻。最后，进行步骤(5)。

在另一个方法中，步骤(1)和(2)可在步骤(4)前进行。

本发明的另一个方面是提供一种方法，在做基于细胞检测时，基于阻抗测量仪测得的基本相同电极阵列的总电阻，用来确定阵列上有细胞的电极阵列的电阻。在这种方法中，各个电极阵列上放置相同的基准溶液(例如，不含有细胞的，相同的细胞培养液)，进行电子测量并确定电传导线的电阻。由于确定了这些电传导线的电阻，有细胞悬浮液的电极阵列的电阻，可由在阻抗测量仪上测得的总电阻计算出。这个总电阻包括有细胞的电极阵列的电阻，电子开关的电阻，和电传导线的电阻。此方法包括下列步骤：

(1)将相同或相似的溶液或悬浮液(基准溶液)置于电极阵列上；

(2)用一个阻抗测量仪器或阻抗测量电路，测量每个电极阵列的总电阻(串联电阻)，这个电阻为电子开关电阻，连接盘和电极结构之间电传导线电阻(例如如图1A所示电极结构，位于连接盘和电导线之间)，和上有溶液或参考溶液的电极阵列的电阻之和；

(3)用等式(15)和等式(9B)，(9C)和(9D)求出电传导线的电阻值。注意计算等式(15)时，电极阵列之间的几何关系(如：图1)用以确定因子α_A-D，α_B-D和α_C-D；

(4)在每个电极阵列上放置所需测量细胞悬浮液；用一个阻抗测量仪或阻抗测量线路，测量每个电极阵列的总电阻(串联电阻)，这个电阻为电子开关电阻，连接盘和电极结构之间电传导线电阻，和上有所需测量细胞悬液的电极阵列的电阻之和；

(5)用等式(10A，10B，10C和10D)计算电极阵列的电阻，即从步骤(4)测得的总电阻中减去电子开关的电阻和电传导线的电阻。

注意在上述方法中，在电极阵列上放置基准溶液以确定电传导线的阻抗的步骤(步骤(1)，(2)和(3))，可在在电极阵列上放置所需测量细胞悬浮液步骤和测量总电阻(步骤(4))之前或之后进行。例如，可先做步骤(4)，然后做步骤(1)和(2)。在一个方法中，在步骤(4)后，将所需测量细胞悬浮液从电极阵列上移走，后在电极阵列上加入基准溶液。在另一个方法中，在步骤(4)后，细胞用细胞裂解液裂解，这样所有电极暴露于相同的基准溶液，以进行步骤(2)和(3)的测量和计算。然后，进行步骤(5)以确定有所需测量的细胞悬浮液的电极阵列的电阻。

确定相同电极阵列的电传导线的电阻可作为或不作为用于细胞检测时细胞-基底阻抗测量的一部分.这取决于电极阵列的阻抗数据(在多时间点单个或多个频率测量)的分析方法。

在一些分析中，人们可能重视放置细胞的电极阵列的电阻或阻抗相对于基线电阻或阻抗的相对改变。在这种情况下希望确定电极阵列的电阻(或阻抗)，它们也可以由测得的总电阻(或阻抗)减去电传导线和电子开关的电阻得到。这样就需要知道电传导线的电阻或阻抗.

在另一些分析中，人们可能重视放置细胞的电极阵列的电阻或阻抗相对于基线电阻或阻抗的绝对改变。在这种情况下，可以从电极阵列有细胞时测得的总电阻或总阻抗中直接减去测得的基线条件下的总电阻或总阻抗。电子开关的电阻(或阻抗)和电传导线的电阻(或阻抗)在总电阻(阻抗)的作用可在这样的减法运算中被抵消了。这样就不需确定电传导线和电子开关的电阻。

在另一些分析中，有时重视计算基于检测的阻抗值的细胞指数或细胞数目指数。取决于用哪些方法计算细胞指数，可需确定，也可不需确定电传导线的电阻。例如，对上述细胞指数计算方法(A)，电传导线电阻的确定是必需的，这是为了消去电传导线电阻对电阻或阻抗相对变化分析的影响.在另一例中，如细胞指数计算方法(F)，不需测量电传导线电阻，因为电传导线电阻的影响在计算中被抵消了。

细胞-基底阻抗的检测可基于或不基于相对于基线阻抗(或电阻)的改变。例如，用基于细胞的实验法检测被测化合物对细胞的作用。一个方法是，监测细胞-基底阻抗并确定被测化合物加入细胞前和加入细胞后的细胞-基底阻抗的变化。细胞-基底阻抗监测可在在加药后的单个频率点或多个频率点，单个时间点或多个时间点测量.例如，在加药前的短时间上测量单个频率或多个频率下有细胞的电极阵列的阻抗，然后往细胞上加入被测化合物。在加药后再次测量单个频率或多个频率下有细胞的电极阵列的阻抗。这样的加药后测量可在规则的或不规则的时间间隔进行多时间点的连续测量。细胞-基底阻抗的改变可从加入待测化合物后测得的阻抗(电阻和/或电抗)减去加入待测化合物前测得的阻抗(电阻和/或电抗)来确定或定量。当在多频率点测量时，对于加入待测化合物后每个时间点，可基于细胞-基底阻抗改变的计算，来获取单个或多个参数。这个参数被用于量化加入化合物后的细胞变化，这个方法可进一步被用于分析细胞对不同浓度的一个被测化合物的反应并获得剂量依赖反应曲线。

归一化细胞指数，Δ细胞指数

给定时间点的“归一化细胞指数”通过将给定时间点的细胞指数除以基准点的细胞指数获得.因此基准点的归一化细胞指数为1。归一化细胞指数是细胞指数以特定点的细胞指数为基准归一化。在本申请的大多数情况下，归一化细胞指数通常以加入化合物前的那个时间点作为归一化基准点。因此，对于所有孔，这个基准点(加入化合物之前的那个时间点)的归一化细胞指数通常都是“一”。用这样一个归一化细胞指数的好处是消除不同的孔和不同的细胞数目对细胞分析的影响。化合物处理后，细胞更多的孔可能有更大的阻抗变化。用归一化细胞指数，消除了这种由于细胞数目不同造成的影响。

“Δ细胞指数”是将给定时间点的细胞指数减去标准时间点的细胞指数得到的。因此Δ细胞指数是测定点的细胞指数相对于初始点(标准时间点)的绝对改变。

细胞变化指数

时间相关的细胞反应(包括细胞毒性反应)可以通过获取直接反应细胞状态变化的参数来分析。比如说，时间相关的细胞反应可以通过计算阻抗反应变化的斜率来分析。这等于阻抗反应相对于时间的一阶导数。此处的阻抗反应可以通过测得的阻抗数据或者派生值(比如细胞指数、归一化细胞指数或者Δ细胞指数)来度量。在另外一个例子中，时间相关的细胞反应(包括细胞毒性反应)可以通过阻抗反应对时间的高阶导数分析.高阶导数可以提供额外信息，如细胞对不同化合物的反应、化合物作用的机理等。

举个例子，在RT-CES系统监测孔中细胞生物状态的实时定量的信息(比如，细胞指数，CI)的基础上，我们描述怎样获得称之为细胞变化指数的参数.这个新的参数，细胞变化指数(CCI)，可以有效地将时间相关的细胞指数与细胞状态连接起来。它通过以下式子进行计算：

$>\mathrm{CCI}\left(t\right)=\frac{\mathrm{dCI}\left(t\right)}{\mathrm{CI}\left(t\right)·\mathrm{dt}}.$>

因此，CCI是细胞指数的标准变化率。CCI值可以用来量化细胞状态变化。对于正常细胞培养条件下，处于指数增长的细胞，细胞指数由此处描述的细胞基底阻抗监测系统确定。细胞指数理想情况下应与孔中的细胞数成正比，因为所有细胞的细胞状态和平均粘附到电极表面的程度不会随着时间有重大变化。因而，细胞指数(CI)随着时间增长呈指数函数，即

$>\mathrm{CI}\left(t\right)=\mathrm{CI}\left(0\right)*2^{\frac{t}{\mathrm{DT}}}---\left(6\right)$>

其中DT是细胞增长到两倍的时间。对于这种指数规律增长的细胞，CCI(t)是一个常数，即

$>\mathrm{CCI}\left(t\right)=\frac{0.693}{\mathrm{DT}}\approx \frac{0.7}{\mathrm{DT}}.---\left(7\right)$>

因此，各种CCI(t)可以如下分类：

(1)如果CCI约等于0.7/DT，细胞指数与预期的细胞的指数增长期(对数增长期)有相似的增长率。

(2)如果CCI远远大于0.7/DT，说明细胞指数的增长比预期细胞的指数增长(或者对数增长)快。这表明细胞生长比正常指数增长快，或者细胞可能有形态变化(比如细胞伸展出去或者更紧密地粘附于电极表面)，导致更大的阻抗信号，或者以上两种变化都有，或者发生与特定细胞培养条件或与特定细胞分析相关的其他细胞行为.

(3)如果CCI大于零，且小于0.7/DT，那么细胞指数的增长比预期的指数增长慢。这说明，相对于指数增长，细胞增长减慢，或者细胞增长受到加到培养基内的化学药物、其他细胞培养参数的抑制，或者某些细胞死亡，不再粘附到电极表面，或者发生与特定细胞分析相关或特定细胞培养条件相关的细胞行为。

(4)如果CCI约等于零，那么细胞指数几乎是一个恒定值.这可能说明细胞增长几乎完全抑制。比如说，所有细胞都抑制在细胞周期的某一点，不再往前生长。或者，这可能说明培养基中细胞死亡的数量约等于新分裂出来的细胞.或者可能说明细胞达到细胞培养的平台期；也可能说明细胞数量超过细胞基底阻抗监测系统的测量上限。或者，有其他与特定细胞分析相关或特定细胞培养条件相关的细胞行为。

(5)如果CCI是负的，那么细胞指数随着时间减小，说明细胞不再粘附到电极表面，或者细胞形态改变了。

(6)如果CCI是负的，且绝对值很大，那么随时间变化，细胞指数快速减小，说明细胞很快失去与电极表面的贴附，或者细胞快速改变形态。

D.实时细胞检测的方法

本发明提供细胞水平上(基于细胞的)的检测方法，可对细胞增殖、细胞生长、细胞死亡、细胞形态、细胞膜特性(如尺寸、形态、细胞膜的组成)细胞贴附和细胞运动性进行实时分析。因此本方法可进行细胞毒性分析、增殖分析、凋亡分析、细胞贴附分析、细胞活化或刺激分析、抗癌化合物效能分析、受体配体结合或者信号转导分析、细胞骨架变化分析、细胞结构变化分析(包括但不仅限于细胞膜尺寸、形态及组成)、细胞数量、细胞质量或性状控制、时间相关的细胞毒性分析、细胞分化或去分化分析、检测或测定中和性抗体、特定T细胞介导的细胞毒性分析、细胞贴附力分析、细胞间相互作用分析、微生物、病毒和环境毒性分析，等等。

实时分析意指细胞的行为或状态能以规则或不规则的间隔连续检测.根据不同试验，对细胞行为、反应和状态的检测和数据记录或显示可以在几秒或几分钟的时间内完成。细胞的反应可以在选定的时间范围内基本上连续检测.比如，培养的细胞在加入一种试剂后可以以5到15分钟的间隔连续检测几个小时或者数天。无论是规则还是以不规则的检测间隔以及检测时间都可以由实验者决定。

因而，本发明的基于细胞的阻抗检测方法避免了由于时间点或者样本或细胞分析选择的时间点的局限造成的难以避免到结果上的偏差。另外，检测不需要额外准备细胞样本或者添加试剂，从而可以更方便、更快地得到结果，同时消除了这些过程中可能引入的错误。

对细胞-基底检测以及相关器件、系统和使用方法的描述已在如下文件中：美国专利临时申请60/379,749，递交于2002年7月20日；美国临时中请60/435,400，递交归档于2002年12月20日；美国专利临时申请60/469,572，递交于2003年5月9日；PCT申请PCT/US03/22557，题为“基于阻抗的检测装置和方法”，递交于2003年7月18日；PCT申请PCT/US03/22537，题为“基于阻抗，检测细胞和微粒的装置和方法，递交于2003年7月18日；美国专利申请10/705,447，题为“基于阻抗的检测装置和方法，递交于2003年11月10日；美国专利申请10/987,732、美国专利申请10/705,615，题为“基于阻抗，检测细胞和微粒的装置和方法，递交于2003年11月10日。在此将以上专利申请中的关于细胞-基底阻抗检测以及相关器件、系统和使用方法，的描述以参考文献的方式整合到本申请中。本发明会揭示进一步详细的细节。

简言之，用本发明技术测量细胞-基底或者说细胞-电极阻抗使用了细胞-基底阻抗检测器件(cell-substrate impedance monitoringdevices)，其孔底表面(如微滴定板的孔)排列合适几何形状的微电极阵列(microelectrode arrays)，或者在多个液体容器(孔)(multiplefluid containers(wells))的底部面向的一方以相似的方式设计有电极。将细胞加入到器件的孔后，细胞会和电极表面接触并贴附上去。细胞的有无以及状态的改变都会影响电极传感器表面电子和离子的通过。测量电极间阻抗可提供关于电极上细胞生物状态的重要信息。当细胞生物状态发生变化时，系统可以实时并自动获取其模拟电信号，并可以转换成数字信号以进行进一步的分析。

优选的，用本发明的系统进行细胞-基底阻抗分析.这个系统包含本发明的检测器件、阻抗监测仪、器件检测台(器件工作台，由连接检测器件和阻抗分析仪的电子线路组成)、以及控制器件工作台并记录分析阻抗数据的软件系统。

在本发明的一个系统中，基于测量到的电极阻抗值可自动获取并提供相应的细胞指数。所得到的选定孔的细胞指数反映了：1)贴附在此孔电极表面的细胞数量，2)此孔电极表面的细胞贴附状态(紧密的还是松散的).因此，贴附在电极表面的生理状态相似的同一种类的细胞越多，细胞指数越大。同样的，细胞在电极表面贴附得越好(例如细胞延伸得更大从而有更大的接触面积，或者细胞与电极表面贴附得更加紧密)，细胞指数越大。

本发明的一方面提供了一种基于细胞水平(基于细胞的)的检测方法，包括：a)提供一套细胞-基底阻抗测量系统，包括两个或多个电极阵列，每个阵列都位于检测器件(检测板)的一个液体容器内；b)将检测器件连接到阻抗检测仪；c)将细胞加入检测器件的一个或者多个液体容器中；d)监测至少一个有电极阵列和细胞的液体容器的细胞-基底阻抗.优选的是，阻抗从至少一个液体容器中测得，至少在三个时间点获得阻抗度量。从至少三个时间点测得阻抗值，作阻抗-时间依赖性曲线，产生一个或多个液体容器的一条或多条阻抗曲线。

本系统另一方面提供了在阻抗测量系统中作细胞分析的方法，包括a)提供本发明的细胞-基底阻抗测量系统，包含有两个或多个电极阵列的器件，每个阵列位于器件的一个孔内；b)将细胞导入器件的一个或多个孔中；c)测量至少一个孔的细胞-基底阻抗，孔包含电极阵列和细胞。优选的是，在器件的一个或多个孔中，至少三个时间点测得阻抗值.优选的是，从至少三个时间点获得的阻抗测量或者从阻抗测量得到的阻抗值，绘制阻抗-时间依赖性曲线，产生一个或多个孔的一条或多条阻抗曲线。

此方法可用来检测细胞状态，此处的细胞状态包括但不限于：细胞贴附或连接在基底包括电极上的状态(例如细胞伸展程度，细胞贴附面积，细胞贴附紧密程度，细胞形态)，细胞生长或增殖状态；孔中存活和/或死亡的细胞数；细胞骨架的变化和重建(重组)以及细胞进入凋亡和/或死亡的数量。以上说的细胞水平(基于细胞的)检测包括但不仅限于细胞贴附、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞存活、细胞毒性、细胞形态探测、细胞计数、细胞性状控制、时间依赖性细胞毒性特征、IgE介导的细胞激活或者刺激、受体配体结合、病毒和细菌毒素介导的细胞病理变化和细胞死亡、检测或定量分析中和抗体、检测特定的T细胞介导的细胞毒性作用、细胞水平(基于细胞的)上的受体配体结合筛选和测定。

在本发明的一个优选实例中，须将细胞加入到有电极阵列的至少两个孔中，以检测至少两个有电极阵列和细胞的孔阻抗。

试验中所用细胞可以是从任何物种中分离出的原代细胞或细胞系。原代细胞可以来自血液或组织。细胞也可以是通过生物工程改造后的细胞，这些细胞内引入了核酸或蛋白质。在某些实例中，在不同的孔中加入不同类型的细胞，可以对这些细胞的行为进行对比。

阻抗检测分析可以持续从几分钟到几天，甚至几周。虽然本发明没有要求，但优选的是检测3个或更多的时间点的阻抗。测量阻抗可以以规则或不规则，或者两者结合的时间间隔进行。在细胞水平(基于细胞的)检测的一个实例中，我们以规则的时间间隔检测细胞-基底阻抗。在本发明的一些实例中，我们可以不规则的时间间隔和特定时间段内规则的时间间隔测量阻抗。可以在一个或多个频率上检测阻抗。例如某些实例中在每个检测点以某个范围的频率检测阻抗.比较好的办法是，在大约1Hz到100MHz中间选取至少一个频率检测阻抗，更优选的是，在大约100Hz到2MHz之间选取至少一个频率检测阻抗。

另一方面，本发明提供了一种细胞水平(基于细胞的)实时测试一种化合物对细胞作用效果的方法，包括：a)提供一套上面描述的系统；b)将细胞加入到多孔器件的孔中；c)在含细胞的孔中加入化合物；d)以规则或不规则的时间间隔，检测加化合物前和加化合物后的细胞-基底阻抗，这样，时间依赖性的阻抗变化可以提供加入化合物之前的时间依赖性细胞状态信息和化合物作用下时间依赖性细胞状态信息。

细胞状态信息包括，但不限于：细胞贴附或连接在基底包括电极上的状态(例如细胞伸展程度，细胞贴附面积，细胞贴附紧密程度，细胞形态)，细胞生长或增殖状态；孔中存活或死亡的细胞数；细胞骨架的变化和重组以及细胞进入凋亡或死亡的数量。细胞状态信息还可能包括引起以上一个或多种细胞状态指示因子变化的所有化合物和细胞相互作用.例如，如果化合物与细胞表面受体结合并引起细胞形态变化，这种化合物和受体的结合就可以用检测细胞-基底阻抗的方法检测。以上说的细胞水平(基于细胞的)检测包括但不仅限于细胞贴附、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞存活、细胞毒性、细胞形态探测、细胞计数、细胞性状控制、时间依赖性细胞毒性特征、IgE介导的细胞激活或者刺激、受体配体结合、病毒和细菌毒素介导的细胞病理变化和细胞死亡、检测或定量分析中和抗体、特定的T细胞介导的细胞毒性效应、细胞水平(基于细胞的)上的受体配体结合筛选和测定。

在上述基于细胞的分析的一个实例中，细胞-基底阻抗以规则的时间间隔测量。在可效仿实例中，在加入化合物之前和之后，阻抗以规则的时间间隔2h、1h、30min、15分钟测量。在本申请中，实时检测意味着我们可以以多种不同的时间分辨率测量细胞-基底阻抗。比如，测量可以以长一点的时间间隔(每个小时或每两个小时)进行，或者以短一点的时间间隔(每分钟或几分钟)进行。实时检测并不意味着测量以持续不断的方式进行。换句话说，实时检测并不意味着在每一个时刻都在测量。

图2显示用此发明的方法检测细胞增殖的结果。试验中，将H460细胞加入到本发明的16孔细胞-基底阻抗检测系统器件的孔中，每个孔接种的初始细胞数是不同的。将与器件相连的系统的器件工作台置于37℃，5％ CO₂的组织培养箱中。以15分钟的时间间隔连续检测细胞-基底阻抗，持续125小时.细胞指数由系统对每一个时间点计算得到并针对每个细胞接种数给出细胞生长(增殖)曲线。细胞生长曲线以对数(log)方式作图，给出了指数生长期和平台生长期。

图3显示实时检测NIH3T3细胞的贴壁及伸展过程的结果。将细胞接种到预先包被多聚赖氨酸(poly-L-lysine)或者纤连蛋白(fibronectin)的细胞-基底阻抗检测器件。将器件与器件工作台连接，将器件工作台置于37℃，5％ CO₂的组织培养箱中。通过检测细胞-基底阻抗检测系统的阻抗，来检测细胞在不同包被表面的贴壁及伸展过程。阻抗每3分钟检测一次，检测3小时。每一个时间点的细胞指数由阻抗检测系统计算得到并以时间为参数作图.

图4检测Cos-7细胞受表皮生长因子(EGF)刺激后形态改变的实验结果。将Cos-7细胞加入到本发明的16孔检测器件的孔中。将检测器件与细胞基底-测量系统的器件工作台相连，器件工作台置于37℃，5％ CO₂的组织培养箱中。细胞在用50ng/ml EGF刺激前，血清饥饿处理8小时。对照组细胞没有加EGF。阻抗每3分钟检测一次，检测2小时，接着以1小时为间隔检测14小时。细胞指数由系统计算得到并以时间为参数作图.由于EGF引起的细胞膜褶皱以及肌动蛋白的运动造成细胞指数在起始有一个跳跃。箭头所指处为加入EGF的时间点。

D1.细胞增殖分析

本发明提供细胞增殖分析的方法。在这些分析中，阻抗值增加表示细胞数量增加。可对阻抗值作阻抗值-时间依赖性曲线，获得本发明的细胞基底测量器件的孔中细胞的生长曲线。

本发明提供获得至少一条细胞生长曲线的方法，包括：提供有两个或两个以上电极阵列的器件，每个阵列与器件的一个液体容器(孔)相对应；将器件连接到阻抗分析仪；将细胞接种到一个或多个液体容器；在液体容器中接种细胞之后，在三个或更多个时间点测量一个或多个液体容器的阻抗值；对三个或更多个时间点的阻抗值作时间依赖性曲线，产生一个或多个液体容器中细胞的至少一条生长曲线。

本发明还提供用本发明的系统产生至少一条生长曲线的方法.这个系统包括多孔细胞-基底阻抗测量器件、阻抗分析仪、器件工作台(器件检测台)、和软件系统。这个方法包括：提供多孔细胞-基底阻抗测量系统；将细胞接种到系统的一个或多个孔中；接种细胞后，在三个或更多个时间点测量一个或更多个孔的阻抗值；对三个或更多个时间点的阻抗值做时间依赖性曲线，产生一个或多个孔的细胞生长曲线。

优选的是，能够在四个或更多个时间点用本发明的器件或系统测量液体容器的阻抗值，其中的至少一个点是在细胞加入液体容器之前。优选的是，阻抗值在从几分钟到几天的分析时间内，以规则或不规则的时间间隔来测量。在很多例子中，增殖分析可以通过几个小时到几天时间内的阻抗值测量来完成。

增殖分析时，优选的是，在多于一个液体容器中(即复孔)接种有相同数量的同种细胞。在这种情况下，可以作在分析时间点上的，复孔测得的阻抗平均值与时间的关系曲线。优选的是计算平均值的标准偏差。

生长曲线可以通过作阻抗值-时间依赖性曲线获得，也可以通过细胞指数-时间依赖性曲线获得。细胞指数是由阻抗测量，计算得到的，可以是比如归一化细胞指数或Δ细胞指数。阻抗测量轴或者细胞指数轴(通常为y轴)可以选择使用对数值。

阻抗值可以是任何由阻抗度量得到的阻抗指数，包括但不局限于细胞指数、归一化细胞指数或者Δ细胞指数。在特定的实例中，阻抗值也可以是计算得或原始测得的阻抗值。细胞指数(包括归一化细胞指数和Δ细胞指数)是作生长曲线的有用值，因为它将阻抗度量与细胞数量联系起来。对于细胞生长曲线，在给定时间点的Δ细胞指数可以通过将给定点的细胞指数减去基线点的细胞指数得到，基线点可以是细胞刚刚贴附且未进入对数生长期的时间点。优选的是，阻抗值的确定、生长曲线的产生都用软件进行，并且优选的是，用直接与阻抗分析仪连接的软件。比如，用本发明的一个系统作生长分析，阻抗值可以由测量或者推算或者计算得到，生长曲线可以由控制并接受阻抗分析仪数据的软件产生。

由阻抗值或者细胞指数(包括归一化细胞指数和Δ细胞指数)产生的生长曲线可以选择性地用于计算细胞生长或行为的一个或多个动力学参数。比如说，生长曲线可以用于计算停滞期的长度、细胞贴附时间、细胞贴附率或者细胞倍增时间。

图2显示实时检测H460细胞增殖情况，细胞以不同的初始细胞数目接种在本发明的细胞-基底阻抗测量系统。细胞增殖情况在超过125小时的时间内每15分钟记录一次。对数形式的细胞生长曲线显示细胞对数生长或者细胞的稳定状态。此处显示的细胞指数曲线可以用于计算细胞倍增时间。例如，观察细胞初始接种密度为900个细胞的细胞指数。细胞指数从0.3增长到3.0大约用了57小时(大概55小时到112小时之间)所以细胞指数倍增时间大约是17(＝log(2)＊57)个小时。假如在这个范围内，细胞数和细胞指数存在线性关系，那么细胞倍增时间等于细胞指数倍增时间。所以，细胞倍增时间(DT)约为17.2小时。另外一个计算细胞指数倍增之间的简单方法就是画出细胞指数增加到两倍所需要的时间。比如，初始细胞接种数目为900个细胞的细胞指数曲线，细胞指数从1.0(大概82小时)改变到2.0(大概99小时)所需的时间约为17个小时，那么细胞指数倍增时间是17个小时。

图3用本发明的细胞-基底阻抗测量系统实时检测NIH3T3细胞贴附和伸展。细胞接种到包被有多聚赖氨酸或纤维蛋白的器件上。细胞在不同包被表面的贴附和伸展3个小时内每3分钟被实时检测一次。用图3显示的细胞指数曲线，我们可以计算细胞贴附时间和细胞贴附率。细胞加入孔中(图3中的零点)后，初始细胞指数迅速增加，反映细胞伸展和贴附过程.细胞指数从零增加到最大值或者稳定值的时间，就是细胞贴附的时间(假设细胞接种后的初始阶段没有细胞分裂和生长)。对于NIH3T3细胞，细胞在纤维蛋白包被的孔中的贴附时间约为1.2小时，而在多聚赖氨酸包被孔中的贴附时间约为3.5小时。细胞贴附率定义为1除以细胞贴附时间。所以，NIH3T3细胞在纤维蛋白和多聚赖氨酸包被的孔中的贴附率分别为0.83每小时和0.29每小时。

图4用本发明的细胞-基底阻抗测量系统实时检测Cos-7细胞形态改变。细胞经过8个小时的血清饥饿和有或没有50ng/mlEGF刺激处理。细胞形态的改变在2个小时时间内每3分钟检测一次，之后14个小时，每小时检测一次。EGF处理的细胞的初始跳跃应归于EGF引起的膜皱缩和肌动蛋白活动.箭头指示EGF刺激的点。用图4显示的细胞指数曲线，我们可以计算细胞贴附时间和细胞贴附率。细胞加入孔中(图4中的零点)后，初始细胞指数迅速增加，反映细胞伸展和贴附过程。细胞指数从零增加到最大值或者稳定值的时间，就是细胞贴附的时间(假设细胞接种后的初始阶段没有细胞分裂和生长)。对于此处的Cos-7细胞，细胞贴附时间约为4小时。细胞贴附率定义为1除以细胞贴附时间。就Cos-7细胞来说，细胞贴附率约为0.25每小时。进一步，我们可以计算停滞期的长度。停滞期相当于完成细胞贴附后细胞进入增长期的时间.图中的细胞指数曲线显示细胞贴附在4个小时完成。细胞在大约9个小时出现细胞指数的重大增长，指示细胞的增长。所以停滞期的时间为5个小时(＝9小时-4小时)。

比较两种或更多种细胞的生长曲线

用本发明的方法做增殖分析时，可以在分开的孔中接种两种或更多种细胞，获得两种或更多种细胞的生长曲线。生长曲线或由生长曲线得到的动力学参数可以进行对比.

在这个方面，本发明包括产生至少两种细胞的生长曲线的方法：提供拥有两个或更多个电极阵列的检测器件(检测板)，每个阵列与一个液体容器相对应；将检测器件连接到阻抗分析仪；将两种或更多种细胞接种到两个或更多个液体容器，其中至少一个液体容器接受一种细胞，至少另一个液体容器接受另一种细胞，以此提供两个或更多个液体容器来比较两种或更多种细胞；加入两种或更多种细胞到两个或更多个液体容器后，在三个或更多个时间点，检测两个或更多个接种不同细胞的液体容器的阻抗；对三个或更多个时间点的阻抗作时间依赖性曲线，产生两个或更多个细胞的生长曲线。

本发明还提供用本发明的系统产生至少一条生长曲线的方法，这个系统包括一个多孔细胞-基底阻抗测量器件、一个阻抗分析仪、一个器件工作台(器件检测台)和一个软件程序。具体方法为：提供多孔细胞-基底阻抗测量系统；接种两种或更多种细胞到检测器件的两个或更多个孔，其中至少一个孔接受一种细胞，至少另一个孔接受另一种细胞，以提供两个或更多个含两种或更多种细胞的孔；在两个或更多个孔中，加入两种或更多种细胞后，在三个或更多个时间点检测两个或更多个含不同种类细胞的孔的阻抗；做三个或更多个时间点的阻抗-时间依赖性曲线，产生两种或更多种细胞的生长曲线。

优选的是，在上述细胞增殖分析中，测量阻抗在四个或更多个时间点进行，其中至少一个点是在细胞加入液体容器之前。优选的是阻抗值在几分钟或几天的分析时间内，以规则或不规则的时间间隔来测量。例如，几个小时到几天时间内的某个区间。

增殖分析时，优选的是，作重复孔的实验，即多于一个液体容器中接种有相同数量的同种细胞。在这种情况下，可以作在分析时间点上的从重复孔测得的阻抗平均值与时间的关系曲线。优选的是，计算一下平均值的标准偏差。

不同类型的细胞生长曲线可以通过上述方法获得.阻抗或者阻抗值，比如细胞指数、归一化细胞指数或者Δ细胞指数，可以作时间依赖性曲线。阻抗度量轴或者细胞指数轴(通常为y轴)可以选择使用对数值.

由阻抗值或者细胞指数(包括归一化细胞指数和Δ细胞指数)得到的生长曲线可以选择性地用于计算细胞生长和细胞活动的一个或多个动力学参数。比如，生长曲线可以用于计算停滞期的长度、细胞贴附时间、细胞贴附率或者细胞倍增时间。

优选的是，两种或更多种不同细胞的生长曲线，或者由两种或更多种不同细胞的生长曲线得到的动力学参数可以进行比较，确定不同细胞在增殖模式、增值率或能由生长曲线得到的动力学参数上的不同。这些不同种类的细胞可以是任何种类的，包括从动物或人血液或组织中分离出来的原代细胞，或细胞系中的细胞.例如，两种原代癌症细胞，或者不同阶段的同种原代癌症细胞的增值率可以进行比较。另举一例，不同基因型个体的原代细胞也可以进行比较.另外，原代细胞或干细胞细胞系的增值率可以进行比较。另外，一个细胞系的对照细胞和经过基因修饰的细胞的生长曲线或者参数可以进行比较。另外，病毒感染的细胞和对照细胞的生长曲线或参数可以进行比较。

D2.用细胞-基底阻抗系统将细胞定量化

本发明包含细胞定量化的方法，包括：提供有两个或更多个电极阵列的检测器件，每个阵列对应器件的一个液体容器；将检测器件连接到阻抗分析仪；将细胞接种到一个或多个液体容器(孔)；将细胞加入一个或多个液体容器后，在一个或多个时间点测量一个或多个液体容器的阻抗值；获取一个或多个时间点的细胞指数；用细胞指数来确定一个或多个时间点上，一个或多个液体容器中的细胞数量。细胞指数是这样确定细胞数量的，用一个公式将细胞指数和细胞数量联系起来。公式通过以下步骤获得：提供细胞基底测量器件；将器件连接到阻抗测量设备；将细胞接种到一个或多个液体容器；测量一个或多个含细胞的液体容器的阻抗；通过阻抗计算细胞指数；测量阻抗值的时候，用不同于阻抗测量的方法确定细胞数量；获得联系两个或更多个时间点，一个或更多个液体容器中的细胞数量和阻抗值的公式。

在获得上述方法中的公式的实例中，有时，接入孔的细胞数量是已知的，或可在加入孔之前预先确定的。在这种情况下，可以假设在测量阻抗以获取公式时，细胞数量没有改变或只有轻微改变。

用不同于阻抗测量的方法确定细胞数量可以是细胞板计数、血球计计数、流式细胞计数或者库尔特(Coulter)计数器计数。

这种方法也可以用本发明的一个阻抗测量系统实现，这个系统包含一个多孔细胞-基底阻抗测量器件，一个阻抗分析仪，一个器件工作台，和控制软件。具体方法为：提供多孔细胞-基底阻抗测量系统；将细胞接种到一个或多个孔中；在一个或多个孔中加入细胞后，在一个或多个时间点测量一个或多个包含细胞的孔的阻抗；获得一个或多个时间点的细胞指数；用细胞指数确定上述一个或多个时间点的至少一个孔的细胞数量。

有公式将细胞指数和细胞数量联系起来，通过这个公式，细胞指数可以用来确定细胞数量.这个公式是通过如下步骤获得的：提供细胞基底测量系统，系统拥有至少一个多孔细胞-基底阻抗测量器件；将细胞加入到系统检测器件的一个或多个孔中；在两个或更多个时间点测量含有细胞的一个或多个孔的阻抗；在两个或更多个时间点，通过阻抗计算细胞指数；用不同于阻抗测量的方法，确定两个或更多个时间点，一个或多个孔的细胞数量；获得一个或多个孔中，两个或更多个时间点，细胞数量和阻抗的相互关系公式。

在获得上述方法中的公式的实例中，有时，接入孔的细胞数量是已知的，或可在加入孔之前预先确定的。在这种情况下，可以假设在测量细胞阻抗以获取公式时，细胞数量没有改变或只有轻微改变。

用不同于阻抗测量的方法确定细胞数量可以是细胞板计数、血球计计数、流式细胞计数或者库尔特(Coulter)计数器计数。

用细胞-基底阻抗测量设备，比如此处所描述的设备作分析时，对于给定细胞类型，细胞指数(包括归一化细胞指数和Δ细胞指数)和细胞数量相关的公式可以在分析中用于测定给定细胞的数量。通常，对于给定细胞类型或者在相似生理条件下的细胞，细胞指数和细胞数量相关的公式可以用于以后的分析，而不需要每次分析都计算一次公式。但是，必须指出的是，这个公式只有在与获得公式时有相同生理条件的情况下才有效.如果细胞情况不同，比如培养基的组成改变，或者细胞贴附表面变换，那么这个公式就不再适用。另一个例子中，如果细胞在某次分析中处于对数生长期，在另一次分析中处于停滞期，那么这个公式也不再适用。另一点值得一提的是，获取的细胞指数或阻抗也依赖于细胞贴附于表面的情况和细胞的形态。如果在一次分析中，细胞形态或者细胞贴附改变了，那么我们需要区分这些改变是由细胞数量改变、细胞形态改变还是细胞贴附改变造成的。

作为一个例子，我们可以获得NIH3T3细胞在实验条件下，细胞指数和细胞数量之间的相关公式.这个特定例子中，将细胞指数转化为细胞数量的公式是：细胞数量＝2000*细胞指数-145。为了测试这个公式，我们发现用图8所示的方法基于细胞指数数据估计的细胞数量与实际接种的细胞数量之间的误差低于20％。

D3.基于细胞的检测测试化合物对细胞的影响

另一方面，本发明提供了一种基于细胞的检测来测试一种或多种化合物对细胞影响的方法，包括：准备一套本发明的检测器件(检测板)，包含两个或更多个电极阵列，每个阵列对应于器件上的一个液体容器(孔)；将检测器件连接到阻抗分析仪上；将细胞加入一个器件的两个或者多个有电极阵列的液体容器(孔)中；在一个或多个有电极阵列和细胞的液体容器中的一个中加入至少一种化合物，提供至少一个有测试化合物的液体容器；准备至少一个对照液体容器(孔)，加入细胞，但不接受化合物测试；至少在三个时间点检测加化合物后一个或者多个孔的细胞-基底阻抗，分析一个或多个测试化合物的孔和一个或多个对照孔的阻抗值，阻抗的改变可以提供细胞对一种或多种化合物反应的信息。

本发明的相关方面也提供基于细胞的分析，以研究一个或多个测试化合物对细胞的作用。该系统包括：一个多孔细胞-基底阻抗测量器件、一个阻抗分析仪、一个器件工作台(检测板工作台或器件检测台，包含涉及检测器件、连接两个或多个电极阵列到阻抗分析仪的电子线路)、控制工作台并记录分析阻抗分析仪数据的软件。具体方法为：准备一个多孔细胞-基底阻抗测量系统；将细胞接种到器件的两个或更多个孔中；加入至少一种测试化合物到两个或多个有细胞的孔的至少一个孔中，获得至少一个测试孔；准备至少一个对照孔，接种细胞，但是不加入测试化合物；在加入一种或多种化合物之后的至少三个时间点，测试一个或多个加有化合物的孔和一个或多个对照孔的细胞-基底阻抗。加入一种或多种化合物之后的至少三个时间点，分析一个或多个加有化合物的孔和一个或多个未加化合物的对照孔的阻抗，阻抗的变化可以提供细胞对一种或多种化合物的反应的信息。

测试的化合物可以是任何化合物，包括大分子、小分子、复合物、有机分子、无机分子、生物分子如，但不限于，脂、类固醇、碳水化合物、脂肪酸、氨基酸、多肽、蛋白质、核酸或它们的任何结合产物。测试的化合物可以是合成的化合物、自然生成的化合物、自然生成化合物的衍生物等等。测试化合物的结构可以是已知的也可以是未知的。

细胞对一种或多种化合物的反应的信息包括，但不限于：细胞贴附或连接在底层包括电极上的状态(例如细胞伸展程度，细胞贴附面积，细胞贴附紧密程度，细胞形态)，细胞生长或增殖状态；孔中存活或死亡的细胞数；细胞骨架的变化和重建以及细胞进入凋亡或死亡的数量。细胞状态信息还包括引起以上细胞状态指示因子变化的所有化合物和细胞相互作用。例如，如果化合物与细胞表面受体结合并引起细胞形态变化，这种化合物和受体的结合就可以用检测细胞-基底阻抗的方法检测.

试验中所用细胞可以是从任何物种中分离出的原代细胞或细胞系细胞。细胞也可以是通过生物工程改造后的细胞(例如，细胞来源于有基因修饰的生物，如基因敲除生物，或者细胞用生物工程方法过量表达某种内源或外源基因，或者细胞正常的基因表达被反意分子或siRNA调控。)在某些实例中，不同孔内加入不同类型的细胞以比较它们对一种或多种化合物的反应。

用上述方法所作的细胞分析包括，但不局限于细胞贴附、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞存活、细胞毒性、细胞形态检测、细胞定量化、细胞性状或质量控制、时间依赖性细胞毒性分析、IgE介导的细胞活化或刺激、受体-配体结合、病毒、细菌或环境毒素介导的细胞病理变化或细胞死亡、中性化抗体定量化、特异T细胞介导的毒性效应、用于筛选或衡量配体-受体结合的细胞分析。

本发明研究测试化合物对细胞的作用的方法中，优选的是，在加入上述至少一种化合物到上述至少一个化合物测试孔之前的至少一个时间点，作阻抗测量。优选的是，能够在四个或四个以上时间点测量阻抗，其中至少一个时间点在加入一种或多种测试化合物之前。优选的是，在分析期间，比如几个小时到几天，以规则或不规则的几分钟到几天的时间间隔来检测阻抗。以上细胞水平(基于细胞的)测试的一个实例中，加入测试化合物前至少有一个细胞-基底阻抗检测点，此后以固定间隔检测。例如加入化合物前以一个或多个间隔测量阻抗，加入化合物后以固定的2小时、1小时、30分钟或者15分钟为间隔测量。优选的是，阻抗以固定时间间隔测量三次以上。在当前应用中，实时检测意味着允许使用不同的时间分辨率测量细胞-基底阻抗，例如以较长的时间间隔如1小时或2小时测量，或以较短的时间间隔如1分钟或几分钟测量。

可以以一个或多个频率检测阻抗。例如某些实例中在每个检测点用一段频率检测阻抗。较优选的是，是在大约1Hz到100MHz中间选取至少一个频率检测阻抗，优选的是，在大约100Hz到2MHz之间选取至少一个频率检测阻抗。

优选的是，作以下测试化合物分析的重复，即在多于一个孔的细胞中加入相同浓度的相同化合物。在这种情况下，测量时间点上的阻抗值可以用重复孔的平均值。优选的是，能够计算平均值的标准偏差。

本发明的方法中，阻抗分析可以包含作阻抗-时间依赖性曲线，获得至少一种被测化合物的阻抗曲线和至少一条对照阻抗曲线。至少一种被测化合物阻抗曲线和至少一条对照阻抗曲线作比较，如果有明显区别的话，确定一个时间段，即被测化合物阻抗曲线与对照阻抗曲线有明显不同的时间段，表明这个时间段化合物对细胞有作用效果。例如，被测化合物阻抗曲线明显不同于对照曲线的时间段，可以假设被测化合物影响以下一个或多个细胞状态，比如细胞贴附或粘着、细胞生长或增殖、细胞骨架的组织或功能、或者细胞凋亡或死亡。

本发明优选，但并不要求，对有细胞和被测化合物的孔的阻抗测量数据与有细胞但没有化合物的孔的阻抗测量数据进行对比。例如，我们可以比较加入化合物前的一个时间点或多个时间点的阻抗分析与加入化合物之后的一个时间点或多个时间点的阻抗分析。这样的比较可以直接用于评估细胞对加入化合物的反应。另外，我们还可以用获得的阻抗值计算细胞指数(或细胞数量指数)。

计算细胞指数(细胞数量指数)的方法在此处和以前的美国专利申请号10/705,447，美国专利申请号10/987,732中已说明。该两个专利申请中关于细胞数目指数和它的计算的说明都以参考文献的方式被整合到本申请中。我们可以比较分别由加入化合物的测试孔和不加化合物的对照孔的阻抗值计算得到的细胞指数，来估计化合物对细胞的作用。换个做法，我们可以比较分别由加入化合物之前的一个或多个时间点和加入化合物之后的一个或多个时间点的阻抗值计算得到的细胞指数，来估计化合物对细胞的作用。在一些优选实例中，细胞指数可以用来指示细胞毒性。

在本申请的C部分，我们已经说明了从阻抗值计算细胞指数的方法。可以对至少三个时间点的至少一个测试孔和至少一个对照孔的细胞指数(包括归一化细胞指数和Δ细胞指数)作时间依赖性曲线，获得一条或多条被测化合物细胞指数曲线和一条或多条对照细胞指数曲线。比较一条或多条被测化合物细胞指数曲线和一条或多条对照细胞指数曲线，确定被测化合物曲线和对照曲线有明显差异的时间段(如果有的话)，即化合物对细胞有作用的时间段。例如，被测化合物曲线与对照曲线有明显差异的时间段，可以假设被测化合物影响以下一个或多个细胞状态，比如细胞贴附或粘着、细胞生长或增殖、细胞骨架的组织或功能、或者细胞凋亡或死亡.

一个或多个被测化合物孔和一个或多个对照孔的三个或更多个时间点的细胞指数可以用来计算三个或更多个时间点的细胞变化指数(CCI)或者细胞指数对时间的二阶导数。细胞变化指数(CCI)的计算方法已在本申请的C部分说明。给定时间点的CCI值可以确定为约等于0.7/DT、远大于0.7/DT、大于零且小于0.7/DT、约等于零、小于零、或远小于零.这些值可以指示分析点细胞的行为：CCI约等于0.7/DT表明细胞以指数增长率增长；CCI远大于0.7/DT说明细胞增长率大于指数增长率；CCI大于零且小于0.7/DT说明细胞增长率小于指数增长率；CCI约等于零说明没有增长(恒定的细胞指数)；CCI小于零说明细胞从基底上去贴附；CCI远远小于零说明细胞从基底上快速去贴附。

对于给定时间点的分析，对照孔和被测化合物孔CCI值的不同可以说明化合物对细胞有作用的时间，还可以提供化合物作用类型的信息。

CCI还可以进一步用于获取被测化合物的效用信息。作至少三个时间点，被测化合物孔和对照孔CCI时间依赖性曲线，获取至少一个对照孔和至少一个测试孔的细胞变化指数曲线(CCI曲线)。比较一个或多个被测化合物CCI曲线和一个或多个对照CCI曲线，获得细胞对上述至少一种测试化合物反应的细胞状态或行为的信息.细胞状态或行为为以下状态之一：细胞贴附或粘着状态；细胞生长或增殖状态；生长细胞和死亡细胞的数量；细胞骨架的改变或重组织；凋亡或坏死的细胞数量。

多于一种细胞的细胞分析

本发明还提供比较一种化合物对两种或更多种细胞的作用的方法。一方面，此方法具体为：准备一个拥有两个或更多个电极阵列的检测器件(检测板)，每个电极阵列与器件的一个液体容器(孔)相对应；将检测器件连接到阻抗分析仪；将细胞接种到两个或更多个有电极阵列的孔中，其中至少一个孔接种一种细胞，至少另一个孔接种另一种细胞；将被测化合物加入到一个或多个接种有一种细胞的孔，将被测化合物加入到一个或多个接种有另一种的细胞的孔，以提供至少两个含不同细胞的被测化合物的孔；准备至少两个对照孔不加化合物，至少一个对照孔加入一种细胞，至少另一个对照孔加入另一种细胞；在加入一种或多种化合物后的至少三个时间点，检测两个或更多个有不同种细胞的被测化合物孔和两个或更多个对照孔的细胞-基底阻抗；分析阻抗值，阻抗值来自加入化合物之后的至少三个时间点测量的两个或更多个含不同种细胞的加入被测化合物的孔和两个或多个对照孔，阻抗值改变可以得知细胞对一种或多种被测化合物的反应。

本发明的相关方面还提供研究一种或多种被测化合物对细胞的作用的细胞分析方法，此方法用本发明的细胞-基底阻抗测量系统进行，该系统包括多孔细胞-基底阻抗检测器件、阻抗分析仪、器件工作台(器件检测台，包括连接检测器件，并连接器件的两个或更多个电极阵列到阻抗分析仪的电子电路)、控制器件工作台并记录分析来自阻抗分析仪的数据的软件。方法具体为：准备一个多孔细胞-基底阻抗测量系统；将细胞接种到两个或更多个有电极阵列的孔中，其中至少一个孔接种一种细胞，至少另一个孔接种另一种细胞；将一种被测化合物加入到一个或多个接种有一种细胞的孔，将此被测化合物加入到一个或多个接种有另一种的细胞的孔，提供至少两个有不同种细胞的被测化合物孔；准备至少两个孔不加化合物但加入不同种细胞作为对照，其中至少一个孔加入一种细胞，至少另外一个孔加入另一种细胞；在加入一种或多种化合物后的至少三个时间点，检测两个或更多个有不同种细胞的被测化合物孔和两个或更多个对照孔的细胞-基底阻抗；分析阻抗值，阻抗值来自加入一种或多种化合物之后的至少三个时间点测量的两个或更多个含不同种细胞的加入被测化合物的孔和一个或多个对照孔，阻抗值改变可以得知细胞对一个或多个被测化合物的反应.

本发明研究被测化合物对细胞的作用的方法中，优选的是，在至少两个孔中加入化合物之前，至少在一个时间点测量至少两个含不同细胞的被测化合物孔的阻抗。更优选的是能够测量四次或更多次的阻抗，其中至少一次是在加入一种或多种测试化合物之前.优选的是，阻抗测量在几个小时到几天的分析期间能以几分钟到几天的规则的或不规则的时间间隔进行。在上述细胞分析的一个实例中，在加入被测化合物之前，至少测量一次细胞-基底阻抗，加入化合物之后以规则的时间间隔进行。例如，加入化合物之前，以一个或多个时间间隔测量阻抗；加入化合物之后以规则的2个小时、1个小时、30分钟或15分钟的时间间隔测量阻抗。优选的是，能够以规则的时间间隔测量三次或更多次阻抗。在本申请中，实时分析意味着允许以多种时间分辨率测量细胞-基底阻抗，比如，以长一点的时间间隔比如每个小时或每两个小时测一次，或者以短一点的时间比如每分钟或几分钟测一次.

可以以一个或多个频率检测阻抗。例如某些实例中在每个检测点用一段频率检测阻抗。优选的是，在1Hz到大概100MHz中间选取至少一个频率检测阻抗，更优选的是，是在100Hz到大约2MHz之间选取至少一个频率检测阻抗。

如先前对化合物分析的描述，被测化合物可以是任何对细胞的作用可研究的化合物。比较细胞反应所用的被测化合物可以是化合物对其中至少一种细胞的作用已知，或者对所有待分析细胞的作用都未知。本发明所选的方法中，细胞至少接种到三个孔，每个孔都有一个电极阵列，并且至少一个孔包含电极阵列和没有加化合物的细胞.对照孔不加化合物，它的阻抗值可以与加化合物的孔进行对比，确定被测化合物对细胞的作用。

如先前对化合物分析的描述，分析中所用的细胞可以是从任何物种(species)分离的原代细胞，也可以是细胞系的细胞。在一些优选实例中，不同种类的细胞是不同个体的同种细胞，所以有不同的基因型。一种或多种细胞可以是基因工程细胞(例如，细胞来自基因修饰过的组织，如基因敲除组织、过表达内源基因或转入基因的细胞、正常基因表达经过反义分子或RNA静默处理)。在这些情况下，基因修饰的细胞可以与对照细胞进行比较。在另外一个例子中，比较处于不同分化阶段或不同基因型的干细胞对生长因子的反应。在另外的例子中，细胞可以是癌细胞，测试被测化合物的细胞毒性。细胞可以是分离自不同个体上相同类型，或不同癌细胞系或相同类型但不同阶段的癌细胞的同种原代癌细胞.在一些实例中，在不同孔中加入三种或更多种细胞，比较一种或多种化合物对三种或更多种细胞的行为的作用。在本发明的优选实例中，对于每种细胞，需要有一个不加测试化合物的对照。

我们可以进行很多分析，研究测试化合物对两种或更多种细胞的作用。这种分析包括，但不局限于，细胞粘着分析、细胞凋亡分析、细胞分化分析、细胞增殖分析、细胞生存分析、细胞毒性分析、细胞形态检测分析、细胞定量化分析、细胞性状控制分析、时间相关毒性分析、IgE介导的细胞活化或刺激分析、受体-配体结合分析、病毒或细菌或环境毒素介导的细胞病理变化和细胞死亡分析、检测或定量中性化抗体、特定T细胞介导的细胞毒性效应分析、筛选或测量抗体-受体结合的细胞水平分析。

本发明的分析，优选的是，作重复被测化合物分析，即在多于一个的孔中接种同种细胞、加入同样浓度的同种化合物。在这种情况下，分析点的阻抗值可以是重复孔的平均值。优选的是，计算一下平均值的标准偏差。

比较第一第二种细胞的时间依赖性反应，看它们的反应有多少相似和差异。本发明中的一种方法中，作含第一种细胞的孔的阻抗的时间依赖性曲线，给出第一种细胞的阻抗曲线；作含第二种细胞的孔的阻抗的时间依赖性曲线，给出第二种细胞的阻抗曲线。包含不同细胞的孔的细胞指数(包括归一化细胞指数或Δ细胞指数)可以从阻抗数据计算得到，然后作时间依赖性曲线，得到细胞指数曲线.

不同细胞种类的阻抗曲线或细胞指数曲线进行比较，可以确定它们对化合物反应的时间段、反应的强度(反应的幅值)、反应时间长短的相似与不同.从对照孔得到每种细胞不加化合物的对照阻抗曲线和细胞指数曲线，与被测化合物曲线比较，确定特定化合物对每种细胞的作用。化合物对两种或多种细胞中的一种或多种细胞的作用可以是对以下细胞状态的影响：细胞贴附或粘着、细胞生长或增殖、生存细胞和死亡细胞数量、细胞骨架组织或功能、被测化合物作用下细胞凋亡或坏死的数量。我们可以设计研究化合物对特定细胞过程或活动的影响。

分析中，化合物对至少一种细胞的作用可能已知。化合物对至少一种细胞的作用机理可能已知。在这些情况下，化合物作用后，一种或多种细胞与已知反应的细胞进行比较，可以获得它们对此化合物的反应相似或不同的信息。

在本方法的一个优选实例中，比较特定种类的细胞对某种化合物的时间依赖性细胞毒性反应。细胞毒性分析提供一种或多种细胞对化合物的敏感性信息。

图10A和B是多种细胞(表1列出)对olomoucine的反应，由本发明的细胞-基底阻抗测量细胞检测。将给定细胞系接种到图1所示加工有电子传感器阵列的微孔器件。Olomoucine处理之前和之后，间隔15或30或60分钟持续检测细胞反应。这些细胞指数曲线的比较显示，它们存在相似性.举100uM olomoucine处理的例子。测试大量种类的细胞，在某段时间(比如10、20或30小时)，olomoucine处理导致几乎恒定的细胞指数。这与olomoucine是一种细胞周期阻断化合物有关，加入化合物后，细胞不再分裂，所以细胞数量不再改变，但细胞仍然活着。所以在这个时间段，细胞指数不再随着时间改变。几乎平衡的细胞指数曲线也在rescovitine处理后得到，这是另外一种导致细胞周期停滞的化合物。图10A和图10B显示的细胞指数曲线与图9A和图9B、图11A和图11B显示的细胞指数曲线有很大的不同，它们的化合物有不同的作用机理。

从含不同种细胞和被测化合物的孔中测得的阻抗信息计算得到CI值，CI值可以用于获得细胞变化指数(CCI)值。在分析时间点，比较特定种类的细胞的CCI值，可以发现不同细胞对化合物的反应是否相似。作CCI-时间依赖性曲线，对比一种或多种测试化合物作用于不同细胞的CCI曲线，可以确定被测化合物对不同细胞作用的相似和差异。

对多种化合物的基于细胞的检测

本发明还提供了比较两种或多种不同化合物对细胞的作用的方法。一个方法为：准备本发明的检测器件，含至少三个或以上电极阵列，每个阵列对应检测器件的一个孔；将检测器件连接到阻抗分析仪；将细胞接种到器件的三个或更多个有电极阵列的孔中；在三个或更多个有细胞的孔的至少一个孔中加入至少一种化合物，在三个或更多个有细胞的孔的至少另外一个孔中加入至少另外一种化合物，以提供至少两个不同化合物测试孔；三个或更多个有细胞的孔中至少有一个作为对照孔，加入细胞，但不加化合物；在加入一种或多种被测化合物后的至少三个时间点，检测两个或两个以上不同化合物的孔和一个或一个以上对照孔的阻抗；分析加入一种或多种被测化合物后的至少三个时间点，两个或两个以上不同化合物的孔和一个或一个以上对照孔的阻抗，从阻抗值的变化能够得知细胞对一种或多种被测化合物的反应。

在另一方面，本发明用细胞-基底阻抗测量系统提供了细胞水平(基于细胞的)上检测两种或两种以上化合物对细胞影响的方法。方法为：a)准备一套细胞-基底阻抗检测系统；b)将细胞加入器件的至少两个有电极阵列的孔中；c)在至少一个有电极阵列和细胞的孔中加入第一种化合物；d)在器件的至少另一个有电极阵列和细胞的孔中加入第二种化合物；e)检测至少一个含细胞和第一种化合物的孔和至少一个含细胞和第二种化合物的孔的细胞-基底阻抗，阻抗的改变可以提供细胞对第一种或第二种化合物的反应的信息。

优选的是，将第一种化合物和第二种化合物对细胞的时间相关性影响进行对比以观察细胞对两种化合物的反应的异同。本方法的一种具体应用中，可对时间依赖性的细胞毒性反应进行比较。

实验中用到的细胞和化合物可以是上面测试化合物作用中用到的细胞和化合物。

在本发明的分析中，优选的是，重复被测化合物分析，即在多个孔中接种同种细胞，加入同样浓度的同种化合物。在这种情况下，在分析点时间点上阻抗值可以使用重复孔的平均值。优选的是，计算一下平均值的标准偏差。

阻抗检测的方法如前检测化合物效果的方法一样。优选的是，在至少一个孔加入一种化合物前的至少一个时间点，测量至少两个孔和至少一个对照孔的阻抗。优选的是，阻抗测量能够在四个或更多个时间点测量，并且至少一个时间点在加入一种或多种被测化合物之前。优选的是，在分析期间(比如几个小时到几天的分析区间)以规则的或不规则的时间间隔(几分钟到几天)测量阻抗。在上述细胞分析的一个实例中，细胞-基底阻抗测量在加入被测化合物前的至少一个时间点和加入化合物之后的规则的时间间隔进行。例如，可以在加入化合物之前以一个或多个时间间隔，加入化合物之后规则的时间间隔，2小时、1小时、30分钟、或15分钟测量阻抗.优选的是，阻抗在一定时间间隔的三个或以上时间点测量。在本申请中，实时分析意味着允许以多种多样的时间分辨率测量细胞-基底阻抗。例如，测量以较长的时间间隔比如每个小时或两个小时，或以较短的时间间隔比如每分钟或几分钟进行.

阻抗测量可以用一个或多个频率。例如，在一些优选实例中，阻抗测量可以用一个频率范围内的任意一个频率。优选的是，阻抗用1Hz到100MHz之间的至少一个频率测量，优选的是，用100Hz到2MHz之间的至少一个频率。

优选的是将含有不同化合物的阻抗检测数据进行对比。

在一个实例中，对于至少两个化合物的孔，对三个或更多个时间点的阻抗值作时间依赖性曲线。优选的是，没有接受化合物的对照孔也在三个或更多个时间点测量阻抗，作时间依赖性曲线。不同化合物的阻抗曲线可以与对照阻抗曲线进行对比，确定化合物对细胞的作用的异同。

含不同种类细胞的孔，也可以通过阻抗值计算细胞指数(包括归一化细胞指数或者Δ细胞指数)，并作时间依赖性曲线，获得细胞指数曲线。

细胞对不同化合物的阻抗曲线或者细胞指数曲线可以进行对比，确定细胞对不同化合物反应的时间段，反应的强度(程度)，反应时间长短的异同.对比一个或多个对照孔和被测化合物孔的阻抗曲线或细胞指数曲线，可以获得每种化合物的特别效果.化合物对细胞的作用可以是对以下细胞状态的作用，比如，细胞贴附或粘着、细胞生长或增殖、细胞存活或死亡的数量、细胞骨架组织与功能、被测化合物作用导致凋亡或坏死的细胞数量.我们可以设计分析方法，来研究化合物对特定细胞过程或活动的作用。

分析中所用的一种或多种化合物对细胞的作用可能已知。一种或多种化合物的作用机理可能已知.在这些情况下，细胞对其他被测化合物的反应与细胞对已知作用的化合物的反应进行对比，可以得知细胞对不同化合物的反应和对已知化合物的反应的异同。

关于细胞对化合物的反应的信息包括但不局限于关于以下细胞状态的信息：细胞在包括电极在内的基底上的贴附或粘着状态(比如，细胞伸展的程度、一个细胞贴附的面积、细胞贴附的紧密程度、细胞形态)、细胞生长或增殖状态、细胞存活或死亡的数量、细胞骨架变化和重组织和凋亡或坏死的细胞数量。关于细胞状态的信息还可能包括任何导致一种或多种以上细胞状态的变化的化合物-细胞相互作用。例如，如果化合物结合到细胞表面的一个受体，这种结合导致细胞形态的改变，那么化合物与受体的结合可以用细胞-基底阻抗测量来分析。用上述方法所作的细胞分析包括但不局限于：细胞贴附、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞存活、细胞毒素、细胞形态检测、细胞定量、细胞性状控制、时间依赖性细胞毒素分析、IgE介导的细胞激活或刺激、受体配体结合、病毒或细菌毒素介导的细胞病理变化和死亡、中性化抗体的检测和定量化、特异T细胞介导的胞毒效应、配体-受体结合筛选和测量的细胞水平分析。

多数化合物可以用多样化细胞进行分析。这个方法的一个较好实例，对比了不同细胞对一组化合物的时间依赖性胞毒反应。

含不同种类细胞、加入一种化合物的孔的细胞变化指数(CCI)可以由细胞指数获得，细胞指数由阻抗值计算得到。在分析时间点，特定细胞种类的CCI值可以进行比较。这些比较可以显示，不同细胞对同一种化合物的反应是否相似。CCI值也可以作时间依赖性曲线，不同种类的细胞在一种或多种被测化合物处理后的CCI曲线进行比较，可以得出不同细胞对被测化合物的反应的异同。

例如，由曲线得到的细胞反应的时间段、反应幅值(强度)，反应时间长短的不同，表明化合物的作用或机理的不同。阻抗不同可以反映细胞状态的不同，例如，化合物处理导致的细胞贴附或粘着、细胞生长或增殖、生存或死亡的细胞数量、细胞骨架组织或功能、凋亡或坏死的细胞数量等。

我们可以进行很多分析，研究两种或更多种化合物对细胞行为的作用。这些分析包括，但不局限于，细胞贴附分析、凋亡分析、细胞分化分析、细胞增殖分析、细胞生存分析、胞毒分析、细胞形态检测分析、细胞定量分析、细胞性状控制分析、时间依赖性胞毒分析、IgE介导的细胞活化或刺激分析、受体-配体结合分析、病毒、细菌或环境毒素介导的细胞病理变化或细胞死亡分析、中性化抗体检测或定量化、特异T细胞介导的胞毒效应分析、筛选或测量配体-受体结合的细胞水平分析。

本方法的一个优选实例，对比时间依赖的一组化合物的细胞毒性反应。“细胞毒性检测与分析(Cytotoxicity Profiling)”比较细胞对一系列潜在细胞毒性化合物的阻抗反应，提供被测化合物的作用效果和机理信息。细胞毒性分析可以通过结合比较以下数据进行：阻抗图和由阻抗-时间图、CI-时间图、CCI值、CCI-时间图得到的动力学参数。

本方法的一个实例中，细胞毒性反应分析可能包括在给定化合物浓度下获得时间依赖性细胞毒性反应的变化斜率。在另一个实例中，实时分析细胞毒性反应，可能包括给定化合物浓度下获得时间依赖性细胞毒性反应对时间的高阶导数。

不同浓度的同种化合物对细胞的作用效果的测定

本发明还包括测定不同浓度的一种或多种化合物对细胞作用效果的方法。

一方面，测定不同浓度被测化合物对细胞的作用方法为：提供本发明的有三个或以上电极阵列的检测器件，每个阵列与一个孔相对应；将检测器件连接到阻抗分析仪；将细胞接种到至少两个含电极阵列的孔中；在两个或更多个有细胞的孔中加入不同浓度的被测化合物；提供含细胞但不加入化合物的对照孔；在加入测试化合物之后的三个或更多个时间点，检测两个或多个含不同浓度被测化合物的孔和一个或更多个对照孔的细胞-基底阻抗；分析在加入测试化合物之后的三个或更多个时间点的两个或更多个含不同浓度被测化合物的孔和一个或更多个对照孔的阻抗，阻抗值的变化能够提供细胞对化合物的反应信息。

一相关方面，本发明提供通过细胞-基底阻抗测量系统研究被测化合物的两个或更多个浓度对细胞的作用的方法。方法具体为：准备本发明的细胞-基底阻抗测量系统；将细胞接种到至少两个含电极阵列的孔中；在两个或更多个有细胞的孔中加入不同浓度的被测化合物；准备含细胞但不加入化合物的对照孔；加入被测化合物后至少三个时间点，检测两个或两个以上不同浓度被测化合物的孔和一个或多个对照孔的细胞-基底阻抗；分析加入被测化合物后至少三个时间点，两个或两个以上不同浓度被测化合物的孔和一个或多个对照孔的细胞-基底阻抗，阻抗值的变化能够提供细胞对化合物的反应信息。

用于此分析的细胞和被测化合物可以是以上描述的检测被测化合物作用的任何细胞和被测化合物。

阻抗检测的方法如前检测化合物效果的方法一样。在上述至少两个测试化合物孔内加入上述至少一种化合物之前，于至少一个时间点上测量至少两个不同被测化合物孔的和至少一个对照孔的阻抗。优选的是，阻抗在四个或更多个时间点测量，其中至少一个点在加入一种或多种被测化合物之前。优选的是，在分析期间(比如几个小时到几天的分析区间)以规则的或不规则的时间间隔(几分钟到几天)测量阻抗。在上述细胞分析的一个实例中，细胞-基底阻抗测量在加入被测化合物前的至少一个时间点和加入化合物之后的规则的时间间隔进行。例如，可以在加入化合物之前以一个或多个时间间隔，加入化合物之后规则的时间间隔，2小时、1小时、30分钟、15分钟测量阻抗。优选的是，阻抗在一定时间间隔的三个或以上时间点测量。在本申请中，实时分析意味着允许以多种多样的时间分辨率测量细胞-基底阻抗。例如，测量以较长的时间间隔比如每个小时或两个小时，或以较短的时间间隔比如每分钟或几分钟进行。

阻抗测量可以用一个或多个频率。例如，在一些优选实例中，阻抗测量可以用一个频率范围内的任意一个频率。优选的是，阻抗用1Hz到100MHz之间的至少一个频率测量，更优选的是，用100Hz到2MHz之间的至少一个频率测量。

在一个实例中，对于至少两种化合物浓度，对三个或更多个时间点的阻抗，或者，优选的是细胞指数(包括归一化细胞指数或者Δ细胞指数)，作时间依赖性曲线。优选的是，在相同的时间点也作对照的阻抗曲线，对照孔不加化合物。阻抗曲线或细胞指数曲线可以显示出化合物影响细胞的时间段。在一些优选实例中，细胞指数可以用于细胞毒性的指示。

图9A和B显示用本发明的细胞-基底阻抗电子检测系统检测不同细胞(表1列出)对doxorubicin处理的反应。接种图中所示的细胞系到配有电子传感阵列(图1)的微孔中。在加入doxorubicin之前和之后间隔15、30或60分钟，持续检测细胞的反应。比较这些细胞指数曲线显示不同细胞的反应存在一定的相似。举3.13uMdoxorubincin处理为例子，刚处理时，对于大多数被测细胞和DMSO对照的细胞，细胞指数随着时间以相似的方式增长。过了10-20个小时，细胞指数达到峰值，峰值与细胞种类有关，然后开始随着时间下降。从那个时间开始，细胞指数可测量地下降。这样“先增长后下降”的细胞指数曲线，在细胞用5-Fluorouracil处理的时候也能观察到。Doxorubicin和5-Fluorouracil作用于细胞的DNA复制或DNA拓扑(topology)。

进一步，这些细胞指数曲线与图10A和图10B的细胞指数曲线有很大的不同。图10A和图10B中，加入100uM的olomoucine化合物之后10、20、甚至30个小时的细胞指数几乎是一个稳定值。图9显示的细胞指数曲线与图11的细胞指数曲线也有很大的不同。图11中，使用nM级的paclitaxel导致在前15个小时(时间取决于细胞种类)细胞指数下降，之后再上升。这些细胞指数曲线的动态变化反映不同化合物与细胞的相互作用不同。对细胞作用方式相似的化合物拥有相同的机理，会导致相似的细胞指数反应曲线。这些曲线的一个应用就是根据观察的细胞指数曲线研究化合物作用的机理。如果细胞指数反应有特定的曲线，我们就可以推导出化合物作用的机理。换言之，如果两种化合物显示相似的、动态的细胞指数反应曲线，那么这两种化合物可能以相似或相同的机理作用于细胞。

图11A和B用本发明的细胞-基底阻抗电子检测系统检测不同细胞(表1列出)对paclitaxel处理的反应。接种图中所示的细胞系到配有电子传感阵列(图1)的微孔中。在加入paclitaxel之前和之后间隔15、30或60分钟，持续检测细胞的反应.比较这些细胞指数曲线显示不同细胞的反应确实存在一定的相似。如0.78-12.5nM范围的palitaxel处理为例子。典型的nM级paclitaxel处理，会在刚开始的时候使细胞指数下降15-20小时。对于某个特定细胞指数曲线，当细胞指数达到一个最小值时，它会逆转它的下降趋势，开始上升。这种“先下降后上升”特性的细胞指数曲线在vinblastin或colcemid处理的细胞上也观察到。Vinblastin处理的细胞指数曲线的例子在图16A和图22中显示。所有这些化合物——例如paclitaxel、vinblastine和colcemid，都被称为“有丝分裂毒物”，有相同的药物作用机理。例如，vinblastine和paclitaxel在细胞内作用于微管动力变化上。

另外，在给定分析点，作细胞指数(包括归一化细胞指数或Δ细胞指数)-化合物浓度依赖性曲线。这些剂量反应关系可以用于获得时间相关的IC5、IC10、IC20、IC30、IC40、IC50、IC60、IC70、IC80、IC90或IC95。在一些优选实例中，计算了化合物的时间依赖的IC50。确定化合物的IC50的范围，可以提供化合物对细胞有最大作用的时间段信息。

从含不同种细胞和被测化合物的孔中测得的阻抗信息计算得到CI值，CI值可以用于获得细胞变化指数(CCI)值。在分析时间点，比较特定种类的细胞的CCI值，可以发现不同细胞对化合物的反应是否相似。作CCI的时间依赖性曲线，对比不同细胞的CCI曲线，可以确定被测化合物对不同细胞作用的相似和差异。

例如，由曲线得到的细胞反应的时间段、反应幅值(强度)，反应时间长短的不同表明化合物的作用或机理的不同。阻抗不同可以反应细胞状态的不同，例如，化合物处理导致的细胞贴附或粘着、细胞生长或增殖、生存或死亡的细胞数量、细胞骨架组织或功能、凋亡或坏死的细胞数量等。

优选的是能够对比不同种类细胞的孔的阻抗值。在一个优选实例中，测量了多种剂量浓度的化合物作用于不同细胞的阻抗值。在一些实例中，可以测试多种化合物对多种细胞的作用。在一些实例中，可以测试多种浓度的多种化合物对多种细胞的作用。

细胞毒性检测与分析(Cytotoxicity Profiling)

在另一个方面，本发明提供了对化合物进行实时细胞毒性(胞毒)分析的方法，具体为：a)提供上述的系统；b)将细胞接种到多孔检测器件的孔中；c)在有细胞的孔中加入化合物；d)在加入化合物之前和之后以规则或不规则的时间间隔测量细胞-基底阻抗；这里，时间相关的阻抗改变提供时间相关的化合物细胞毒性信息。在一个实例中，细胞-基底阻抗以规则的时间间隔测量。在一个实例中，在加入化合物之前和之后，以每隔2小时、1小时、30分钟、15分钟的时间间隔测量阻抗。

在上述方法的一个实例中，在多个孔中加入相同的细胞和不同浓度的化合物。这个方法提供时间依赖性和浓度依赖性细细胞对化合物的毒性反应。

另一方面，本发明提供分析和对比第一种化合物和第二种化合物对一种细胞的时间依赖性细胞毒性作用的方法，具体为：a)用上述方法作第一种化合物对一种细胞的实时细胞毒性分析；b)用上述方法法作第二种化合物对上述细胞的实时细胞毒性分析；c)对比第一种化合物和第二种化合物对细胞的时间依赖细胞毒性作用，观察它们的异同。在本方法的一个实例中，确定多个剂量浓度的第一种化合物时间依赖的细胞毒性反应。在另一个实例中，确定多个剂量浓度的第二种化合物时间依赖的细胞毒性反应。在另外一个实例中，确定多个剂量浓度的两种化合物时间依赖的细胞毒性反应。

在上述方法的另一个实例中，第一种化合物是已知其细胞毒性效应机理(known mechanism for its cytotoxic effect)的化合物，第二种化合物则未知其机理。如果第二种化合物时间依赖的细胞毒性反应与第一种相似，那么第二种化合物可能与第一种化合物有相似的细胞毒性效应机理。

对比化合物的细胞毒性反应可能有多种方法。细胞指数(或细胞数目指数)可以通过阻抗值计算得到。在上述方法的一个实例中，获得化合物的时间依赖的IC50，通过比较基于细胞指数值的时间依赖的IC50曲线比较它们的细胞毒性反应.如果IC50曲线有相似的时间依赖趋势，两种化合物可能有相似的细胞毒性效应机理。在上述方法的另一个实例中，直接比较两种化合物的时间依赖细胞毒性反应，两种化合物的浓度可能一样，可能不同。直接比较可以通过分析反应度量的变化斜率(等于反应对时间的一阶导数)，比较细胞对两种化合物时间依赖的反应度量的变化斜率进行。在另一个方法中，时间依赖的细胞毒性反应可以通过分析它们对时间的高阶导数进行。高阶导数的对比可能提供更多的化合物导致的细胞毒性机理信息。

这个方法的一个实例中，实时细胞毒性反应分析包括时间依赖的化合物对多种细胞的IC50值的获得。另一个实例中，实时细胞毒性反应分析可能包括对给定浓度化合物的细胞毒性反应的变化斜率的获得。另一个实例中，实时分析细胞毒性反应可能包括对给定浓度的化合物的细胞毒性反应对时间的高阶导数的获得。

另一个实例中，应用上述方法作多种化合物对多种细胞的细胞毒性分析。

在本方法的另一个实例中，实时分析细胞毒性反应可能包括对时间的变化斜率的获得。在另一个实例中，给定浓度的化合物对细胞作用，实时分析细胞毒性反应可能包括细胞毒性反应对时间的高阶导数的获得。

以下给出一些使用本细胞-基底阻抗测试系统进行化合物测试的例子并以图片说明的形式讲解。这些例子中，细胞指数的计算与本申请C部分中描述的细胞指数计算方法(A)一样.本申请的某些图片中使用了归一化细胞指数。给定时间点的归一化细胞指数是将该时间点的细胞指数除以参考时间点的细胞指数。所以，参考点的归一化细胞指数为1。

正如本发明所描述的，如果细胞贴附状态没有改变，或改变很小，那么细胞指数越大，孔中的细胞数量越多。细胞指数下降说明有些细胞不再贴附在基质表面，或者在化合物的影响下细胞死亡。细胞指数的增加说明有更多的细胞贴附在基质表面，说明整体细胞数量增加。

图5H460细胞受不同浓度抗癌药paclitaxel作用的时间-细胞指数曲线。试验中，将H460细胞加入到16孔细胞-基底阻抗检测器件的孔中。将器件与器件工作台连接，将器件工作台(检测台)置于37℃，5％ CO₂的组织培养箱中。当细胞培养到指数生长期后用不同浓度的paclitaxel刺激。以15分钟为间隔连续检测细胞-基底阻抗50小时，以此检测细胞对不同浓度paclitaxel的反应。细胞指数由阻抗检测系统对每一个时间点计算得到并以时间作图。当paclitaxel的浓度在67nM到500nM之间时，随浓度升高，H460细胞指数逐渐下降。但加药后15到20小时都降到最低点，只是达到最低点的时间随药物浓度的不同而不同.这一点过后，这些孔的细胞指数逐渐上升。用33nM药物刺激的孔中，细胞指数在加药后15小时几乎没有什么变化。15小时后细胞指数逐渐上升。

细胞对化合物的反应包括但不局限于以下信息：细胞在基质(包括电极)上的贴附或粘着状态(例如，细胞伸展的程度、一个细胞的贴附面积、细胞贴附的紧密程度、细胞形态)、细胞生长或增殖状态、存活或死亡的细胞数量、细胞骨架改变和重组织、凋亡或坏死的细胞数。细胞状态信息还包括化合物作用下上述一种或多种状态的任意改变。例如，如果化合物结合到细胞表面受体，导致细胞形态改变，那么这种结合就能够用细胞-基底阻抗测量来分析。上述方法能进行的细胞分析包括但不局限于：细胞贴附、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞生存、细胞毒性、细胞形态检测、细胞定量化、细胞质量或性状控制、时间相关的细胞毒性分析、IgE介导的细胞活化或刺激、受体配体结合、病毒和细菌毒素介导的细胞病理变化和细胞死亡、中性化抗体的检测和定量化、特异T细胞介导的细胞毒素效应、配体-受体结合的筛选和测量。

图6H460细胞受抗肿瘤药物AC101103作用的细胞指数时间依赖性曲线.试验中，将H460加入到16孔细胞-基底阻抗检测器件的孔中。将器件与器件工作台连接，将器件工作台置于37℃，5％ CO₂的组织培养箱中。当细胞培养到指数生长期后用不同浓度的AC101103作用。以30min为间隔连续检测细胞-基底阻抗20小时，以此检测细胞对不同浓度药物的反应。

很明显，图6中的细胞指数曲线和图5中的有很大不同。当化合物浓度为3.125毫克/毫升，6.25毫克/毫升，12.5毫克/毫升时，细胞指数分别在加药后5小时、15小时，20小时以后几乎保持恒定值。化合物浓度为3.125mg/ml和6.25mg/ml时，细胞指数在加入化合物之后5小时和15小时后开始上升。前两者细胞指数在相应时间以后开始上升。当化合物浓度为25毫克/毫升时，加入化合物后，细胞指数开始逐步而缓慢地下降。当化合物浓度为50毫克/毫升时，加入化合物大约10小时内细胞指数基本不变，但之后迅速下降。

图7A549细胞受阿霉素(doxorubicin)作用药物动力学反应。在16孔器件中每孔接种10000个A549细胞。将器件与器件工作台连接，将器件工作台置于37℃，5％ CO₂的组织培养箱中。药物处理前用细胞-基底阻抗检测系统以相同时间间隔检测细胞贴附和生长过程。当细胞生长到指数生长期，在孔中加入不同浓度的阿霉素(doxorubicin)。在某些孔中加入相同体积的溶剂作为对照。时间、剂量依赖性的细胞反应由细胞-基底阻抗检测系统记录并如图所示。

例1.用ACEA RT-CES系统检测细胞对抗肿瘤药物的动态反应。

在本研究中，我们用RT-CES系统动态检测肿瘤细胞对特定机理化疗化合物的反应，分析特定细胞反应的模式。我们测试了13个肿瘤细胞系(表1)，包括乳腺、前列腺、肝、结肠、卵巢、肾、纤维原细胞和中枢神经系统的癌细胞。每种肿瘤细胞用11种化疗化合物处理，分为以下几类：DNA损伤剂、蛋白激酶抑制剂、抗有丝分裂药、细胞周期特异抑制剂、蛋白质合成抑制剂和一种未知种类的化合物(表2)。细胞和化合物相互作用的模式是动态的，并和剂量有关。我们刻画并总结了所有被测细胞系和化合物的相互作用模式。图9、10、11展示了Doxorubicin、olomoucine和paclitaxel与12个不同细胞系的相互作用。

另外，我们通过检测细胞周期进程、细胞的存活率和形态，尝试将特定的细胞反应与细胞指数曲线的形状(图12、13和14)联系起来，从而刻画这些化合物的生物学效应。更进一步，我们计算每种化合物对各种细胞系的随时间变化的IC50(图15)，给出了计算细胞变化指数(CCI)的算法，来刻画细胞对不同化疗试剂的反应。细胞变化指数(CCI)由不同细胞系对不同化疗试剂的动态RT-CES反应计算得到。基于CCI值，在时间范围上的每个CCI值区域用黑白阴影区表示。例如，特定细胞系用特定化合物的IC50浓度处理后，在某个特定时间段，如果CCI值约为零，然后变为正数，达到0.7/DT，那么细胞对这个化合物的反应前后用矩形和矩形表示。这种分析的例子见图16。图17的整个黑白阴影图表示细胞对多种化合物的动态反应。

在本研究的总结中，我们注意到用RT-CES系统筛选化疗试剂，可得出特异的活性模式(activity pattern)，它依赖于化合物本身、化合物浓度、作用时间和细胞种类。每种药物的“特征性”模式(signaturepattern)与特定生物现象相关，例如对数生长、细胞周期停滞、形态变化和细胞死亡。细胞变化指数是RT-CES数据得到的很好的参数，它能够从数学的角度描述细胞变化。基于CCI值的细胞反应的描述说明，拥有相似作用机理的药物显示相似的细胞反应模式(similarpattern).因此，相似的动态细胞-化合物相互作用模式可说明相似的作用机理、相似的阻断模式、或相似的可能的分子靶标。RT-CES系统可以适应高通量动态筛选和分析抗肿瘤化合物，本研究展示的信息密集方法可以用于分析已经存在的肿瘤化疗试剂，筛选新的化合物，提供新的思路以研究抗肿瘤试剂作用机理。

表I.测试一系列化合物的癌细胞系列表

 

癌细胞系器官或组织来源MDA.MB231乳癌MCF7乳癌NCI-H460非小细胞肺癌MV522 SW非小细胞肺癌A549非小细胞肺癌HT29结肠癌HCC2998结肠癌A2780卵巢癌OVCAR4卵巢癌PC-3前列腺癌HepG2人肝肉瘤A431类上皮癌HT1080纤维肉瘤

表II.用于研究细胞对一系列抗肿瘤化合物的反应的化合物列表

例2细胞毒性检测与分析(Cytotoxicity Profiling)

方法

细胞.此研究所使用的所有细胞来自ATCC，细胞置于5％ CO₂37℃的培养箱培养。H460、HepG2和HT1080细胞用含5％FBS和1％青链霉素的RPMI培养基；NIH3T3细胞用含10％ FBS和1％青链霉素的DMEM培养基。

匆胞增殖分析.对于每种细胞，接种所示数目的细胞到96孔微孔板(e-plate^TM)，每个孔里面都有电极结构，并加入100uL培养基。用RT-CES系统(一个细胞-基底阻抗测量系统)每30分钟检测一次细胞贴附、伸展和增殖状态。细胞增殖根据实验需求在48-72小时的时间段内检测。电子数据读取、细胞传感阻抗以细胞指数的形式显示出来。

药物处理和匆胞毒性检测.对于每种细胞，根据它们相对的增殖模式(图18)选择最适宜的细胞浓度。接种所示数目的细胞到艾森16孔或96孔电子检测板(检测器件)(本发明的一个检测器件)，最终体积为100uL体积。用RT-CES系统(本发明的示模范系统)持续检测细胞贴附、伸展和增殖，每30分钟测一次。接种后约24小时，细胞处于对数增长期，用100uL溶有所示化合物的培养基处理细胞.另有细胞用DMSO处理，作为对照。根据实验需要，培养基中最终DMSO浓度在0.25％到0.5％的范围。

MTT分析。接种数量递增的NIH3T3细胞到16孔电子检测器件，并用RT-CES获得相应的细胞指数。迅速吸出培养基，用厂家提供的步骤对细胞作标准MTT分析。

流式细胞仪计数。以每孔500,000个细胞的密度在60mm组织培养皿接种A549细胞。大概24小时后，用指定终浓度的Olomoucine处理细胞。16个小时后用PBS洗去，胰蛋白酶消化，PBS洗两次，用70％甲醇固定，保存在4℃，直到染色。用propidium iodide染色细胞，在488nm波长处，用流式细胞计数仪(FACS)分析。

用RT-CES实时检测细胞增殖动态

为了用RT-CES系统获得细胞增殖动态，以三个复孔，每孔2500和10,000个细胞的密度，接种四种细胞(H460人肺癌细胞、H1080纤维肉瘤细胞、HepG2人肝肉瘤细胞、NIH3T3鼠纤维原细胞)到艾森96孔电子检测器件。在指定的时间段(图18)用RT-CES持续检测细胞，每30分钟检测一次。如图18所示，每种细胞有它自己的特定动力学轨迹，与接种的细胞数、整体细胞的数量和大小、细胞作用到传感器表面的程度有关。另外，每种细胞系都有确定的贴附和伸展动力学，以及有确定的细胞进入指数增长阶段的时间，这些特征可在细胞培养传代的不同阶段提供良好的中间控制，以能够标准化地、有效地培养细胞。

为了确定RT-CES细胞指数单位与孔中的细胞数量相关，接种递增数量的NIH3T3细胞到艾森16孔电子检测板(检测器件)，并检测达到10个小时，获得这个时间段的细胞指数。图19A显示细胞数量-细胞指数相关曲线，表明对于这种细胞，RT-CES系统可以检测少到100个细胞，并在两个数量级的范围内达到10000个细胞，细胞数量和细胞指数都是线性关系.另外，图19A显示实验终止后，用MTT分析法分析细胞。图19B显示，即使达到1000个细胞，MTT分析中，与背景值没有很大的不同；对于超过1000的细胞数量，MTT单位与接种的细胞数量有线性关系。然而，必须记住的是，RT-CES能够进行动态持续的测量，而图19显示的只是单一的一个点，因为MTT分析是一种单点分析方法。

用RT-CES系统估计药物与靶细胞的相互作用

为了能够用RT-CES系统估计药物效力，确定Tamoxifen对不同细胞系的IC50值，与加入Tamoxifen后48小时的MTT分析比较。根据表III，从RT-CES系统得到的IC50与从MTT分析得到的非常一致，说明RT-CES系统可以用于估计各种药物对不同贴壁细胞系的作用效力。

为了观察药物与靶细胞作用的动力学特点，接种A549肺癌细胞到艾森96孔电子检测板(检测器件)。持续检测细胞，直到细胞进入对数生长阶段，按照指示的终浓度在细胞中加入不同浓度的paclitaxel。如图20A显示，最高浓度的paclitaxel最早导致细胞毒性效应，主要来自可由Annexin V着色，以确认的带来的细胞死亡(图20B)。值得注意的是，细胞从最初药物的细胞毒性效应恢复，并开始重新增殖.造成这个现象的原因仍在探索中，可能是paclitaxel的代谢和失活，也可能是细胞中出现抗paclitaxel的部分细胞群(subpopulation)。不过这个实验清晰地证明RT-CES系统提供的实时检测的极大优势，并提供使用者观察和估计药物作用的整个过程的机会，提供了细胞存活率或化合物细胞毒性之外的更多信息。图20A中观察到的现象，很容易被传统的单点分析方法(如MTT等)忽视。

使用RT-CES系统持续检测药物与靶细胞的相互作用的另一个优势是，用户可以获得研究感兴趣药物作用机理的思路或信息。为了证明这一点，接种A549细胞到艾森96孔微孔检测器件，用RT-CES系统持续检测。细胞或用DMSO处理作为对照，或用100μM Olomoucine处理，Olomoucine是CDK抑制剂，能导致细胞周期停滞在G1→S转换期或G2→M转换期，这取决于细胞种类。如图21A所示，将Olomoucine加入到指数生长期的A549细胞，导致细胞指数轨迹停滞，保持在细胞周期阻断的稳定状态，细胞既不增殖也不死亡。用DMSO处理的对照细胞持续增殖，直到平台期，即它们达到接触抑制，细胞指数记录无变化。为了用RT-CES检测证明Olomoucine对A549细胞的作用确实是因为阻断细胞周期，在组织培养皿上生长的A549细胞用同样浓度的DMSO和Olomoucine处理，然后用流式细胞仪分析。如图21B所示，流式细胞仪分析显示，用指示浓度的Olomoucine处理的A549细胞细胞周期停止在G2→M期，此时CDKs(如CDK2)活化。总而言之，用RT-CES系统动态检测药物与靶细胞的相互作用，提供用户理解药物作用机理和与细胞作用的模式的机会。

为了使RT-CES系统用于细胞毒性分析，我们检测不同机理的细胞毒性试剂与A549细胞的相互作用。图22显示RT-CES系统测得的A549细胞的特征性曲线，细胞用不同浓度的5-fluorouracil、vinblastine和staurosporine处理。根据图22，动态检测给定细胞毒性试剂与细胞的相互作用，产生特征性动力学模式图，它们与细胞背景、药物浓度、作用时间和药物作用机理有关。由于每种化合物有其独特的模式，可以通过比较未知作用机理和已知作用机理的化合物作的动力学模式，将这些动力学轨迹用于确定化合物作用于未知靶标的机理。

用RT-CES系统无标记动态检测细胞增殖、存活率和细胞毒性，相对传统终点分析有着明显而重大的优势。它允许内在的细胞质量控制，保证不同分析的一致性和可重复性。动态检测可以观察药物与靶细胞作用的所有阶段，用户就能够优选地理解药物作用的模式和作用机理。更进一步，药物与靶细胞作用的实际动力学轨迹非常重要，因为它提供药物作用机理的线索。最后，因为每种化合物或药物在与靶细胞作用外都有自己的特性，RT-CES系统可以用于确定药物与未知靶标的作用机理。

表III.用Tamoxifen处理不同癌细胞系，比较用RT-CES系统得到的和用MTT分析得到的IC50值。将给定细胞系接种到艾森16孔检测器件，并用RT-CES系统检测.大约24小时后，用递增浓度的Tamoxifen处理细胞，然后继续检测。实验在大约48小时后结束，然后用MTT分析16孔检测器件中的细胞。用RT-CES系统得到的IC-50是与时间相关的。在表中，显示药物处理大约48小时后RT-CES系统确定的和MTT分析确定的IC-50值.

这里所有引用的文献，包括专利、专利申请和发表文章，还包括目录中引用的文献都以参考文献的方式被全部整合到本申请中。

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