编码的多重粒子的比较基因组杂交

摘要

本文公开的内容涉及评价基因组DNA的方法，所述方法包括：a)提供基因组DNA样品；b)提供粒子混合物，所述混合物包含来自不同粒子集的粒子，其中每个粒子集包含大量编码的粒子和用于特定基因组基因座的核酸杂交探针，使得混合物共同地包括用于大量不同基因组基因座的探针；c)在杂交条件下将样品与一部分粒子混合物接触；和d)在混合物的各个部分中，通过监测可测定的标记评价样品与粒子的杂交，其中监测信号表示每个需要测定的基因组基因座的拷贝数。本发明还涉及粒子混合物，其包含来自其不同粒子集的粒子。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求下述申请的优先权:于2005年12月23日提交的美国申请序 号60/753,584；于2005年12月23日提交的美国专利序号60/753,822；于2006 年2月3日提交的美国专利序号60/765,311，和于2006年2月3日提交的美 国专利序号60/765,355，上述每个申请的内容通过引用并入本文。

背景

比较基因组杂交(CGH)是评价基因组内容物(genomic content)的方法。例 如，可以使用CGH分析先天性异常、遗传疾病和癌症。

概述

我们已经发现使用编码的粒子平行地评价多个样品，从而评价基因组内 容物的方法。在一些实施方案中，可以通过平行地评价来自未知样品的DNA 和参比DNA，来检测基因组内容物中的差别，例如，无需将用于分析的DNA 与参比DNA组合成单一的混合物。用于分析的DNA和参比DNA保持彼此 分离。例如，可以用单一标记评价多个样品。在其它一些实施方案中，通过 比较相同混合物中用于分析的DNA和参比DNA，使用单一的检测标记检测 基因组内容物的差别。例如，用于分析的DNA和参比DNA可具有不同的直 接或间接标记。还可以使用本方法评价其它核酸，例如，mRNA，如用于基 因表达分析中。

在一个方面，本公开的特征在于评价基因组DNA的方法。本方法使用混 合物，其包括来自不同粒子集的粒子。每个粒子集包含大量的编码的粒子， 和用于特定基因组基因座的核酸杂交探针，使得所述混合物共同地包括用于 多个不同基因组基因座的探针。该方法可以包括:提供基因组DNA样品和粒 子混合物；在杂交条件下将样品与部分粒子混合物接触；和通过监测可检测 标记，在混合物的各个部分评价样品与粒子的杂交。监测信号表示每个需要 研究的(interrogated)基因组基因座的拷贝数。

可以提供多于一个的核酸样品(例如，包括基因组DNA的样品)。例如， 可以根据本发明评价每个核酸样品。可以在不同的腔室(compartment)内评价 样品。在一些实施方案中，可以在同样的腔室内评价多于一个DNA样品。

在一些实施方案中，可以用光谱法检测可检测标记。例示性的可检测标 记可以包含藻红蛋白或其它荧光分子。

在一些实施方案中，核酸杂交探针包括或源自克隆的核酸。例如，核酸 杂交探针可以包含来自细菌人工染色体(BAC)的核酸。BAC核酸可以包含人 基因组DNA的片段或非人(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、羊、牛、 狗、猫、马、鸟、爬行动物、非人灵长类(例如，猴或狒狒)，或苍蝇)基因组 DNA的片段。

在一些实施方案中，核酸杂交探针可以包含对特定的染色体基因座具有 特异性的一个或多个寡核苷酸(例如，寡核苷酸的集合)。例如探针可以对彼此 为50、20、5、2、1或0.5百万碱基(megabases)之内的序列具有特异性。

在一些实施方案中，例如，可以使用至少2、5、10、20、50、100或200 个不同的粒子集，来评价不同的基因组基因座各自的数目。在一些实施方案 中，粒子集中所有编码的粒子可以具有同样的编码(code)。在其它实施方案中， 每个粒子具有唯一的编码，并储存信息，指示哪个粒子在哪个粒子集中或哪 些探针附接于每个粒子。

在一些实施方案中，多个样品中至少一个样品可为参比样品，其中每个 需要测定的基因组基因座的拷贝数已知。方法可以包括，将参比样品的监测 信号与其它样品的信号进行比较，以确定样品中每个需要测定的基因组基因 座的拷贝数。

在一些实施方案中，当提供多于一个的DNA样品时，将每个样品用第一 间接标记来标记，并可将每个样品与用第二间接标记来标记的参比DNA组 合。参比DNA可为来自参比来源、每个需要测定的基因组基因座拷贝数都已 知的基因组DNA。例如，第一间接标记可以是荧光素，而第二间接标记可以 是生物素。

在一些实施方案中，评价可以包括(i)将包括单一标记和与第一间接标记 结合的物质的第一组成部分(first moiety)与样品的第一部分结合，和(ii)将包括 单一标记和与第二间接标记结合的物质的第二组成部分与样品的第二部分结 合。例如，第一组成部分可以包括抗生蛋白链菌素(streptavidin)或抗生物素蛋 蛋白(avidin)和可检测标记(例如，藻红蛋白)，而第二组成部分可以包括抗-荧 光素抗体或其功能部分和可检测标记(例如，藻红蛋白)。在一些实施方案中， 对每个基因组样品，评价每个不同粒子集中的至少5、10、20、30、50、70 或100个粒子。

当提供多于一个样品时，多于一个样品中的每个可在多腔室设备的不同 腔室中。在一些实施方案中，每个样品可以在多孔板的不同孔中。多孔板可 以是96孔、384孔或1024孔试验板。

可以使用方法，例如，检测多个不同的染色体基因座的杂合性 (heterozygosity)，可以检测染色体扩增，杂合性的缺失、染色体基因座的杂合 缺失(heterozygous deletion)，或者染色体基因座的纯合缺失(homozygous deletion)。

在一些实施方案中，粒子不与聚合酶接触，例如在杂交后不与聚合酶接 触。在一些实施方案中，粒子不与任何酶接触，例如，在杂交后不与任何酶 接触。

在一些实施方案中，基因组DNA样品可为未标记的(unlabeled)。该方法 可还包括将标记的探针杂交至基因组样品，其中，对于附接于粒子的每个核 酸杂交探针，标记的探针杂交至在同样的基因组基因座的基因连接位点，使 得如果样品中存在基因组基因座，则可以通过由标记的探针与样品核酸链杂 交和样品核酸链与附接于粒子的核酸杂交探针杂交而形成的复合物将标记的 探针固定于粒子。在一些实施方案中，可以在将基因组DNA样品杂交至附接 于粒子的核酸探针的同时，将标记的探针杂交。在一些实施方案中，可以在 将基因组DNA样品杂交至附接于粒子的核酸探针之后，将标记的探针杂交。

在一些实施方案中，本方法可还包括用间接标记来标记某个来源的基因 组DNA，以提供基因组DNA样品。

在一些实施方案中，例如当使用单一可检测标记时，本方法可还包括用 单一标记来标记某个来源的基因组DNA以提供基因组DNA样品的步骤。在 本方法的一些实施方案中，可以用单一标记来标记所有的基因组DNA样品。

在一些实施方案中，可以用同样的间接标记来标记基因组内容物未知的 所有基因组DNA样品。在一些实施方案中，可以用同样的间接标记来标记大 部分基因组DNA样品。

在一些实施方案中，本方法可还包括在评价杂交之前振荡粒子。

例如，粒子可以用荧光染料全息编码或编码，所述染料具有与单一检测 标记可分离的光谱(spectra)。在本方法的一些实施方案中，粒子可以具有磁性。 例如，粒子是顺磁珠(paramagnetic bead)。

在另一个方面，本公开提供使用单一的可检测部分和粒子混合物评价基 因组DNA的方法，所述混合物包括来自不同粒子集的粒子，其中每个粒子集 包含大量编码的粒子和用于特定基因组基因座的核酸杂交探针，使得混合物 共同地包括用于多个不同基因组基因座的探针。所述方法包括:提供至少一 个参比DNA样品和多个基因组DNA样品。每个样品用同样的可检测部分标 记。所述方法还包括:将每个样品与部分粒子混合物在杂交条件下接触；并 通过监测可检测部分，评价混合物各个部分中每个样品与粒子的杂交。例如， 每个样品在各自的容器中与粒子混合物接触。监测信号可表示每个需要研究 的基因组基因座的拷贝数。所述方法可以包括本文所述的其它特征。

在另一个方面，本公开的特点在于使用单一的可检测标记和粒子混合物 评价核酸的方法，所述混合物包括来自不同粒子集的粒子，其中每个粒子集 包含大量编码的粒子和用于特定靶物的核酸杂交探针，使得混合物共同地包 括用于多个不同靶物的探针。所述方法可包括:提供至少一个用第一间接标 记来标记参比核酸样品和多个测试核酸样品。每个测试样品用第二间接标记 来标记。所述方法可包括:将每个测试样品和参比样品与部分粒子混合物在 杂交条件下接触，其中每个测试样品与参比样品在各自的容器中与粒子混合 物接触；将包括单一标记和与第一间接标记结合的物质的第一组成部分与每 个测试样品的第一部分结合；将包括单一标记和与第二间接标记结合的物质 的第二组成部分与每个测试样品的第二部分结合；通过监测样品第一部分中 的单一标记和样品第二部分中的单一标记来评价每个测试样品。监测信号可 表示每个靶物的拷贝数。所述方法可包括，对于每个测试样品，比较来自第 一部分中的单一标记的信号与来自第二部分中的单一标记的信号，以获得测 试样品中的探针拷贝数相对于参比样品的表征值。所述方法可包括本文所述 的其它特征。

在另一个方面，本公开提供粒子混合物，所述混合物包含来自不同粒子 集的粒子，其中每个粒子集可包含大量编码的粒子和用于特定基因组基因座 的核酸杂交探针，使得混合物共同地包括用于多个不同基因组基因座的探针。

在一些实施方案中，用于至少一些基因座的探针可包含细菌人工染色体 DNA。在一些实施方案中，用于至少一些基因座的探针可包含超声处理的细 菌人工染色体DNA。在一些实施方案中，用于至少一些基因座的探针可包含 合成寡核苷酸集合。

在一些实施方案中，粒子混合物可还包括粒子，所述粒子包括来自至少 两个样品的杂交的DNA，其中每个样品包括基因组DNA，而且每个样品可 用不同的间接标记来标记。在一些实施方案中，粒子混合物可还包括来自单 一样品的杂交的DNA，所述单一样品用可检测标记来标记，或者包括来自多 于一个样品(例如，第一样品和第二样品)的杂交的DNA。

在另一个方面，本公开的特点在于具有多个腔室的多腔室板，其中至少 多个孔中的每个可包含:粒子混合物，比如本文描述的任何粒子混合物；和 样品或参比基因组核苷酸。样品和参比核苷酸可在单独的容器中。在一些实 施方案中，样品和参比核酸可以用同样的标记检测。

在另一个方面，本公开的特点在于试剂盒，其包括:用第一间接标记来 标记的参比基因组DNA(或其它参比核酸)样品；用第二间接标记来标记基因 组DNA(或其它核酸)样品的试剂。试剂盒还可以包括下述的一种或多种:包 括单一标记和与第一间接标记结合的物质的第一组成部分；包括单一标记和 与第二间接标记结合的物质的第二组成部分；和粒子混合物，比如本文所述 的任何粒子混合物。试剂盒还可以(任选地)包括对如何使用试剂盒检测单一标 记和/或进行实验的说明。

还公开了包括本文所述的一种或多种组分的试剂盒。试剂盒还可以包括 材料，其包括使用组分用于方法(例如本文所述方法)的说明。试剂盒可以包括 一个或多个克隆的或合成的核酸序列(比如细菌人工染色体(BACS)或一个或 多个合成寡核苷酸集合，或个体寡核苷酸)，一个或多个微孔板，和/或一个或 多个粒子集(例如，如本文所述)或粒子混合物。

粒子，比如珠，提供特别稳固的系统用于评价基因组内容物。基于粒子 的方法包括接近或处于溶液相动力学的杂交，因此提供增强的均匀性。粒子 易于获取用于特定探针的很多数据点。例如，对于小粒子(例如，直径达到几 微米的粒子)，可以分别分析具有相同探针的至少10、50或100个粒子。大 粒子可以从每个粒子的不同位置获得多个数据点。对于大粒子，获得很多数 据点经常需要更少的粒子。可以使用统计学确定具有相同探针内容物的粒子 群的中值或平均信号。

可以将本文所述方法用于比例计量(ratiometric)实验。比例计量方法通过 同时而竞争性地进行多个实验，从而修正实验精确性中的很多潜在误差。例 如，温育条件或捕获分子或标记试剂的浓度中的任何偏差，都可以通过标准 化来修正。可以使用竞争性和非竞争性的比例计量方法，例如，用于比较基 因组内容物或基因表达。

本文引用的所有专利、专利申请和参考文件都通过引用并入本文。

附图简述

图1-6是根据一个实例，以固定于实验珠上的捕获分子进行的系列特异 性结合相互作用的示意图。

图7是图1至6中所述实例方法的流程图。

图8-10描述根据例示性实施方案进行的参比实验的结果。

图11描述使用双重间接标记-单杂交来表达RNA的例示性实验的结果。

图12是线形图，描述根据一个实施方案进行的单色(单标记)实验的结果， 其中参比和测试样品不在同一个孔中。

详述

有效而经济的设计特点大大地促进了多重核酸方法。如本文所述，可以 使用单标记检测进行宏大的多重实验。实验使用来自不同粒子集的小粒子混 合物。每个粒子集包含大量编码的粒子和用于特定靶物(如特定基因组基因座 或RNA)的核酸杂交探针。可将来自不同集的粒子组合以提供混合物，所述混 合物共同地包括用于多个不同靶物的探针。

在一个实例中，将粒子混合物分成至少两部分，A和B。用第一组成部 分标记测试样品基因组DNA，并与标记的A部分杂交。用基团标记参比 DNA(通常为来自参比样品的基因组DNA)，所述基团可以与第一组成部分相 同或不同(即，第二组成部分)。参比DNA与B部分杂交。测定来自A部分 和B部分的信号，然后比较。如果参比DNA和样品DNA用同样的基团标记， 那么它们在不同容器中进行处理。进行少量操作，可使用设备评价两个杂交 反应，所述设备经过配置以检测标记基团是直接标记，还是与直接标记偶连 (例如，在杂交之前或之后)。

所用的基团可以是间接标记(如用作间接标记的染料)、直接标记(如染料， 例如荧光团)，或特异性结合对的成员。检测可以是直接或间接的，例如，通 过使用特异性结合对的标记的第二成员进行二级(secondary)检测。

在第二个实例中，用不同的间接标记来分别标记测试和参比样品基因组 DNA。间接标记通常是特异性结合对的第一成员。将样品互相混合，并与粒 子混合物的同一部分杂交。在温育和洗涤后，将所述部分分入至少两个容器 中，用于与两个特异性结合对中相应的第二成员一起温育。两个特异性结合 对中的这些第二成员可以与第三标记偶连，而且如果需要，可以与第四标记 偶连，所述第四标记用于检测。通常，检测器标记和两个间接标记彼此完全 不同。例如，如果一个或多个标记是荧光标记，那么它们具有不同的激发和/ 或发射光谱，使得它们可以通过光谱区分。

为了说明，可将生物素用作测试样品的间接标记，并将羧基荧光素用作 参比样品的间接标记。因此，在第一个容器中，加入荧光标记的抗生蛋白链 菌素(其与生物素结合)并温育，而在第二个容器中，加入荧光标记的抗-荧光 素(其与羧基荧光素结合)并温育。对于LUMINEX xMAP^TM系统，优选用于检 测的荧光标记是藻红蛋白。然后使用单色检测系统顺序读出每个与结合的荧 光标记产物温育的粒子混合物的值(测试和参比样品)，并将信号进行比较。

这两个例子说明了使用单一检测获得比较或比例计量信息的方法。在例 示性应用中，可以在单一多孔板中，使用具有用于不同靶物(例如不同基因组 基因座)的探针的粒子混合物，处理大量不同的病人样品。将粒子混合物置于 板的每个孔中。每个样品放入一个孔中。以这种方式，可以平行而且在有机 器人(robotic)帮助的情况下处理多个样品。然后可使用设备(比如流式细胞仪) 评价每个样品，从而检测与混合物中不同粒子类型的杂交。

在一些实施方案中，用两种不同的直接或间接标记来标记测试和参比样 品。如果标记是直接的(例如，荧光染料，比如青色素(cyanine)3和青色素5)， 则可以混合样品并与粒子集杂交，用能区分两种标记的设备进行检测。如果 标记是间接的(即，特异性结合对的第一成员，比如生物素和荧光素)，则特异 性结合对的每个第二成员(例如，抗生蛋白链菌素和抗荧光素)可用唯一的检测 器标记(如青色素3和青色素5)来标记，并用能区分两种标记的设备进行检测。

粒子

可以使用各种不同类型的粒子以评价核酸内容物，例如，基因组内容物。 粒子可以是任何形状(例如，圆柱、球形等)、大小、组成或物理化学性质。可 以选择粒度或粒子组成，使得粒子可以从流体中分离，例如，在具有特定孔 径的滤器上或通过其它物理性质(例如磁性)来分离。

粒子通常适于多重实验。例如，每个粒子包括唯一的编码，特别是，除 特异于基因组DNA的核酸探针之外的编码。编码以能够在杂交和分析过程中 稳定的方式嵌入(例如，在粒子内部中)或另外附接于粒子。可以通过任何可检 测方法，如通过全息编码，通过荧光性质、颜色、形状、大小、光发射、量 子点发射等提供编码，以鉴定粒子从而鉴定固定于其上的捕获探针。在一些 实施方案中，编码不是由核酸提供的。

例如，可以使用光学、化学、物理或电子标志编码粒子。这种编码技术 的实例是光条形码荧光染料，或其它手段。

一个例示性的平台使用浸渍于聚合物粒子中的荧光染料混合物，作为鉴 定固定了特异性捕获探针的粒子集的每个成员的手段。另一个例示性的平台 使用全息条形码以鉴定圆柱形玻璃粒子。例如，Chandler等(5,981,180)描述了 基于粒子的系统，其中不同的粒子类型由浸渍于聚合物粒子中的两个或更多 荧光染料的各个部分的混合物来编码。Soini(5,028,545)描述了基于粒子的多 重实验系统，其使用时间分辨的(time-resolved)荧光进行粒子鉴定。Fulwyler (4,499,052)描述使用通过颜色和/或大小区分的粒子的例示性方法。US 2004-0179267、2004-0132205、2004-0130786、2004-0130761、2004-0126875、 2004-0125424和2004-0075907描述由全息条码编码的例示性粒子。

US 6,916,661描述了与纳米颗粒结合的聚合微粒，所述纳米颗粒具有为 粒子提供编码的染料。聚合微粒的直径小于一毫米，例如，大小为直径在从 约0.1微米至约1000微米，例如，3-25μm或约6-12μm。纳米颗粒可以具有， 例如从约1纳米(nm)至约100,000nm的直径，例如，约10-1000nm或200-500 nm。

可以通过将来自不同粒子集的粒子组合而制备用于检测多个基因组基因 座的粒子混合物。每个粒子集包含大量具有相同编码的粒子，和特异于特定 基因座的核酸探针内容物。例如，不同粒子元素的数量可为10-3000、10-500、 20-200、50-2000、50-500或50-200，或75-300。可以分别制备每个粒子集， 然后将粒子集的部分与其它粒子集的部分组合，以提供粒子混合物。

粒子集的每个部分包括大量粒子，从而当使用粒子混合物的部分分析 DNA样品时，在每个样品的杂交反应中存在很多特异于特定基因座的粒子(例 如，至少10、20、30、50、80，或100个粒子；或者甚至1-5个)。可以在液 体样品中在悬浮液中振荡粒子，以促进较快地结合于探针。

分析粒子以确定与粒子杂交的程度。例如，检测与基因组DNA相关的标 记。可以使用设备分别评价粒子，所述设备能够读出粒子编码，并确定与每 个特定粒子关联的信号。

核酸探针

粒子通常具有特异于一个特定染色体基因座或基因的探针，视应用而定。 例如，可以从克隆的DNA(例如，BAC或酵母人工染色体或其它来源克隆的 DNA)、扩增的DNA或寡核苷酸制备探针。通常，可以使用序列可确定的任 何来源的核酸。将探针固定于粒子上，例如在表面上，或用于多孔粒子，或 内表面和/或外表面。

一个染色体探针包含合成寡核苷酸的混合物。另一个例示性类型的染色 体探针源自BAC克隆的DNA，其可以固定为片段的BAC DNA。

通常，附接于特定粒子的探针可以是片段的混合物。例如，片段包含随 机重叠序列，其中大部分的长度为600-2000碱基对。可以制备合成寡核苷酸 序列的混合物作为探针，其中每个序列长度为约60-150碱基对，或者重叠或 者是连续的序列。寡核苷酸混合物具有确定的组成，并可以用经济有效的方 式制备。

探针可以共价附接于特定粒子上。例如，US 6,048,695描述了附接探针 的例示性方法。如果用于特定粒子集的探针是一个或多个化学合成的寡核苷 酸，则可以合成具有能与粒子上的基团反应的化学基团(例如，胺)的寡核苷酸。 探针还可以源自其它来源，例如，质粒、粘粒和人工染色体。例如，可将细 菌人工染色体(BAC)超声处理，然后与交联剂反应，所述交联剂将BAC共价 附接于粒子上。例如，可以使用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]盐酸碳化二亚 胺(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)(EDC或 EDAC化学)以将核酸探针(如超声处理的BAC DNA)附接于粒子上。

通常，将探针附接于粒子集时，粒子集中的所有粒子就具有了相同的“编 码”。因此，检测器将与特定的附接的探针杂交的信号与粒子集中所有粒子的 “编码”相关联。可以使用软件(或者甚至人工计算)，以将两个“编码”的信 号与特定的探针相关联。在极端情况下，每个粒子具有唯一的序号，即，它 自己的编码。只要用特定探针修饰粒子编码的数据库轨迹(database track)，就 可以使用来自检测器的数据以将信号和与探针的杂交相关联。

标记

标记样品。可以使用各种方法标记样品DNA，例如用于分析的基因组 DNA。可以使用核苷酸通过聚合来引入标记，所述核苷酸包括至少一些经修 饰的核苷酸，例如，生物素、地高辛(digoxygenin)、荧光素或青色素修饰的核 苷酸。在一些实施方案中，通过随机引发和聚合来引入标记。其它实例包括 切口平移(nick translation)(Roche Applied Science，Indianapolis IN；Invitrogen， Carlsbad CA)和化学标记(Kreatech ULS，Amsterdam NL)。通常，可以使用适于 标记基因组DNA样品的任何标记方法。

共享的参比。在很多实施方案中，方法评价已知参比样品和未知实验样 品之间的信号比例。例如，使用两个间接标记(生物素和荧光素)，以允许两个 样品的竞争杂交。杂交后，将样品分成两个(或更多的)部分，分别评价每个部 分。可以使用评价的结果以提供两个间接标记水平的比例。这个方法具有使 用竞争性杂交来将实验之间的任何偏差标准化的优点:将参比和实验样品在 同样的容器中同时进行实验，与同样的粒子混合。

平行参比。对于某些实施方案，也可能将已知和未知样品分隔开。不使 用竞争性杂交。在这种情况下，在一个容器中对参比样品进行实验，而在另 一个容器中对至少一个实验样品进行实验。例如，容器可以是多孔板的不同 孔。如果使用多个实验样品，可在不同容器(例如在多孔板的不同孔)中评价每 个样品。对于每个探针，可以用与竞争实验同样的方法，获得实验样品信号 与参比样品信号之间的比例。

在使用这种方法时，可以在几个或很多实验样品之间共享单一参比样品。 对于每天涉及多个样品的实验，通过避免对多个重复的正常样品进行标记， 可以节省试剂成本和劳力。也不需要对样品进行操作，以获得用于不同分析 的不同部分。每个样品可以只评价一次。

非共价附接的标记。在另一个实施方案中，避免单独对每个样品进行共 价标记。例如，将未标记的基因组DNA样品与固定于编码的粒子的捕获探针 杂交，其中所述捕获探针包含BAC DNA或如上所述的寡核苷酸混合物。还 可以将预标记的报告序列与探针样品复合物在邻近于捕获探针序列但不与其 重叠的序列杂交。这些标记的报告序列可以在相同或不同的杂交反应中来进 行杂交。以此方式，可以在大规模环境中大量生产标记的报告序列，与进行 实验时分别标记每个样品相比，可以降低每个实验的成本。

检测

可以通过评价来自一个或多个可检测标记的信号，对于每个粒子，检测 表示杂交程度的信号。通常分别评价粒子。例如，粒子可以通过流式细胞仪。 例示性的流式细胞仪包括可从Beckman Coulter，Inc.(Fullerton CA)得到的 Coulter Elite-ESP流式细胞仪或FACScan^TM流式细胞仪，和可从Cytomation， Inc.，Fort Collins，Colo.得到的MOFLO^TM流式细胞仪。除了流式细胞术，可以 使用离心机作为分离和将微粒分类的设备。在美国专利号5,926,387中描述了 合适的系统。除了流式细胞仪和离心，可以使用自由流动电泳设备，作为分 离和将微粒分类的设备。美国专利号4,310,408中描述了合适的系统。还可将 粒子置于表面上，并扫描或成像。

例示性应用

本文所述的基因组评价方法具有各种应用，包括诊断学和法医学。例如， 可将它们用于确定成人、生殖细胞、胎盘细胞或胎儿细胞的基因组内容物。 细胞可以来自任何物种，但通常来自二倍体物种或具有更多倍数性(ploidy)的 物种。例如，细胞可以来自植物(例如，农作物植物)或动物(例如，人类或驯 化的动物)。

对于人类医疗用途，可以使用方法评价来自病人的样本，例如，来自活 组织检查的样本、血液样本、羊水样本或颊拭子。特别地，病人可以是具有 患癌症风险或患有癌症的病人。样本可以是来自肿瘤附近或来自肿瘤的组织 的样本。例如，方法可用于评价来自癌或肉瘤，或者来自肺、乳房、甲状腺、 淋巴、胃肠、生殖-泌尿道的肿瘤、腺癌，例如，恶性结肠癌、肾细胞癌、前 列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺的非小细胞癌、小肠癌和食道癌的细胞的基因组内 容物。已知很多在癌症中发生改变的染色体基因座。参见，例如Dutrillaux 等Cancer Genet.Cytogenet.49:203-217(1990)，US 5,670,314(肺癌)，US 5,635,351(神经胶质瘤)和US 6,110,673。方法可用于评价血液细胞的基因组内 容物，例如B或T细胞，或者来自白血病或淋巴瘤的细胞。

本文所述的方法也可适用于其它核酸，例如，除了基因组DNA之外的 DNA、mRNA或其它RNA。

通过下述非限定性实例进一步阐述发明的一些方面。

实施例

实施例1

在这个例示性的比例计量实验中，使用粒子评价具有单一标记的平行的 多个样品。例如，将不同的样品置于单独的容器，比如两个单独的微板孔中。 在每个容器中使用一种或多种对照试剂(control reagent)以将两者之间的结果 标准化。

下面描述了使用单一标记读出系统的例示性多结合实验。例如，用两个 样品I和II进行多重多结合粒子实验。可以将实验延伸至其它样品。用间接 标记来标记每个样品，如用生物素标记样品I，而用二硝基酚(DNP)标记样品 II。来自两个样品的特异性分析物竞争与针对每个粒子类型的核酸探针结合。 在温育和洗涤后，将粒子集分到两个容器中，与两种特异性二级标记分别温 育。在第一个容器中，加入荧光标记的抗生蛋白链菌素并进行温育，而在第 二个容器中，加入荧光标记的抗-DNP并进行温育。对于LUMINEX xMAP^TM系统，优选的荧光标记是藻红蛋白。通过将粒子编码与藻红蛋白信号相关联 的单色检测系统，顺序评价结合有荧光标记的产物I和II的每个经温育的粒 子集中的粒子。

参照图1，实验珠1具有固定于其表面上的捕获分子2。在图中，就本实 施例而言，将捕获分子示意性显示为线性核酸序列，但是捕获分子可以是特 异结合对中的任何核酸成员，比如克隆的DNA或寡核苷酸。将实验珠悬浮于 第一液体实验缓冲液3中。

在图2中，向图1的珠悬浮液中加入两个标记样品。在这个实施例中， 如在基因表达或比较基因组杂交实验中可以发现的，将样品示意性地显示为 核酸序列，但本技术可以用于任何类型的特异性结合实验。在图中，用第一 间接标记B(在本实施例中为生物素)标记来自第一样品的分子5，用第二间接 标记D(在本实施例中为二硝基酚[DNP])标记来自第二样品的分子4。在这个 实施例中，用“D”标记的分子4是用“B”标记的分子5的两倍。样品分子 将竞争与它们固定在珠上的结合对的互补物结合。

图3描述了将样品分子温育并特异性结合以捕获珠上的分子后，图1中 间接标记的样品分子和珠。标记的样品分子4和5竞争结合在捕获分子2上， 并在结合处形成结合复合物。每个珠上的特异性结合事件的数目近似地与互 补样品分子的浓度成比例；在本实施例中，在每个珠上捕获的用“D”标记 的样品分子4是用“B”标记的样品分子5的两倍。

在图4中，将具有其捕获的间接标记的分析物7和8的珠复合物9洗涤 并在第二缓冲液12中重悬。洗涤去除任何没有与珠特异性结合的任何样品分 子。还显示将珠分成两等份A和B。这通常通过下述方法完成:通过振荡将 珠悬浮于缓冲液中，然后将约一半体积的珠-缓冲液悬浮液吸取至另一个容器 中，如另一个微板孔中。珠复合物9的两等份具有近似相等的量和浓度。

在图5中，向每等份中加入与样品分子上的间接标记互补的、不同的荧 光标记分子缀合物10和11。在A部分中，加入与荧光标记10(如藻红蛋白 或青色素或其它荧光团)缀合的抗生蛋白链菌素。选择荧光标记，使其与下游 的荧光珠阅读系统相容。在B部分中，加入与同样的荧光标记11缀合的抗 DNP。在本实施例中使用抗生蛋白链菌素和抗DNP，因为它们与例示性的生 物素和DNP间接标记互补，但是可以使用任何高亲和性特异性结合对。

在图6中，在温育图5所示的混合物后，形成了荧光标记的珠缀合物13 和14，然后洗涤并将珠复合物重悬于第三缓冲液15中。每等份包含荧光标 记的珠复合物，每等份中珠上的荧光标记的量近似与一个实验样品中的分析 物浓度成比例。每等份可以单独在单标记荧光珠阅读系统，如LUMINEX xMAP^TM系统中读数，以产生与每个珠上的荧光标记密度成比例的信号。

图7是图1-6中所述实施例实验的流程图。将第一样品16与第一间接标 记17(此例中为生物素)一起温育18，以产生第一间接标记的样品19。分别地， 将第二样品20与第二间接标记(DNP)21一起温育22，以产生第二间接标记 的样品23。然后将具有间接标记的两个样品19和23与编码珠集24一起以 竞争性方式温育25，其中珠集可以是，例如，具有固定于每个珠类型 (LUMINEX术语中的珠“区域”)上的不同捕获分子的编码LUMINEX珠的集 合。在竞争性温育25后，洗涤珠，并用洗涤缓冲液34重悬26，将重悬的珠 分成两等份27和28。

然后向每个等份分别加入每个间接标记的荧光标记的特异性互补物。在 这个实施例中，将抗生蛋白链菌素-藻红蛋白29温育31于第一间接珠等份27， 其中抗生蛋白链菌素特异性地与珠复合物上的生物素间接标记结合。分别地， 将抗DNP-藻红蛋白30与第二珠等份28一起温育32，其中抗DNP特异性结 合于珠复合物上的DNP间接标记。接下来，继续保持两等份相分离，用洗涤 缓冲液35和36洗去31和32过量的荧光缀合物。最后，在本实施例中使用 LUMINEX xMAP 100^TM或xMAP 200^TM设备分别读取33每个荧光标记的珠等 份。

实施例2

图8至10描述例示性参比实验的结果。图8显示五重(five-plex) BAC-CGH实验的特异性和灵敏性，所述实验在平台上运行，以 生物素和荧光素作为间接标记。首先，将来自五个BAC中每一个的片段化的 DNA通过下述方法固定在LUMINEX珠的五个集上:起初将羧化的珠表面修 饰成氨基表面，然后使用1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]盐酸碳化二亚胺(ECD或 EDAC化学)将BAC片段的5’末端固定于珠上。然后将六个珠集(每个集具有 不同的LUMINEX珠ID或“区域”)汇合成多重珠集。这些步骤详述如下:

BAC探针、标准物和样品。使用细菌人工染色体(BAC)DNA使捕获探 针固定于编码珠上。将全部由Health Research Division，Roswell Park Cancer Institute(Buffalo，NY)提供的五种不同的人BAC在下述实验中用作固定化捕 获探针:RP11-289D12(15q11.2)；RP11-524F11(17p11.2)；RP11-1398P2 (4p16.3)；RP11-476-C20(22q11.21)；RP5-59D14(17p13.3)。在括号中列出了 这些BAC的Roswell Park克隆#及染色体基因座。

将这些BAC在实验中用作标准物。使用五种BAC的汇合物产生酶标记 的阳性样品，所述样品用生物素标记和未标记的核苷酸进行Klenow随机引物 标记。此外，将Cot-1DNA(Invitrogen15279-011，Carlsbad CA)固定于编码珠， 作为阴性对照。

制备BAC探针并固定于珠上。将BAC DNA固定于来自Luminex(Austin TX)的LUMINEX xMAP^TM珠上。xMAP^TM珠由表面上以羧基官能化的聚苯乙 烯制成。这些珠以顺磁和无磁两种形式提供。顺磁珠促进将珠从溶液中分离 用于洗涤步骤，但是当在过滤柱或板(例如，HTS 0.45μm，目录MSHVN4510， Millipore，Billerica MA)上进行洗涤时，同样的规程对无磁珠也起作用。

将BAC和对照探针固定在磁性LUMINEX珠上的固定规程如下。

通过与4，9-二氧杂-1，12-十二烷二胺和乙基-3-[3-二甲氨基丙基]盐酸碳化 二亚胺(EDC)反应，进行羧化物珠的氨基转化(amino conversion)。

1.使用硅化的200μl吸液管吸头，将来自六个珠区域(24、46、47、56、 68和79)的LUMINEX标准运输/储存瓶中的250μl(2.5×10⁶珠)分装 入六个单独的1.5ml Eppendorf管中。

2.向每管中加入750μl的0.1M 2-(N-吗啉)-乙烷磺酸(MES)0.15M NaCl pH6.0。将每管漩涡振荡并超声处理。

3.通过将钐-钴磁盘磁体接触瓶的侧面10分钟，使每个管中的磁珠球成 粒(pellet)。小心去除900μl液体，同时避免搅动磁珠。

4.在每管中用MES将总体积调整至80μl。向每管中添加10μl4，9-二氧 杂-1，12-十二烷二胺(在50μl/ml MES)和10μl EDC(50mg/ml在MES 中)。

5.将每管漩涡振荡并超声处理以将珠重悬。

6.在室温于试管旋转器上温育120分钟。

7.向珠中加入900μl PBS，漩涡振荡并超声处理。

8.使用磁体，用5分钟将磁珠制成粒状。用移液管移出1000μl液体， 加入1000μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)。将每管漩涡振荡并超声处理以将 珠重悬。

9.通过用磁体制粒，洗涤每管珠3×，取出液体，加入洗涤缓冲液(1× PBS，0.01％ BSA，0.01％ Tween 20)，超声处理并漩涡振荡。最后加 入缓冲液250μl1×PBS 0.01％ BSA，用于储存。

将BAC和对照DNA EDC偶连(EDC coupling)在珠上:

1.将六个珠区域中每个0.5×10⁶氨基珠(50μl)等分入1.5ml Eppendorf管 中，漩涡振荡并超声处理。

2.向各管中加入5.0μl BAC DNA或Cot-1DNA(通过超声处理片段化) (标称浓度50ng/μl)，短时间漩涡振荡。加入5μl刚刚溶解的EDC(10 mg/ml在dH₂O中)。立即漩涡振荡，然后在室温于暗处温育30分钟。 重复加入EDC，漩涡振荡并温育30分钟。加入700μl溶于dH₂O中 的0.2％Tween 20，并漩涡振荡。

3.使用磁体将磁珠制成粒状5分钟。去除上清液。将珠重悬于900μl溶 于dH₂O的0.05％ Tween 20中，漩涡振荡并超声处理。在100℃加热 5分钟以使偶连至表面的双链DNA变性。将此步骤再重复一次。

制备多重珠混合物

1.将具有固定化BAC和Cot-1对照探针的6管珠中的每管漩涡振荡并超 声处理。从每个珠管中吸取等份至新管中，预计的珠量为2500珠/μl。

2.使用磁体将多重珠混合物制成粒状10分钟。加入200μl温的  Slide Hybridization Buffer #2(Ambion，Austin TX)。等份中 使用10μl珠混合物，使每等份中每个区域的约2500个珠足够进行 20次杂交。

对于验证实验，通过汇集用于制备多重珠的同样的BAC DNA片段来制 备样品DNA。双链的BAC DNA将在变性后与它们自身进行特异性杂交，允 许以已知浓度样品产生标准曲线。将八个浓度中每种的稀释物(从6.25ng/ml 向下两倍稀释)用作标准。将这些DNA稀释物中的每个分成两等份，用荧光 素或生物素标记两等份中的各一等份以产生间接标记的样品。

使用以生物素标记的和荧光素标记的核苷酸取代标准青色素染料标记的 核苷酸的标准BioPrime^TM BAC平面微阵列随机引物标记试剂盒(Invitrogen， Carlsbad CA)进行标记。具体如下:

1.将五种BAC中的每一个等份汇集到一个管中，漩涡振荡。向两个微 量离心管中各加入2μg汇集物。用去离子H₂O将体积调整至50μl。

2.将来自试剂盒的40μl 2.5X随机引物混合物加入两个标记反应中的每 一个。漩涡振荡2秒钟，离心10秒钟。

3.于100℃在加热块上将DNA变性5分钟。在冰水中快速冷却(snap-cool) 5分钟，离心10秒钟。

4.制备生物素主混合物(master mix)(足够进行六次反应)

16μl光谱标记缓冲液(EDTA和tris缓冲液中未标记的dNTP核苷酸混合 物，Spectral Genomics，Houston TX)

10μl生物素dCTP

6.5μl Klenow(Invitrogen，Carlsbad CA)

共32.5μl

5.向每管中加入10μl主混合物，离心10秒钟，并将每管在37℃温育2 小时。

6.从每个反应中移出3μl，并在琼脂糖凝胶上进行电泳，以确认标记产 物长约100bp。

7.加入8μl溶于dH₂O中的EDTA，pH8.0，在70℃温育10分钟。将标 记样品置于冰上。

8.加入90μl Spectral Genomics Hybridization Buffer1(人Cot-1DNA和剪 切鲑鱼睾丸)，加入38.8μl5M NaCl，并漩涡振荡。加入260μl异丙 醇，漩涡振荡并离心。

9.室温温育20分钟。全速离心20分钟。在需要使用前于4℃储存。

10.在使用之前，将标记的BAC加热至室温，并离心10分钟。

11.移出上清液，并加入1000μl70％乙醇30％d。另外离心3分钟，并 去除所有液体，保留沉淀(pellet)。

12.风干10分钟，或者直至目测干燥。

13.向沉淀加入20μl去离子水，在室温温育10分钟。标记DNA的预计 浓度:2μg/20μl(100ng/μl)。

在步骤4，用荧光素核苷酸取代第二荧光主混合物中的生物素核苷酸， 重复上述步骤。这两种操作的产物是:生物素标记的BAC汇集物和荧光素标 记的BAC汇集物。这些包含与用作探针的相同BAC的标记汇集物，其是固 定化探针的完美匹配阳性杂交互补物。可将同样的步骤用于从细胞制备的核 酸样品，例如，来自病人或其它受试者的基因组DNA。

然后将八对间接标记的样品中的每对与LUMINEX多重珠集杂交，八对 样品由浓度逐渐增加的荧光素标记的样品与浓度逐渐减少的生物素标记的样 品混合组成，根据图8中沿图示的横轴上的标志。如下所详述，杂交在50℃ 进行两小时，然后是三次严紧洗涤(stringency wash)，也在50℃进行。严紧洗 涤缓冲液为，按照顺序，2X SSC+50％去离子甲酰胺；2X SSC+0.1％Igepal； 和0.2X SSC。

杂交与检测

1.在1.5ml微量离心管中制备四个稀释系列的标记样品。将相应对的同 样标记的稀释液混合，形成下述8个样品:

样品#        5BAC汇集物，   荧光素      5BAC汇集物，   生物素

1            0.039ng        +           6.25ng

2            0.078ng        +           3.12ng

3            0.156ng        +           1.56ng

4            0.31ng         +           0.78ng

5            0.78ng         +           0.31ng

6            1.56ng         +           0.156ng

7            3.12ng         +           0.078ng

8            6.25ng         +           0.039ng

2.在SpeedVac^TM(Kendro Laboratory Products，ThermoElectron Corp， Asheville NC)中干燥减少(drydown)标记样品的体积。加入10μl如上 所制备的温热的多重珠混合物。用吸头混合，并于98℃在块加热器 (block heater)上变性2分钟。

3.通过在覆盖铝箔的50ml离心管中温育微管来进行杂交，置于50℃烘 箱中的旋转架上2小时。

4.杂交后，向每个样品管中加入1ml的0.2X SSC并漩涡振荡。

5.将每管中的物质转移至96孔PCR板的两个孔中，将每个杂交的珠集 分成一对500μl等份。

6.用磁体在板孔中将珠制粒10分钟，小心去除500μl上清液以避免珠 的丢失。

7.向每对孔的一个中加入100μl的8μg/ml PJ31S抗生蛋白链菌素-藻红 蛋白(Prozyme，San Leandro CA)，并向一对中的另一个孔加入100μl 的8μg/ml抗荧光素-藻红蛋白(Invitrogen，A-21250)。然后，温育板， 同时于室温在NCS^TMShaker Incubator(PerkinElmer，Boston MA)上 950RPM振荡30分钟，然后用1×PBS+0.01％ Tween 20缓冲液洗涤 珠。

8.用磁体将每个板孔中的珠制粒10分钟，小心去除100μl上清液以避 免珠的丢失。加入100μl Tris-NaCl-Tween 20缓冲液，通过反复吸取 而混合以将珠重悬。

9.在LUMINEX 100^TM分析仪上将样品读数，记录每个孔中每个珠区域 的中值荧光强度。

如上述步骤(7-9)中所详述的，在完成了使用间接标记进行的两样品竞争 杂交实验后，重新划分多重实验珠集。将一个等份用4μg/ml抗-荧光素-藻红 蛋白进行第二标记，而另一等份用4μg/ml抗生蛋白链菌素-藻红蛋白进行第 二标记。然后将这些第二标记的珠集中的每个在LUMINEX xMAP 200^TM系统 上分别读数。

结果示于图8中。将来自每个BAC的信号显示为单独的数据追踪(data track)，单独显示荧光素标记的样品与生物素标记的样品。每一个显示在约 160:1的浓度范围内浓度对信号的线性响应。看起来最大的荧光素标记信号没 有干扰最低的生物素标记信号，反之亦然。而且，来自其上固定有COT-1的 珠的信号比特异性结合事件的最低信号还要低。这样的信号在所有条件下都 小于全标度(full scale)的2％。这证明，在这些浓度范围中，两种间接标记没 有显示实质的(substantial)干扰或者交叉反应性。

图9显示用不同的方式格式化的来自图8的数据。这是“一样-一样 (same-same)”散点图，其为差异基因表达微阵列分析中常用的类型。两个轴 的标度是生物素和荧光素标记的BAC样品的标准化浓度。在理想或完美的实 验中，每个数据点都将在对角线上:每个竞争实验的间接标记样品的信号都 是一样的，因为浓度是一样的。实际的数据在接近对角线处聚集，与理想实 验的偏差不超过1.5倍，通常偏差会更小。标准CGH(或基因表达)实验通常 使用2:1差异信号作为指示生物显著性的阈值。

实施例3

图10表示5重CGH实验的结果，该实验使用与上述相同的多重珠集， 针对间接标记的基因组DNA样品进行实验。将基因组DNA样品(人基因组 DNA:男性；Promega Corporation，Madison WI)分成两等份。一份用荧光素 间接标记，而另一份用生物素间接标记，实验使用前面提及的BioPrime^TM试 剂盒以产生两种间接标记样品。然后将两种间接标记样品混合，一起针对多 重珠集进行竞争性实验。在使用间接标记进行竞争实验后，将珠集分开，一 等份用抗-荧光素-藻红蛋白进行第二标记，而另一等份用抗生蛋白链菌素-藻 红蛋白进行第二标记。然后将这些第二标记的珠集中的每个在LUMINEX xMAP 200^TM系统上读数。将得到的数据，再次格式化为图10中的“一样-一 样”散点图。如图9中所示的特别构建的稀释系列，基因组DNA分组样品的 数据接近地符合图上的对角线。

实施例4

在阐述本发明另一方面的例示性实验中，将合成的70-mer胺-修饰的寡核 苷酸探针(Operon Biotechnologies，Huntsville AL)固定于Luminex多重珠并进 行单色实验，其中参比和测试样品不在同一个孔中。这个实验使用17个不同 的探针，其中四个是代表X和Y染色体上基因座的五个寡核苷酸的汇集的或 组合的集合，如下表详述。用这个多重探针集进行区分男性和女性DNA的验 证实验。

表1

 

     珠ID     基因染色体 位置                   寡核苷酸探针序列                     52                                                               ZFY      USP9Y    EIF1AY   CYorf15B PCDH11Y                                                                   5Y   组合 的                           TGAGACACCATAAAGAAGTTGGTCTGCCCTAACAG TGTGTCTACAAGCTTGTAAAGATGTTGGCCTTGA  (SEQ ID NO:1)                          TCACCTGATTCTTCCAATGAGAATTCCGTAGCAAC TCCTCCTCCAGAGGAACAAGGGCAAGGTGATGCC  C(SEQ ID NO:2)                         TTGAACCAAGTGTTTTTACATGACAAGTTCTCTGA GGATGGTTCTACAGTTGGGATTTTGGCCATCATC  (SEQ ID NO:3)                          ATGGGGCAGCAGTTAGAGGGTTGTGCTCTTTCTA  GTGTGGGATAGTTTGCAAGATGATATGTTGTAGCC (SEQ ID NO:4)                          TGTGCGGGTTAATACAACAAACTGTCACAAGTGTT TGTTGTCCGGGACGTACATTTTCGCGGTCCTGCTA (SEQ ID NO:5)                         

 

     珠ID     基因染色体 位置                   寡核苷酸探针序列                              43                                                                           Q96MI2_ HUM             UTY             TTTY14  Y9              Y10                                                                                    5Y        组合 的                                          CCAACACCCCAGCTCCGCTGCTGCCGCCACCGCA  GTGCTCTCTAGTCGCCATTGGTTACCTAAACTTTC C                                   (SEQ ID NO:6)                          AGGTGTGAGCCACCATGCCCGGTAAACTTTTAAAA ATGTAAG CAAAATTACAGTATGTAAAACACACATT                                     (SEQ ID NO:7)                          TCATGCAGCCTGCACCAGCGCCGGGTCGGAGAGT                                      CAGAGGCCACCCTGAGATGGACCGAGATCTTCAG  TT                                                                      (SEQ ID NO:8)                                                              TTGGGAGGGGTAATAGTGAAGTGTTTTTCCACTAA ATTACTTTTTTCTAATCAGTGTGAAGTGACACAGG (SEQ ID NO:9)                          TCACACCCACTGCTGGACAGTGTGAGTCAGGGGC  AGCCTGGACTGATGCCATGGCATTTCTGCTTGCTA A(SEQ ID NO:10)                                            63                                                      PHF6_H   UM       GPC3     RNF127   DUSP9    NP_87241 3.1                                                              5X   组合 的                           CTTGAGTTTCTATACTTTTAAGAAGAGCTCTTTGTT CCTGGGGGAGGGGGGCAGGGGGTGAATTTTACT    (SEQ ID NO:11)                          ACAACCTCGGGAACGTTCATTCCCCGCTGAAGCTT  CTCACCAGCATGGCCATCTCGGTGGTGTGCTTCT   (SEQ ID NO:12)                          TCCTTAAAGGACAGACTGAATGGTATTCGACGAGT  CCTGGCCTTCATATCCCGAAACCAAAACTAGTGA   (SEQ ID NO:13)                          CGTGCCTATGGCGGGACCACGCTCGGAGCCTGC    CTCTTCTGCGACTGTTACTTTTTCTTTGCGGGATG  G(SEQ ID NO:14)                         CTGTCTCTCTGCGCTTGGAACACCTTCCCCTGTGT  ACTACTGGCATAAACTTGAGGGAAGAGACATCGT   (SEQ ID NO:15)                         

 

     珠ID     基因染色体 位置                   寡核苷酸探针序列                              56                                                                        CDX4    MAGEH1          ALAS2           IL13RA1 XP_37225 7.1                                                                                    5X        组合 的                                     GTCCGATGCCAGCCTCCAATTTCGCTGCGGCACC  GGCTTTCTCGCACTATATGGGGTATCCTCATATGC (SEQ ID NO:16)                         AAGAGAGTCACAGGTACCCCAAGGAGTAGATGCC  AGGGTCCTAAGTTGAAAATGATGTCGATTGGGGG  C                                   (SEQ ID NO:17)                         GCAATTTCTGTCGCCGTCCTGTACACTTTGAGCTC                                     ATGAGTGAGTGGGAACGTTCCTACTTCGGGAACA                                      (SEQ ID NO:18)                         AGCTTCTTTGCCAAGACCTTTCAAAGCCATTTTAG GCTGTTAGGGGCAGTGGAGGTAGAATGACTCCTT  G                                   (SEQ ID NO:19)                         AGCAACGCCCGTTATTTTCATGTGGTCATTGCTGG GGAATCAAAGGATTCCCCCTTTGAGGGAGGGACT  T                                   (SEQ ID NO:20)                            9          MCL1              1q21.2TTGGAACTAGGGTCATTTGAAAGCTTCAGTCTCGG AACATGACCTTTAGTCTGTGGACTCCATTTAAAA  (SEQ ID NO:21)                              40            CASP3          4q34CCATGGACCACGCAGGAAGGGCCTACAGCCCATT  TCTCCATACGCACTGGTATGTGTGGATGATGCTGC (SEQ ID NO:22)                              62          BAK1                6p21.31CTGGCACAGTGTAATCCAGGGGTGTAGATGGGGG  AACTGTGAATACTTGAACTCTGTTCCCCCACCCTC (SEQ ID NO:23)                                 44            TNF                        6p21.33GGCTTAGGGTCGGAACCCAAGCTTAGAACTTTAA GCAACAAGACCACCACTTCGAAACCTGGGATTCA G                                  (SEQ ID NO:24)                           100     CYC1       8q24.3TACACCATAAAGCGGCACAAGTGGTCAGTCCTGA AGAGTCGGAAGCTGGCATATCGGCCGCCCAAGTG

 

     珠ID     基因染色体 位置                   寡核苷酸探针序列A           (SEQ ID NO:25)    2          BAG1          9p12GATTTCTTCAGGGCTGCTGGGGGCAACTGGCCAT  TTGCCAATTTTCCTACTCTCACACTGGTTCTCAAT (SEQ ID NO:26)                              36            TRAF2          9q34CTGCGGGTAAAGTGTGAGAGCTTGCCATCCAGCT  CACGAAGACAGAGTTATTAAACCATTACAAATCTC (SEQ ID NO:27)                              85            BNIP3                10q26.3AACTGGAGTCTGACTTGGTTCGTTAGTGGATTACT TCTGAGCTTGCAACATAGCTCACTGAAGAGCTGT  (SEQ ID NO:28)                            1        TNFRSF1 A                      12p13.2CGAGCACGGAACAATGGGGCCTTCAGCTGGAGCT  GTGGACTTTTGTACATACACTAAAATTCTGAAGTT (SEQ ID NO:29)                              76                TNFAIP2                  14q13.32GCAGTGCTGAGTCAGGATTTGGGGCCGGCTCTCT  TGGGTCTGTCCCCTTTTCCCAGGTACTGCCTTACA (SEQ ID NO:30)                              29          AKT1                14q33.3TCTTGGTGACTGTCCCACCGGAGCCTCCCCCTCA  GATGATCTCTCCACGGTAGCACTTGACCTTTTCGA (SEQ ID NO:31)                              10        BAX                19q13.3TTTTCCGAGTGGCAGCTGACATGTTTTCTGACGGC AACTTCAACTGGGGCCGGGTTGTCGCCCTTTTCT  (SEQ ID NO:32)                            6            NUP62                  19q13.33TGTACCT TGGGTGGCACTTGT TATGCTATCCTGTG CTAGCCGTTTGTGCCTCGTCTCGCTGTTAGATTG  (SEQ ID NO:33)                        

将胺修饰的寡核苷酸探针与编码Luminex xMap微球或珠偶连以制备多 重寡聚物珠(oligo bead)混合物的规程如下。

1.将-20℃的新鲜等份，干燥的(desiccated)EDC(1-乙基-3[3-二甲基氨基 丙基]盐酸碳化二亚胺盐)粉末(Pierce Biotechnology，Rockford IL)升至 室温。

2.将70mer C-6胺-修饰的寡核苷酸在dH₂O中重悬至100μM(100皮摩 尔/μL)。

3.通过轻微振荡和超声处理约20秒将保存的xMAP微球重悬。

4.将保存的微球中的1,250,000个珠(100μL)转移至1.5ml Seal-Rite微量 离心管(USA Scientific，Ocala FL)中。

5.通过在≥8000xg微离心3-5分钟(足够固体粒形成的时间)，将保存的 微球制粒。

6.去除上清液，并通过超声处理约20秒(时间足够使管中见不到粒或弥 散)，将制粒的微球重悬于50μl 0.1M MES缓冲液，pH4.5中。

7.将100μM胺寡核苷酸1:4(1μL加入3μLdH₂O中)稀释至终浓度为25 μM(25皮摩尔/μL)。

8.加入1.0μL捕获寡聚物(25皮摩尔)，并通过超声处理约20秒来混合。

9.制备溶于dH₂O中的10mg/mL EDC的新鲜溶液(注意:将EDC粉末 返回干燥以再用于第二次EDC加入)。

10.对于每个反应，逐个向微球加入2.5μL新鲜的10mg/mL EDC(25μg 或≈[0.47μg/μL]_终)，并通过超声处理约20秒来混合。

11.于暗处在室温温育30分钟，在15分标记(mark)超声处理(以减少微 球的沉积)。

12.在dH₂O中制备第二份新鲜的10mg/ml EDC溶液(注意:现在应该弃 去EDC粉末的等分。我们推荐使用新鲜的EDC粉末的等分进行每个 偶连事件)。

13.对于每个反应，逐个向微球中加入2.5μL的新鲜10mg/mL EDC，并 通过超声处理约20秒来混合。

14.于暗处在室温温育30分钟，在15分标记超声处理。

15.向偶连的微球中加入1.0mL的0.02％ Tween-20，通过漩涡振荡和超 声处理来混合。

16.通过≥8000xg微离心3-5分钟将偶连的微球制粒。

17.去除上清液，并通过漩涡振荡和超声处理将偶连的微球重悬于1.0 mL的0.1％ SDS缓冲液中。

18.通过≥8000xg微离心6-10分钟将偶连的微球制粒。

19.去除上清液，并通过漩涡振荡和超声处理约20秒钟将偶连的微球重 悬于100μL的10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0中。

假设回收率为100％，得到的寡聚物-偶连的珠浓度为12,500微球/μL。

将标准的正常基因组DNA用作本实验的测试样品，所述DNA由多个同 性别的名义上正常的个体汇集(Promega，Madison WI)。使用男性DNA作为测 试样品，女性DNA作为参比样品。用Invitrogen BioPrime试剂盒和Spectral Genomics试剂标记2μg每种样品，如上面实施例4中所述，只是用生物素核 苷酸取代试剂盒中的青色素核苷酸以获得生物素标记的样品。

在Luminex xMAP珠上进行多重验证实验，样品均为一式两份，根据下 述规程使用96孔微板中的四个孔进行。

1.对于每个样品，向Matrix(Hudson NH)聚丙烯96孔V形底聚丙烯微板 的孔中加入1.0μg生物素标记的人基因组DNA。

2.向V形底板的每个孔中加入10.0μg的Cotl DNA和10.0μg的鲑精 (Invitrogen，Carlsbad CA)以进行杂交。包括没有生物素DNA的阴性 对照孔，但是包含核酸阻断剂(Cot 1 DNA和鲑鱼精子)。这将用来确 定珠空白。

3.在SpeedVac中将板干燥30-120分钟，或直至孔的底部澄清。

4.处理温热的Spectral Genomics Hyb II缓冲液以溶解沉淀，并通过向 1.5mL管中的1/4去离子蒸馏H₂O中加入3/4的缓冲液来稀释。

5.向稀释的Spectral Genomics Hyb II缓冲液中加入适当量的多重寡聚物 珠混合物，使得结果为每孔～300的每种珠编码(足够7.5μL/孔)。通过 上下吸取来混合。

6.使杂交缓冲液中的7.5μL多重寡聚物珠混合物在V形底板的每个孔中 分布以进行杂交。通过上下吸取来混合。

7.用Matrix单条板盖盖住孔，并用Bio-Rad(Hercules CA)板盖将板密封。

8.在96孔热循环仪中，于100℃将板中的样品变性2分钟，然后冷却至 50℃2分钟，盖未加热(with no heated lid)。

9.将板放在PerkinElmer NCS微板温育器中，在50℃和1150rpm摇动下 温育过夜。

10.杂交后，向每个反应中加入100μL的2X SSC，50％甲酰胺(Spectral Genomics Stringency Wash，使用前加热至50℃)，并在PerkinElmer NCS板温育器中，在50℃和1150rpm摇动下将板温育20分钟。

11.用30μL的0.2X SSC浸润Millipore 0.45μm HT过滤板中的所有孔， 用于均匀的真空过滤。

12.将Matrix V形底板中的体积转移至Millipore过滤板中进行洗涤。

13.使用Millipore真空歧管(manifold)轻微施加真空以去除液体，并用纸 巾将过滤板的底部拍干(pat dry)。

14.向每个反应中加入100μL的2X SSC，0.1％Igepal(Spectral Genomics Stringency Wash，使用前加热至50℃)，用铝箔盖住顶部(松散地)，并 在PerkinElmer NCS微板温育器中，在50℃和1150rpm摇动下将板 温育20分钟。

15.使用Millipore真空歧管轻微施加真空以去除液体，并用纸巾将过滤 板的底部拍干。

16.向每个反应中加入100μL的2X SSC(Spectral Genomics Stringency Wash，使用前加热至50℃)，用铝箔盖住顶部(松散地)，并在 PerkinElmer NCS微板温育器中，在50℃和1150rpm摇动下将板温育 10分钟。

17.使用Millipore真空歧管轻微施加真空以去除液体，并用纸巾将过滤 板的底部拍干。

18.向每个反应中加入100μL的1X PBS、0.1％BSA、0.05％ Tween及 4.0μg/mL的 Streptavidin-R-PE(Prozyme Lot PJ13S)，用铝 箔盖住顶部(松散地)，并在PerkinElmer NCS混合器中，在25℃和1050 rpm摇动下将板温育30分钟。

19.使用Millipore真空歧管轻微施加真空以去除液体，并用纸巾将过滤 板的底部拍干。

20.向每个反应中加入100μL的1X PBS、0.01％ Tween 20，并对过滤板 施加真空，拍干。

21.向每个反应中加入100μL的1X PBS、0.01％Tween 20。在PerkinElmer NCS微板温育器中，在1050rpm将过滤板振荡至少1分钟。

22.使用Luminex 200设备读取样品，使用每个珠区域的中值荧光信号， 最小珠计数设定为50。

验证实验的结果示于图12中，其中女性样品信号与男性样品信号的比例 在纵轴，寡核苷酸探针同一性在横轴。取每个样品的一式两份的信号的平均 值。X和Y性别特异性染色体探针产生的信号比例在一致线(unity line)以上或 以下超出1.2，同时所有非性别特异性探针产生的信号比例在一致线之上和之 下小于1.2。

实施例5

通常使用双荧光团实验，在印制的微阵列上进行多重差异基因表达。在 这类实验中，两个RNA样品即参比样品和待测样品，在标记核苷酸存在的情 况下，通过反转录酶酶法转化成cDNA。因此cDNA产物有一部分核苷酸用 荧光标记，由此可对它们进行光学检测。每个样品分别用两种不同的荧光团 标记，通常为青色素3和青色素5，将标记的样品汇集并竞争性地杂交至微 阵列。在荧光扫描设备上检测，微阵列上每个元素上两种染料的比例表示每 个实验RNA序列在相应样品中的相对浓度。

在顺磁Luminex xMAP^TM珠上，根据本技术的一个方面，用单荧光团读 出器(readout)进行这类实验。从Operon(Huntsville AL)获得代表38个基因的 寡核苷酸(“寡聚物”)探针。这些寡聚物探针长70-mer，在5’末端具有胺基。 将每个寡聚物序列固定于xMAP珠集上，其具有特定的xMAP珠ID编码或 区域，使用常用的EDAC偶连化学。代表的38个基因是NRP2、CARD14、 IGFALS、TSSC3、PSEN2、IGFBP4、TP53BP2、GAPD、PRODH、TNFRSF7、 RAB6KIFL、ILF1、BCL2L2、DNASE1L3、PPP1R15A、PIG1l、HSPD1、CDH1、 IGFBP5、IRF1、TNFRSF10C、TNFRSF17、LTA、DFFB、IL16、PTPN13、 IL3、TNFSF18、CCNG1、CCND1、TUCAN、RIPK3、CASP6、IL2、TNFAIP2、 IL24、K-ALPHA-1和TRIP，并带有阴性对照。然后将39种珠类型汇集到一 个多重珠集中，并将来自此集合的等份放于96孔微板的孔中，如下所述进行 基因表达实验。

为了验证本技术，使用单一的参考RNA样品(Universal Human Reference RNA，Stratagene，La Jolla CA)。将单一样品分成两份，因此每个基因的差异实 验的期望结果为1:1的比例。这通常在基因表达平台上进行评价。根据本技 术的一个方面，作为间接标记用生物素标记RNA的一个等份，用荧光素标记 另一等份。然后汇集这两个间接标记的样品，与先前制备的多重珠集混合， 并允许同时进行杂交。

杂交后，将实验珠集分成两等份。将抗生蛋白链菌素-藻红蛋白报告试剂 (对生物素标记的样品具有特异性)加入一个等份中并与该等份一起温育，将抗 -荧光素-藻红蛋白(对荧光素标记的样品具有特异性)加入另一等份中并与该 等份一起温育。在xMAP^TM设备中，藻红蛋白是优选的报告荧光团。然后将 顺磁珠等分通过板磁体推至微板孔壁，通过吸液管取出液体试剂，并将标记 的珠重悬于洗涤缓冲液中。然后在Luminex xMAP 200^TM设备上对两等份珠按 顺序读数。

将得到的信号数据绘制在散点图上，如图11中所示。如果所有数据都处 于同一线(identiy line)的位置，则对应于1:1的比例且相关值R²为1.0。在这 个验证实验中，相关因子是0.96。这个值是对使用2-染料检测的通常印制微 阵列产生的值的改进，其通常产生0.92-0.96的R²值。

其它实施方案在权利要求的范围之内。