葎草花粉主要致敏蛋白单克隆抗体

摘要

本发明提供了葎草花粉主要致敏蛋白单克隆抗体，其是以葎草花粉主要致敏蛋白作为免疫原制备获得。所述葎草花粉主要致敏蛋白可从葎草花粉中分离获得，能与89％以上葎草花粉过敏病人血清特异性IgE结合，经SDS－PAGE测定其表观分子量约为12kDa，等电点为4.7，N端序列为：NH

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及葎草花粉主要致敏蛋白单克隆抗体。

背景技术

花粉症在世界各国的发病率从1％～25％不等^[1]，多项流行病学调查结果显示花粉症患者约占全世界总人口的10％～15％^[2～5]，但我国目前尚无全国普通人群花粉症发病率的流行病学数据。30年前对局部地区少数普通人群做花粉症流行病学调查显示其发病率可达5％^[6]。

上世纪八十年代由叶世泰、乔秉善牵头全国数十家医院完成的中国气传致敏花粉调查显示，很多地区夏秋季空气中葎草花粉的含量仅次于蒿属花粉^[7]。1989-1992年，尹佳、叶世泰在对北京地区九种夏秋季花粉的临床研究中证实：葎草花粉是引起我国北方地区夏秋季花粉症的重要原因^[8]，同时在国内首次应用鼠抗人IgE单克隆抗体建立了人血清葎草花粉特异性IgE的检测方法^[9]，并在1995年美国变态反应和临床免疫学年会上向世界首次报告葎草花粉是中国北方地区夏秋季花粉症的重要原因^[10]。

尹佳等近年对1120例夏秋季花粉症患者发病情况研究显示：葎草花粉在我国夏秋季花粉症患者中的阳性百分比高达66％(739/1120)，我国夏秋季花粉(蒿和葎草花粉)诱发的过敏性鼻炎平均发病年龄为27岁，哮喘的平均发病年龄为32岁^{[11，12，13，14]}；而赵京等在北京地区13～14岁儿童呼吸道过敏性疾病流行病学调查中发现：蒿属花粉敏感者为5.7％，葎草花粉敏感者为4.2％^[15]；据此推测葎草花粉症患者在我国普通人群中的比率应超过5％，即约超过650万人患有葎草花粉症^{[11，12，13，14]}。

葎草是一年生缠绕草本植物，花期7-9月，果期9-10月，生于城市与乡村的沟边、路旁、庭院附近及田野间、石砾质沙地及灌丛间，生命力极强，为我国常见的杂草，除新疆、青海以外的各个省区均有分布，日本、朝鲜、俄罗斯也有分布。

葎草花粉是我国夏秋季重要的致敏花粉，可诱发严重的夏秋季鼻炎、结膜炎和哮喘。在我国人群中，15～34岁是夏秋季花粉诱发鼻炎的高发年龄段，25～44岁是哮喘的高发年龄段，在全部夏秋季花粉症患者中，37％在5年内，47％在9年内可发展为季节性哮喘，由于这部分患者由鼻炎发展至哮喘多集中在25～54的青壮年阶段，且其进程需经历5～10年，因此在34岁以前，夏秋季花粉症患者中单纯鼻炎的比例较高；35岁以后哮喘的比例增高，但也有18％的患者鼻炎和哮喘在同一年首次发作，部分患者因夏秋季花粉诱发的哮喘症状非常严重，在其诱发的季节性哮喘患者中，77.9％需口服平喘药物；77.7％夜间不能平卧；30.4％需要急诊输入氨茶碱或糖皮质激素类药物治疗^[11，12]。近一半的夏秋季花粉症患者有可能在首次发病的9年内发展为季节性过敏性哮喘是一个不容忽视的临床问题。夏秋季花粉过敏性鼻炎和过敏性哮喘发病的高峰年龄正值人生精力充沛、为社会创造财富的阶段，因此，寻求阻止和干预夏秋季花粉过敏性鼻炎向哮喘发展的时机与方法非常重要。

世界卫生组织在关于过敏性疾病免疫治疗的指导性文件中指出，特异性免疫治疗是目前唯一能够阻止过敏性疾病自然进程的治疗方法。因此，对夏秋季花粉诱发的严重过敏性鼻炎患者应尽早开始特异性免疫治疗，防止其发展为哮喘；对已有哮喘的患者，更应积极进行特异性免疫治疗，防止哮喘进一步加重。

葎草花粉过敏原诊断和治疗制剂是诊断和治疗因葎草花粉诱发的鼻炎和哮喘的关键药剂，而在生产和应用此药剂过程中需确保每一批产品生物效价一致、主要致敏蛋白含量一致，因此，花粉主要致敏蛋白是制定标准化制剂的核心之一。

主要致敏蛋白还是未来人工合成花粉诊断和治疗制剂的核心。

获得用主要致敏蛋白制备的单克隆抗体，将可检测药物和生物制剂中葎草花粉主要致敏蛋白含量，确定药物剂量和浓度。

目前对葎草花粉致敏蛋白的研究很有限。孙秀珍等^[16]采用SDS-PAGE、免疫印迹等方法分析葎草花粉致敏蛋白，发现在含有的至少10种蛋白成分中有5种致敏蛋白，分子量分别为8.0、28.8、35.1、42.0、55.0、65.0、76.2、100.5kDa，其中8.0kDa的蛋白能与84.6％葎草花粉过敏哮喘患者血清中sIgE结合，是主要致敏蛋白，而11.8～23kDa的蛋白虽然含量占优势但此分子量范围的蛋白既无变应原性也无免疫活性，与哮喘和皮试阳性反应的关系不大。

Park JW^[17]等发现葎草花粉含有10、16、20、29、42kDa的5种致敏蛋白成分；其中10kDa的蛋白质可能是主要致敏蛋白(与葎草花粉过敏病人血清sIgE的阳性结合率为72％)，对10kDa致敏蛋白的N端氨基酸序列分析未发现其与目前所鉴定的致敏蛋白存在同源性，其等电点大致为pI5.1。而韩国另一位学者Park HS^[18]研究显示，13、70、80kDa蛋白是葎草花粉的主要致敏蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供葎草花粉的主要致敏蛋白单克隆抗体。

本发明的蛋白是从葎草花粉中分离纯化得到，能与89％以上葎草花粉过敏病人血清特异性IgE结合，通过SDS-PAGE测定其表观分子量为12kDa，等电聚焦实验测定其pI＝4.7，N端序列分析表明其N端序列为：NH₄⁺-MDNPFENGMKA-COO^-。

本发明以葎草花粉作为原材料，制备蛋白粗提液，经SDS-PAGE电泳及免疫印迹实验表明12kDa处的蛋白为葎草花粉主要致敏蛋白，其与葎草花粉过敏病人血清sIgE的阳性反应率达到89％。将制备的粗提液通过凝胶分子排阻层析收集得到10～38kDa分子量区域的蛋白，最后通过阴离子交换层析得到4个洗脱峰，经电泳分析表明，第四个洗脱峰蛋白分子量为12kDa，一系列体外免疫学实验表明其确为葎草花粉主要致敏蛋白。进一步对收集得到的主要致敏蛋白进行N末端序列分析，其N端氨基酸序列为：NH₄⁺-MDNPFENGMKA-COO-，经检索，未发现相同蛋白，表明所获得的蛋白为一个新蛋白，现将该蛋白命名为Hum s 1。

本发明还进一步将获得的蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，最后筛选得到能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

通过上述得到的单克隆抗体，还可以进一步构建免疫检测试剂盒。

本发明提供的单克隆抗体具有高的灵敏度和特异性，可用于葎草花粉变应原制剂中主要致敏蛋白的定量标示。

附图说明

图1是28例葎草花粉阳性血清对葎草花粉粗提液的免疫印迹结果，其中1～28是28例患者血清各自的免疫印迹条带，a为来源于28例阳性血清的混合血清，b为健康志愿者血清对照，c为空白对照，M为蛋白分子量标准，由上至下分别为97.0，66.0，45.0，30.0，20.1，14.4kDa；

图2是凝胶分子排阻层析中目标收集组分的SDS-PAGE图，图中M为蛋白质分子量标准，1为葎草花粉粗提液，2为经盐析处理后的葎草花粉粗提液，3凝胶分子排阻层析目标组分收集液；

图3是用HiTrap Q FF分离纯化获得的第一步和第二步收集液的SDS-PAGE图，图中M为蛋白质分子量标准，1～3为第一步收集液，4为第二步收集液；

图4是等电聚焦电泳图，S-100为凝胶分子排阻层析目标收集组分(重复两次)，A为主要致敏蛋白；

图5是等电点Mr的标准曲线；

图6是交叉反应检测结果。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1  葎草花粉主要致敏蛋白的确定

1、葎草花粉症患者血清和健康志愿者血清的采集：对葎草花粉症患者血清和健康志愿者血清的采集均有严格的入选标准。本研究共采集到28例葎草花粉症患者血清，患者入选标准如下：1)典型的夏秋季花粉过敏病史：季节性鼻炎、眼结膜炎和(或)支气管哮喘，夏秋季节(7～10月)发病；2)葎草花粉浸液皮内试验≥++同时Pharmacia CAP system RAST FEIA检测葎草花粉sIgE≥II级(0.70kU/l)。同时本研究共采集到10例健康志愿者的血清，入选标准为：无过敏性疾病史(包括药物、食物过敏以及过敏性鼻炎、支气管哮喘以及其它过敏性疾病)，大籽蒿、葎草、PP(夏秋季混合花粉，含灰藜、大麻、向日葵和苍耳花粉)皮内试验均阴性，血常规嗜酸粒细胞及血清总IgE正常，男性6例，女性4例，年龄22～45岁，平均年龄(32±4)岁。本研究中所有涉及人体血清的体外免疫学实验均采用以上所述的葎草花粉症患者血清和健康志愿者血清。

2、葎草花粉蛋白盐析粗提液制备：用0.01MPBS缓冲液(pH8.0)以1:20(质量/体积，w/v)比例于4℃24hr提取丙酮脱脂干燥的葎草花粉，粗提液经浓缩达到至少1mg/ml时用80％饱和度硫酸铵沉淀蛋白，后将沉淀的蛋白复溶于0.01MPBS缓冲液(pH8.0)中，经10000g×10min离心取上清液，得到葎草花粉蛋白盐析粗提液。

3、主要致敏蛋白的确定(采用免疫印迹方法)：将上述制得的葎草花粉蛋白盐析粗提液经SDS-PAGE制备胶分离，方法参照Laemmli法进行。将蛋白样品与样品缓冲液(2×)按1∶1比例混合，100℃煮5min，后10000g×5min离心取上清上样。应用15％分离胶，5％浓缩胶(根据《分子克隆》上配方)对样品进行分离(DYCZ-23A型垂直电泳槽，北京市六一仪器厂)。起始电压80V，待溴酚兰前沿进入分离胶后将电压升至150V，恒压电泳，直至溴酚兰前沿到达凝胶下边界，停止电泳。取下凝胶进行半干转印。应用DYCP-40C型转移槽(北京市六一仪器厂)Towbin buffer(25mMTris，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH8.3)，恒流转印90min(恒流值＝胶面积(cm²)×1.2mA)，将蛋白转印至PVDF膜(孔径0.45μm，MILLIPORE，U.S.A)。将PVDF膜放入盛有封闭液(5％BSA/PBS-T)的平皿中4℃过夜封闭。将封闭后的PVDF膜切成3mm宽的小条分别与不同患者血清反应(第一抗体与抗原结合)，温育血清用PBS-T作1:3稀释，室温置摇床过夜温育。一抗温育结束后用洗涤液(PBS-T)洗涤3×5min，后进行与辣根过氧化物酶标鼠抗人IgE抗体(二抗)的温育，室温3hr，二抗稀释度1:1000(PBS-T作稀释液)。膜二抗温育结束后用PBS-T进行洗涤3×5min，进行DAB底物显色，待蛋白带显色清晰即可用蒸馏水漂洗，终止反应。免疫印迹结果如图1所示。图中1～28为28例患者血清各自的免疫印迹条带，a为来源于28例阳性血清的混合血清，b为健康志愿者血清对照，c为空白对照，M为蛋白分子量标准。从上图结果可看到12kDa位置蛋白为主要致敏蛋白，阳性反应率达到89％。

实施例2  主要致敏蛋白的分离纯化

1、凝胶分子排阻层析

层析系统： Purifier10(Amersham公司)

层析柱：Sephacryl 100预装柱(Amersham公司)

柱体积120ml

长度×直径：60cm×16mm

分离范围：10-100kDa

1)样品制备：

a、将新鲜采集的葎草花粉用丙酮脱脂，干燥。

b、4℃条件下用0.01M PBS(pH8.0)磁力温和搅拌提取(1/20w/v)24hr。

c、10000g×30min进行离心(4℃)得到上清液。

d、将上清液浓缩至蛋白浓度至少1mg/ml时进行80％饱和度的硫酸铵盐析沉淀，5000g×30min离心处理，弃去上清后将沉淀蛋白复溶于0.01M PBS(pH8.0)缓冲液中，并用该缓冲液进行2d(4℃)的透析处理以去掉其中的硫酸铵，后浓缩使蛋白浓度达到12mg/ml左右。

2)平衡液和洗脱液：0.05M PBS(pH7.2)

洗脱条件：V上样量＝1ml，流速0.5ml/min

目标组分是平均保留体积为87.25±0.65ml的洗脱峰，该组分包含了10～38kDa范围的蛋白。该分离步骤有很好的重复性。蛋白电泳图谱如图2所示。

2、阴离子交换层析

层析系统： Purifier10(Amersham公司)

层析柱：HiTrap Q FF(Amersham公司)(CV＝1ml)

缓冲系统：

0.02M BisTris-HCl(pH7.0)(柱平衡缓冲液A，starting buffer)

0.02M BisTris-HCl(pH7.0)+2M NaCl(最大浓度洗脱缓冲液B，elution buffer)

分离过程：将凝胶分子排阻色谱分离得到的目标组分收集液经蒸馏水透析并浓缩处理后用A缓冲液作5～10倍稀释以调整该蛋白溶液的pH值达到7.0，经10000g×10min离心后将上清液加入到用A缓冲液平衡好的阴离子交换柱HiTrap Q FF中，用含0～0.1M NaCl浓度梯度的A缓冲液进行线性梯度洗脱15ml，再以0.1MNaCl浓度恒定洗脱15ml，接着用含0.1～0.2M NaCl浓度梯度的A缓冲液进行20ml的线性梯度洗脱。其中流速设定为1ml/min。

分离结果：在0～0.1MNaCl浓度范围的线性梯度洗脱阶段(洗脱体积15ml)及随后的0.1MNaCl恒定浓度洗脱阶段(洗脱体积15ml)先后出了三个峰，这三个峰都未达到基线分离，1为主峰，2、3为连续的两个小肩峰。在0.1～0.2MNaCl浓度范围的线性梯度洗脱阶段(洗脱体积20ml)出了一个不尖锐的单峰，被标记为4。其中4为主要致敏蛋白的洗脱峰。1、2、3、4各收集组分的电泳图谱如图3所示。通过ImageQuant TL v2003.03软件分析得到该蛋白的分子量为12kDa。将该组分作ELISA分析，发现其与实施例1中12kDa蛋白的免疫学实验结果一致。说明分离获得的确为葎草花粉主要致敏蛋白，该蛋白的N端氨基酸序列为NH₄⁺-MDNPFENGMKA-COO^-，经检索未发现相同蛋白，因此该蛋白为一个新蛋白。

通过IEF(等电聚焦电泳，如图4所示)分析该蛋白的等电点，由等电点Mr得到标准曲线(如图5所示)：Y＝3.5578x-11.736R²＝0.9971

       表1  等电点Mr的pI值及相应的迁移距离记录

根据标准曲线推导纯化致敏蛋白的等电点：

d＝5cm，pI＝4.7

实施例3  葎草花粉主要致敏蛋白的单抗制备

具体操作参照巴德年主编的《当代免疫学技术与应用》中第十一章：杂交瘤技术与单克隆抗体制备。操作过程简述如下：

1)免疫动物取3只6周龄的雌性健康BALB/c小鼠同时免疫。第一次免疫每只小鼠注射10～15μg抗原。将弗氏完全佐剂与抗原100μl等体积混合，用微量搅拌器充分混匀，腹腔注射。

2)2～4周后进行第二次免疫，也称加强免疫。加强免疫的抗原量减半，并改用弗氏不完全佐剂，但注射体积和方法不变。加强免疫共行4次，直至血清效价达到要求。符合要求的免疫小鼠在细胞融合前至少应休息一个月，使血清效价有所下降。

3)融合前3天进行最后一次冲击免疫，用PBS150μl溶解抗原50μg，经小鼠尾静脉注射。

4)免疫效果检测免疫2～3次后从眼眶取血检测血清效价。用加样器吸取血浆2～5μl，用PBS稀释至100倍，1000倍，2000倍，4000倍。检测方法采用ELISA。

5)细胞融合分别收集骨髓瘤细胞和B淋巴细胞，将准备好的骨髓瘤细胞和脾细胞移至一个50ml离心管中，加入一些不含血清的培养基，离心，吸取上清后放在掌心摇动使细胞团成松散的糊状。将离心管置于37℃水浴中，吸取1ml 50％的PEG溶液，慢慢加入细胞中，边加边搅拌，1min加完。静置1min再吸取预先准备好的10ml不含血清的培养基，缓慢加入，以稀释PEG，减少毒性作用。边加边缓慢搅拌，先慢后快，前2min加入2ml，后2min加入剩余的培养基。离心，吸去上清。将细胞团摇散，加入少量的新鲜IMDM培养基。

6)将融合细胞进行接种和选择性培养，融合成功的细胞可在HAT选择性培养基中长期存活，其余未杂交细胞都将死亡。

7)杂交瘤细胞的检测通过ELISA和免疫印迹的方法将那些能够分泌目的抗体的杂交瘤细胞检测出来。吸取细胞液体培养基上清进行检测。

8)阳性杂交瘤细胞的克隆化培养将阳性的杂交瘤细胞进行单细胞分离培养，采用半固体培养基法。

9)杂交瘤细胞的扩增与冻存将克隆化培养后的阳性杂交瘤细胞需及时冻存以防止这些细胞的染色体丢失，发生变异。扩增培养用含10％胎牛血清的普通完全培养基，冻存采用含10％DMSO的普通完全培养基。

10)单克隆抗体性质的鉴定鉴定内容包括亲和常数、特异性(交叉反应性)、免疫球蛋白的类型及亚类。

11)单克隆抗体的生产将杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔制备腹水，再用腹水分离纯化IgG抗体。

单抗特异性分析：目的旨在检测抗体是否还与目的抗原之外的其他抗原起反应，这是单抗最重要的指标。测定方法采用ELISA(固相酶联免疫测定)法，将如下三种抗原进行平行包被：葎草花粉主要致敏蛋白Hum s 1，大籽蒿花粉变应原浸液，灰藜花粉变应原浸液，包被蛋白浓度均为5μg/ml，将获得的每株单克隆抗体同时与三种包被抗原反应，如果某株单克隆抗体与两种或两种以上的包被抗原有反应，说明该株单克隆抗体具有交叉反应性(即除了能与葎草花粉主要致敏蛋白Hum s 1结合外还能与大籽蒿花粉和/或灰藜花粉中的某些抗原结合)，本分析方法的目的旨在筛选出具有高特异性的单克隆抗体(即只与葎草花粉主要致敏蛋白Hum s 1结合的抗体)，因此弃用具有交叉反应性的单克隆抗体，实验结果如图6显示。图6中每排并列三个孔为一组，从左至右分别包被葎草花粉主要致敏蛋白Hum s1，大籽蒿花粉变应原浸液，灰藜花粉变应原浸液，每组代表不同株单抗同时与包被的三种抗原反应，并排三个孔中有两个或两个以上孔呈色的表明该株单克隆抗体有交叉反应，弃用，最终获得8株只与葎草花粉主要致敏蛋白Hum s 1反应的抗体。

同时，通过免疫印迹的方法分析了通过上述方法筛查出的8株抗体是否在葎草花粉变应原浸液所包含的所有抗原中仅与主要致敏蛋白Hum s1结合，方法如下：1.跑葎草花粉变应原浸液的SDS-PAGE制备电泳；2.将蛋白半干转印到PVDF膜上并用5％BSA-PBST进行封闭；3.将膜切成3mm宽的小条后与各株单克隆抗体进行一抗反应；4.一抗反应结束后对膜进行洗涤再与辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG多克隆抗体进行二抗反应，最后进行DAB显色。方法的具体操作可参照葎草花粉主要致敏蛋白的确定中采用的免疫印迹方法。结果表明这8株单克隆抗体仅与葎草花粉中的Hum s 1结合。

亲和常数的测定：亲和常数(Ka)反映的是抗体与抗原结合的能力。在特定的条件下，对于特定的抗原抗体系统，Ka是固有的，该值越大反应达到平衡越快，且达到平衡时抗原抗体复合物的相对浓度越大，能产生抗原抗体复合物所需的抗原量也越少，即亲和力高的抗体用于临床检验时反应快，用量少，灵敏度高。对葎草花粉主要致敏蛋白Hum s 1单克隆抗体亲和常数的测定采用稀释抗体法粗略估计亲和常数，具体操作如下：

1.将葎草花粉主要致敏蛋白Hum s 1进行包被，包被浓度为5μg/ml；

2.将提纯的各株抗体做系列稀释；

3.各株抗体均取不同浓度的抗体100μl与包被抗原反应，随着抗体量的下降，结合率不断下降，各株抗体均可测得一组吸收值；

4.以反应孔吸收值为纵坐标抗体浓度为横坐标作图，从图中找出结合率从最高点下降50％时相对应的抗体浓度。这一浓度的倒数即为抗体亲和常数。

由此得到8株单克隆抗体的亲和常数，具体数值见表，其中有两株抗体亲和常数的数量级达到10⁹，四株抗体亲和常数的数量级达到10⁸，另两株抗体亲和常数的数量级为10⁷。

单克隆抗体的免疫球蛋白(Ig)类型和亚类鉴定：鉴定单克隆抗体Ig类型和亚类采用免疫双扩散法，具体操作如下：

1.以磷酸盐溶液配制1％琼脂糖溶液，趁热倒入直径35mm的小平皿中，凝结后打孔，中间一个，周围6个。

2.取杂交瘤培养上清液1ml加入硫酸铵0.3g沉淀抗体，10000r/min离心5min吸去上清，加入50μl磷酸盐溶液，溶解沉淀物。

3.取10～15μl加入中央孔中，周边孔分别加入抗不同Ig类或亚类的抗体10～15μl，4℃保湿放置24hr以上，出现沉淀线者为阳性反应，表明这种抗体属于对应的Ig类或亚类。

结果表明筛选出的8株单克隆抗体均为IgG，其中有5株抗体的亚类为IgG1。

上述实验方法均是参照巴德年主编的《当代免疫学技术与应用》中第十一章：杂交瘤技术与单克隆抗体制备进行。通过上述方法共得到了8株理想的杂交瘤细胞，如表2所示，这些杂交瘤细胞分泌产生的单克隆抗体均可用于构建免疫检测试剂盒，从而用于检测药物和生物制剂中葎草花粉主要致敏蛋白含量，确定药物剂量和浓度。

  表28 株抗体的类型或亚类及相对亲和力常数

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