银/水、银凝胶和银基组合物及用于制造和使用该组合物的方法

摘要

公开了一种无色的组合物，其包括金属颗粒(比如银纳米颗粒)和水，其中所述颗粒包括金属元素(比如银)内部和金属氧化物(比如一种或多种银氧化物)外部，其中金属纳米颗粒以约5～40ppm的含量存在于水中，该组合物具有显著的抗菌性能。描述了使用该组合物的方法。该组合物能与水凝胶结合而基本不损失其抗菌性能。还公开了具有出乎意料的生物学功效的各种含金属的组合物。

说明书

技术领域

[2]本发明一般涉及新奇的银/水混合物(有时称为分散在水中的银纳米颗粒)，特别涉及新奇的组合物和/或银/水混合物形态、银水凝胶、结合了现代抗生素及结合到银离子上的各种配体的新奇的银组合物、基于特定初始银/水混合物的银凝胶、结合到/包含于特定包合物比如粘土和/或沸石材料中的银离子和/或金属、以及用于制造和使用所述组合物的方法，所述组合物作为试剂抑制有害于人类和/或动物或其他生物健康或保健的各种有机体(包括某些病毒)。此外，此外，本发明在此还公开了除银之外的其他金属，在许多情况下，它们可与银互换使用。本发明还公开了该创造性组合物的各种组合和浓度。

背景技术

[4]众所周知，银的某些制品已显示出杀菌性能。在开发出现代抗生素之前，银被用作杀菌剂和抗生素。在上个世纪，消费者将银颗粒切碎置入他们的饮用水中，或将整个银片浸入饮用水中，从而通过喝水摄入银。用银器皿(即银器)吃饭的习惯可能是源于人们相信银有益于健康的性能。

[5]给药悬浮在溶液中的银会增强个体健康的原因有很多。该溶液可能有助于抑制细菌、病毒、及其他有害有机体的生长，以及杀死存于其中的该类细菌、病毒、和其他有机体。银的组合物还可能具有消炎作用，于是足以减轻某些症状，比如肿瘤、疼痛并发症和哮喘。

发明内容

[6]本发明的第一实施方式描述了使用银/水组合物以治疗人类(或比如某些动物)某些疾病的用途。本发明的一个实施方式包括银组合物，该组合物包含银的纳米颗粒(例如，大多数的银纳米颗粒的直径为10～50nm)，在优选实施方式中，该银组合物可以包含内部的金属银和不同于所述内部银的外壳或外部(比如银离子外壳、一种或多种银氧化物外壳)，(比如不同的组成和/或不同相，等等)其中银颗粒悬浮在水(比如纯水)中。在进一步优选的实施方式中，至少90％的银颗粒的直径为10～50nm。本发明的优选实施方式包括一种含有银颗粒(包括某些包覆有银氧化物的银颗粒)的银组合物，其中超过50％的银颗粒的尺寸小于0.015微米，于是银颗粒呈胶态悬浮(即不析出)在水中。本发明的另一优选实施方式包括类似的银颗粒，其中约95％的银颗粒的直径为10～40nm。在进一步优选的实施方式中，约95％的银颗粒的直径为10～30nm。

[8]本发明的一般目的在于提供以5～40ppm(但有时低于5ppm)存在于水中的银的用途，以杀死或灭活有害于人类和/或动物或其他活生物的微生物(包括某些病毒)。此外，本发明特别提供了含有银纳米颗粒和水的组合物，在优选实施方式中，所述颗粒包括，比如元素银内部和比如一种或多种银氧化物(比如离子态氧化银、银氧化物比如Ag₂O、AgO、Ag₄O₄等)外壳或局部外壳或外层，所述氧化物外壳或外层以各种相态存在(比如，以单斜体和/或四方体存在的Ag₂O)，其中银颗粒以5～40ppm的总浓度悬浮(比如胶态悬浮)在水中。本发明的一个实施方式包括以5～40ppm的浓度存在于水(优选为如下所述的纯水)中的银纳米颗粒(在如下说明书中，应当理解，当根据此处公开的电化学技术处理时，所用术语“银颗粒”等不仅指元素银，而且指其上部分地或基本全部包覆有一种或多种组合物外壳的元素银颗粒，该外壳在其至少一部分上包含有一种或多种银氧化物)，其中超过50％的银颗粒的最大尺寸小于0.015微米。在优选实施方式中，大多数银颗粒的直径是10～40nm。在进一步优选的实施方式中，大多数银颗粒的直径是10～30nm。根据本发明教导的方法制造以及随后根据本发明教导的方法而形成凝胶、粉末、粘土或沸石(如下优选实施方式中所述)的银水组合物(以及从根据本发明制造的银/水混合物中萃取作为基本上离散的颗粒的银颗粒)、以及银/水混合物，例如是非常有效的抗微生物试剂和抗病毒剂(有时也是抗寄生剂)。本发明的目的还在于提供含有5～40ppm银的在水中的银组合物，根据此处公开的使用所述银/水组合物的方法，通过按如下方式使用所述组合物，使其作为抗生素是非常有效的：(1)在活的有机体内部；(2)在活的有机体外部以及在各种硬的且多孔的表面(比如，工作台面、食品制品的表面、食品制备装置、医院各表面、诊疗器械、水管(金属和/或塑料的)、空气过滤装置等)的外部(或内部)；以及(3)将银或银水组合物与污水(比如废水处理、池塘水、污水容器、水管等，优选在所述混合之前已从其中除去大量的固体)混合在一起，从而进行水净化处理。

[9]本发明的一个优选实施方法是提供使用对美国专利No.6,214,299(“专利299”)中所述装置和/或方法进行改进后的装置和方法制造的银水组合物，其中将美国专利No.6,214,299中的具体内容引入本发明作为参考。此外，根据本发明的方法，可以使用其他金属比如铜(和铜合金)、锌、铂、以及钛和上述金属的合金及其混合物的组合物，以形成其他预期的金属/组合物，这些金属/组合物也具有令人惊奇的功效。

[10]我们已对专利299中的装置和工艺进行了改进和提高以提供本发明中的银组合物，随后将对该工艺进行更为详细地说明。实质上，已对如专利299中公开的八个银/一个共用电极装置进行了改进，将其放大以安装一个较大的(比如75～85加仑)水箱。为在75～85加仑的容器中开始制造银/水组合物，需将70～75加仑的纯度相对较高的水(例如过滤水、反渗透水、或不含有任何大量的潜在杂质的水等)加入到容器中，所述水中典型地包含低于2ppm总浓度的溶解固体，或进一步优选包含低于1ppm总浓度的溶解固体。在优选实施方式中，向容器中添加约5加仑的用已知生产方法预先制得的银/水组合物。约5加仑的该“底料”是有帮助的，但不是必需的。该底料实质上提供了足够量的将存在于容器中的导电银颗粒，于是当在相对较短的时间内达到足够的电压/电流时，电流能在各个电极之间传导。该“底料”还导致产生如下所述略小的初始“泰勒锥体(Taylor cones)”。水箱配有进气口(典型地位于水箱的底部附近)，从而在制造水/银液体期间允许气泡流流经水/银液体。已经发现，与专利299中描述的叶轮混合机相比，该方法导致混合量明显地提高，这可以由一定程度提高的效率来证明。

[11]电极装置在如专利299中所述的约10,000V交流电(各组银电极具有独立的电压支持)相同或近似数量级的电压下工作(至少开始时如此)。显著高于10,000V的电压易于产生其内溶有大量银离子的溶液。本组合物包括超过97％的以5～40ppm存在于银/水溶液中的金属银颗粒，银/水溶液中实质上几乎没有游离银离子存在。

[12]根据如下所述的方法确定银的浓度。实际上，基本连续地运行75加仑的银/水制造装置，并用装置中的试样进行分析直到水中的银达到预期的浓度(ppm)。已经发现，在此处所述的操作条件下，10ppm的银/水组合物需要运行一天半，22ppm的银/水组合物需要运行约3天，32ppm的银/水组合物需要运行约6天。当寻求更高浓度的银颗粒时，银/水组合物中形成银颗粒的速率显得较慢。当要求银/水组合物中的银的浓度高于50ppm时，在此处公开的工艺参数内，达到该浓度需要花费相对较长的时间，迄今为止在合理的时间内获得的最高浓度约为50ppm。预期能达到更高的银颗粒浓度。但是，较低浓度的银颗粒抑制各种病原体的效果是突出的，故迄今为止不需要更高浓度的银颗粒。

[13]银/水组合物中的银纳米颗粒都有非常类似的总粒度和形状特性，这在下面的特性部分将进行更详细地说明。与许多传统的“胶体银”组合物不同，这些银/水组合物是完全无色的并对中等强度的光和温度变化是基本稳定的，从而不需要使用任何添加剂以提高稳定性(许多现有技术的胶体银需要和/或使用添加剂)。人们相信以该方式使用组分和工业化生产步骤生产不同于其他被称为“胶体银”产品的银/水组合物，能导致银/水组合物具有更高的功效。随后将对本发明的新奇的银/水组合物的一些突出的物理性能差异(比如粒度、组成、光谱图等)进行更为详细地说明。

[14]本发明的银/水组合物也基本不与额外添加的许多物料反应，这些物料包括，比如单独的或组合的如下物料：(1)过氧化氢；(2)EDTA二钠(乙二胺四乙酸二钠)，其实际上可以作为银/水组合物的增强剂(比如可以使银/水组合物具有更大的功效)；(3)碘(比如聚维酮碘，有时显示出较为温和的反应性)，其可以辅助银/水组合物更病原性地抑制各种病原体，以及(4)各种商品抗生素(其实际上能导致银/水组合物和抗生素之间产生一定的协同效应，从而导致其可潜在地用于新的且非常期望的待实现的组合治疗)。于是，能将各种添加的物料或物质与本发明的新的银/水组合物一起组合使用(比如添加或供给)，从而以协同方式增强任一材料单独可以显示的预期效果。具体地说，组合时，在许多情况下(比如抗生素组合)，产生的组合效果是协同的从而超过单独的物料或物质的个体叠加效应(例如2+2＝6)。当然，一些可允许的添加剂使新的组合物仅适于局部或表面治疗，这是由于它们对生物体(比如人类或动物)具有潜在的内部毒性。可以根据如下许多条件改变所需的添加剂的量，包括：特定的传染(比如病毒、细菌、寄生虫等)或感染、除添加剂之外存在的其他物料的量等。然而，所需添加剂的精确量对本领域的技术人员来说是在常规试验范围之内。此外，银/水混合物的浓度也能影响所需添加剂的量，这对本领域的技术人员来说也是在常规试验范围之内。

[15]优选的添加剂的一个例子是过氧化氢。过氧化氢是已知的杀菌剂。已经发现过氧化氢具有与本发明的新的银/水组合物的协同交互作用。可用浓度为比如30wt％(单位体积重量％或重量百分数)或甚至更高的过氧化氢。虽然可用更高的浓度，但将与本发明的银/水组合物一起使用的过氧化氢的浓度优选为接近于30％或以下，进一步优选为落在约1～5wt％的范围内。

[16]本发明的一个优选实施方式在于提供一种组合物，其包含5～40ppm的银颗粒、1～3wt％的过氧化氢、以及余量的水(比如经过滤的或基本净化的水)。本发明的另一优选实施方式是作为抗菌剂的水中组合物的用途及其使用方法，该组合物包含10～40ppm的银和1～3wt％的过氧化氢。

[17]与本发明的银/水组合物一起较好地起作用的添加剂的另一个例子是乙二胺四乙酸二钠，也称为“EDTA钠”或“EDTA二钠”(两者在文献中有时被提到)，它们具有如下化学式：(CH₂N(CH₂COOH)CH₂COONa)₂2H₂O。在本发明的另一优选实施方式中，向本发明的银/水组合物中添加或供给少量的(比如0.5～10ppm，或进一步优选为0.5～5ppm，或更进一步优选为约0.5ppm)EDTA二钠。在本实施方式中，发现只要添加少量的EDTA二钠就能增强银/水组合物的功效(比如增强杀菌的、消毒的和/或抗菌的性能)。无需用任何特别的理论或说明可知，EDTA二钠可以增加细胞壁渗透性，从而增强本发明的银/水组合物的总体效果。本发明的另一优选实施方式是水中组合物的用途及其使用方法，该组合物包含10～40ppm的银和0.5～10ppm的EDTA二钠，其作为抗菌剂、杀菌剂、抗病毒剂和/或消毒剂。

[18]与本发明的银/水组合物一起较好地起作用的添加剂的另一个例子是聚维酮碘。碘是一种医学中众所周知的预防剂，用于治疗各种病原体。可用各种浓度的商品碘，但通常使用且优选使用的浓度是10％。在本发明的该优选实施方式中，协同组合包括约25～50％体积比的替换用的银/水混合物，用于替代10％的碘溶液。虽然银/水混合物与碘之间可能发生一些反应，但由如下所述的试验结果可知银/水与聚维酮碘的协同组合具有局部杀菌剂(比如一种软膏)和/或预防剂的功能，以抑制割伤、烧伤和/或擦伤中的感染。本发明的另一优选实施方式是水中组合物的用途及其使用方法，该组合物包含10～40ppm的银和聚维酮碘，其作为抗菌剂、杀菌剂、抗病毒剂和/或消毒剂。

[19]本发明的另一优选实施方式是在称为组合治疗的方法中将本发明的银/水组合物与各种商品用抗生素组合使用。组合治疗已引起人们较大的兴趣，这是因为，在过去的二十年中，抗生素抗性已广为存在，因此这一问题已受到全球的关注。由革兰氏阴性菌比如大肠杆菌、克雷伯杆菌、变形杆菌、志贺菌和假单胞菌引起的感染已日益引起人们的关注，这是因为这些有机体已具有对抗生素的多药耐性。最近对引起院内感染的革兰氏阴性临床分离菌的耐药性模式研究结果已表明，大部分分离菌对普通的抗生素比如氨苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、复方新诺明、以及第一代和第二代头孢菌素是耐药性的。此外，这些分离菌中的约70％的是耐环丙沙星的。在本发明的该实施方式中，当银/水混合物(作为液体混入或经干燥后作为固体添加，从而形成比如粉末，此处有时称为“Sildust”)与各种抗生素组合时，银/水混合物显示出协同性，而不仅仅是叠加特性。棋盘分析表明，某些抗生素在与银/水混合物组合时，会导致抗生素具有几倍于单独用银的效果(例如，与用于彼此组合中的两种抗生素(阿米卡霉素和头孢哌酮)的0.625的FIC指数相比，与阿米卡霉素和头孢哌酮组合的银/水混合物显示出约0.1875的FIC指数，此时两种组合物均用于抑制比如MRSA(耐2，6-二甲基苯青霉素金黄葡萄球菌))，随后将进行更为详细地说明。本发明的另一优选实施方式是包含10～40ppm的银和各种抗生素的组合物的用途及其使用方法，该组合物在被称为“组合治疗”的治疗中作为抗菌剂和/或杀菌剂和/或抗病毒剂。能添加到常规抗菌治疗中的根据本发明的银/水混合物的精确量(和浓度)是常规试验中的问题。特别地，用特定的抗菌方法(以及抗病原体的抗生素功效)治疗特定的病将影响所需的银/水混合物的量和浓度。

[20]虽然下面列举了很多使用单独的银/水溶液或与各种添加剂组合的银/水溶液的试验，但此处也表明某些载体能显著地提高由处于各种状态的银/水溶液获得的结果。具体地说，已经发现将含水的银/水组合物制成半固体的水凝胶(下面有时称为“Silgel”或另一说法称为“Silderm”)，或者甚至制成该物料的片状体，显著地增强了它用于某些领域的功效。水凝胶是典型的亲水性凝胶，通过向水溶液—在该情况下为含有本发明的银/水溶液的水溶液中添加某些亲水的有机聚合物制得。然而，可以预料其他的“胶体银”溶液也可以根据此处的方法形成水凝胶，虽然该种水凝胶没有与本发明中的水凝胶相同的效果，但这些水凝胶具有某些预期的用途。因此，本发明也试图包括那些水凝胶的特定方面。水凝胶如预期的那样提高了银在表面比如皮肤表面创口中的保持力。对于伤口护理，水凝胶或片材还具有如下显著的优点，即保护伤口周围的细胞组织从而防止干化，这通常会促使伤口愈合。最显著地，水凝胶基本或完全不抑制本发明的银纳米颗粒的抗菌性。此外，这些水凝胶可作为出色的手或皮肤清洁剂、以及护肤剂(比如，将水凝胶涂在手上，使得即便手与病原体相接触，护肤剂凝胶也能有助于抑制比如因切口或擦伤引起的感染，从而具有预防剂的作用)，从而制造出在健康或保健领域具有较大用途的凝胶。

[21]特别地，在抑制危险细菌的传播及医护环境中抗生素抗性方面，洗手被认为是一个最重要的因素。用于现代医学中的大多数卫生洗手液是乙醇基的，有一些缺陷。在这些缺陷中，首要的缺陷是损害皮肤，这是因重复暴露于乙醇基产品而引起的。还有人报道了在某些情况下的(1)刺激性接触性皮炎以及(2)过敏性接触性皮炎。这降低了许多医护人员对洗手卫生品的依从性。

[22]另一个导致人们不履行有效的洗手卫生习惯的因素是下述事实，即作为液体的洗手卫生品典型地被永久性固定在洗手盆或水池上。这导致医护人员必须从病人的床边走到洗手盆边接着返回到下一个病人处。如果洗手液较易获得，那么能消除该问题，从而确保更好的依从性。如此处所详细论述的，已经证实本发明的水凝胶产品长时间内显著地降低了指示生物中的细菌数，从而导致其成为可替换的洗手卫生品。因此，本发明的水凝胶产品还显示出作为“护肤剂”的重要用途，其以预防方式保护正常的健康皮肤免于各种致病物质。

[23]在本发明的另一优选实施方式中，银基产品可以至少部分地或在某些情况下基本完全地替代本发明中的银/水组合物。具体地说，已经发现乙二胺四乙酸银(或AgEDTA)本身具有非常有吸引力的抗菌特性。特别地，如上所述，EDTA二钠对本发明的银/水组合物来说是有用的添加剂。然而，EDTA(乙底酸)是一种出色的合成螯合剂。EDTA(C₁₀-H₁₆-N₂-O₈)被允许用于人类食品从而经常被添加到软饮料中作为防腐剂。EDTA还被用于对人类的重金属螯合治疗。然而，还没有人考虑过用AgEDTA作为抗菌剂(比如其本身或与其他疗法比如此处公开的那些疗法组合)使用。大规模市场应用领域比如肉或蛋白质生产及加工工业、肥皂工业、清洁剂工业(比如个人和家用护理产品)、农业或农牧业和保健业较非常适合使用粉末状稳定的银，该银具有许多非常有利于健康或保健的优点(比如治疗和预防)。特别地，AgEDTA较易获得并且相对较易制造、保藏和运送。本发明的该实施方式发现了AgEDTA的新用途，即，使用AgEDTA粉末用于人类、植物和/或动物的健康或保健和/或动物和人类中的某些机能障碍的治疗(比如能够用作治疗剂和/或用作预防剂)。Akzo-Nobel目前制造出一种可接受的AgEDTA。其它的银螯合剂或络合剂比如，例如EDDS银、姜黄色素银、黄连素银、和四环素银也显示出抗菌性，并且使用这些材料用于人类或动物的健康和保健在现有技术中也是新的且未被发现的。可以使用各种其他的有机结构来将银和/或银离子携带和/或传递到各个有效的位置上或生物结构上。同样地，所需的AgEDTA的量将根据围绕需要(比如治疗要求和/或预防)的特定的生物学问题而改变。

[24]在本发明的另一优选实施方式中，添加的银基无机产品可以至少部分地或在某些情况下基本完全地替代本发明中的银/水组合物。具体地说，可以可控地将银(比如银离子、金属银、Ag⁺)附于或固定在比如粘土层上或之间和/或沸石中的笼内。通过控制比如硅酸盐层的电荷、沸石笼的电荷、以及层间距离或沸石笼的尺寸可以发生该固定过程。就这点来说，银可以被紧密地或相对松散地连接或键合，这取决于特定的健康或保健应用以及银与生物制剂之间交互作用的点(例如在生物制品的表面上、或在内部、或与内部的结合处等)。因此，获得的产品可以包括全液体产品和可饮用或可喷涂的产品、以及胶状的或糊状的并且可如凝胶或浆料那样喷洒在表面上的产品。

[25]此处论述的任何一种金属可以被保持在晶态或非晶态的氧分子或含氧分子的一个或多个原子层的包合物内。已经证实某些金属/包合物结构具有出乎意料的功效。此外，除将银结合到氧化物层(比如粘土)结构和网状(比如沸石)硅酸盐结构内之外，还可以使用磷酸盐和氧化物比如水滑石。更进一步说，能用于本发明中的优选的粘土或云母族(能具有不同的表面电荷和/或不同的层间距离)包括，例如伊利石、蒙脱石、绿泥石、以及蛭石。

[26]由于如下几个原因，进一步优选粘土或云母、以及沸石作为金属离子载体，这些原因包括：许多是自然产生或较易衍生的材料，颗粒能保持在预期的胶体粒度范围内，例如使其能悬浮在液体(比如水)中，并且是非常典型的生物友好(比如，几乎没有副作用)材料。就这点来说，一旦将银置于比如粘土或沸石包合物内，接着就将分子加热到适当温度(比如100～200℃)以将银固定到包合物上或其内。可以在从流动性很高到粘度很高的较宽粘度范围内制备所有的这些材料。

[27]通常，当元素阳离子被各种阴离子配位时，具有任何给定价态的元素比如阳离子的电子能级可以被改变。特别地，键的共价性越多，能级变化得越多。当银被不同数目的氧化物离子围绕(或配位)时，银的电子结构很可能发生较小到适中的变化。阳离子比如银的阳离子的电子结构的该种变化也应发生在各种银氧化物结构中的任一个上。更进一步地说，存在更为普通的方法，其中银能被置于氧的包合物或笼内。就这点来说，通过比如用银阳离子交换结构中的钠阳离子，钠离子能够进入可交换的腔或空间内(比如，在粘土片层上或之间或在沸石的网格内)。通常，将一种材料的交换阳离子的能力称为它的“CEC”或“阳离子交换能力”。用于CEC的单位典型地为“meq/100克”或每100克的毫当量。通常，CEC数值越高，材料接受阳离子(比如银阳离子)的能力就越高。因此，许多氧配位的银化合物能作为银(或其他金属)的载体，从而可由其本身或与其他治疗剂组合作为治疗剂。

[28]更进一步地说，通过扩散和干燥被结合到硅胶内的银金属或银离子也是传递本发明中的金属的优选机制。

[29]在本发明的另一优选实施方式中，可以组合使用上述颗粒、有机的和/或无机的结构从而对人类和动物的健康和保健产生积极的影响。具体地说，根据本发明，可以单独使用如上所述的金属颗粒。可以进一步将金属颗粒与比如如上所述的有机化合物(比如AgEDTA)组合。更进一步，可以将根据本发明的金属离子与无机化合物(例如粘土或沸石)中的任何一种组合。更进一步，可以将本发明的的金属离子与任何有机分子(比如AgEDTA)和无机分子(比如粘土或沸石)组合。可以构造银金属或银离子传递体系的组合，使得比如任何上述银传递体系的内部消耗能将银传递到比如有机体中的不同部分。特别是，例如，对人类来说，某些银可以通过口、经由消化道、以及经由大肠和/或小肠等被吸收。此外，取决于例如粘土或沸石相对于水(以及此处公开的各种凝胶化合物)的含量，本发明中的所得产品可以从高流动性(低粘度)到很粘(高粘度)。就这点来说，一般相对于水(以及胶凝剂)提供的粘土或沸石越多，最终产品越粘。

[31]提供下述说明使本领域的所有技术人员均能使用本发明，并列举出实施本发明的发明人所预期的最佳方式。虽然此处已限定了本发明的一般原则，具体到提供一种改进的银/水组合物(此处有时指分散在水中的银纳米颗粒)，但对本领域技术人员来说仍较易进行各种改进，此处的银/水组合物本身可以单独使用或与其他公开的材料组合使用(比如，混合或基本连续地供给)并能形成各种水凝胶或浆料组合物，所有这些组合物都显示出能杀死人类和/或动物体内和体外的病原体。

[32]一般来说，本发明提供表一种新颖的方法，其中通过使用以5～40ppm的浓度存在于水中的银纳米颗粒、或包含在比如AgEDTA中的活性银颗粒、和/或此处论述的其他化合物来杀死或灭活有害于人类和/或动物的微生物。根据应用、和/或存在的添加剂，可以在体内或体外使用银/水组合物。根据应用，银/水组合物还可以包含各种优选的添加剂，这些添加剂中的许多种类在此没有具体列举，但对本领域的技术人员来说是显而易见的。

附图说明

[34]图1～6所示为根据本发明形成的银/水组合物中形成的银颗粒在各种放大倍数下的TEM显微图。

[35]图7a～7d所示为由不同的TEM中产生并使用不同于用于产生图1～6的技术的TEM显微图；图7e所示为取自本发明的银/水组合物的银颗粒的EDS(EDAX)谱图。

[36]图8所示为取自本发明的银/水组合物的银颗粒的电子衍射图。

[37]图9包括三个SEM显微图，共同显示电子束可能破坏取自本发明的银/水组合物的银颗粒。

[38]图10所示为新的银电极在用于根据本发明工艺之前的SEM显微图。

[39]图11、12和13分别所示为如图10中所示的部分1、2和3的EDS元素分析图。

[40]图14所示为用于制造根据本发明的银/水组合物的电极尖端的SEM显微图。

[41]图15和16分别所示为如图14中所示的部分1和2的EDS元素分析图。

[42]图17所示为被用的银电极尖端在约3500X处的SEM显微图。

[43]图18a和18b是取自GNC Liquid Silver Dietary Supplement的银颗粒(25ppm)的TEM显微图。

[44]图19a和19b是取自被称为“Silverado”的胶体银制品的银颗粒的TEM显微图。

[45]图20a和20b是取自被称为Vitamin World Bioorganic Advanced Colloidal Minerals的银颗粒(3ppm)的TEM显微图。

[46]图21所示为银颗粒的5个TEM显微图的覆盖图对比，其中2个对应于取自本发明的银颗粒，另外3个对应于取自商品胶体银的银颗粒。

[47]图22a和22b所示为7个不同的拉曼光谱，其中3个对应于本发明中的银/水组合物、一个对应于纯水、一个对应于去离子水，并且两个对应于商品胶体银制品。

[48]图23a所示为两个对应于本发明的银/水组合物的拉曼光谱；图23b所示为三个对应于3种商品胶体银制品的拉曼光谱。

[49]图23c所示为对应于本发明的银/水组合物的另一拉曼光谱。

[50]图24a所示为本发明的银/水组合物的拉曼光谱；图24b所示为分别对应于银/水、锌/水、和铜/水组合物的三个拉曼光谱。

[51]图25所示为在细菌协同性纸片扩散试验中可能的交互作用图。

[52]图26所示为组合治疗中描述加合性、协同和拮抗效应的棋盘式滴定图及其图。

[53]图27所示为MDR分离菌对10ppm的银/水混合物的敏感性图像。

[54]图28所示为用于MRSA的抗生素组合物的图像。

[55]图29所示为用于大肠杆菌(E.coli)的抗生素组合物的图像。

[56]图30所示为用于假单胞菌(Pseudomonas)的抗生素组合物的图像。[57]图31所示为在银/水组合物形成工艺期间“瞬时”外加电压、以及瞬时银浓度与处理时间之间的函数关系图。

[58]图32所示为分别使用原子吸收光谱和电导率测量技术的瞬时银浓度与处理时间的函数关系图。该图还表示制备32小时后、以及均质化后的银浓度。

[59]图33所示为在本发明的银/水组合物形成工艺期间瞬时外加电压、功率系数和瞬时银浓度与处理时间之间的函数关系图。

[60]图34是表示SILDERM的水分损失情况图。

[61]图35是表示SILDERM的水分吸收情况图。

[62]图36所示为银螯合物(由Akzo-Nobel制造的AgEDTA)抑制绿脓杆菌的抗菌活性图像。

[63]图37所示为银螯合物(Alpha Chemicals制造的AgEDTA)抑制绿脓杆菌(MDR)的抗菌活性图像。

[64]图38所示为SILDUST抑制大肠杆菌(MDR)的敏感性图像。

[65]图39所示为SILDUST的抗病毒活性与暴露时间的函数关系图。

[66]图40是测试平板中心的图像，显示了噬菌斑的生长。

[67]图41是测试平板的图像，该图显示三小时后没有噬菌斑，从而显示了SILDUST的抗噬菌体生物活性。

[68]图42所示为本发明的200ppm的银/水组合物的4个X射线衍射图、以及叠加其上的四个参比X射线衍射图(比如AgO、Ag₂CO₃、Ag和Ag₂O)。

[69]图43所示为Ag₄O₄的“TGA”分析图、以及Ag₄O₄的“DTA”分析图。

[70]图44a和44b是对应于根据本发明制造的高岭石/银混合物的SEM显微图。

[71]图45a和45b分别是对应于44a和44b所示显微图的EDS(EDAX)分析图。

[72]图46是根据本发明制造的新颖的沸石/银混合物的SEM显微图。

[73]图47是其内含有替代的银并根据本发明制造的沸石Linde 4A的EDS(EDAX)分析图。

[74]图48a所示为10ppm的银/水溶液和32ppm的银/水溶液在190nm～400nm波长范围内的紫外-可见(UV-Vis)光谱；图48b所示为同一试样在190nm～250nm范围内的UV-Vis光谱。

具体实施方式

[76]非限定性优选实施方式如下所述：

[77]一种组合物，包含胶态悬浮在水中的银纳米颗粒，其中银的总含量为5～40ppm，该组合物杀死或灭活有害于人类和/或动物的微生物。

[78]一种组合物，包含胶态悬浮在水中的银纳米颗粒，其中银的总含量约为10±2ppm，该组合物杀死或灭活有害于人类和/或动物的微生物。

[79]一种组合物，包含胶态悬浮在水中的银纳米颗粒，其中银的总含量约为22±2ppm，该组合物杀死或灭活有害于人类和/或动物的微生物。

[80]一种组合物，包含胶态悬浮在水中的银纳米颗粒，其中银的总含量约为32±3ppm，该组合物杀死或灭活有害于人类和/或动物的微生物。

[81]一种由包含胶态悬浮在水中的银纳米颗粒的前体银/水组合物制得的水凝胶组合物，其中前体材料中的银的总含量优选为约32±3ppm(但可以或多或少)，该水凝胶组合物杀死或灭活有害于人体的微生物，从而能用作比如皮肤清洁剂、创口愈合剂和/或护肤剂或皮肤杀菌剂。

[82]应当理解，指定银/水组合物中银纳米颗粒的总量并不是完全地指定材料。由于制备的构成组合物的纳米颗粒较小，故给定浓度的银将代表较大量的颗粒。此外，给定浓度的银的总表面积将增加。因此，颗粒度和颗粒度的范围是用于确定本发明的银/水组合物的效果的重要参数。此外，在所述银颗粒上的外壳比如氧化物外壳(例如部分的或基本完全的)也可以影响本发明中的银/水组合物的效果，该外壳固有地由本发明的工艺条件产生。然而，通过其他工艺获得的银颗粒(以及除了银之外的金属，比如锌、铜、铜合金、钛、铂、以及上述金属的合金或混合物)上的类似外壳也应在本发明的范围之内。因此，只要参照此处的银、使用此处论述的各种其他的可选金属，那么应认为这些金属也可能显示出效果，这取决于特定的生物条件(例如涉及的特定的病原体)。

[83]另一类实施方式是上述组合物中的任何一种，其中超过50％的银纳米颗粒的最大尺寸小于0.015微米。

[84]另一类实施方式是上述组合物中的任何一种，其中超过75％的银纳米颗粒的最大尺寸小于0.015微米。

[85]另一类实施方式是上述组合物中的任何一种，其中超过90％的银纳米颗粒的最大尺寸小于0.02微米。[86]另一类实施方式是上述组合物中的任何一种，其中超过75％的银纳米颗粒的最小尺寸大于0.005微米。

[87]另一类实施方式是上述组合物中的任何一种，其中超过90％的银纳米颗粒的最小尺寸大于0.005微米并小于0.040微米。

[88]另一类实施方式是上述组合物中的任何一种，其中银纳米颗粒包括零价的银，即在其核心或中心部分中处于金属态、氧化态的银(Ag(0))、和至少一层选自于Ag(I)、Ag(II)、和Ag(III)的离子氧化态银外壳，其中AgO、Ag₂O、和/或Ag₄O₄外壳最可能存在于金属银核中的至少一部分(或基本全部)上。

[89]另一类实施方式是上述组合物中的任何一种，其中银颗粒包括零价的银即金属态、氧化态的银(Ag(0))，和具有化学计量的AgO或Ag₂O或另一种已知化学计量的银氧化物外壳，该银颗粒在用于制备本发明的新颖Ag₂O-银/水组合物的工艺条件下是稳定的。

[90]进一步的实验证据表明，固有地存在于本发明的颗粒中的至少一部分上的银氧化物外壳至少部分地以比如Ag₄O₄的形式—即银II氧化物存在。在该材料的分子中，银原子中的两个可以为1⁺态(银I)，另两个银分子可以为3⁺态(银III)。此外，在一定条件下，银可以以2⁺态存在(银II)，从而产生至少部分的比如Ag₂O的外壳。这些外壳固有地由本发明的工艺条件(例如在电极/水界面处及其周围产生的那些条件)产生，并对本发明中的银/水组合物的总体效果产生非常重要的影响。迄今为止，还难以确定外壳的具体组成，但实验细节已在随后的表征部分被提供。

[91]另一类实施方式是上述银/水实施方式中的任一种与过氧化氢的组合，该过氧化氢以1～3重量％存在于最终产品中。

[92]另一类实施方式是上述银/水实施方式中的任一种与EDTA二钠的组合，该EDTA二钠以0.5～10ppm的量存在于最终产品中。

[93]另一类实施方式是上述银/水实施方式中的任一种与约50～75％(v/v)的10％替代用聚维酮碘的组合，该替代物替代了最终产品中约25～50％的银/水混合物。

[94]另一类实施方式是将上述银/水实施方式中的任一种与各种商品抗生素(无论是液态或粉末形式)组合，从而产生协同有效的组合治疗。

[95]另一类实施方式是使用上述所有的组合物按如下方式来抑制人类或动物病原体的方法：(1)体内、(2)体外或(3)体内与体外。

[96]另一类实施方式包括使用AgEDTA用于人类和/或动物的健康或保健。

[97]另一类实施方式包括其他的银试剂比如AgEDDS、姜黄色素银、黄连素银、以及四环素银的用途。

[98]另一类实施方式包括其他金属比如锌、铜、铜合金、钛、铂和上述金属的合金或混合物的用途，它们可与此处公开的制备方法和工艺应用方法中的银相替换。为简要起见，此处主要指银，但应当理解，此处公开的其他金属同样是有益的。

[99]在本发明的另一优选实施方式中，添加的银基无机产品可以至少部分地或在某些情况中基本完全地替代本发明中的银/水组合物。具体地说，可以可控地将银(比如银离子Ag+、银金属)附于或固定在粘土层之间和/或沸石中的笼内。通过控制比如硅酸盐层的电荷、沸石笼的电荷、以及层间距离或沸石笼的尺寸可以进行固定。就这点来说，银可以被紧密地或相对松散地连接或键合，这取决于特定的健康或保健应用以及银与生物制品之间的交互作用点(例如在生物的表面上、或在内部、或内部的组合等)。因此，获得的产品可以包括全液体和可饮用或可喷涂的产品；以及胶状的或糊状的可如凝胶或浆料那样在表面上喷洒的产品。此处所述的任何一种金属可以保持在晶态或非晶态的氧分子或含氧分子的一个或多个原子层的包合物内。已经证实某些金属/包合物结构具有出乎意料的功效。此外，除将银结合到氧化物层(比如粘土)和网状(比如沸石)硅酸盐结构内或结构上之外，还可以使用磷酸盐和氧化物比如水滑石。更进一步说，能用于本发明中的优选的粘土或云母族(能具有不同的表面电荷和/或不同的层间距离)包括，例如伊利石、蒙脱石、绿泥石、以及蛭石。

[100]由于如下几个原因，进一步优选粘土或云母、以及沸石作为金属离子载体，这些原因包括：许多是自然产生或较易衍生的，颗粒能保持在预期的胶体粒度范围，例如使其悬浮在液体(比如水)中，并且颗粒是非常典型的生物友好材料(比如，几乎没有副作用)。就这点来说，一旦将银置于比如粘土或沸石内或其上，接着就将分子加热到适当温度(比如100～200℃)以将银固定到包合物上或其内。可以在从流动性很高到很粘的较宽粘度范围内制备所有这些材料。

[101]更进一步地说，通过扩散和干燥被结合到硅胶内的银金属或银离子也是传递本发明中的金属离子的优选机制。

[102]在本发明的另一优选实施方式中，可以组合使用上述颗粒、有机的和/或无机的结构从而对人类和动物的健康和保健产生积极的影响。具体地说，根据本发明，可以单独使用如上所述的金属颗粒。可以进一步将金属颗粒与如上所述的有机化合物(例如AgEDTA)进行组合。更进一步，可以将根据本发明的金属离子与无机化合物(例如粘土或沸石)中的任何一种组合。更进一步，可以将本发明的的金属离子与有机分子(比如AgEDTA)和无机分子(比如粘土或沸石)组合。可以构造银金属或银离子传递体系的组合，使得比如上述任何一种银传递体系中的体内消耗能导致银被传递到比如有机体中的不同部分。特别是，例如，对人类来说，某些银可以通过口、经由消化道、以及经由大肠和/或小肠等被吸收。此外，取决于例如粘土或沸石相对于水(以及此处公开的各种凝胶化合物)的含量，所得产品可以从高流动性(低粘度)到很粘稠(高粘度)。就这点来说，一般相对于水(以及胶凝剂)提供的粘土或沸石越多，最终产品越粘。

实施例

[104]组合物的形成

[105]根据美国专利No.6,214,299中阐明的工序制备银/水组合物，其具体内容被引入本发明作为参考。

[106]用于制造根据本发明的包含银的组合物的优选方法使用包含电极的电化学电池，并包括如下步骤：

[107](a)设置至少两个与一定量的高纯水接触的银电极；

[108](b)通过银电极输送电流，从而将银颗粒从所述银电极中分离，该方法足以导致在水内产生悬浮的银颗粒；以及

[109](c)在制备所述的悬浮银颗粒期间，搅拌水从而使银颗粒以更为均一的浓度分散在所述水内，于是每批均能制造出大量且基本均匀分布的悬浮银颗粒。

[110]用于制造包含银/水组合物的组合物的另一优选方法使用电化学电池，并包括如下步骤：

[111](a)建立一个电路，该电路包括电源、电连接到所述电源上的第一导体和电连接到所述电源上的第二导体，其中所述第一导体设置成空间上与所述第二导体分隔，导体中的至少一个由元素银制成，或可选地由锌、铜、铜合金、钛、铂和上述金属的合金或其混合物制成；

[112](b)通过将第一导体和第二导体设置成与液体电阻相联来闭合电路；

[113](c)开启电源以同时向第一导体和第二导体提供交流电，使得第一导体和第二导体内的电压交替增加和减小，从而导致银(或其他金属)颗粒从第一电极中分离并进入液体电阻从而悬浮分布在所述液体电阻内；以及

[114](d)通过将电极向液体电阻方向移动来选择性地调节电极以补偿因银颗粒从电极中逐渐分离所导致的电极长度的降低，从而防止在电极与所述液体电阻之间产生电弧，并在电极的尖端保持预期的电流密度。

[115]制造银/水组合物的各个水箱或水槽具有由8个变压器(可用于本发明的变压器是Franceformer，Part No.48765)组成的电源，该变压器额定的输入为120VAC，在30毫安处的最大输出为10,500VAC。优选各个变压器配有45微法的电容器(比如Aerovox，Part No.M24P3745MP2)，该电容器用穿过变压器的输入导线平行绕制。

[116]变压器与电容器的组合在某些情况下是有益的，在其他情况下是优选的。特别地，变压器有助于使交流电源(AC电源)的电压和电流正弦波位相发生变化。电压和电流位相差的程度被称为功率因子。功率因子越接近于1.0，电压和电流之间的相位越匹配，传递到电极上的功率越大(比如，功率典型地由电压电流的乘积确定)。

[117]每个槽都备有透明盖板，该盖板由比如适合的聚合物制成，并被构造成可安装8个电极组。各个电极组包括由比如18gauge的银片制成的固定电极，该固定电极两侧为两个由比如18gauge的银线制成的自耗电极(0.9999的纯度)。优选电极在中间部分被弯曲一半，并且其端部双螺旋地扭曲在一起以获得预期电压和功率密度组合。每个电极组由一个变压器供电。

[118]当各个水槽被加满用于制备时，调整电极使得固定电极与水良好接触(比如至少1/3～1/2的片材被浸没)，自耗电极则位于水面之上。

当电源被开启时，水会上升从而在各个自耗电极周围形成锥形结构。该锥形结构在文献中被称为“泰勒锥体(Taylor cone)”。起初，水非常纯，从而具有较高的电阻。于是，当使用比如固定电流、10,000V的变压器时，电极上的外加电压起初非常高，比如约6500～8500V，自耗电极可高于水面5～10mm，从而在自耗电极处获得预期电压和预期电流密度。由于水的电导率相对于电极的高电导率较低，故这导致产生相对较大的泰勒锥体(比如产生较大的电场)。当在空气-水-银电极界面处将银颗粒从自耗电极中除去时，银纳米颗粒产物被形成。由于水中具有越来越多的银颗粒，故水/银混合物的电阻下降。在固定电流或电流限定方案中，外加电压将随时间下降或减小(例如，见图31)。于是，自耗电极典型地降低到更接近于水面，例如，也许仅高于水面1～2mm。简单地说，泰勒锥体将更小，这是因为电极与水之间的电导率具有更小的差值(即存在更小的电场)。通常，在制备期间应适当地调整自耗电极和/或水位以保持初始几何形状。即使泰勒锥体在制备期间变小(从而代表例如金属颗粒进入溶液)，但在制备结束时仍存在较小的泰勒锥体。在整个制备期间，用空气搅拌各个水槽中的水以保持均一性。

[119]一旦银/水溶液中的银达到了预期的或指定的ppm，那么可以接着抽取产物，视预期或需要使其经过1微米的过滤器进入几个非常大的比如2,300～6,500加仑容积的储料槽中的一个内，并在装瓶发送之前进行分析。通过使用热硝酸的溶解工艺进行分析，并使用Perkin-Elmer Analyst 300原子吸收光谱仪进行分析。其后，可以将制得的银/水组合物与其他成分混合以制备水凝胶、片材，或可以同时灌装入瓶、或可以如下所述地将其与其他添加剂混合(比如，作为液体或经烘干并作为粉末添加)。

[120]再次参照图31可知，实时电压降和银浓度的数据对于时间的函数对应于形成本发明的银/水组合物的试验。显而易见，随试验的进行，电压随银浓度的增加而减小。还注意到各个自耗电极上泰勒锥体的尺寸相应地减小。由于取样和混合问题，不应认为该图中的银浓度数据是定量的，但其是有代表性的(比如在任一取样时刻，银/水混合物不是完全均匀的)。

[121]现在参照图32，其显示的是用于相同试验的银浓度以及几个添加的浓度数据点的两条曲线。带有方块的灰线表示基于60ml试样的瞬时银浓度(由原子吸收光谱确定)，该试样通过吸管由水槽的近似中间深度处及槽中心和槽壁之间约一半处获得。带有菱形的黑线表示由校准器粗略估计的瞬时银浓度，该校准器先前用于测定上述液体中的60ml等分液体的电阻率。为获得原始电阻率数据，水起初(即时间为0)具有约175千欧厘米的电阻率。与此相比，在试验中的31个小时的标记处，水/银混合物具有约62.7千欧厘米的电阻率。

[122]紧接着低于32个小时标记处的浓度/电阻率的数据点是用“方块”表示的单个数据点。该数据点表示由原子吸收光谱测定的银浓度，其在切断高电压但用鼓泡器/混合器再持续搅动另一个20小时以使混合物均一化后进行测定。

[123]由图32中可得出一个结论，即当银形成时，尽管在试验期间使用了鼓泡器/混合器，但银起初并没有均匀地分布在槽中。确切的说，在将银全部添加到槽中后，在鼓泡器/混合器发挥作用使银均匀地分散在水中之前，存在一定的滞后。

[124]图33是另一个在银/水制备试验期间瞬时电压和银浓度作为时间函数的图。该图还显示了电源变压器的瞬时“功率因子”。于是，功率系数初始为约0.8，约6小时后增加到约0.97的最大值，约30小时后降低到约0.6的较低值。此外，电压/时间数据数学上符合等式y＝-2.1333Ln(X)+8.7057，其中Y对应于电压，X对应于时间。水中银的ppm由“方块”表示，其开始为约1ppm，约30小时后达到约11ppm的最大值(比如，由于过滤后水不是完全纯的)。

[125]物理特性

[126]可以用(乙炔)火焰原子吸收光谱法(FAAS)、电感耦合等离子体法(ICP)、原子发射光谱法(AES)或本领域技术人员熟知的在合适的浓度范围内对银敏感的其他技术，对本发明的银组合物中银含量进行分析。如果银组合物的颗粒较小且粒度均匀(比如0.01微米或以下)，那么通过直接用原子吸收光谱法或ICP/AES分析胶体可以获得相当精确的分析结果。这是因为用于原子吸收光谱的样品制品实质上使所有银离子化，使其易于检测。

[127]如果组合物包含的颗粒高达0.2微米，那么优选使用溶解工艺。该溶解工艺不一定适用于在制造或贮藏阶段与卤化物或其他阴离子接触的银组合物，所述卤化物或其他阴离子可以与细分散的银反应，或与蛋白质或其他胶状物料结合。溶解工艺的一个实施方式如下所述：

[128]1.取10ml等分的充分混合或摇动的待分析银组合物，接着将它放入干净的带有密封盖的聚碳酸酯瓶子或其他适宜材料的容器中(一般为瓶子)。优选其尺寸为30～100ml。

[129]2.用微吸管或滴管，向瓶中的银组合物中添加0.1ml试剂级的硝酸。

[130]3.在瓶盖紧密适配的前提下，将银组合物加热到至少约80℃，优选为约90～100℃，此时轻微搅动一段时间以充分溶解银—溶解实质上是瞬时的。

[131]4.用适配的瓶盖将获得的混合物冷却至室温。充分摇动瓶子。该溶解工艺还溶解存在于银颗粒上的任何银氧化物表层。

[132]5.用原子吸收光谱法、ICP/AES、或等效的方法分析银混合物中的银含量。优选使用新的制备标准或标准，优选根据设备厂商的指令，视需要用适当的稀释液来制备。

[133]6.在报道结果时，必须考虑制备期间所有的稀释，包括因添加硝酸导致的1％的稀释。

[134]用Perkin Elmer AAnalyst 300原子吸收(AA)光谱仪确定对应于图31、32、33等中数据的本发明银/水组合物中的银浓度。根据如上所述的工艺溶解本发明的银/水组合物试样。

[135]原理

[136]Perkin Elmer AAnalyst 300系统包括具有Universal GemTip雾化器的高效率的燃烧器系统和原子吸收光谱仪。燃烧器系统提供所需的热能以使化合物分解，于是形成游离的分析原子从而使原子吸收发生。光谱仪使用作为基本光源的中空阴极灯、单色仪和探测器测定在特定波长处被吸收的光量。氘弧灯校正原子云中非原子类产生的背景吸光度。

[137]银及银/水组合物的物理/化学形态分析

[138]A.引言

[139]为确定组合物中银的存在形式，用飞行时间二次离子质谱(TOF-SIMS)对在水中名义上含有22ppm银的组合物试样进行分析。结果发现大部分的银以银(0)(即金属银)存在，并且存在一般为组合物比如银(II)的氧化物(AgO)的表面覆层。如上所述的银(II)的氧化物通常银(I)和银(III)的化学计量组合。

[140]B.实验步骤

[141]在室温下蒸发几滴22ppm的本发明的银组合物以干燥硅基片。用TOF-SIMS分析残留物，并将其作为试样。通过将由供应商处获得的一些参比粉末颗粒放置于硅基片上，来对参比银(II)氧化物(AgO)材料进行分析，并将其作为参比材料。

[142]飞行时间二次离子质谱技术(TOF-SIMS)基于该原理，即用精密聚焦的初级离子束脉冲轰击固体试样，接着用飞行时间质谱仪对试样表面中产生的二次离子进行分析。该分析技术是表面敏感性分析，其信息来源于延伸到表面以下约20～40A(1A＝1×10^-4微米)的层。TOF-SIMS技术通常用作检验工具以鉴定未知样品的组成。如果可用合适的微量分析标准进行校准，那么它能够进行定量分析。采用标准的高质量分辨率进行该分析。

[143]C.结果

[144]分别获得Ag(II)O参比材料和制品试样中的负离子质量。两个光谱中的质谱区表明存在一种以上的银氧化物，该银氧化物很可能作为银颗粒上的至少部分覆层存在。该数据表明银(II)是存在于试样颗粒表面上的银的平均氧化态。与制品试样相比，参比试样中的银氧化物(比如AgO)信号显示出明显更高的强度，这可能是因为金属银在试样中占主导地位。接下来将说明，随试样中平均粒度降低，银与银氧化物的比值因将有更多的银氧化物存在也将降低。

[145]尺寸/形态/成分分析

[146]此处描述的银/水制品的异常效果可能是由于颗粒的表面性质/内部性质(比如氧化物/金属)和/或银纳米颗粒的粒度分布和/或银纳米颗粒的形态之间的关系。平均粒度越小，表面积越大，特别的表面化学的贡献越大。然而，如果颗粒过小，那么可能会失去稳定性和/或其他的交互作用，从而对产品产生负面影响。本发明的银/水组合物是出色的，这是因为它们在基本上没有表面活化剂等的纯水中是稳定的(比如许多现有技术的“胶体”银需要蛋白质以保持银颗粒悬浮)。此外，银/水组合物基本上是无色的，而其他的胶体银制品(特别是具有较大粒度的制品)通常显示出一定颜色。这些性能是上述讨论的制造条件的结果。

[147]组合物的数据分析表明其平均粒径为0.0106微米，粒径范围为0.005微米～0.0851微米。然而，粒径分布分析表明超过95％的颗粒其直径为约0.005微米～约0.015微米。

[148]用扫描电镜(SEM)、能谱仪(EDAX)和透射电镜(TEM)进一步对颗粒进行分析。特别地，银/水组合物被干燥并被放置在EM栅格上，接着用SEM(即扫描电子显微镜)和两种不同的TEMs(即透射电子显微镜)检测。这些分析工具可以确定在10～30nm内的粒度分布。然而，在一些产生的显微图中，需要对粒度作些估计，这是因为颗粒在干燥中易于团聚在一起或成块。经干燥的团块的粒度在50～100nm之间。图1～6所示为本发明的银/水组合物中经干燥的银颗粒的各种TEM显微图。图7a～7d所示为根据本发明制造的银颗粒的各种TEM显微图，其中这些显微图由不同的技术产生。特别地，将本发明的银/水组合物放在C膜上，接着在约-100℃的温度下，用低温TEM(即与用于产生图1～6的TEM不同的TEM)检测。于是，本发明的银/水组合物基本上被瞬时冰冻。低温TEM在约-100℃及约100kV的功率下工作，所产生的显微图如图7a、7b、和7c所示。图7a～7c清楚表明其平均粒度低于20nm。此外，图7d所示为在“SAD”模式中的TEM分析。通常，这些TEM显微图(图7a～7c)显示未团聚的银颗粒的最大粒度为15nm或以下，其中一些较小的颗粒为3.5～5nm。图7d中的衍射分析显示颗粒主要是金属银，它们是孪生倍增的，且基本是纯的。这些显微图预示可能存在覆层或外壳。图7e所示为取自本发明的银/水组合物中的银颗粒的EDAX谱(即能量分散谱或“EDS”)。图7e表明银中根本不存在金属杂质(比如Au、Pt等)。存在的铜来自所需的显微装置。有证据表明存在相当量的氧，它可以存在于铜中、以及作为银颗粒中至少一部分上的外壳存在。

[149]图8所示为本发明的银颗粒的电子衍射图。该数据暗示存在至少一种银氧化物。对该数据有许多解释，但是图9表明，在数据收集过程中可能发生对银颗粒的电子束损伤。在检测由其他厂商制造的胶体银时，该电子束损伤是不明显的(如下所述)。因此，使用SEM和TEM技术的数据收集是非常困难的，这是因为来自电子束的能量能损伤(从而改变)目标组合物的任何表面。因此，对这些结果要加以非常小心的处理和分析。

[150]图42所示为另一表征工具的结果。在该情况下，使用粉末X射线衍射技术以进一步证明氧化物相的存在。特别地，图42所示为取自根据本发明制造的经干燥的200ppm银/水组合物上四个不同位置处的四个X射线衍射图。此外，四个X射线衍射图上叠加的是除纯银金属之外的物质的四个参照衍射图。特别地，通过标准的反渗透水过滤工艺将根据本发明制造的32ppm银/水组合物浓缩成约200ppm。特别地，使本发明的银/水组合物通过反渗透水过滤系统，其中来自反渗透水过滤系统中的“废”水包括更浓缩的银组分。一旦获得200ppm的溶液，就将该溶液置于通氮环境中干燥，以产生能进行X射线衍射的粉末。具体地说，将银/水混合物放入盘中，用塑料薄膜包覆该盘并将氮气导入盘/塑料薄膜组件中的一端，接着将氮气从盘/塑料薄膜组件的相反端排出。为使银/水混合物中所有的组分保持完整，该装置的温度不超过约75～80℃。于是有足够量的干粉(即由200ppm的溶液中制得)可用于X射线衍射分析。

[151]产生的X射线衍射图清楚显示存在至少四种分离的物质。就这点来说，明显可知一组碳酸银的峰出现在约18～22°。这些峰很可能是由干燥过程引起的。就这点来说，即使在干燥过程中试图在200ppm的溶液上形成氮气层，但仍很可能存在来自空气中的CO₂。此外，一组峰出现在约33°。然而，这些峰中的每一个都可以可归因于银氧化物(AgO)、碳酸银(Ag₂CO₃)、和/或氧化银(Ag₂O)。因此，还不完全清楚存在的是哪种物质。此外，银金属的强峰出现在约38°。在各个X射线衍射图中可看到该强峰。然而，注意到氧化银(Ag₂O)的小峰也出现在约38°。更进一步，银氧化物(AgO)的强峰与碳酸银(Ag₂CO₃)相对也较强的峰均出现在约37°。还注意到，银氧化物(AgO)的峰对应于银氧化物正方晶相中的一种。通过评估产生的X射线衍射数据，并将其与现成数据库文件对比，清楚地显示根据本发明的新发明的银/水组合物中存在一种或以上的银的氧化物相。存在氧化物的组合可能是由于根据本发明的新颖处理技术。人们注意到，没有可供使用的Ag₄O₄的X射线衍射图以与本发明的X射线衍射图进行比较。

[152]然而，商品Ag₄O₄是存在的。就这点来说，首先购买Ag₄O₄的试样，接着对该粉末进行热重分析(TGA)和差热分析(DTA)。特别地，图43分别对应TGA分析和DTA分析。由图43中的DTA曲线清楚可知Ag₄O₄的吸热出现在约181℃。该吸热也符合图43中的TGA曲线所示的重量损失。这些试验测定结果对应于分解为Ag₂O的Ag₄O₄。第二个非常强的吸热出现在约403℃，而且该第二个吸热与重量损失一致。这两个试验点对应于分解为Ag金属的Ag₂O。

[153]图10所示为在用于根据本发明的工艺之前的新的银电极的SEM显微图。对标记为1、2和3的电极部分进行EDS元素分析。这三个单独的分析分别如图11、12和13所示。这些分析显示基本上为纯银。

[154]图14所示为在用于根据本发明的工艺之后的所用银电极的尖端的SEM显微图。在标记为1和2的所用电极部分进行EDS元素分析。这两个单独的分析分别如图15和16所示。图17所示为在更大放大倍数(约3500X)下所用电极尖端的SEM显微图。还用EDS元素分析对部分4和5进行检测，也发现它们基本为纯银。

[155]商品胶体银中银颗粒的比较

[156]为理解本发明的银/水组合物相对于已知的胶体银的性能差异(比如生物学功效)，对物理特性差异进行了检测。图18a和18b是银颗粒的TEM显微图，该银颗粒对应于2004年购自General Nutrition Center(综合营养中心)并在市场中被称为GNC Liquid Colloidal SilverDietary Supplement的第一胶体银(25ppm)(“GNC”)。图19a和19b是银颗粒的TEM显微图，该银颗粒对应于在市场中被称为“Silverado”的第二胶体银。图20a和20b是银颗粒的TEM显微图，该银颗粒对应于在市场中被称为Vitamin World Bioorganic AdvancedColloidal Minerals的第三胶体银(3ppm)(Bioorganic)。图21是取自本发明的两种银/水组合物的银颗粒(被标记为“ASAP20”和“ASAP 10”)与取自已知被称为“GNC”、“Silverado”和“Bioorganic”的三种商品胶体银之间的TEM显微图覆盖对比。明显的粒度和形状差异在这些显微图中较为明显，从而表明在不同的胶体银之间存在物理、结构和潜在的化学差异，这有助于部分解释在一般化学组成类似的不同产品之间生物学功效的差异。

[157]光谱特性

[158]拉曼光谱

[159]用拉曼光谱对银/水混合物做进一步的分析。在三种不同的拉曼光谱仪上采用多种分析方法。采用拉曼和共振拉曼光谱的理由在于人们相信当与本发明的银/水组合物比较、以及与“纯的”或去离子水比较时，不同胶体银中不同的振动模式(和/或振幅)是显而易见的。此外，水分子中观察到的这些不同的振动模式有助于更好的确定胶态体系，并且有助于解释不同银基产品中存在不同的生物学功效。

[160]在第一组拉曼光谱测定中，采用Vitech(UIm，德国)的共焦拉曼显微镜。型号是CRM200。通过使用每条测量谱线的积分时间为15秒的(即三个分离的各为5秒的采集时间)的Nikon 60x(NA＝1)浸没透镜获得光谱。CCD以约1,799的波数为中心。将一滴溶液滴入培养皿中的小孔中，接着将浸没透镜降低到其内。用于拉曼光谱的激光源是具有约10mW的532nm光波。使用具有约0.3×0.3×0.75微米(约7×10^-8皮升)共焦体积的共焦检测系统。

[161]图22a和22b所示为对7个试样的数据收集的结果图。虽然标记不同(10PR和10PSU)，但两个试样是相同的且对应于前面提及的“ASAP 10”(即本发明的银/水组合物中的10ppm的银)。“HPLC”对应于购自Alfa Aesar的高纯(HPLC级超纯)水。“D1”对应于去离子水。“GNC”对应于GNC Liquid Colloidal Silver Dietary Supplement(25ppm)。“AGX-32”对应于本发明的32ppm的银/水组合物。“VW”对应于Vitamin World BioorganicAdvanced Colloidal Minerals(3ppm)(先前称为Bioorganic)。不同的试样之间显示明显的差异。比如，这几种水/银基溶液中的主要伸缩模式(比如约3400～3500 l/cm的波数)显示出较大的差异。此外，500 l/cm以下的振动/转动行为也在试样之间显示出明显的差异。还可以观察到在约1600 l/cm处的弯曲模式中有一些差异。不需要结合任何特殊的理论或说明，本发明的银/水组合物的不同行为表现，可以比如影响或至少有助于说明该组合物相对于其他被研究的试样的不同功效。

[162]第二组拉曼数据由不同的光谱仪系统产生。虽然两组数据之间的数值不同(有力地说明水的拉曼光谱数据与使用的分析装置有关)，但该数据组中的数据也显示出本发明的银/水组合物在与其他胶体银或其他水进行比较时存在明显的差异。在该组拉曼光谱测定中，使用反射拉曼显微镜。通过使用Olympus 20×透镜(NA＝0.4)获得光谱。CCD探测器集中于四个不同的波数，即1600、2500、3400和4400 l/cm。用于拉曼的激光源是具有约11.5mW的514.5nm光波。在图23a、23b和23c中各个图上可以发现与光谱有关的辅助信息。这些图上试样的标记与上述文本中的一致。两组拉曼光谱数据强有力地证明在这些不同的试样中存在不同的分子运动，这有助于说明(或至少证明)根据本发明的银/水组合物的生物有效性。

[163]用第三个多激光线的Renishaw共焦拉曼微谱仪产生第三组拉曼数据。设定该系统使其能在试样上方和浸入试样内测定。设计该装置用于研究比测定的第一组中所述试样体积大100～1000倍的试样体积。具有Leica DL DM显微镜的反射微谱仪装有20x(NA＝0.5)的浸没透镜或5x(NA＝0.12)的干透镜。各个透镜的后孔尺寸等于或超过扩大的激光束直径。使用两种激光频率，即在1/2设置功率处用于514.5nm的50mW的多线氩激光器和在633nm处的20mW的氦氖激光器。将高分辨率的光栅安装在单色仪的光学路径中，从而允许在50～4000波数(1/cm)间进行连续扫描。使用10～20秒的积分时间。将在50ml烧杯中的液体试样置于透镜的下面。两种激光器被用于研究共振波，此时，前者激光器主要用于获得拉曼光谱。进样量为约25ml。用5x干透镜进行的测定是将物镜置于液体上约5mm从而检测弯液面下约7mm的体积。用位于试样内约4mm的20x的浸没透镜进行浸没测定，同时允许对相同的空间体积进行研究。分别调整用于各个透镜的CCD探测器的探测面积从而使信号强度和信噪比最大化。用于本发明的银/水组合物的代表性光谱如图24a所示。图24b所示为根据本发明制造的三种不同的金属/水溶液的拉曼光谱。曲线1对应于13ppm的银/水溶液；曲线2对应于10ppm的锌/水溶液；以及曲线3对应于11ppm的铜/水溶液。

[164]虽然三组数据之间的数值略有不同(有力地说明水的拉曼光谱数据与分析仪器和仪器装置有关)，但这些数据组中的数据表明本发明的银/水组合物相对于其他胶体银或其他水之间存在明显差异。所有的拉曼光谱数据组强有力地证明，在这些不同的试样中存在不同的分子运动和化学键，这有助于说明(或至少证明)根据本发明的银/水组合物的效果。此外，图24b中所示的三种不同的金属/水溶液的拉曼图谱的差异也预示着可能存在不同的效果。

[163]紫外-可见(UV-VIS)光谱

[164]用UV-Vis光谱对银/水混合物作进一步的分析。除拉曼光谱之外，使用UV-Vis光谱以探求在光谱的不同部分额外的区分模式和/或振幅。使用单个UV-Vis光谱仪收集数据。就这点来说，使用UV-Vis微型光谱仪获得能量吸收谱。用能在约190nm～约1100nm波长范围内扫描的双束扫描单色器系统获得该信息。用于收集吸收谱的UV-Vis光谱仪是JascoMSV350。组装该仪器以支持使用10mm×10mm熔化石英比色杯的低浓度液体试样的测定。用具有下述工作参数的光电倍增管(PMT)和光电二极管探测器获得上述波长范围的数据：2nm的带宽、0.5nm的分辨率，接着从生成光谱中扣去水的基线背景。就这点来说，从生成的光谱中扣去纯水的UV-Vis特征谱，从而显示更有代表性的银/水混合物的光谱特征。

[165]“卤化”钨和氘“D2”能源被用作MSV350的主要能源。光谱仪的光学路径被设定为允许能束穿过试样，聚焦于试样比色杯的中心。样品制品限于填满和充满比色杯，且基本上可在全封闭式试样室内将它们设置在比色杯支架上。输出数据被测定并显示为吸光度单位对波长和频率的关系(比尔-朗伯定律)。对应于如图48a和48b所示的两个光谱的试样间的主要差异是各个试样中的银浓度。具体地说，图48a和48b中较高的振幅曲线对应于32ppm的银/水溶液，较低的振幅曲线对应于10ppm的银/水溶液。峰的波长或频率位置(即峰和谷的位置)非常相似。

[166]如上所述，可以可控地将银(比如银离子、银金属、Ag+等)附于或固定在比如粘土层之间和/或其上和/或沸石的笼内。一种将比如银离子放入或放在粘土、云母、或沸石上的方法是形成处于可溶解状态的离子类型的银，并将所述物质引入粘土或沸石组合物或混合物中。交换的原理，比如用银离子交换另一种阳离子，有时被称为“BEC”或“CEC”(有两个简写的名称，用于指代“系统”的阳离子交换能力)。就这点来说，已知大多数高岭石材料具有2～5(即2～5meq/100克)的阳离子交换能力。例如，蒙脱土具有约100meq/100克的阳离子交换能力。然而，沸石可以具有几百meqs/100克的阳离子交换能力。例如，众所周知的被称为“Linde 4A沸石”的沸石具有400～500meq/100克的BEC或CEC数。通常，BEC或CEC数越高，材料接受阳离子的能力越强。

[167]进行实验步骤以确定高岭石或沸石是否能变成银(或其它的金属阳离子)的保持/传递体系。特别地，采用下述步骤制备并分析银-粘土试样以及银-沸石试样。

[168]一般地，首先用去离子水清洗典型的高岭石和Linde 4A沸石材料三次以除去可能的氯污染，该污染能使特定的银起始材料(比如银离子)在其可能优选地附于高岭石和/或沸石结构上/内之前发生沉淀(或不希望有的反应)。然后将这些经洗涤的材料以合适的浓度与硝酸银(AgNO₃)溶液混合在一起，该浓度应符合各个材料预期的或已知的“CEC”。接着再次用去离子水洗涤获得的经处理的材料，以除去任何未利用的硝酸银。在约120℃处，于电阻干燥炉中将试样干燥过夜。特别地，清洗工序如下所述：

[169]将约两克高岭石或沸石试样放入离心管中。然后添加去离子水。接着在机械腕摇床上将试样和去离子水混合物搅动约40分钟。然后在约1000RPM处将混合物离心约30分钟。接着从试样管中倾析出剩余的液体。添加去离子水、摇动、离心、以及倾析的步骤重复总共三次以进行清洗。

[170]一旦初始的2克试样已被适当地清洗，从而除去可能的氯污染，就将硝酸银导入到清洁的高岭石和沸石材料中。特别地，将约0.09克的硝酸银导入高岭石混合物中并将约4.25克的AgNO₃导入Linde 4A沸石中。特别地，将测定量的硝酸银添加到各个试管中，接着添加去离子水以填满试管，然后在机械腕摇床上将混合物搅拌约40分钟，之后在约1000RPM处离心约30分钟。接着倾析出液体。总共重复三次添加硝酸银、添加去离子水、在机械腕摇床上搅拌、离心、以及倾析的步骤。在已经完成洗涤和硝酸银导入工序后，从离心管中除去试样，并将试样放入铝(Al₂O₃)坩锅中，接着在约120℃处，在电阻加热炉中将其干燥过夜。然后用SEM显微图和扫描电镜能谱仪(EDAX)技术表征获得的高岭石/银和沸石/银材料。图44a和44b所示为根据上述技术制造的高岭石试样的SEM显微图。由这些显微图中清楚看到高岭石的“书状”或“薄片状”结构(比如在图44a中标识为“X”和“Y”的SiO₂和Al₂O₃的层)，清楚表明银阳离子已经位于粘土材料的“边缘”附近。明显存在一些类型的银连接或交换，可由这些显微图中较明亮的“页状”部分证明(注意：部分“X”和“Y”表示试样中各种其他的“书状”结构)。图45a～45b所示为分别如图45a和45b中所示试样的能谱(EDAX)分析图。这些分析清楚表明，如预期的那样，存在高岭石的铝和硅、以及一些钛(预示存在金红石)。还能看到非常小的银峰，这符合具有相对较低的2～5的高岭土BEC数值。

[171]图46所示为对应于根据上述工序处理的沸石的SEM显微图。由于沸石具有较高的CEC数值(即约500)，那么图46中沸石管状结构在显微图中显得“发亮”(比如参见图46中的部分“A”)。该“发亮”说明银已在整个沸石结构内基本均匀分布。就这点来说，如果存在发亮的银金属本身的亮点，那么银还没有被结合到沸石内/上。图47是图46中所示的试样的能谱(EDAX)分析图。此外，还存在相对较高振幅的铝和硅的峰，但是存在非常高的银峰(比如，与图45a～45b中所示的高岭石中的Ag峰相比)。这些非常高的银峰对应于沸石相对于如图44a和44b所示高岭石的结构(即较低的BEC)而在其结构中对银具有更强的俘获能力(即较高的BEC)。

[172]22ppm银组合物有效抑制枯草芽胞杆菌的证据

[173]A.实施例的目的

[174]本实施例的目的在于说明本发明的银基组合物对试验生物体枯草芽胞杆菌中细菌内生孢子的抗菌活性。通过使用枯草芽胞杆菌内生孢子的悬浮液进行标准灭菌时间分析，来完成该实施例。通常，细菌的内生孢子是耐灭活的。

[175]B.材料和方法[176]试验生物体。由营养琼脂上生长的培养物制得包含枯草芽胞杆菌(ATTC#19659)内生孢子的试验悬浮液，该营养琼脂中添加了额外的芽胞形成增强成分。用无菌水对平板进行收获，接着通过在水中重复离心和再悬浮来纯化内生孢子。最后用70％的乙醇洗涤30分钟，以确保杀死所有生长的细菌。将孢子悬浮在含有0.1％ Tween 80(聚山梨酸酯表面活化剂类)的水中以防止结块。

中和剂。中和剂混合物由12.7％的 80(聚山梨酸酯)、6.0％的 SN(萘-甲醛缩聚物钠盐类)、1.7％的卵磷脂、1％的蛋白胨、以及0.1％的胱氨酸组成。该溶液被用来中和任何化学品，从而使它们不影响细菌随后的生长。

[177]灭菌时间工序

[178]a)将9.9ml等分的杀菌剂(本发明的22ppm的银水组合物)放入无菌的20mm×150mm的试管中。试管在20℃的水浴器中达到平衡。

[179]b)将9.9ml等分的杀菌剂(本发明的22ppm的银水组合物)放入无菌的20mm×150mm的试管中。试管在20℃的水浴中进行平衡。

[180]c)在30分钟、1小时、以及4小时处，分别向含有9ml中和剂的试管中添加1ml的有机体/杀菌剂悬浮液。充分混合试管内物质。

[181]d)2分钟后，按1:10用生理盐水(PSS)逐次稀释经中和的悬浮液。

[182]e)用膜滤法分析在挑选的稀释管中存活的有机体数目。一式两份地将1ml的等分试样涂片。用约100ml的无菌PSS清洗薄膜，接着将其附于营养琼脂平板上。在37℃处，将该平板保温20小时。

[183]f)计算各个过滤器上的菌落数，接着计算减少量的对数。

[184]对照：

[185]A)通过对选取的按1:10用PSS稀释的试验悬浮液进行膜滤分析，来计算试验悬浮液滴度。

[186]b)通过用100ml滴度包含100cfu的稀释液接种9ml中和剂和1ml杀菌剂的混合物来进行中和对照。由此在试管中产生约10cfu/ml的溶液，从而在通过使用一式两份的1ml试样进行膜滤法分析之前使其保持20分钟。

[187]C.结果

[188]枯草芽胞杆菌滴度

                                         稀释液

菌落数         1:1×10⁶         1:1×10⁷           1:1×10⁸

               TNTC             75                 7

               TNTC             58                 8

[189]TNTC＝数目太多难以计算

                   时间枯草芽胞杆菌孢子/杀菌剂悬浮液的稀释液

            1:1×10¹     1:1×10²    1:1×10³     1:1×10⁴     1:1×10⁵    1:1×10⁶

30分钟      -            -           TNTC         TNTC         57          10

            -            -           TNTC         TNTC         51          7

1小时       -            -           TNTC         TNTC         28          3

            -            -           TNTC         TNTC         55          3

2小时       -            TNTC        TNTC         126          23          -

            -            TNTC        TNTC         183          17          -

4小时       TNTC         TNTC        88           12           -           -

            TNTC         TNTC        69           12           -           -

[190]TNTC＝数目太多难以计算

[191]中和对照：1:1×10⁸

[192]D.讨论

[193]滴度测试结果显示，在初始悬浮液中存活的枯草芽胞杆菌孢子浓度为6.65×10⁸个孢子/毫升。用100ml的该悬浮液接种9.9ml的杀菌剂从而在分析试管中产生6.65×10⁶个孢子/毫升的初始浓度。

[194]由这些工序获得的结果可计算减少量的对数(LR)和灭菌百分数(PK)。其数值如下表所示。使用如下公式计算其值：LR＝-Log(S/So)，PK＝(1-(S/So))×100；其中S＝在特定时间处有机体的浓度，So＝在时间为零处有机体的初始浓度。

时间                   减少量的对数           灭菌百分数

30分钟                 0.090                  18.8

1小时                  0.205                  37.6

2小时                  0.634                  76.6

4小时                  1.928                  98.8

[195]中和对照数据显示，杀菌剂完全被中和。实际数值与由未进行明显杀菌的稀释液所得数值相符。

[196]此处测试的杀菌剂制品显示出较好的抑制枯草孢子的杀孢能力。枯草芽胞杆菌是用于杀孢子试验的普通品种，其与引起炭疽的菌类属于相同的属。因为它们具有遗传相似性，故用枯草芽胞杆菌孢子作为炭疽芽胞杆菌、炭疽杆菌的非病原性替代品。于是，这些结果适用于炭疽。预期更长的暴露将导致额外的灭菌。

[197]10PPM的银与1.0％过氧化氢的组合物及14PPM的银与1.5％过氧化氢的组合物抑制枯草芽胞杆菌的证据

[198]A.实施例的目的

[199]本实施例的目的在于说明本发明的两种银基组合物对试验有机体枯草芽胞杆菌的细菌内生孢子的抗菌活性。通过使用枯草芽胞杆菌内孢子的悬浮液进行标准灭菌时间分析来完成该实施例。相对于上述实施例(采用22ppm的银)的观察结果可知，本实施例中的过氧化氢(H₂O₂)确实对银组合物的抗菌性能有促进作用。在存在本发明的银组合物时，过氧化氢是稳定的。虽然过氧化氢本身具有显著的抗菌性能，但它经常被催化酶或其他微生物酶破坏。然而，在过氧化氢发生任何酶破坏之前，过氧化氢能减弱细菌的细胞壁从而增强银颗粒的进入。

[200]B.材料和方法

[201]1.试验菌。由营养琼脂上生长的培养物制得包含枯草芽胞杆菌(ATTC#19659)内生孢子的试验悬浮液，该营养琼脂中添加了额外的芽胞形成增强剂。用无菌水收获平板，接着通过在水中重复离心和再悬浮来纯化内孢子。最后用70％的乙醇清洗30分钟，从而确保杀死所有生长的细菌。将孢子悬浮在含有0.1％ 80(聚山梨酸酯表面活化剂类)的水中以防止结块。

[202]2.中和剂。中和剂混合物由12.7％的Tween 80(聚山梨酸酯)、6.0％的 SN(萘-甲醛缩聚物钠盐)、1.7％的卵磷脂、1％的蛋白胨、以及0.1％的胱氨酸组成。该溶液被用来中和任何化学品，从而使它们不影响细菌随后的生长。

[203]3.灭菌时间工序；

[204]a)将9.9ml等分的各个杀菌剂(本发明的胶体银组合物：一种含有14ppm的银和15％的H₂O₂，另一种含有10ppm的银和1.0％的H₂O₂)放入无菌的20mm×150mm的试管中。试管在20℃的水浴中进行平衡。

[205]b)在时间为零处，用100ml的试验菌悬浮液对各个试管中的杀菌剂进行接种。

[206]c)在10分钟、30分钟、2小时、4小时、6小时、以及8小时处，分别向含有9ml中和剂的试管中添加1ml的有机体/消毒剂悬浮液。充分混合试管内物质。

[207]d)2分钟后，按1:10用生理盐水(PSS)逐次稀释经中和的悬浮液。

[208]e)用膜滤法分析在挑选的稀释管中存活的有机体数目。一式两份地将1ml的等分试样涂片。用约100ml的无菌PSS清洗薄膜，接着将其附于哥伦比亚琼脂(Columbia Agar)平板上。在37℃处，该平板保温20小时。

[209]f)计算各个过滤器上的菌落数，接着计算减少量的对数。

[210]4.对照：

[211]a)通过对选取的按1:10用PSS稀释的试验悬浮液进行膜滤分析，来计算试验悬浮液滴度。

[212]b)通过用100ml滴度1:10³的稀释液接种9ml中和剂和1ml杀菌剂的混合物，来进行中和对照。由此在试管中得到约2,000cfu/ml，在按1:10稀释之前使其保持20分钟。通过使用一式两份的1ml试样对两个试管进行膜滤法分析。所有的结果如表1a和1b所示。

[213]C.结果

[214]枯草芽胞杆菌孢子滴度：

                                        稀释液

菌落数         1:1×10⁶         1:1×10⁷          1:1×10⁶

               TNTC             36                5

               TNTC             27                4

[215]TNTC＝数目太多难以计算。

表1a

    含有14ppm的银和1.5％H₂O₂的溶液

时间                      枯草芽胞杆菌孢子/杀菌剂悬浮液的稀释液

        1:1×10¹     1:1×10²    1:1×10³   1:1×10⁴     1:1×10⁵

10分钟  -            -           TNTC       TNTC         227

        -            -           TNTC       TNTC         265

30分钟  -            -           TNTC       TNTC         258

        -            -           TNTC       TNTC         273

1小时   -            -           TNTC       TNTC         55

        -            -           TNTC       TNTC         33

2小时   -            TNTC        207        29           -

        -            TNTC        237        24           -

4小时   59           3           1

        57           5           1

6小时   0            0           0

        3            0           0

8小时   1            0           0

        1            0           0

[216]TNTC＝数目太多难以计算。

[217]中和对照：

未稀释                          1:1×10¹

TNTC                            195

TNTC                            210

[218]TNTC＝数目太多难以计算。

表1b

    含10ppm的银和1.0％ H₂O₂的溶液

时间                         枯草芽胞杆菌孢子/杀菌剂悬浮液的稀释液

           1:1×10¹      1:1×10²     1:1×10³     1:1×10⁴     1:1×10⁵

10分钟     -             -            TNTC         TNTC         230

           -             -            TNTC         TNTC         287

30分钟     -             -            TNTC         TNTC         254

           -             -            TNTC         TNTC         260

1小时      -             -            TNTC         TNTC         146

           -             -            TNTC         TNTC         124

2小时      -             TNTC         TNTC         64           -

           -             TNTC         TNTC         71           -

4小时      TNTC          72           5

           TNTC          77           5

6小时      0             0            0

           2             0            0

8小时      0             0            0

           0             0            0

[219]TNTC＝数目太多难以计算。

[220]中和对照：

未稀释                           1:1×10¹

TNTC                             200

TNTC                             184

[221]TNTC＝数目太多难以计算。

[222]D.讨论

[223]数据显示，在初始悬浮液中存活的枯草芽胞杆菌孢子浓度为2.59×10⁸个孢子/毫升。用100ml的该悬浮液接种9.9ml的杀菌剂从而在分析试管中产生2.59×10⁵个孢子/毫升的初始浓度。

[224]由这些工序获得的结果可计算减少量的对数(LR)和灭菌百分数(PK)。其值如下表所示。使用如下公式计算其值：LR＝-Log(S/So)，PK＝(1-(S/So))X100，其中S＝在特定时间处有机体的浓度，So＝在零时间处有机体的初始浓度。由于在30分钟内没有显著的灭菌，故10分钟内的数据用于So值。6小时和8小时的暴露时间没有产生高到足以可靠的数值。于是，在线性回归中没有使用这些数据。使用Minitab统计软件包中的“拟合曲线”命令对减少量的对数进行线性回归。得到的回归方程式和达到99.9999％减少量所需的时间与减少量的对数以及灭菌百分数如表2所示。

表2

时间               14ppm的银+1.5％的H₂O₂              10ppm的银+1.0％的H₂O₂

            减少量的对数      灭菌百分数       减少量的对数     灭菌百分数

30分钟      -0.03             -7.9             0.003            0.6

1小时       0.66              78.0             0.28             47.8

2小时       2.05              99.1             1.58             97.4

4小时       4.63              99.998           3.54             99.97

[225]回归分析

[226]用于14ppm的拟合曲线的方程式：Y＝-0.66704+1.32936x。用于10ppm的拟合曲线的方程式：Y＝-0.59690+1.03933x。这些方程式预示达到99.9999％减少量所需的时间对14ppm的组合物是5.02小时，对10ppm的组合物是6.35小时。

[227]中和对照数据显示杀菌剂完全被中和。预期的计数与稀释液中预期的对应数值相符。

[228]被测试的试验杀菌剂溶液显示出显著的抑制枯草芽胞杆菌孢子的杀孢能力。用于这些评估中的枯草芽胞杆菌菌株与AOAC杀孢子试验中指定的一种菌株相同。来自该有机体的孢子对大多数杀菌剂有显著的耐药性。达到99.9999％所需的时间与许多冷杀菌剂的杀孢子标记要求呈线性关系。

[229]10PPM的银组合物作为光谱抗菌剂的有效性证据

[230]A.方法

[231]根据标准的肉汤微量稀释法进行MIC(最低抑菌浓度)和MBC(最低杀菌浓度)试验。将MIC定义为抑制感染菌(体外)繁殖的抗生素的最低浓度。报道的结果以微克/毫升计。对于医学抗生素，体外数据基于可达到的药物血清浓度来说明，药物血清浓度会根据剂量、给药途径、蛋白结合程度、感染的位置、病人的年龄和体重、以及其他因素而变化。将MBC定义为杀死99.9％的初始接种微生物所需的抗菌剂的最低浓度。

[232]通过在液态培养物中繁殖各个试验菌的纯培养物进行测试。用浊度测定来控制培养物的浓度。在营养肉汤中制备逐次稀释的各个试验抗生素。计算稀释程度以确定各个有机体对每种试剂的易感范围。将标准量的试验培养物添加到各个试管中，接着将试管放回到用于繁殖的培养箱(37±2℃)中。测定试管浊度以确定细菌繁殖。在MIC浓度以下，试管显示出光密度随时间增大，这说明有细菌繁殖。不显示繁殖的抗生素的最低浓度是MIC。然后在新培养基中再次培养“不繁殖”的试管。再次培养中不显示繁殖的“不繁殖”的试管中抗生素的最低浓度是MBC。结果如表3所示。

[233]B.结果：

表3

                                       抗生素(ppm)

有机体        四环素        氧氟沙星     青霉素G       头孢哌酮       红霉素        银

化脓性链球菌  0.625/>5      1.25/2.5     >5.0          0.313/1.25     0.003/0.019   2.5/5.0

变形链球菌    0.625/>5      2.5/>5.0     0.521/>5      1.25/>5        0.009/0.019   2.5/10.0

格氏链球菌    0.156/0.625   2.5/5.0      0.009/0.039   1.25/1.25      0.005/0.019   2.5/10.0

肺炎链球菌    0.078/0.625   2.5/2.5      0.019/0.019   0.313/0.313    0.002/0.004   2.5/2.5

粪链球菌      0.313/>5      1.25/5.0     5.0/>5.0      >5.0           0.009/1.25    10.0/10.0

金黄葡萄球菌  0.313/>5      0.417/0.625  2.5/>5.0      5.0/5.0        0.039/>5.0    5.0/5.0

绿脓杆菌      0.078/>5      0.156/0.313  0.13/>5.0     2.5/5.0        2.5/>5.0      1.67/5

大肠杆菌      1.67/>5       0.104/0.156  >5.0          0.625/>5.0     5.0/>5.0      2.5/2.5

产气杆菌      >5            0.078/0.156  >5.0          2.92/>5.0      >5.0          2.5/2.5

阴沟肠杆菌    1.67/>5       0.156/0.156  >5.0          >5.0           >5.0          2.5/5.0

伤寒杆菌      1.25/>5       0.078/0.156  >5.0          1.25/2.5       5.0/>5.0      2.5/5.0

亚利桑那菌    0.625/>5      0.078/0.078  >5.0          0.833/>5.0     4.17/>5.0     2.5/5.0

鲍氏志贺菌    1.25/>5       0.078/0.156  >5.0          0.625/>5.0     5.0/>5.0      1.25/1.25

肺炎杆菌      2.5/>5        0.417/0.625  >5.0          >5.0           >5.0          2.5/2.5

产酸克雷伯菌  1.25/>5       10.104/0.156 >5.0          1.25/>5.0      >5.0          1.25/1.25

[234]用数据表示MIC/MBC(以百万分之一(ppm)计的最低抑菌浓度/最低杀菌浓度)，“>”表示获得MIC或MBC所需的浓度高于试验测定的试验参数。例如，用在化脓性链球菌上的四环素的最高浓度是5ppm。在该浓度处，在再次培养的“不生长”的试管中仍存在细菌生长。因此，MBC必须>(大于)5ppm。

[235]在随后的研究中确定了与出血性腹泻和结肠炎爆发相关的大肠杆菌菌株O157：H7的MIC/MBC。MIC被确定是2.5ppm，MBC被确定是5ppm。

[236]C.结论

[237]对本发明的10ppm的银组合物进行测试，结果发现其对所有的试验菌有抑菌性和杀菌性。在其他的研究中，将该组合物与其他商品胶体银产品进行对比，结果发现其具有比其他所有试验制品(未显示数据)更出色的活性。最有意义的观察是10ppm的银组合物具有广谱性。观察到其抗菌活性非常稳定且不依赖于特定的试验菌。除了粪链球菌和金黄葡萄球菌(分别具有10ppm和5ppm的MIC值)之外，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的MIC值均在1.25ppm～2.5ppm之间。除了变形链球菌、格氏链球菌、以及粪链球菌(MBC值均为10ppm)之外，MBC值具有类似的1.25ppm～5ppm的取值范围。数据表明，本发明的10ppm银的实施方式显示出与测试的任何一种抗生素相同或更宽的抗菌活性谱。抗生素通常将抗菌谱限于易感菌，但如数据所示，本发明的银组合物具有相同的抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的效果。数据表明，由于银一般具有较低的毒性，且银组合物具有较宽的抗菌活性谱，故该制品能有效地用作抗生素的替代品。

[238]D.关于优选实施例的参考文献

[239]1.U.S.EPA IRIS Report for Silver-CASRN 7440-22-4

[240]2.Fox CL，Modak SM.Mechanism of Silver Sulphadiazine Action on Burn Wound.Infections.Antimicrobial Agents Chemother.5：582-588.1974.

[241]3.Furchner，JE，Richmond CR，and GA Drake.Comparative Metabolism of Radionuclidesin Mammals.IV.Retention of Silver-110m in the Mouse，Rat，Monkey，and Dog.Health Phys.15：505-514.1968.

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[243]5.Hindler，JA，and JH Jorgensen.Procedure in Antimicrobial Testing in DiagnosticMicrobiology.(CR Mahon and G Manuselis，eds.)pp 63-91.1995.

[244]32PPM的银组合物有效抑制绿脓杆菌、猪霍乱沙门菌和金黄葡萄球菌的证据

[245]A.方法

[246]用AOAC(Association of Official Analytical Chemists AOC Methods，vol.1，15^th edition，1990，AOAC Arlington，VA)官方方法955.14、95515和964.02对绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)ATTCC#15442、猪霍乱沙门菌(Salmonella choleraesuis)ATTCC#10708和金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC#6538进行测试。从原种培养物中接种营养肉汤(NBAOAC)试管，接着在37±2℃处培养试管。在接下来的三天内将培养物转接到新的营养肉汤试管中，最终的转接物在37±2℃处培养48～54小时。将假单胞细菌培养物倾析到新试管中以除去表皮。将其他的培养物涡旋3～4秒，使其在室温下保持10分钟。最终按1:100用蛋白胨水(PEPW)稀释培养物，蛋白胨水中添加了马血清以产生5％总量的待测菌。在测试液中浸泡试验载体(10mm长抛光的304不锈钢柱：8mm的外径和6mm的内径)15分钟，使用前在37±2℃处去水、排水及干燥40±2分钟。

[247]耐苯酚性。将五个1ml等分的各种试验苯酚稀释液放入无菌试管中，接着使其在20±2℃的水浴中进行平衡。每间隔30秒，将0.5ml的各种测试物添加到适当的苯酚稀释液中，搅拌，并且重新置于水浴：在合适的5、10、15分钟的暴露时间后，从分析试管中移出一接种环的悬浮液，接着转接到李氏肉汤(LETH)试管中。在37±2℃处培养LETH试管2天。

[248]载体滴定。为滴定载体，制备10ml蛋白胨Tween(聚山梨酸酯)(PEPT)的空白液。将两种载体装入单个试管中，表示第一个1:10稀释液。剧烈搅拌试管以使细菌进入溶液，接着将其逐次稀释9ml的LETH培养基空白液。在37±2℃处培养稀释的空白液。最后可生长的试管表示载体上有机体的滴度的对数。AOAC需要载体从而具有1×10⁴cfu/载体的最小数值。

[249]银组合物的测试。使用无菌玻璃吸管，将10ml等分制得的杀菌剂装入无菌试管中，接着在保持20±2℃的致冷水浴中进行平衡。在不与试管的侧壁接触的前提下，每隔30秒将一种经干燥的受侵染载体添加到各个银组合物的试管中，接着将其放回到水浴中。在5及10分钟的暴露间隔处，对各个有机体测试杀菌剂抑制60个经干燥的受侵染载体的情况。在暴露之后，将载体从杀菌剂中移出，接着将其转接到LETH试管中。培养试管在37±2℃处被培养2天，用阳性(+)或阴性(0)标记表示测试菌的生长情况。

[250]对照样。至于各个有机体，将经干燥的受侵染载体添加到LETH试管中作为阳性对照。未接种的培养基试管用作阴性对照。在培养后，用1～100菌落形成单位(cfu)的相应微生物穿刺接种所有的阴性对照试管，以显示中和效果。为显示培养基的生长促进性，还用具有相同的1～100cfu的三种微生物接种阴性对照试管。一式三份地将接种物在大豆酪蛋白消化液琼脂(SCDA)上涂布平板，以检验接种物滴度。在37±2℃处培养试管和平板，直到在所有的试管中看到生长。[251]在绿脓杆菌中和上，发现接种物的初始滴度>100cfu，这对所有的方案都过高。因为已经穿刺接种所有的初始试管，故通过将载体放入所有三个批次的银组合物杀菌剂试管中10分钟，来用相同批次的试验培养基进行模拟试验。接着将载体再次转接到LETH空白液中。然后用1～100cfu的微生物穿刺接种这些试管。如前所述培养试管并进行标记以确定生长或不生长。还接种来自相同批次的新的无菌培养基试管，作为生长促进性的证明。

[252]B.结果：

[253]使用金黄葡萄球菌的初期试验结果表明，试样#1及#2通过验证，但试样#3未通过。据调查，确定试样#3在发运之前已经受到损坏。从与试样#3相同批次中获得新瓶，将新瓶标记为试样#4。用试样#4重复金黄葡萄球菌测试。AOAC对该情形进行了指导，即对任一时间点和有机体，只有1种载体允许用于各批次生长测试。

[254]对于所有批次、时间点、以及有机体，阳性对照表明生长，阴性对照表明不生长。

[255]一式二份地对所有有机体进行载体滴定。报告的滴度是重复实验的平均值。对所有的三种有机体，发现载体上的平均滴度为5.5×10⁴～5.5×10⁶cfu/载体。AOAC要求载体具有1.0×10⁴cfu/载体的最小值。

[256]对于绿脓杆菌，3/180的载体显示在5分钟测试点处生长，2/180的载体显示在10分钟测试点处生长。对于金黄葡萄球菌，16/180的载体显示在5分钟测试点处生长，2/180的载体显示在10分钟测试点处生长。对于猪霍乱沙门菌，6/180的载体显示在5分钟测试点处生长，1/180的载体显示在10分钟测试点处生长。

[257]假单胞细菌试验中，在用1:90苯酚处理5、10或15分钟后，培养基显示生长现象，在用1:80苯酚处理5或10分钟后，培养基显示生长，但在用1:80苯酚处理15分钟后，培养基不生长。在用1:70苯酚处理5、10或15分钟后，葡萄球菌培养基显示生长，在用1:60苯酚处理5或10分钟后，培养基显示生长，但在用1:60苯酚处理15分钟后，培养基不生长。在用1:100苯酚处理5、10或15分钟后，沙门氏菌培养基显示生长，但在用1:90苯酚处理5、10或15分钟后，培养基不生长。

[258]32、22及10ppm的银和22ppm的银与1.5％的H₂O₂及10ppm的银与10ppm的K₂S₂O₈有效抑制新接种的牛肉试样中的沙门氏菌及大肠杆菌的证据

[259]A.实施例的目的

[260]本实施例的目的在于证明本发明的银基组合物对牛肋部肉试样的抗菌活性，该试样的外表面上用沙门氏菌的五种菌株混合物、或大肠杆菌O157:h7分别以较高接种液浓度(1×10⁶cfu/cm²)和较低接种液浓度(1×10⁴cfu/cm²)接种(cfu＝菌落形成单位)。

[261]B.材料和方法

[262]牛肉试样。在8小时的除脏术内，从屠宰室中获得牛组织试样。通过在第11根和第12根肋骨之间切割，来从悬挂在冷冻冷却器内的眮体中剥离腹直肌，接着沿天然缝隙剥离出肌肉。将获得的无菌试样置于塑料袋中及冰袋上，接着在同一天将其运送到实验室中，其中用Multi-Vac(A-300)即时包装该试样，并将其置于4℃的冷却器内。用于测试的试样具有5.8～6.0之间的pH，且在不超过除脏术后的36小时内获得。将随机选取的腹直肌切割处理成13×8cm的试样。处理后，利用3.5cm²的火焰杀菌不锈钢圈装置及外科手术刀，无菌状态下从各个试样中相间隔地获得两块肉心。将组织肉心装入具有25ml的0.1％蛋白胨的无菌细菌分离器袋中，接着在细菌分离器(Lab Bender 400)中混合两分钟。逐次制备稀释液，接着在处理后0分钟、20分钟、1小时、4小时、以及24小时处，将其在选取并回收的培养基上螺旋式涂平板。

[263]细菌培养物。从堪萨斯州州立大学(KSU)培养物保藏中心中获得细菌培养物，接着用“保护珠”保藏系统将其保藏。用于沙门氏菌样品的有如下培养物：利尔沙门菌(S.lille，UGA)、蒙德维亚的沙门菌(S.montevideo，UGA)、伤寒杆菌(S.typhimurium，UGA)、阿贡纳沙门菌(S.agona，KSU 05，CDC发作分离菌)、以及纽波特沙门菌(S.newport，KSU 06，CDC发作分离菌)。用于大肠杆菌样品的有如下培养物：大肠杆菌0157:H7(CDC 01，03)、大肠杆菌O157:H7(USDA-FSIS 011-82 Rif resistant 100ppm)、大肠杆菌O157:H7(ATCC 43895HUS associated Type I and Il toxins Rif.Res.)及大肠杆菌ATCC#23740(Genotype K-12prototrophic lambda)。

[264]通过将一个浸润珠放入5ml的Tryptic Soy Broth(TSB)的溶液中，并在35℃处培养24小时，来培养保藏培养物。接下来，分别在5ml的TSB溶液中接种0.05ml接种环量的各种培养物，接着在35℃处培养24小时，以获得纯培养物。培养后，分别在49ml TSB中接种1ml的各种培养物，接着在35℃处培养24小时。在培养后，试样离心(15,300×g，4℃)，接着倾析出上清物质，并用50ml的0.1％的蛋白胨再悬浮所得团块，接着最后一次离心(15,300×g，4℃)。倾析出蛋白胨，接着用10ml的0.1％的蛋白胨再悬浮残留的团块。将5个10ml的各个培养物瓶混合在一起，以产生50ml含有10⁹cfu/ml的沙门氏菌混合物。使用0.1％的蛋白胨将混合物稀释到10⁶cfu/ml或10⁴cfu/ml。通过在选取的不同培养基上进行培养，并使用API 2OE试剂盒对假定菌落进行生化分析，来确认培养物。

[265]接种的方法。将牛的肋部肉(腹肌肉)试样修剪成13×8cm(104cm²)，接着用沙门氏菌的5种菌株混合物、或大肠杆菌O157:h7分别以较高接种液浓度(10⁶log cfu/cm²)和较低接种液浓度进行接种(10⁴log cfu/cm²)。用具有其内含试样的密封接种物容器的塑料喷瓶，将该接种物雾化喷在组织表面上。对于较高浓度和较低浓度的接种液，肉表面上的沙门氏菌的实际浓度分别近似为5.0和3.4log cfu/cm²。至于大肠杆菌O157:H7，肉表面的接种浓度分别是4.2和3.9log cfu/cm²。

[266]然后将牛肉试样垂直悬挂在连接在电动车的不锈钢钩上，该电动车将拉着牛肉试样通过标准喷雾室(堪萨斯州州立大学，食品安全实验室)，进行喷雾处理。用本发明的银组合物或去离子水以20psi、相隔13cm对标准压力冲洗室内的牛肉处理20秒。喷嘴(BETENF0580 303)将约20ml的溶液喷到牛肉试样的表面上。溶液及处理室的温度为约14℃。在处理0、20、60和240分钟后，从牛肉试样的侧面随机获得一式两份的3.5cm²的肉心样品。在选取回收的不同培养基上培养并检测试样。通过用0分钟处接种物/未处理样品的log₁₀cfu/cm²减去在特定取样时间处(0、20、60、以及240分钟)接种物/经处理样品的log₁₀ cfu/cm²，计算减少量的对数。样品处理包括使用根据本发明的32ppm、22ppm、以及10ppm的银组合物。分别对22ppm的Ag与1.5wt％的过氧化氢的组合以及10ppm的Ag与10ppm的过硫酸钾(K₂S₂O₈)的组合进行测试。

[267]C.32ppm的银组合物的结果

[268]使用根据本发明的32ppm的银组合物使牛排上的细菌减少。在下文中，将该减少量表示为在时间0处对照样中细菌数与在取样(即处理)时间处经处理的样品中细菌数量的比值的对数(log₁₀)。

[269]对于以较低的初始细菌数(10⁴)存在的沙门氏菌，减少量的对数被记录如下：0分钟处为0.78、20分钟处为1.11、60分钟处为1.08、以及240分钟处为1.23。因此，在4小时(240分钟)处，对照物中初始细菌数与用32ppm的银处理过的试样中的细菌数的比值为10^1.23。对于更高的初始细菌数(10⁶)，减少量的对数被记录如下：0分钟处为0.86、20分钟处为0.95、60分钟处为0.98和240分钟处为1.17。该结果表明，本发明的32ppm的银实施方式显示出对牛排上的沙门氏菌有效的杀菌效果。这是令人鼓舞的，因为在肉表面上杀菌对任何杀菌剂来说均是一种极限测试。

[270]对于用于较低的初始细菌浓度(10⁴)的大肠杆菌，减少量的对数被记录如下：0分钟处为1.03、20分钟处为1.28、60分钟处为1.42、以及240分钟处为1.58。对于更高的初始细菌数(10⁶)，减少量的对数被记录如下：0分钟处为0.65、20分钟处为0.60、60分钟处为0.83和240分钟处为0.87。该结果表明，本发明的32ppm的银实施方式显示出对牛排上致病的大肠杆菌有效的杀菌效果。

[271]D.22ppm银组合物的结果

[272]银水的结果。对于以较低的初始细菌浓度(10⁴)存在的沙门氏菌，减少量的对数被记录如下：0分钟处为0.41、20分钟处为0.43、60分钟处为0.48、以及240分钟处为0.68。对于更高的初始细菌数(10⁶)，减少量的对数被记录如下：0分钟处为0.24、20分钟处为0.24、60分钟处为0.42和240分钟处为0.61。该结果表明，本发明的22ppm的银实施方式具有对牛排上的沙门氏菌有效的杀菌效果。

[273]银水组合物与1.5wt％过氧化氢的结果。对于用于较低的初始细菌浓度(10⁴)的沙门氏菌，减少量的对数被记录如下：0分钟处为0.34、20分钟处为0.33、60分钟处为0.36、以及240分钟处为0.62。对于更高的初始细菌数(10⁶)，减少量的对数被记录如下：0分钟处为0.28、20分钟处为0.14、60分钟处为0.30和240分钟处为0.69。该结果表明，本发明的与1.5wt％过氧化氢组合的22ppm的银实施方式具有对牛排上的沙门氏菌有效的杀菌效果。

[274]E.10ppm的银组合物的结果

[275]银水组合物的结果。对于用于较低的初始细菌浓度(10⁴)的沙门氏菌，减少量的对数被记录如下：0分钟处为0.38、20分钟处为0.41、60分钟处为0.39、以及240分钟处为0.61。对于更高的初始细菌数(10⁶)，减少量的对数被记录如下：0分钟处为0.24、20分钟处为0.21、60分钟处为0.41和240分钟处为0.54。该结果表明，本发明的10ppm的银实施方式具有对牛排上的沙门氏菌有效的杀菌效果。

[276]与10DDm的K₂S₂O₈组合的银水组合物的结果。对于用于较低的初始细菌浓度(10⁴)的沙门氏菌，减少量的对数被记录如下：0分钟处为0.26、20分钟处为0.28、60分钟处为0.35、以及240分钟处为0.58。对于更高的初始细菌数(10⁶)，减少量的对数被记录如下：0分钟处为0.03、20分钟处为0.16、60分钟处为0.21和240分钟处为0.36。该结果表明，本发明的与10ppm的过硫酸钾(K₂S₂O₈)组合的10ppm的银实施方式具有对牛排上的沙门氏菌有效的杀菌效果。

[277]10PPM的银有效用于治疗人类疾病的证据

[278]A.实施例的目的

[279]本实施例的目的在于说明本发明的银基组合物实施方式用于治疗各种人类疾病的应用。这部分的研究由Dr.Kwabiah在西非加纳的空军驻地医院、Sr.Sackey在Korie-Bu教学医院和Dr.Abraham在Justab临床/产科医院进行。用本发明的含10ppm银的银/水组合物对总共58个病人进行了治疗。该组合物被用在体内和体外用作传统抗生素的替代品。治疗的疾病包括疟疾、上呼吸道感染、尿路感染、窦炎、阴道酵母菌感染、眼睛、鼻子及耳朵感染、切口、真菌皮肤感染、以及性传染病比如淋病。

[280]B.治疗方法及结果

[281]腹痛及腹泻。该方法包括如下步骤：用约5～25ml的所述银组合物进行给药，每天口服1～5次，直到有反应为止。一天中用10ml(约两小匙)本发明的组合物对一个病人治疗3次。病人在一天内完全康复。

[282]支气管炎。该方法包括如下步骤：用约2～25ml的所述银组合物进行口服给药，每天1～5次，直到有反应为止。每天用5ml(约两小匙)本发明的组合物对两个病人治疗2次，持续3天。病人在三天内完全康复。

[283]阴道酵母菌(假丝酵母)。该方法包括如下步骤：用约5～25ml的银组合物作为阴道洗剂进行给药，每天1～5次，直到有反应为止。每天用约10ml(约两小匙)本发明的组合物对5个病人治疗两次。病人在六天内完全康复。

[284]结膜炎。该方法包括如下步骤：用几滴银组合物对受感染的眼睛进行给药，每天1～5次，直到有反应为止。每天用几滴本发明的组合物对2个病人受感染的眼睛治疗两次。病人在一天后完全康复。

[285]外部切口及感染(包括葡萄球菌皮肤感染、溃疡腐烂及脓疮感染)。该方法包括如下步骤：用银组合物对感染区进行给药，每天1～5次直到有反应为止。每天用5ml(约1小匙)本发明的组合物对6个病人的感染区治疗2次。病人在三天内完全康复。

[286]外耳炎。该方法包括如下步骤：用银组合物对受感染的耳朵进行给药，每天1～5次，直到有反应为止。每天用约两滴本发明的组合物对6个病人受感染的耳朵治疗3次。病人在约四天后完全康复。

[287]中耳炎。该方法包括如下步骤：用银组合物对受感染的耳朵进行给药，每天1～5次，直到有反应为止。每天用约两滴本发明的组合物对一个耳朵受感染的病人治疗3次。病人在四天内完全康复。

[288]真菌皮肤感染。该方法包括如下步骤：用银组合物对局部感染区进行给药，每天1～5次，直到有反应为止。每天用约10ml(约两小匙)本发明的组合物对2个病人治疗3次。病人在八天内完全康复。

[289]淋病。该方法包括如下步骤：用银组合物对感染区进行给药，直到有反应为止。每天用约10ml(约两小匙)本发明的组合物对2个病人治疗3次。病人的症状在六天内消失。

[290]疟疾。该方法包括如下步骤：用银组合物对病人进行口服给药，每天1～5次，直到有反应为止。在第一研究阶段，每天用约10ml(2小匙)本发明的组合物对11个病人治疗3次。病人的症状在5天内消失。下文将对疟疾方案进行更详细地说明。

[291]口臭及齿龈炎。该方法包括如下步骤：用银组合物作为漱口药进行给药，每天1～5次，直到有反应为止。用该组合物作为漱口药对两个病人各自进行治疗。症状在三天内(齿龈炎)和一天内(口臭)完全消失。

[292]盆腔炎。该方法包括如下步骤：用约5～25ml的银组合物作为阴道洗剂进行给药，每天治疗1～5次，直到有反应为止。每天用约5ml(约1小匙)本发明的组合物对1个病人治疗2次。病人的症状在5天内消失。

[293]咽炎。该方法包括如下步骤：用银组合物作为漱口剂进行给药，每天治疗1～5次，直到有反应为止。每天用约10ml(2小匙)本发明的组合物对4个病人治疗3次。病人在六天内完全康复。

[294]逆转录病毒感染(HIV)。该方法包括如下步骤：用包含5～40ppm银的银组合物对口腔区域进行给药，每天治疗1～5次，直到有反应为止。每天用约5ml(约1小匙)本发明的组合物对1个显示HIV(艾滋病毒)的病人治疗2次。病人的症状在5天内消失。

[295]窦炎及鼻炎。该方法包括如下步骤：用银组合物对鼻子进行给药，每天治疗1～5次，直到有反应为止。每天用约两滴本发明的组合物滴入鼻腔而分别对鼻腔感染的6个病人(四个为窦炎，两个为鼻炎)治疗3次。病人在四天内完全康复。

[296]扁桃体炎。该方法包括如下步骤：用银组合物作为漱口剂进行给药，每天治疗1～5次，直到有反应为止。每天用本发明的组合物对一个病人治疗3次。病人在七天内完全康复。

[297]上呼吸道感染。该方法包括如下步骤：用所述银组合物进行口服给药，每天治疗1～5次，直到有反应为止。每天用约5ml(约l小匙)本发明的组合物对2个病人各自治疗3次。病人在六天内完全康复。

[298]尿路感染。该方法包括如下步骤：用所述银组合物进行口服给药，每天治疗1～5次，直到有反应为止。每天用约10ml(2小匙)本发明的组合物对3个病人治疗2～3次。病人在六天内完全康复。

[299]C.讨论

[300]这些结果与此处报道的体外试验中的各种情况相一致。实质上，银组合物对大量微生物的体外抑制是非常有效的。然而，试验显示，即使在大量有机材料存在的前提下，仍保持该效果。在有机背景相当高的情况下，银组合物也

是普遍体内有效的。许多其他杀菌剂在大量有机材料存在的前提下是无效的，并且/或者是腐蚀性过大或有毒而不能用于体内。

[301]在非洲加纳额外进行的疟疾研究

[302]在加纳还进行了另一个更集中的研究。本研究的目的在于使用一个非常特殊的方案，并且仅集中于本发明的10ppm的银/水组合物对感染了疟疾的病人的治疗性能。

[303]本方案的目的在于设计一种工艺，借此对根据本方法制得的10ppm的银/水溶液对病人可能的治疗性能进行测试，该感染了疟疾的病人已感染了四种疟原虫的一种。对该方案的概述如下：

[304]由对该疾病及其治疗领域非常熟悉的内科医生在内科门诊部或在医院内进行试验。每个医生总共检查16个病人，并要求病人每天服用银产品2次，共持续5天，在试验开始前的某天抽取他们的血液，接着每天如此，直到血液检查显示寄生虫已经消失了至少两天。只有病人完全遵从安排服用银并进行每日血液检查才支付报酬。

方案中的细节：

参与试验的内科医生数：2人

每个内科医生检查的病人数：16～8个男性和8个女性

[305]试验的总天数：15天

[306]用于治疗病人的10ppm的银/水组合物的剂量：总的1盎司的日剂量分成两份相等的剂量：上午服用二分之一盎司(3茶匙)，下午服用二分之一盎司(3茶匙)。用银/水溶液在总共15天的试验中的5天内对病人进行治疗，或者如果寄生虫到第5天时仍没有完全清除，那么继续进行银/水治疗，直到寄生虫被清除，或者直到15天，这在第一次试验时曾经发生过。

[307]如果病人的寄生虫到第二天或第三天时被清除，那么继续服用银/水直到5天，将此时作为寄生虫被完全清除的时间而在记录本中进行记录。

[308]如果病人在服用了15天的银/水后仍携带寄生虫，那么如常终止试验，在记录本中将该病人记录为没有治愈。

[309]对于在不到5天内被治愈的病人，记录完成寄生虫消失的日期，病人继续服用银/水直到5天，并继续试验直到15天。

血液检查：

[310]待用的血液检查：通过对来自各个病人的薄的或厚的血液涂片进行吖啶橙染色试验、或吉姆萨氏染色试验，来确定病人血液中寄生虫的存在(或消失)。在第0天测试病人的血液，以确定他们确实具有疟疾活性情况。如果血液检查确认了疟疾活性情况，那么接着筛选进入试验的病人。筛选包括记录重要的数据比如名字、年龄、报告的病人发病日、告知病人在试验期间对他们的要求、完全服从时支付给他们的报酬、以及不服从将导致其没有报酬地从试验中退出。对同意参加试验的病人，给他们一份手写的指令表，告诉他们每天如何服用银产品，每天去哪里进行血液检查，以及强调为获得这些天的报酬按试验方案完成的必要性。

上述方案严格遵循在非洲加纳进行的最新研究。所有的病人均服用相同的剂量，每天检查他们的血液以确定疟原虫类寄生虫的存在。下表4列举出如上所述的早期研究(研究1和研究2)、以及作为上述刚提出的方案的新的研究3。

[311]概要

表4

 

研究1234病人数11161613年龄范围8～752～903～6115～57男性/女性NANA8/86/7日均剂量10ml5ml15ml15ml最短的康复时间⁺3天3天2天3天最长的康复时间7天10天8天6天平均康复时间5.0天6.3天4.3天4.0天#用于检查疟原虫的病人071613#病人W.疟原虫000^*0^*#治疗失败0000

+康复时间为当医生评估时，无症状病人的治疗时间。

^*每天对这些病人中的每一位进行检查，持续14天。六天后，他们的血样中的都显示疟原虫阴性。

[312]显而易见，本发明的10ppm的银/水溶液具有显著的抑制疟疾寄生虫的积极效果。

[313]100ppm的银有效抑制疟疾(在体外)的证据

[314]引言

[315]在全球范围内，疟疾已经成为且始终是公共卫生主要关注的问题。该疾病由疟原虫属的寄生原生虫引起。该生物体的生活史是复杂的，该寄生虫要么在无脊椎动物寄主(蚊子)中进行有性繁殖，要么在脊椎动物寄主中进行无性繁殖。除了哺乳动物作为脊椎动物寄主之外，鸟类及爬行动物也可作为疟原虫的寄主。蚊子中疟原虫的生活史部分是导致子孢子形成的孢子生殖阶段，该子孢子在喂食时通过载体被引入脊椎动物寄主体内。子孢子导致裂体生殖阶段，该阶段内寄生虫在红细胞处及红细胞外位点繁殖。寄生虫在其孢子生殖阶段是在细胞外，在裂体生殖开始阶段则转到细胞内位置。在寄生虫的体外培养中，要求模拟蚊子载体中生命史的孢子生殖阶段的条件、以及模拟促进寄生虫在脊椎动物寄主中红细胞外及红细胞位置生长的裂体生殖阶段条件。

[316]疟疾是世界上最流行的寄生疾病之一，考虑到致命性，其在世界上主要传染病中的级别不低于第三级。导致疟疾的原生动物寄生虫来自于疟原虫属。如下四种疟原虫原生虫导致疟疾：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。主要通过疟蚊类蚊子传入，与受感染的血接触，比如输血也会发生疟疾感染。

[317]疟疾的典型症状包括发烧、头疼、寒冷、呕吐、发抖和惊厥。在一些少见的恶性疟疾中，可以没有寒热症状，病人可能神智昏迷或昏迷。症状缓解周期能持续几周到几个月。通常将严重的贫血归于因感染疟疾而死亡的原因。

[318]恶性疟原虫：

该寄生虫具有几个重要的特征。这些特征包括：配子母细胞的新月形形状、其后者较慢的生长速度、以及细胞核周围色素的局域化(围核分布)，该局域化在其他灵长类疟原虫的配子母细胞中是没有的。

恶性疟原虫也不同于其他人类疟原虫，其具有更高的毒性和致死效应，此时恶性疟原虫在红细胞内阶段的裂殖生殖主要局限于毛细管及内脏器官窦。由恶性疟原虫导致的该疾病的通用名称是“恶性间日疟”。

材料及方法

柠檬酸盐水：

氯化钠 9gm

柠檬酸钠 20gm

蒸馏水 1000ml

吉姆萨氏染液(Giemsa Stain)：

吉姆萨氏染色剂粉末 75g

绝对乙醇 75ml

甘油 25ml

Field′s 染液：

Field′s溶液#1

1.将1.6g的亚甲基蓝溶解到1升的蒸馏水中。

2.将2.6g的Na₂HPO₄(无水)溶解到步骤1所得溶液中。

3.将1g的天青1号(Azure 1)溶解到步骤2所得溶液中。

4.将2.6g的KH₂PO₄溶解到步骤3所得溶液中。

5.将其温和加热，同时搅拌或振荡45分钟～1小时。

6.室温下静置24小时。

7.过滤

Field′s溶液#2

1.将2g的曙红Y溶解到1升的蒸馏水中。

2.将2.6g的Na₂HPO₄溶解到步骤1所得溶液中。

3.将2.6g的KH₂PO₄溶解到步骤2所得溶液中。

4.过滤

赖特氏染液(Wright′s Stain)：

赖特氏染剂粉末 6.0g

吉姆萨氏染色剂粉末 0.6g

甲醇 1,000ml

使用前搅拌过夜并过滤。

人的血清/血型AB+的血浆

人的血清/血型A+的血浆

RPMI-1640不完全培养基

(个人通信：Dr.Sutar，Haffkine Institute，Parel)

RPMI-1640完全培养基

(个人通信：Dr.Sutar，Haffkine Institute，Parel)

受感染血液的收集及处理

[319]通过对孟买的Kasturba传染病医院中临床诊断患有间日疟原虫及恶性疟原虫疟疾的病人进行静脉穿刺，在1ml的柠檬酸盐水中收集了6ml等分的血，由此获得寄生红细胞。血样被收集在10ml的无菌小瓶中。通过制备薄的涂片并用10％用于识别及确认疟原虫种类的吉姆萨氏染液/菲氏染液/赖特氏染液使涂片染色来检测试样。记录试样中寄生虫血症的百分比。

[320]用不完全培养基清洗寄生的血细胞两次，接着用完全培养基清洗一次，于是在完全培养基中制得6％的细胞悬液。通过在每个培养皿中配制0.5ml的悬浮物来准备培养物。向其中添加1.5ml的完全培养基，接着在5％的CO₂及14～17％的O₂的环境中培养平板。每天通过用无菌巴氏吸管吸出旧的培养基并添加1.5ml的完全培养基来更换培养基。通过在一周后添加新的细胞(取自A+或AB+型血液；按与上述相同的方法进行洗涤并制备悬浮液)、每周清洗2次来维持培养，直到目标寄生虫指数达到≥1％。如果初始寄生虫指数超过1％，那么将血液培养基混合物(BMM)直接用于药物敏感性(Thanh，2001)及其它方面研究(Tasanor，2002)。

涂片的制作及染色工艺

[321]每周清洗培养物两次。至于清洗，将培养物从平板中移出，并将其转移到离心管中。将约5ml的不完全培养基添加到各个离心管中并充分混合。以约1000～1500rpm的速度离心试管10分钟。约10分钟后，从离心机中移出试管，接着除去上清液。随后，使培养物经历两次非常类似的清洗，一次使用RPMI-1640不完全培养基，另一次使用RPMI-1640完全培养基。三次清洗后将培养物转移到各个培养皿中。由各个培养物制得涂片，接着用吉姆萨氏/Field′s/赖特氏染液使其染色。将约1.5ml的培养基添加到各个平板，并在光学显微镜下对平板进行检测，记录下各个培养物的寄生虫指数或寄生虫血症的百分比。每个星期向各个平板中添加新的红细胞(Pradhan，1984)。

[322]涂片的制作

[323]将一滴平板中的培养物放在载物片上。制作薄片并使其风干。通过将载物片浸在含有绝对乙醇的摇瓶中来固定该涂片。制备10％的吉姆萨氏染液，接着将其用于染色涂片。将载物片浸入10％的吉姆萨氏染液中约30～40分钟，接着在自来水下清洗。

[324]寄生虫指数

[325]通过计算薄的血液涂片中每100个红细胞中的寄生虫数目，来计算寄生虫指数。为此观察最小量的100个网格或10,000个红血球(RBC)。

[326]培养系统

用5％的血细胞和约1％的寄生虫血症制备平板培养物。初始寄生虫血症越低，在体外生长期间产生的寄生虫的数量增加得越多。

[327]药物敏感性

[328]将16mm的平底无菌的微孔板用于药物敏感性试验。一个微孔板用于一个试样。头两个孔用作对照，孔中装入50μl病人的BMM或培养物以及50μl的RPMI完全培养基，但不装入药物。为进行测试，将50μl培养物或病人的BMM混入含有50μl具有各种浓度的制得的银纳米颗粒(ESNP)的孔中。覆盖微孔板，接着在约37℃处、于烛罐中将其培养约48小时。大部分寄生虫在48小时培养的末尾进入裂殖体阶段。培养后，用微量吸管除去浮于上层的培养基，从各个孔中取出血液用于制作涂片，并观察裂殖体进展情况。通过计算在培养前的染色膜和培养后的染色膜中寄生虫的数量、以及与抑制裂殖体形成有关的ESNP，来对试验进行评估。对于有效的试验，对照样孔应显示≥10％的成熟裂殖体(Wemsdorfer和Wemsdorfer，1995)。

结果

 

种类寄生虫减少百分比恶性疟原虫94％间日疟原虫92％伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)90％

[329]用作显示抗疟疾功效的体外试验结果表明，ESNP-100ppm能够体外降低寄生虫数。由于收集的寄生虫来自于那些显示出体温升高较多及典型疟疾感染症状的病人，故这是有意义的。

[330]10PPM的银有效抑制结核细菌的证据

[331]A.目的

[332]本实施例的目的在于证明本发明的银组合物抑制引起结核的细菌的功效。本实施例描述了用于评估本发明的杀结核菌功效的方法。该方法基于在1985年12月11日被EPA接受的杀结核菌活性试验方法。[参见：美国环境保护局，1986，杀虫剂和有毒物质办公室。对所有具有杀结核菌要求的抗菌杀虫剂杀结核菌有效性数据的电话会议通知数据(1986年6月13日接到)]。

[333]B.材料和方法[334]材料。本发明的银组合物包括10ppm的水中银。通过使用液体或液体基体抑制牛分枝杆菌BCG(Mycobacterium bovis BCG，TMC 1028)来对银组合物进行评估。该生物体引起动物结核，从而导致人类患上结核。将其用作主要引起人类结核的结核杆菌(M.tuberculosis)的“代表”，如试验所示，该组合物对结核杆菌具有类似的敏感性。一式两份地将试验菌暴露于银组合物中四次，接着用膜滤法定量。

[335]工序。从保藏器中取出一小瓶冰冻的保藏培养物，并进行解冻。将等体积的缓冲明胶(BUGE)添加到细胞悬液中，接着在将培养物置于冰浴器中保持0～4℃下，用(聚四氟乙烯类)组织研磨器将其均质化1分钟。用 80(聚山梨酸酯)盐水溶液(ST80)将均一化的细胞悬浮液稀释到约10⁷cfu/ml。

[336]测试滴定。在含有9ml中和剂肉汤(NEUB)的稀释空白液中，通过进行10^-6的稀释，制备培养物的十倍逐级稀释液。通过首先向过滤室中添加10～20ml的生理盐水(PHSS)，接着添加1ml等分的合适的稀释液，来膜滤3个1ml等分的适当的稀释液。然后用约100ml的PHSS冲洗滤料。从过滤室中无菌地移出滤料，接着将其置于7H11琼脂平板上。在37±2℃处，在湿容器中培养平板21天。

[337]阳性对照。制备含有9ml的ST80的试管，并使其在20±0.5℃处进行平衡。在0时刻，将1ml的试验菌培养物添加到试管中(1:10稀释)。将试样保持60分钟。通过10^-6的稀释，在含有9ml的NEUB的空白稀释液中制备十倍逐级稀释液。通过首先向过滤室中添加10～20ml的生理盐水(PHSS)，接着添加1ml等分的合适的稀释液，来膜滤3个1ml等分的合适的稀释液。然后用约100ml的PHSS冲洗滤料。从过滤室中无菌地移出滤料，接着将其置于7H11琼脂平板上。在37±2℃处，在湿容器中培养平板21天。

[338]测试。将两个含有9ml试样的25×150mm试管在水浴器中在20±0.5℃处进行平衡。向每个含有试验杀菌剂(即银组合物)的试管中添加1ml的试验菌培养物。通过涡旋混合试管，接着将其放回到水浴器中。在15、30、45、以及60分钟时，将1.0ml等分的杀菌剂-细胞悬液转入到9ml的NEUB中，并充分搅拌。通过10^-6的稀释，在含有9ml的NEUB空白稀释液中制备十倍逐级稀释液。通过首先向过滤室中添加10～20ml的PHSS，接着添加1ml等分的合适的稀释液，来膜滤3个1ml等分的合适的稀释液。用约100ml的PHSS冲洗滤料。从过滤室中无菌地移出滤料，接着将其置于7H11琼脂平板上。在37±2℃处，在湿容器中培养平板21天。

[339]苯酚对照。为显示培养物最低的活力及耐药性，对培养物抗0.8％苯酚溶液的性能进行测试。将1ml等分的试验菌培养物放入在25±0.5℃处平衡后的9ml苯酚溶液中，接着培养20分钟。在暴露期之后，从苯酚/生物体溶液中取出1ml溶液，并将其添加到9ml的NEUB中。通过10^-6的稀释，在含有9ml的NEUB空白稀释液中制备十倍逐级稀释液。通过首先向过滤室中添加10～20ml的PHSS，接着添加1ml等分的合适的稀释液，来膜滤3个1ml等分的合适的稀释液。用约100ml的PHSS冲洗滤料。从过滤室中无菌地移出滤料，接着将其置于7H11琼脂平板上。在37±2℃处，在湿容器中培养平板21天。

[340]中和验证。将1ml等分的杀菌剂添加到8ml的NEUB中。使杀菌剂/中和剂肉汤在与试样相同的温度处进行平衡。将1ml的试验菌培养物添加到混合物中并充分混合。持续培养的时间大约为试样可进行过滤所需的时间。此外，向9ml的NEUB中添加1ml等分的试验菌并充分混合(1:10稀释)。在含有9ml的NEUB空白稀释液中，通过10^-6的稀释，制备十倍逐级稀释的两种试管。通过首先向过滤室中添加10～20ml的PHSS，接着添加1ml等分的合适的稀释液，来膜滤3个1ml等分的合适的稀释液。用约100ml的PHSS冲洗滤料。从过滤室中无菌地移出滤料，接着将其置于7H11琼脂平板上。在37±2℃处，在湿容器中培养平板21天。

[341]C.结果

[342]测试培养物的初始滴度为4.7×10⁷cfu/ml。阳性对照滴度是6.5×10⁶cfu/ml。与空白培养基相比，用于本研究的培养基有效地显示出在杀菌剂/中和剂溶液中具有95.2％回收率的中和性。

[343]至于试验平板，预期的数值被低估，于是报道的数值显示为“>”，以标记该数值是估算的，并且其精确值超过了对稀释液平板的检测极限。

[344]在计算杀菌剂抗牛分枝杆菌的对数值和减少量百分比中，“大于”计算值的估算数值导致“小于”对数及减少量百分比(“<”)。其目的在于显示该结果是估算的并且超过了对稀释液平板的精确检测极限。用阳性对照作为生物体初始滴度来计算所有的减少量。对数及减少量百分比结果总结如下。作为耐测试培养物的度量，在暴露于0.8％苯酚20分钟时，牛分枝杆菌的耐苯酚性显示为约1.81log减少量。

[345]第一次重复：

 

暴露时间log减少量减少量的百分比15分钟<0.12<12.3％30分钟<0.22<40.0％45分钟<1.57<97.2％60分钟<1.56<97.2％

[346]第二次重复：

 

暴露时间log减少量减少量的百分比15分钟<0.26<44.8％30分钟<0.20<36.9％45分钟<1.58<97.3％60分钟<1.53<97.1％

[347]D.结论

[348]使用本发明的银组合物可以有效地抑制肺结核细菌。一种包括给药本发明银组合物的步骤的方法可以有效地抑制肺结核生物体。

[349]10PPM的银有效抑制白色念珠菌ATCC #10231、阴道滴虫ATCC #20235、以及MRSA金黄葡萄球菌ATCC #BAA-44的证据

[350]A.实施例的目的

[351]本实施例的目的在于阐明本发明的银组合物对抗白色念珠菌(Candida albicans)ATCC10231、阴道滴虫(Trichomonas vaginalis)ATCC 20235、以及耐药性金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC BAA-44的功效。

[352]白色念珠菌-一种酵母菌、以及阴道滴虫-一种原生虫，能导致许多健康问题，包括阴道炎、尿布疹、以及鹅口疮。如下结果显示，本发明的银组合物对两种生物体产生近似100％的杀死率。该结果显示了本发明的银组合物在女性卫生用品和尿布疹产品中的用途。

[353]当金黄葡萄球菌进入伤口时，其能导致严重的败血症。青霉素曾较容易地治疗该病，但该生物体现在已经变异到具有完全地抗青霉素的程度。该抗生素紧接着的第二代是二甲氧基苯青霉素，但抗二甲氧基苯青霉素的菌株已经变得日益普遍，尤其在医院中。已知这些菌株为MRSA(耐2，6-二甲氧基苯青霉素金黄葡萄球菌)，它们已被称为“超级臭虫”。感染MRSA的人能在大约几天内死亡。在本实施例报道的结果中，发现本发明的银组合物在仅10分钟内杀死91.6％的MRSA，在一小时内杀死99.5％的MRSA。该结果显示了本发明的银组合物在杀死已知的有传染威胁的MRSA中的用途。

[354]B.方法及结果

[355]使用本发明的在水中包含10ppm的银的组合物，采用USP防腐快速挑战试验，获得如下结果。这些结果显示，本发明的银组合物能有效地抑制酵母菌感染、原生虫感染、以及耐药性细菌感染。

[356]白色念珠菌ATCC#10231。白色念珠酵母菌的初始浓度是6.8x10⁵cfu/ml。在与银组合物接触10分钟、30分钟、1小时、或一天后，没有检测到菌落。

[357]阴道滴虫ATCC#30235。阴道滴虫原生虫的初始浓度是6.0×10⁴cfu/ml。在与银组合物接触10分钟、30分钟、1小时、或一天后，每100个生物体的活性为0％。也就是说，通过用于检测鞭毛活性的显微镜对100个阴道滴虫寄生虫进行分析。在与银组合物仅接触10分钟后，100个寄生虫中没有一个显示活性，这说明银组合物对寄生虫具有抑制的或致命的性能。在接触一天后，25％的寄生虫的外膜破裂。

[358]金黄葡萄球菌MRSA ATCC #BAA-44。耐2，6-二二甲氧基苯青霉素的金黄葡萄球菌(MRSA)的初始浓度是6.0×10⁶cfu/ml。在与银组合物接触后，在接触10分钟后探测到其浓度为500,000cfu/ml(杀死91.6％的MRSA)，接触30分钟后为70,000cfu/ml(杀死98.8％的MRSA)，接触1小时后为30,000cfu/ml(杀死99.5％％的MRSA)，接触一天后为低于10cfu/ml(几乎完全杀死MRSA)。

[359]10PPM的银、14PPM的银+1.5％ H₂O₂、以及22PPM的银在抑制下文所述B型肝炎的DNA聚合酶和反转录酶的功效及没有细胞毒性的证据

[360]A.实施例的目的

[361]本实施例的目的在于阐明本发明的银组合物抑制B型肝炎的功效。本实施例显示，本发明的银组合物具有抗病毒特性。用于抗病毒治疗的任何试剂应显示出几乎无细胞毒性，故对银组合物的细胞毒性进行了分析。

[362]B型肝炎由病毒科嗜肝DNA病毒中的DNA病毒引起。B型肝炎病毒(HBV)是3.2kb的DNA病毒，其几乎仅在肝细胞内复制。复制涉及两种主要的酶：DNA聚合酶和反转录酶。本实施例的结果表明，本发明的银组合物干扰了DNA聚合酶或反转录酶的复制。本实施例的结果显示，本发明的银组合物具有抗病毒特性。本实施例的结果显示，本发明的银组合物可以有效地抑制B型肝炎。

[363]进一步详细地说，当B型肝炎进入新寄主的身体时，如果它打破了寄主的免疫系统，那么其会感染肝脏。在该感染中，病毒附在肝细胞的细胞膜上，接着病毒的核心颗粒进入肝细胞。然后，核心颗粒将其DNA及DNA聚合酶成分释放到肝细胞核内。在肝细胞内，通过反转录及翻译过程复制病毒，该病毒包括反转录酶和DNA聚合酶。TDNA聚合酶导致肝细胞产生B型肝炎DNA的拷贝。这些复制的病毒从肝细胞膜释放到血液中。在血液中，它们能感染其他的肝细胞，从而有效地复制。B型肝炎病毒的孵育期约为6～25周(即在发生物理及一般可检测的组织学变化或身体症状之前的时间)。然而，有一些生物化学变化和组织变化发生在如下感染B型肝炎病毒的早期。

[364]B.材料

[365]使用包含根据本公开的10ppm、14ppm、22ppm、以及32ppm的银组合物的溶液。如同获得化合物拉米夫定(合成的抗逆转录剂)和齐多夫定(AZT)一样，从标准商品供应商处获得核苷酸dATP、dGTP、dCTP、和[³H]-dTTP。从受到B型肝炎感染的人中分离出新鲜的B型肝炎病毒，并由Haffine研究所、Mumbai INDIA(WHO认证的试验室)认可。通过典型的细胞培养方法使试验细胞培养物(Vero和Hep2)生长成茂密的单层细胞。

[366]C.方法

[367]1)用于测试DNA聚合酶抑制性的方法。

[368]综合法。用放射性标记的核苷酸和活性抑制剂孵育取自患者的B型肝炎病毒。基于再合成的病毒核酸相对于作为阳性对照的拉米夫丁和作为阴性对照的磷酸盐缓冲液盐水(PBS)的量，计算抑制百分数。

[369]特定的方法。溶解分离的B型肝炎病毒以萃取出游离的聚合酶，从而不含污染性酶。将病毒萃取物(25ml)添加到包含dATP、dGTP、dCTP和[³H]dTTP核苷酸的反应混合物(25ml)中。将活性抑制剂(3ml)添加到包含病毒萃取物和核苷酸的混合物中。在37℃处，将获得的混合物保温24小时。

[370]进行单独的阴性对照试验，其中用磷酸盐缓冲液盐水(PBS，3ml)代替抑制剂(3ml)。

[371]进行单独的阳性对照试验，其中用已知的DNA聚合酶抑制剂(3ml、浓度为3mg/ml的拉米夫丁)代替试验抑制剂(3ml)。

[372]通过添加25ml EDTA和25ml TCA(三氯乙酸)来中断反应。然后将反应混合物点到离子纸(二乙基氨基乙醇(DEAE)纸)上。首先用TCA、接着用乙醇清洗该纸3次。风干滤纸，然后将其放入装有闪烁混合物的闪烁瓶中。通过液体闪烁计数器(Blue Star公司)测定放射性。作为计数对照，在整个工序中始终使用不加病毒的空白银组合物，以检测闪烁计数器方法中任何可能的干扰。

[373]该方法参照P.S.Venkateswaran，I.Millman，以及B.S.Blumberg，“Effect of an extractfrom Phyllanthus niruri on hepatitis B and woodchuck hepatitis viruses：in vitro and in vivostudies”，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1987，84，274～278。通过引用将其内容结合到本发明中。

[374]2)用于测试反转录酶抑制性的方法

[375]使用商品病毒酶制剂--具有聚(A)dT(用于RT的引发剂)的莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(MoMuLV)。将50ml的MoMuLV制品与dATP、dGTP、dCTP和[³H]dTTP核苷酸的混合物合并。

[376]将该混合物与待测试的3ml抑制剂合并，将获得的混合物在37℃处保温24小时。

[377]进行单独的阴性对照试验，其中用磷酸盐缓冲液盐水(PBS，3ml)代替抑制剂。

[378]进行单独的阳性对照试验，其中用已知的反转录酶抑制剂(3ml、浓度为0.625μg/ml的AZT)代替试验抑制剂。

[379]通过添加25ml EDTA和25ml TCA(三氯乙酸)使反应停止。然后将反应混合物点到电离纸(二乙基氨基乙醇(DEAE)纸)上。首先用TCA，接着用乙醇清洗该纸3次。风干滤纸，然后将其放入装有闪烁混合物的闪烁瓶中。通过液体闪烁计数器(Blue Star公司)测定放射性。

[380]3)用于测试细胞毒性的方法。

[381]从正常的、汇合Vero和Hep2的细胞培养物中制备细胞，该细胞培养物通过每隔3～4天进行传代来保持。在测试前一天，用标准技术从培养物中分离出测试细胞，接着使其悬浮在生长培养基中，并装入微孔滴定板的孔中，然后在37±2℃处，将其置于5％ CO₂的培养箱中。将等分的(100ml)各个试验物质装入到孔中(一式三份)，用100ml的PBS作为对照。每隔24小时，在大功率的的倒置显微镜下检测各孔以监测任何细胞病变效应(CPE)。所有的结果如下表5所示。

[382]D.结果

[383]反转录酶抑制性的测试结果：

表5a

样品                             抑制率％

阴性对照(PBS)                    0

阳性对照(AZT)                    31.33

银，10ppm                        89.52

银，14ppm和1.5％H₂O₂             86.93

银，22ppm                        84.46

[384]DNA聚合酶抑制性的测试结果：

表5b

样品                            抑制率％

阴性对照(PBS)                   0

阳性对照(拉米夫定)              31.33

银，10ppm                       77.73

银，14ppm和1.5％H₂O₂            65.6

银，22ppm                       60.89

[385]本发明的银组合物在抑制DNA聚合酶上是卓有成效地。

[386]抑制反转录酶的测试结果：

表5c

样品                            抑制率％

阴性对照(PBS)                   0

阳性对照(AZT)                   18.06

银，10ppm                       89.52

银，14ppm和1.5％H₂O₂            86.93

银，22ppm                       84.46

[387]因此，本发明的银组合物抑制反转录酶。预期本发明的银组合物能有效地抑制由病毒，比如B型肝炎繁殖产生的人类疾病。

[388]细胞毒性的测试结果：

表5d

试样                    Vero               Hep2

对照样(PBS)             无CPE              无CPE

银，10ppm               无CPE              无CPE

银，14ppm和1.5％H₂O₂    CPE阳性            CPE阳性

银，22ppm               无CPE              无CPE

[389]这些结果说明，银组合物基本上是无细胞毒性的。如预期的那样，已知具有细胞毒性的过氧化氢显示出细胞毒性效应。因此，当银用于体内时，其应是无害的。

[390]12.银组合物作为水杀菌剂的功效的证据

[391]A.目的

[392]进行试验以说明本发明的组合物在饮用水杀菌中的功效。

[393]B.方法

[394]用两接种环量的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxtyoca)穿刺接种原始河水试样。将100ml等分的该被穿刺接种的水溶液暴露于0.05ppm、0.1ppm、0.2ppm、0.5ppm、或1.0ppm的本发明的银组合物。在培养了5～60分钟之后，膜滤该试样。用约100ml的无菌水冲洗滤料。从过滤室中无菌地移出滤料，接着将其置于大肠杆菌营养琼脂平板上。在生长条件下培养平板24小时，并计数。

[395]表6

试样         银(ppm)      接触(分钟)   总的大肠菌数    Cfu/100ml

                                       (每ml)

原始水       -            -            36             TNTC

1            1.00         5.0          0              0

2            1.00         10.0         0              0

3            1.00         15.0         0              0

4            1.00         30.0         0              0

5            0.50         10.0         0              0

6            0.50         30.0         0              0

7            0.50         60.0         0              0

8            0.20         5.00         0              0

9            0.20         10.0         0              0

10           0.20         30.0         0              0

11           0.20         60.0         0              0

12           0.10         10.0         0              0

13           0.05         20.0         0              0

TNTC＝数目太多难以计数

[396]银组合物被证明具有令人惊奇的效果。即使在允许进行培养的最低测试浓度(0.05ppm)的银的最短时间(20分钟)处，仍能完全杀死细菌。在0.20ppm和更高浓度处，在5分钟处能完全杀死细菌。似乎显而易见，完全杀死细菌所用时间不到5分钟。

[397]32PPM的银作为表面杀菌剂的功效的证据

[398]美国环境保护局(EPA)已经批准本发明的32ppm的银组合物作为广谱表面杀菌剂用于医院、医学环境、住所、商业建筑、以及营业所中。已经批准将其用于抑制一些最致命的病原体，包括：革兰氏阳性菌，比如金黄葡萄球菌(目前被认为是在美国医院里最致命的细菌)、革兰氏阴性菌，比如猪霍乱沙门菌(导致食物中毒)、以及医院内病原菌，比如绿脓杆菌(在烧伤和切口中经常发现)。

[399]本发明的银组合物能喷在感染区上及其周围，而不危害人类或动物的健康或保健。通过用本发明的银组合物喷涂或通过用其擦抹，可以对选自墙壁、桌子、椅子、照明器具、浴室、玻璃、瓷器、金属、涂釉陶瓷、珐琅和涂漆中的物品进行表面杀菌。杀菌的优选方法包括如下一个或多个步骤：清洁待杀菌的表面，通过喷雾器、拖把、海绵、或布涂覆本发明的组合物，充分湿润待杀菌的表面积，在至少20℃的温度处，使表面保持潮湿至少10分钟(通过阿累尼厄斯方程式或普通技术人员已知的其它方法，能调节时间/温度相互关系)，以及用清洁的纸张或布毛巾擦拭表面。用于杀菌表面的组合物包括含有5～40ppm的银的那些组合物。优选用于表面杀菌的本发明组合物包含32±3ppm的银。另一优选的用于表面杀菌的本发明组合物包含10±2ppm的银。另一优选的用于表面杀菌的本发明组合物包含22±2ppm的银。

[400]银组合物作为超级杀菌剂的功效的证据

[401]A.实施例的目的

[402]本实施例的目的在于显示本发明的银组合物(此处为10ppm的银、14ppm的银和1.5wt％的过氧化氢、和32ppm的银)抑制微生物鼠疫病原体--耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersiniapestis)的抗菌活性。通过使用耶尔森氏鼠疫杆菌悬浮液进行标准的灭菌时间分析，由此证明本发明的银组合物甚至在抑制腺鼠疫细菌上也是有效的。

[403]B.材料和方法

[404]在5％ CO₂的培养箱中，在30℃处，在哥伦比亚琼脂平板上培养耶尔森氏鼠疫杆菌D27菌株24小时。用3ml无菌的HPLC水将平板中的培养物刮入悬浮液中。将悬浮液转入50ml的锥形离心管中。然后用额外的2ml HPLC水冲洗平板。将该冲洗液添加到离心管中。以3,500×g离心该试管5分钟。除去上清液，接着使团块再悬浮于1ml的HPLC水中，以产生约每毫升10¹⁰个细胞的最终浓度。

[405]该方法包括如下步骤：

[406]1.将待测试的9.9ml等分的银组合物装入无菌的20mm×150mm的试管中。试管在20℃的水浴器中进行平衡。

[407]2.在0时刻，用100ml试验菌悬浮液接种银组合物的试管以形成混合物。立即涡旋试管，接着将其放回到水浴器中。

[408]对10ppm或32ppm的银在2分钟、3分钟、4分钟、以及5分钟处，或者对14ppm的银和1.5％ v/v H₂O₂在2分钟、4分钟、6分钟和8分钟处，将1ml的生物体/银混合物移至装入250ml锥形烧瓶中的99ml中和剂中。充分混合烧瓶。

[409]4.接着按1：10用生理盐水(PSS)逐次稀释经中和的悬浮液。

[410]5.通过膜滤法分析在挑选的稀释管和烧瓶中存活的生物体数目。一式两份地将1ml的等分试样涂片。用约150ml(或250ml(如果试样取自中和剂烧瓶))无菌的磷酸盐缓冲液盐水清洗滤膜，接着将其移到哥伦比亚琼脂平板上。经4和5分钟中和的中和剂烧瓶中的总残留物(98ml)也被涂平板。在5％CO₂的培养箱中，在30℃处，培养平板72小时。

[411]6.计算各个滤膜上的菌落数，接着计算减少量的对数。

[412]C.结果

[413]10ppm的银的结果如表7所示。

表7

时间                  log减少量            杀菌百分率

2分钟                 2.63                 99.77

4分钟                 3.20                 99.94

6分钟                 3.46                 99.97

8分钟                 3.68                 99.98

[414]用于这些数据的计算回归方程式是Y＝2.3965+0.1696X。这表明达到99.9999％减少量的时间为21.2分钟。

[415]32ppm的银的结果如表8所示。

表8

时间                 log减少量             杀菌百分率

2分钟                >7.61                 99.999998

4分钟                >7.61                 99.999998

6分钟                >7.61                 99.999998

8分钟                >7.61                 99.999998

[416]14ppm的银和1.5％ v/v H₂O₂的结果如表9所示。

表9

时间                 log减少量             杀菌百分率

2分钟                3.27                  99.95

3分钟                4.72                  99.998

4分钟                5.36                  99.9996

5分钟                6.47                  99.99997

[417]用于这些数据的计算回归方程式是Y＝1.371+1.024X。这表明达到99.9999％减少量的时间为4.52分钟。

[418]本发明的银组合物显示出显著的抑制鼠疫病原体--耶尔森氏鼠疫杆菌的灭菌剂活性。32ppm的组合物在不到2分钟内达到超过99.99999％的减小量(基本上完全杀死)。数据表明，10ppm的银需要约20分钟以获得99.9999％的灭菌量。银和过氧化氢显示出显著的协同效应，其在5分钟处具有99.9999％的灭菌数。这比单独使用10ppm的银更加出色。选择14ppm的银，是因为其他试验的数据预示该浓度的银与过氧化氢组合将获得与单独使用32ppm的银制品相近的结果。

[419]数据总结

[420]下表A包括上述关于本发明的银组合物对多种微生物和人类疾病的影响的结果总结。在某些情况中，列于该表中的数据并未重复上述结果。然而，使用上述说明的方法可以获得该结果，从而使本领域的技术人员能较容易地重现该结果。

[421]通过本发明的银组合物治疗人类疾病及杀死病原体

表A

疾病                 病原体                有效含量

疖子                 金黄葡萄球菌          在5ppm下杀灭

骨髓炎               金黄葡萄球菌          在5ppm下杀灭

杆菌性痢疾           鲍氏志贺菌            在2.5ppm下杀灭

烧伤感染             绿脓杆菌              在5ppm下杀灭

牙斑                 变形链球菌            在5ppm下杀灭

腹泻(出血的)         鲍氏志贺菌            在2.5ppm下杀灭

腹泻                 大肠杆菌              在2.5ppm下杀灭

耳朵感染             流感嗜血杆菌          在1.25ppm下杀灭

耳朵感染             肺炎链球菌            在2.5ppm下杀灭

伤寒                 伤寒杆菌              在2.5ppm下杀灭

会厌炎(儿童中)       流感嗜血杆菌          在1.5ppm下杀灭

眼睛感染             金黄葡萄球菌           在5ppm下杀灭

角膜溃疡-角膜炎      绿脓杆菌               在5ppm下杀灭

食物中毒             亚利桑那菌             在5ppm下杀灭

食物中毒             伤寒杆菌               在2.5ppm下杀灭

食物中毒             大肠杆菌               在2.5ppm下杀灭

心膜炎               粪链球菌               在2.5ppm下杀灭

心膜炎               格氏链球菌             在5ppm下杀灭

脑膜炎               流感嗜血杆菌           在1.25ppm下杀灭

脑膜炎               产气肠杆菌             在2.5ppm下杀灭

脑膜炎               绿脓杆菌               在5ppm下杀灭

脑膜炎               肺炎链球菌             在2.5ppm下杀灭

院内感染             肺炎杆菌               在2.5ppm下杀灭

院内感染             绿脓杆菌               在5ppm下杀灭

院内感染(来自医院)   化脓性链球菌           在1.25ppm下杀灭

肺炎                 金黄葡萄球菌           在5ppm下杀灭

肺炎                 流感嗜血杆菌           在1.25ppm下杀灭

肺炎                 绿脓杆菌               在5ppm下杀灭

肺炎                 肺炎链球菌             在2.5ppm下杀灭

呼吸道感染           化脓性链球菌           在1.25ppm下杀灭

呼吸道感染           大肠杆菌               在2.5ppm下杀灭

呼吸道感染           肺炎杆菌               在2.5ppm下杀灭

猩红热               化脓性链球菌           在1.25ppm下杀灭

败血病               产气肠杆菌             在2.5ppm下杀灭

窦感染               流感嗜血杆菌           在1.25ppm下杀灭

窦炎                 肺炎链球菌             在2.5ppm下杀灭

脓疱病               金黄葡萄球菌           在1.25ppm下杀灭

皮肤感染             金黄葡萄球菌           在5ppm下杀灭

皮肤感染             化脓性链球菌           在1.25ppm下杀灭

链球菌喉咙           化脓性链球菌           在1.25ppm下杀灭

化脓性关节炎         流感嗜血杆菌           在1.25ppm下杀灭

疫喉                 流感嗜血杆菌           在1.25ppm下杀灭

牙炎                 变形链球菌             在5ppm下杀灭

尿道炎(男人)         阴道滴虫               在10ppm下杀灭

尿路感染             大肠杆菌               在2.5ppm下杀灭

尿路感染             肺炎杆菌               在2.5ppm下杀灭

尿路感染             绿脓杆菌               在5ppm下杀灭

尿路感染             粪链球菌               在2.5ppm下杀灭

尿路感染             产气肠杆菌             在2.5ppm下杀灭

阴道炎(妇女)         阴道滴虫               在10ppm下杀灭

伤口感染             大肠杆菌               在2.5ppm下杀灭

伤口感染             产气肠杆菌             在2.5ppm下杀灭

伤口感染             肺炎杆菌               在2.5ppm下杀灭

伤口感染             绿脓杆菌               在5ppm下杀灭

伤口感染             粪链球菌               在2.5ppm下杀灭

酵母菌感染           白色念珠菌             在10ppm下杀灭

[422]制成的银胶体作为水凝胶的功效

[423]人们已经认识到，在现代伤口护理方面，优选伤口治疗应为保持无菌并免于脱水和环境污染。传统的绷带可以有效地保护不受环境污染，但在防止脱水上则基本无效。通过添加各种杀菌物质能使绷带具有抗菌性，但这些物质通常是药性猛烈从而杀死身体细胞以及微生物。在近代，已通过水凝胶材料来改进伤口护理，该水凝胶材料作为半固体(非晶态材料)或作为软质薄片状材料可供使用。水凝胶是亲水性的，从而可防止伤口脱水。薄片状材料可有效地隔绝环境污染，并且因为其亲水特性，水凝胶基本上可吸收由伤口分泌出的过多液体。

[424]通过将亲水性聚合物与水溶液中的其他成分组合来形成水凝胶。在改变pH、温度或其他引发剂条件下，用聚合物形成凝胶。在凝胶中，聚合物的细小分子网络包围水溶液区域。虽然组合物可以是非晶态半固体或更硬的薄片状材料，但与亲水性聚合物相反，组合物中的大多数体积倾向于由水溶液占据。适于制备水凝胶的亲水性聚合物包括明胶、羧基甲基纤维素(及其它纤维素衍生物)、其他的植物或藻类来源的碳水化合物聚合物比如藻酸盐、角叉菜聚糖、黄原胶、角豆胶、胺黄树胶、瓜尔豆胶、阿拉伯树胶及其它植物树胶、丙烯酸共聚物(比如卡波姆Carbopol)、以及上述物质的组合和相似的亲水性聚合物。

[425]含水组分优选包含各种添加物，这些添加物能增强水凝胶的物理特性和/或促进伤口愈合。这些物质包括各种维生素、氨基酸和生长因子以增强愈合或降低瘢痕形成以减少结疤。普通的麻醉剂比如普鲁卡因、利多卡因和其衍生物还可以作为添加剂而被结合以增强舒适度。由于保持伤口无菌是包扎的主要目标，故优选包括各种抗菌剂或杀菌剂。这些物质包括有机酸比如柠檬酸、稀乙酸、苯甲酸、丙酸和乳酸。醇类比如异丙醇或乙醇可如有机杀菌剂一样使用，该有机杀菌剂包括氯化酚醛塑料比如“TCP”(2，4，6-三氯苯酚)、双胍、洗必泰(当与溴棕三甲铵混合时)、洗必泰葡糖酸盐、以及醋酸洗必泰。包括两性表面活化剂的杀菌剂表面活化剂和醛类比如甲醛和戊二醛可以被包括在内。包括碘、碘载体、和聚维酮-碘的卤素消毒剂与过氧化物及其他充氧剂比如过氧化氢同样是有效的。其它有益的成分包括铝-锌收敛剂、呋喃衍生物和喹啉衍生物比如氯碘羟喹。虽然所有这些抗菌剂均是有益的，但它们都易于具有下述缺点，即它们能破坏细胞组织并且/或者微生物对它们能较易产生耐药性。

[426]如同上述的详细证明，本发明的银胶体可高度有效地抗菌，对人的细胞组织非常温和，并且可有效地抑制抗药性微生物。非晶态凝胶和水凝胶薄片均需将有效量的胶体银传递到湿治疗环境中。一方面，当非晶态水凝胶在细胞组织分泌液中缓慢软化并逐渐开始溶解时，非晶态水凝胶缓慢地释放胶体银。另一方面，非晶态水凝胶向细胞组织提供水分，同时当场产生可用的胶体银。此外，存在于包扎中的少量胶体银优于分子态银，这是因为随着时间延长，胶体银的逐渐还原将释放具有出色的微动力活性的银离子。

[427]在初始实验后，选择卡波姆作为有效的水凝胶形成剂，与本发明的胶体银一起使用。研究出基本配方，其一般包括如表9a所示的如下成分。

表9a

 

成分功能供应商胶体银溶液(22ppm或32ppm)活化剂、抗生素和稀释剂美国生物技术实验室卡波姆ETD2020流变修饰剂Noveon三乙醇胺中和剂、渗透剂E.Merck丙二醇湿润剂E.Merck

[428]首先对所有原料的如下性能进行分析：

1.抗细菌活性

2.物理和化学性能：

1.外观

2.气味

3.pH

4.手感

5.密度

6.起泡性

7.流动性。

[429]胶体银溶液(22ppm或32ppm)：

在该配方中，银溶液被用作活性组分(抗菌剂)。它也是该特定的配方中唯一的稀释剂。

[430]A.抗细菌活性：

[431]B.物理和化学性能：

1.外观    无色的澄清液

2.气味    无气味

3.pH      5.0

4.手感    不适用

5.密度    1.00

6.起泡性  不适用

7.流动性  不适用

[432]卡波姆

[433]卡波姆(Carbopol)在化学上被称为聚羧乙烯或羧乙烯聚合物。它是丙烯酸的共聚物并且是高度离子化的(即亲水性的)及弱酸性的化合物。为获得最大粘度，必需中和卡波姆聚合物。聚羧乙烯用于药品、化妆品和织物印花领域作为增稠剂、悬浮剂、分散剂和乳化剂。在该配方中，卡波姆被用作凝胶或增稠剂。

[434]A.抗细菌活性不适用

[435]B.物理和化学性能：

1.外观    干燥、白色的粉末

2.气味    无气味

3.pH      不适用

4.手感    不适用

5.密度    不适用

6.起泡性  不适用

7.流动性  不适用

[436]三乙醇胺

(TEA)C₆H₁₅NO₃(分子量：149.19)

在该配方中，三乙醇胺作为碱化剂用于中和聚羧乙烯以提高粘度。它还增加活化剂的渗透能力。

[437]A.抗菌活性(不适用)

[438]B.物理和化学性能：

1.外观    无色的粘性液体

2.气味    轻微的氨味

3.pH      不适用

4.手感    不适用

5.密度    1.1242g/cc

6.起泡性  不适用

7.流动性  不适用

[439]丙二醇

C₃H₈O₂分子量：76.09

[440]丙二醇在化学上被称为1:2丙二醇。在该配方中，它被用作湿润剂和滑爽剂。

[441]A.抗菌活性  不适用

[442]B.物理和化学性能：

1.外观    无色的粘性液体

2.气味    无气味

3.pH      不适用

4.手感    不适用

5.密度    1.036gm/cc

6.起泡性  不适用

7.流动性  不适用

[443]一旦研究出标准配方，就制造许多批次配料以确定配方的可能范围。从进行的19个试验中，获得如下观察结果。

1.pH的增加提高了凝胶的粘度。

2.卡波姆量的增加提高了凝胶的粘度。

3.卡波姆的百分比越高，粘性越高。

由上述试验可知，在使用的卡波姆和TEA的含量与最终获得的不应超过8.5的pH之间必须进行权衡。于是将配方No.18作为标准，每批料扩大到10Kg。

[444]产品开发研究介绍：

[445]相对于pH、手感、粘性和稠度，必须标准化基于凝胶配方的卡波姆。考虑到该点，在获取主要批料之前，用水作为液相取得各种实验批料以获得适当品质和手感的产品。

[446]批料No.SG/001的配方：

部分A：蒸馏水     83.50g

       卡波姆     00.62g

       NaOH 18％  00.60g

部分B：蒸馏水     1.00g

       丙二醇     5.00g

       NaOH 18％  1.50g

[447]工序：从部分A中称取给定量的蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到蒸馏水中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将18％的NaOH添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[448]结果：1.pH      10.8

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[449]批料No.SG/002配方：

部分A：蒸馏水   83.50g

       卡波姆  00.62g

       TEA     01.20g

部分B：蒸馏水  1.0g

       丙二醇  5.0g

       TEA     1.5gm

[450]工序：从部分A中称取给定量的蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到蒸馏水中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[451]结果：1.pH   7.9(SOP-08)

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

批料No.SG/003配方：

部分A：蒸馏水  86.00g

       卡波姆  00.62g

       TEA     01.20g

部分B：蒸馏水  2.00g

       丙二醇  5.00g

       TEA     1.50g

[452]工序：从部分A中称取给定量的蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到蒸馏水中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[453]结果：1.pH      8.62

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘.

[454]批料No.SG/004配方：

部分A：蒸馏水  86.00g

       卡波姆  00.62g

       TEA     01.00g

部分B：蒸馏水  2.00g

       丙二醇  5.00g

       TEA     1.50g

[455]工序：从部分A中称取给定量的蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到蒸馏水中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[456]结果：1.pH   8.5

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[457]批料No.SG/005配方：

部分A：蒸馏水   86.0g

       卡波姆   0.62

       TEA      1.20g

部分B：蒸馏水   2.00g

       丙二醇   7.00g

       TEA      1.50g

[458]工序：从部分A中称取给定量的蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到蒸馏水中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[459]结果：1.pH      8.7

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[460]批料No.SG/006配方：

部分A：蒸馏水  85.00g

       卡波姆  00.62g

       TEA     01.00g

部分B：蒸馏水  1.00g

       丙二醇  5.00g

       TEA     1.40g

[461]工序：从部分A中称取给定量的蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到蒸馏水中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[462]结果：1.pH      8.4

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[463]批料No.SG/007配方：

部分A：蒸馏水  172g

       卡波姆  1.24g

       TEA     2.40g

部分B：蒸馏水  6.0g

       丙二醇  10g

       TEA     2.80g

[464]工序：从部分A中称取给定量的蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到蒸馏水中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[465]结果：1.pH      8.28

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[466]批料No.SG/008配方：

部分A：银溶液(32ppm) 86g

       卡波姆        0.62g

       TEA           1.20g

部分B：银溶液(32ppm) 2.0g

       丙二醇        5.0g

       TEA           1.5g

[467]工序：从部分A中称取给定量的银溶液，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到银溶液中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[468]结果：1.pH      8.65

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[469]批料No.SG/009配方：

部分A：银溶液(32ppm) 172g

       蒸馏水        12g

       卡波姆        1.24g

       TEA           2.40g

部分B：银溶液(32ppm) 6.00g

       丙二醇        10.0g

       TEA           2.80g

[470]工序：从部分A中称取给定量的银溶液，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到银溶液中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[471]结果：1.pH      8.54

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[472]批料No.SG/010配方：

部分A：银溶液(32ppm) 172g

       蒸馏水        24g

       卡波姆        1.39g

       TEA           2.40g

部分B：银溶液(32ppm) 6.00g

       丙二醇        5.00g

       TEA           2.80g

[473]工序：从部分A中称取给定量的银溶液，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到银溶液中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[474]结果：1.pH      8.43

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[475]批料No.SG/011配方：

部分A：蒸馏水  98g

       卡波姆  0.76g

       TEA     0.56g

部分B：蒸馏水  3.0g

       丙二醇  5.0g

       TEA     1.4g

[473]工序：从部分A中称取给定量的蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到蒸馏水中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[477]结果：1.pH      8.05

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[478]批料No.SG/012配方：

部分A：蒸馏水  98g

       卡波姆  0.76g

       TEA     0.34g

部分B：蒸馏水  3.00g

       丙二醇  5.00g

       TEA     0.64g

[479]工序：从部分A中称取给定量的蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到蒸馏水中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[480]结果：1.pH      6.35

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[481]批料No.SG/013配方：

部分A：银溶液(32ppm)  86g

       蒸馏水         12g

       卡波姆         0.76g

       TEA            0.32g

部分B：银溶液(32ppm)  3.00g

       丙二醇         5.00g

       TEA            0.64g

[482]工序：从部分A中称取给定量的银溶液和蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到溶液中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[483]结果：1.pH      6.7

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[484]批料No.SG/014配方：

部分A：银溶液(32ppm)  86g

       蒸馏水         12g

       卡波姆         0.78g

       TEA            0.32g

部分B：银溶液(32ppm)  3.00g

       丙二醇         5.00g

       TEA            0.64g

[485]工序：从部分A中称取给定量的银溶液和蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到溶液中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[486]结果：1.pH      6.6

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    非常粘

[487]批料No.SG/015配方：

部分A：银溶液(32ppm) 86g

       蒸馏水        12g

       卡波姆        0.68g

       TEA           0.40g

部分B：银溶液(32ppm) 5.0g

       丙二醇        7.0g

       TEA           0.6g

[488]工序：从部分A中称取给定量的银溶液和蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到溶液中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[489]结果：1.pH      6.72

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    粘的

[490]批料No.SG/016配方：

部分A：银溶液(32ppm)  86g

       蒸馏水         12g

       卡波姆         0.64g

       TEA            0.40g

部分B：银溶液(32ppm)  5.0g

           丙二醇        7.0g

           TEA           0.6g

[491]工序：从部分A中称取给定量的银溶液和蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到溶液中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[492]结果：1.pH      6.87

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    粘的

[493]批料No.SG/017配方：

部分A：银溶液(32ppm)  86g

       蒸馏水         12g

       卡波姆         0.62g

       TEA            0.4g

部分B：银溶液(32ppm)  5.0g

       丙二醇         7.0g

       TEA            0.6g

[494]工序：从部分A中称取给定量的银溶液和蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到溶液中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[495]结果：1.pH      7.05

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    粘的

[496]批料No.SG/018配方：

部分A：银溶液(32ppm)  86g

       蒸馏水         12g

       卡波姆         0.58g

       TEA           0.4g

部分B：银溶液(32ppm) 5.0g

       丙二醇        7.0g

       TEA           0.6g

[497]工序：从部分A中称取给定量的银溶液和蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到溶液中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[498]结果：1.pH      7.40

           2.流动性  90℃>5分钟

                     45℃>5分钟

           3.粘性    滑的

[499]批料No.SG/019配方：

部分A：银溶液(32ppm)  86g

       蒸馏水         12g

       卡波姆         0.54g

       TEA            0.4g

部分B：银溶液(32ppm)  5.0g

       丙二醇         7.0g

       TEA            0.6g

[500]工序：从部分A中称取给定量的银溶液和蒸馏水，接着在70℃处，将其置于水浴器中。将卡波姆添加到溶液中，不断搅拌以防止结块。20分钟后，在70℃处，将TEA添加到其中。从部分B中称取所有的成分，接着在70℃处，将其置于水浴器中15～20分钟。将部分B添加到部分A中，搅拌10～15分钟。将其冷却到室温，接着进行分析。

[501]结果：1.pH      7.65

           2.流动性  90℃ 1分钟

                     45℃ 2分钟

           3.粘性    滑的

[502]注意：虽然已提高了凝胶手感，但其稠度是不适宜的。

[503]基于上述结果，对1公斤批料进行如下操作。

部分A：银溶液  860gm

       蒸馏水  100gm

       卡波姆  5.80gm

       TEA     4.00gm

部分B：ASAP溶液  50.0gm

       丙二醇    70.0gm

       TEA       6.00gm

       在对水分损失进行调整后，产生1.0公斤批料。

[504]工序：在清洁的无菌容器中，取出需要量的蒸馏水和银溶液。不断搅拌，使溶液温度升高到70℃。开始逐步少量添加卡波姆并不断搅拌/搅匀。最后在连续30分钟内添加完所有的卡波姆(根据批量大小调整时间)。然后将TEA添加到A相溶液中。

[505]在单独的容器中，混合部分B中的所有成分。将温度升高到70℃，接着将部分B缓慢添加到部分A中。在完成均质化时，将其冷却到室温。

[506]注意：必须用良好的均化器进行卡波姆的分散。在使用新批次的卡波姆时，进行小批量试验。最小化加热时间，这是因为较长时间的加热会导致更多的水分流失。

[507]结果：1.pH     7.4

           2.流动性 >5分钟

           3.粘性   滑的

[508]在中试车间，已使该配方较易放大到10公斤。在增加规模期间，没有遇到问题。推荐使用真空排气以除去残存空气，从而确保均匀充填。

[509]该配方具有如表10所示的如下物理和化学特性。

表10

 

测试说明结果1.金黄色半透明凝胶通过2.气味无气味无气味3.比重1.021.024.流动性在45°和90°处—从始点流到1英寸处超过5分钟在45°和90°处—从始点流到1英寸处超过5分钟5.起泡性<10ml<10ml6.手感/粘性1-滑性1-滑性7.粘度RT30°37032,000±500030,000±500034,00033，5008.PH6.5～8.07.49.冰冻与解冻通过SOPI～10可与初始态相比10.最佳波长(最大值)22ppm—400+/-20nm32ppm—450+/-20nm400nm^**450nm^**11.曝光量没有进一步褪色通过12.互溶性没有与容器反应产生的褪色参照表313.提供水分-10.27％14.吸收水分-80％

[510]微生物学评价

[511]假定银胶体水凝胶具有与原始胶体银相似的微生物性是合理的，这已经如上所述进行了深入测试。然而，添加亲水性聚合物以产生凝胶可能直接影响银的微生物性，或可能因此抑制银扩散从而降低其效果。因此，对银胶体水凝胶也进行与胶体银溶液中所进行的那些微生物学测试相似的微生物学测试。

[512]首先，测试水凝胶以确定组合物是否是自我杀菌的。接着实施如下方案：

[513]获得100ml的无菌液态2-巯基乙醇酸盐培养基(厌氧菌)、无菌大豆酪蛋白消化液培养基(好氧菌)、和土豆葡萄糖肉汤(真菌)，装入烧瓶。将待测试的约100mg的凝胶试样无菌地转入烧瓶组中。一组烧瓶在37℃处培养一周，另一组烧瓶在室温下培养一周。之后，检测烧瓶，没有发现混浊或微生物生长的征兆。因为在无菌条件下没有产生凝胶，故可以确定组合物是自我杀菌的。用100mg的凝胶进行各种测试。该测试对应于在100ml培养基中具有2.2μg的银，或者每毫升培养基中具有0.02214或0.032μg的银。在该浓度处，银没有抗菌活性，于是能够排除假阴性结果。

[514]然后使用各种试验菌以与如上所述22或32ppm的银溶液或22或32ppm的银凝胶制造、以及如表11所示的抑制区域进行比较。将等分的0.1ml活性生长18个小时的各个微生物培养物(约10⁸CFU/ml)接种到无菌营养琼脂平板上。用打孔器在各个接种板中打个10mm直径的孔。将检测量(0/2～0.3g)的产物装入各个孔内，接着培养平板24小时。之后，检测平板，接着测定如下抑制区域(各个区域的总直径)。

[515]表11

[516]这些结果显示，凝胶的抑制效果基本上与银胶体溶液的抑制效果相同；这说明胶凝聚合物对银胶体的抗菌能力并未产生消极影响。在血液琼脂上还培养了一些培养物(化脓性杆菌、白喉杆菌和金黄葡萄球菌)，其结果说明银凝胶对流血、伤口分泌物也是有效的。

[517]用各种抗生素对相同的菌株进行类似测试。在某些情况下，抗生素比银化合物更有效，但在其他情况下，抗生素的效果远不及银化合物。这表明抗生素没有弱化所用的菌株或没有“消灭”菌株(见表12a和12b)。

革兰氏阳性细菌(表12a)

 

抗生素浓度金黄葡萄球菌MRSA1MRSA2枯草芽胞杆菌氨苄青霉素200mcg清除15mm18mm16mm氨噻肟头孢菌素30mcg26mm不抑制清除12mm先锋霉素IV30mcg清除1.0mm0.8mm清除环丙沙星5mcg28mm14mm14mm20mm氯苯唑青霉素1mcg清除清除13mm18mm复方新诺明25mcg清除不抑制不抑制15mm庆大霉素10mcg清除不抑制11mm18mm林可霉素2mcg清除清除清除18mm氧氟沙星5mcg清除15mm16mm22mm甲磺酸培氟沙星10mcg30mm11mm13mm21mm罗红霉素15mcg清除1.0mm12mm20mm四环素30mcg34mm不抑制0.7mm19mm

革兰氏阴性菌(表12b)

 

抗生素浓度大肠杆菌肺炎杆菌伤寒杆菌绿脓杆菌阿米卡霉素30mcg清除18mm清除10mm氨苄青霉素200mcg23mm18mm20mm13mm头孢他啶30mcg21mm20mm22mm19mm头孢唑肟30mcg18mm18mm15mm不抑制氯霉素30mcg22mm21mm23mm不抑制环丙沙星5mcg29mm22mm25mm15mm复方新诺明25mcg24mm19mm27mm清除庆大霉素10mcg清除17mm清除不抑制氧氟沙星5mcg清除29mm清除15mm甲磺酸培氟沙星10mcg清除25mm清除10mm哌拉西林100mcg22mm15mm16mm10mm四环素30mcg19mm18mm16mm不抑制

[518]护手霜试验

[519]由于水凝胶能提高银对皮肤表面的粘附性，故对凝胶作为护手霜的效果进行评估。对于该测试，在志愿者的手上标出一英寸的正方形方块，接着用约1g的凝胶涂覆。用无菌蒸馏水擦试对照区。棉签擦拭该区域，接着用棉签在营养物琼脂上划线。在4小时内每1小时重复棉拭一次。在37℃处，培养划线平板24小时，接着对结果进行评估。

[520]如下表13所示，对照棉签上生长了如此多的细菌，使得细菌数太多而难以计量(TNTC)。用银凝胶处理的区域基本上保持3小时无菌，在第4小时处显示较弱的细菌生长。对于需要为其手进行表面杀菌的医护人员来说，这提供了优选的结果，使他们不需使用刺激性或冲冼类化合物。

表13

 

时间对照22ppm32ppm0小时TNTC不生长不生长1小时TNTC不生长不生长2小时TNTC不生长不生长3小时TNTC不生长不生长4小时TNTC3Cfu2Cfu

虽然水凝胶显示预期的伤口愈合特性，但典型的水凝胶的缺点是微生物通常能经由基体发生迁移。因此，如果用水凝胶包覆伤口并且伤口中的一个区域发生感染，那么感染的生物体可以穿过水凝胶而感染其他区域。通过使用条形的水凝胶为营养琼脂平板上的分离区域驾桥来测试该可能性。通过沿平板直径除去2cm的条形琼脂来将各个琼脂平板分成两个区域。用1.5cm宽重叠在琼脂上的条形水凝胶来为该间隙架桥，其中任一末端处约5mm。然后用约0.5ml的培养物接种于平板的一个侧面，接着培养平板以观察微生物是否能穿越水凝胶“桥”。表14中的结果显示银水凝胶完全阻止了迁移。

表14

 

培养物接种区迁移区大肠杆菌生长旺盛不生长枯草芽胞杆菌生长旺盛不生长MRSA 1生长旺盛不生长绿脓杆菌生长旺盛不生长水凝胶对照生长旺盛生长

根据上述显示结果选择原始凝胶配方，并在如下实施例中进行改动。

[521]实施例A

对于1公斤批料的凝胶，采用如下部分A和部分B中的组分：

部分A：发明的胶体银 32ppm 860g

       蒸馏水       100g

       卡波姆       6.8g

       三乙醇胺     4.0g

部分B：发明的胶体银 32ppm 50g

       丙二醇       70g

       三乙醇胺     6.0g

[522]首先将所需量的蒸馏水和银溶液取到搅拌器中，开始搅拌。缓慢地添加卡波姆(Noveon，美国)。应充分剧烈搅拌以使卡波姆分散，从而防止形成块体。在搅拌期间，应使温度保持在60～70℃之间。

[523]在烧杯中混合部分B中的所有成分。加热到70℃，接着在剧烈搅拌下，将其添加到部分A中。继续混合，然后将其冷却至室温。检查批料的产量。产量应为约1000gm。三乙醇胺会导致卡波姆胶化。

实施例B：

[524]制备如实施例A中所述的所有成分，但添加了1％的胶原。这将使凝胶具有抗菌性以及胶原的优点，该胶原具有加速伤口愈合的支架结构。

实施例C：

[525]制备了如实施例A中所述的所有成分，但添加了1～5％的芦荟(粉末或溶液)。这将给与额外的伤口愈合特性。

实施例D：

[526]制备如实施例A中所述的所有成分，但额外添加了1～10wt％的麦芽糖糊精。这将提供促进伤口粒化的凝胶配方。

[527]银水凝胶结果概要

[528]使用本发明的22ppm和32ppm的银胶体溶液可以制备基于卡波姆的凝胶。由此制得的凝胶相对于它们的溶液对应物具有许多优点，它们在保留其母体银溶液性能的同时能保持在原位。药剂的非晶态水凝胶性质具有加速湿伤口愈合的优点，还通过限制热冲击来限制烧伤伤口的恶化。此外，在早期研究中，已对细胞株上的活性试剂、胶体银溶液进行了测试，结果发现其是无细胞毒性的。

[529]用各种批料对凝胶进行了全面的物理化学评估，其中采用了一系列的详细的方法以进行标准化，并且控制制备期间的产物和工艺。

[530]深入地进行了微生物研究，结果显示凝胶保留了其灭菌性质。已模拟进行了银迁移研究，结果表明凝胶在整个时间段内能将银传递到伤口上。配方设计也不允许微生物从外部迁移到内部，反之亦然。

[531]这些试验证明了基于出版物(Journal of Wound Care Vol 12，No 8 SEPT 2003)的对银水凝胶的假想评估，其中对备选银基包覆物进行了如下几点评估：

1.抗菌抑制区；

2.微生物挑战试验；

3.微生物传递试验；和

4.包覆物中的银含量。

[532]在第一测试中，将银水凝胶分在组B中，在剩下的所有三个试验中，银水凝胶在组A中记分，其总分为20分，以在该评估中得分最高的Calgitrol Ag和Acticot、商品的平均数为基准。

[533]胶体银溶液的抗菌性和抗病毒性使银水凝胶除了用作绷带外，还有一些重要的用途。如上所述，水凝胶是一种理想的抗菌护手霜。此外，银胶体和水凝胶的无刺激特性使该组合体对于带或不带避孕套或避孕膜的男性或女性性行为来说是一种理想的个人润滑剂，其中该组合体将抵制细菌、真菌(注意对白色念珠菌有效)和危险的病毒比如HIV，并且对可重用屏障比如避孕膜进行杀菌。由于水凝胶几乎不含任何油，故它对避孕套或避孕膜没有不良影响，这不同于某些其他的个人润滑剂。

[534]水凝胶洗手液(注意：在此水凝胶和银胶是指相同的发明产品，可交换使用)

[535]据报道，在抑制危险细菌的传播及医护环境中的耐抗菌素方面，洗手是一个最重要的因素。于是，我们决定根据10月25日(2002/51卷/RR-16期)公布的MMWR的指导，对被称为银凝胶的水凝胶作为洗手卫生品的功效进行检验。

使用如下标准操作程序：

需要的材料(SOP)：

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的标准悬浮液(10⁸cfu/ml)、自来水、无菌的橡皮手套、

无菌的试样溶液、无菌的胰蛋白酶大豆琼脂、无菌的微吸管、无菌的试管。

方法：

1.将5ml粘质沙雷氏菌的标准悬浮液涂到手上并且覆盖手的表面。

2.在手上涂抹3ml的测试材料，并且在1/3rd的前臂以下。

3.向手上添加2ml的自来水，并使它们起泡沫(见图1)。

4.在自来水下实时冲洗手和前臂30秒。

5.重复步骤2～步骤4的程序。

6.在第1次、第3次、第7次和第10次清洗后，将用于试样的无菌橡皮手套套在右手和左手上。

7.将75ml的无菌试样溶液注入手套中。

8.对手的所有表面按摩1分钟。

9.通过使用无菌的胰蛋白酶大豆琼脂培养基的活菌计数方法，无菌地获得用于定量分析试样。

10.采用涂布平板技术，其中使用初始液、10^-1、10^-2和10^-3的稀释液。

在37℃处，培养平板24小时。

材料及方法

使用上述SOP中的程序

使用的培养基：标准的胰蛋白酶大豆琼脂(Tryptic Soya Agar)。

使用的培养物：16小时的粘质沙雷氏菌培养物(密度约为10⁸CFU/ml)。

培养温度：37℃

培养时间：24小时.

待评估的产物：22和32ppm的银凝胶、Spitaderm、清洁液、Sterillium

结果：结果如表15a～15e、16a～16e所示

左手

表15a：Spitaderm(附录-II)

表15b：32ppm的银凝胶

表15c：22ppm的银凝胶

表15d：Sterillium(附录-II)

表15e：清洗液(附录-II)

右手

表16a：Spitaderm(附录-II)

表16b：32ppm的银凝胶

表16c：22ppm的银凝胶

表16d：Sterillium(附录-II)

表16e：清洗液(附录-II)

结论：32ppm的银凝胶和22ppm的银凝胶作为洗手卫生品的功效达到了TFM(TentativeFinal Monograph)标准，其功效表现为在第一次使用后，各个手上的指示生物减少了99％，在第10次使用的5分钟内，各个手上的指示生物减少了99.9％。此外，银凝胶作为洗手液比Sterillium和Spitader更有效。最后，作为“涂抹其上”的银凝胶作为洗手剂具有较好的依从性，这是因为它不需要洗手台，也不会使消费者的手干燥或易于受刺激，而是倾向于为使用区加湿。

[536]水凝胶作为创伤敷料材料

[537]引言

[538]可以使用水凝胶敷料作为主要敷料(非晶态浸润的纱布)或作为主要或次要敷料(薄片)以处理局部及整个厚度的伤口、深的伤口(非晶态、浸润的纱布)、带有坏疽或腐肉的伤口、较小的烧伤和由辐射引起的组织损伤。

[539]目前市场中几乎所有的水凝胶均不包括抗菌剂。这是因为抗菌剂和防腐剂可能是细胞毒性的，从而经常延迟伤口愈合。

由于本发明的银/水溶液是没有细胞毒性的，故我们决定用本发明设计的银纳米颗粒制备水凝胶。

最近，已经采用特殊制备的水凝胶用于处理辐射诱发的皮炎。这些敷料具有较高的比热以形成冷却效应，从而在水、血清或血液中至少吸热三次。

[540]优点

·有抚慰性及减少疼痛

·重新水化创面床

·便于自溶清创

·填充床空间(非晶态、浸润的纱布)

·提供从最小至适中的吸水性

·较易涂抹及从伤口中除去

·当感染存在时可以使用

·提供创面床的视图

[541]缺点

·通常不推荐用于有严重分泌液的伤口

·有些需要二次敷料

·如果不包覆较易脱水

·有些难以确保

·有些会导致泡软

[542]方法

[543]将本发明的水凝胶制成片状，作为候选的创伤敷料材料。片状水凝胶可替换地被称为SILDERM。

[544]结果

[545]SILDERM-水分损失

[546]目的：

·确定SILDERM的水分损失能力。

[547]工序：

[548]所需的装置：

·分析天平。

[549]所需的材料

·塑料盘

[550]方法：

·确定空盘的重量

·将SILDERM片放在盘上

·确定盘+SILDERM片的重量

·记下t＝0小时的读数

·每1小时记下读数

·记下整夜的读数。

·然后绘制时间对水分损失的曲线

·确定水分损失的百分数

结果：见如下表17和图34

表17：SILDERM的水分损失能力

 

时间(小时)重量068gm164gm260gm356gm451gm548gm2240gm

结论：能够推定SILDERM薄片能减少占其重量30％的水分。

[551]SILDERM—吸水

[552]目的：

·确定SILDERM的吸水能力

[553]工序：

[554]所需的装置：

·分析天平

[555]所需的材料：

·烧杯

[556]方法：

·确定SILDERM薄片的重量(克)。

·记下t＝0时的读数

·烧杯加满水

·将SILDERM薄片完全浸入烧杯中

·每隔1小时，除去薄片水滴、干燥、接着确定其重量

·记下整夜的读数。

·然后绘制时间与吸水量的曲线

·计算脱水凝胶的吸水百分数

计算(见下表18和图35)

表18

 

时间(小时)重量045gm148gm251gm353gm454gm556gm657gm2268gm

结论：脱水SILDERM薄片能吸收占其重量52％的水分。

[557]SILDERM-银的释放

[560]目的：

·确定SILDERM中银纳米颗粒的持续释放

[561]原理：

·通常将水凝胶敷料片放在伤口上48～72小时。在该状态中，人们希望确定在该时间段内敷料就银释放而言的抗菌活性。

[562]所需的装置：

·培养箱，无菌操作台

[563]所需的材料

·无菌营养琼脂平板、无菌的药棉签、微吸管(100μl～1000μl的容积)、培养16小时的绿脓杆菌(野生型)

[564]方法：

·切出4cm×3cm的SILDERM片

·将Silderm放在涂了绿脓杆菌(野生型)的营养琼脂平板上。

·在37℃处培养约18小时

·沿垂直和水平方向检验抑制区

·然后将相同的SILDERM片放在新涂了绿脓杆菌的营养琼脂平板上

·如上所述培养

重复该工艺进行了最少7天

结果：在检测时，SILDERM如下表19所示显示出3次转接中的抑制活性。

表19：SILDERM挑战试验

 

转接号垂直方向的抑制水平方向的抑制转接152mm35mm转接253mm35mm转接351mm34mm

结论：SILDERM能对每隔24小时新接种物的3次挑战体现出持续的抗菌活性。进行进一步的测试。

[565]用于上述实施方式的培养基组合物如下所示：

营养琼脂：

蛋白胨 10.0gm

氯化钠 5.0gm

肉汁 3.0gm

蒸馏水 900ml

琼脂 2.5gm

pH 7.2±0.2

[566]此外，可以如下所述的物质开发出SILDERM的配方：

·胶原-

胶原—体内最丰富的蛋白质，是纤维状且不溶的，其由成纤维细胞生成。人们在结缔组织包括皮肤、骨头、韧带、以及软骨中发现有该纤维。在伤口愈合期间，胶原促进创面床中新形成的胶原纤维和肉芽组织的沉积和组构。它还通过产生有助于愈合的环境来促进新组织形成及伤口清创。

·麦芽糖糊精-

麦芽糖糊精是伤口愈合促进剂，其通过巨噬细胞活化和吸引来促进愈合，从而降低感染和提高粒化。

·血小板源生长因子(PDGF)-

PDGF促进包含于伤口中的细胞趋化性恢复和繁殖，从而促进肉芽组织的形成。主要用其治疗下肢糖尿病的神经病变性溃疡。

[567]EDTA二钠作为添加剂

[568]已知EDTA二钠增加了各种天然的和合成的化合物的抗菌效果，据推测其作用机制在于提高细菌细胞壁渗透性，从而便于抗菌化合物进入。

[569]已证实金属螯合剂和细菌外部膜渗透剂、乙二胺四乙酸(EDTA)增强了各种抗菌剂抑制绿脓杆菌的活性。添加亚抑菌浓度的EDTA明显降低抗大肠杆菌和粘质沙雷氏菌的头孢丙烯的MICs。

[570]据报道，亚胺培南、头孢他啶和头孢吡肟加上150mcg的EDTA能增加对绿脓杆菌的平均抑制区直径。某研究报道乙二胺四乙酸(EDTA)影响绿脓杆菌的敏感度。当EDTA用于与AgNO₃连接时，其明显增强了后者的抗菌作用，从而观察到对70微克/mlAgNO₃有抗力的肺炎克雷伯菌和金黄葡萄球菌的菌株变得对10微克/ml该化合物敏感。

设计一种特定组成和一组试验，以确定本发明的银/水组合物是否与EDTA二钠一起作用较有利。具体地说，EDTA二钠取自印度孟买的西海岸实验室。EDTA二钠又名Na₂EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，其分子式为(CH₂N(CH₂COOH)CH₂COONa)₂ 2H₂O，分子量为372.24。

[571]用于该试验的培养基为：1000ml营养琼脂(HiMedia公司)、2006年8月到期的B.No.1G115、50.00g动物组织的胃蛋白酶消化液、1.50g酵母提取物、1.50g牛肉汁、5.00g氯化钠、25g I型琼脂、7.4+/-0.2的pH。

微生物菌株

将单独的32ppm的银/水组合物、单独的22ppm的银/水组合物、和32ppm的银/水组合物、以及22ppm的银水组合物添加到EDTA二钠中，接着对它们各自抑制微生物方格的性能进行测试，该微生物包括：

大便试样中的大肠杆菌(耐多药(MDR)菌株)；痰中的绿脓杆菌(耐多药(MDR)菌株)；以及腰部脓包中的耐甲氧苯青霉素的金黄葡萄球菌(耐多药菌株)。

从P.D.Hinduja医院(印度孟买)中获得上述MDR菌株。

福氏痢疾杆菌(Shigella flexneri，实验室菌株)

伤寒杆菌(Salmonella typhi，实验室菌株)

在37℃处，在营养琼脂上(pH为7.4)培养上述细菌菌株。

[572]在无菌蒸馏水中制备添加到Na₂EDTA中的32ppm和22ppm银/水组合物稀释液。使各种微生物悬浮在无菌盐水中，接着稀释至10⁶菌落形成数(cfu/ml)。使用无菌药棉签将它们涂拭在营养琼脂(pH为7.4)表面上。从琼脂中冲压出孔(直径为10mm)，接着将0.1ml的各个稀释液装入孔中。在37℃处培养约24小时后，对所有平板中的任何抑制生长区进行检查，并用区域读数器(Hi Media公司)测定直径(毫米)。结果如表20所示。

结果及讨论

表20 银/水+Na₂EDTA

 

体系大肠杆菌MRSA白色念珠菌32ppm的银/水-对照21mm24mm27mm32ppm的银/水+0.5％Na₂EDTA22mm29mm40mm22ppm的银/水+20mm23mm29mm22ppm的银/水+0.5％Na₂EDTA22mm31mm>40mm

[573]0.5ppm的EDTA二钠明显地增强了22ppm浓度和32ppm浓度的本发明的银/水组合物的功效。

[574]EDTA银作为单用的抗菌剂

[575]设计一种特定的组成和一组试验以确定银螯合物比如EDTA银(或AgEDTA)是否具有抗菌性。具体地说，从AKZO Nobel公司和Alpha Chemicals公司获得EDTA银组合物商品。

[576]所需的装置：

·培养箱，无菌操作台

577]所需的材料：·无菌营养琼脂平板、无菌的药棉签、微吸管(100μl～1000μl的容积)、培养16小时的如下菌株(密度约为10⁸CFU/ml)：

大肠杆菌(野生型)、大肠杆菌(MDR)、绿脓杆菌(野生型)、绿脓杆菌(MDR)、金黄葡萄球菌ATCC 6538P、耐2，6-二甲氧苯青霉素金黄葡萄球菌。

[578]方法：

·将16小时培养的给定试验菌涂拭在无菌营养琼脂平板上。

·使平板搁置15分钟以进行吸附。

·15分钟后，借助于10mm的打孔器，无菌地在琼脂表面中钻孔。

·在孔中装入100μl合适的试样稀释液。保持15分钟以预扩散。

·在约37℃处培养平板约24小时，接着观察结果。

·用Hi培养区域阅读器测定抑制区(毫米)。

[579]结果：见下表21和图36及37.

[580]表21：银螯合物的对比评估

[581]

[582]结论：银螯合物比如EDTA银具有抗菌剂功效。

[583]抗生素组合治疗

[584]当首次发现抗生素时，人们将其吹捧为奇迹般的治疗手段，而它们实际上也是如此。在19世纪未20世纪初致命的感染在本世纪仅仅是治疗较为麻烦。但医学几乎完全是循环发展的。误用、处方过度和/或滥用抗生素已使耐药性细菌株得到进化，于是细菌株再一次威胁健康及生命。

[585]有助于耐药性细菌进化的一些其他因素是用于农业以及作为农业中(比如，用于家禽、牛、猪肉等)食品补充剂的抗生素的使用。很多人认为处方用抗生素在美国的农业工业中被过度使用，它在很多外国中也被过度使用。在农业中经常用抗生素进行初始处理，即使在将培养物样品送到实验室之前也是如此。由于亚洲家禽农场主过度使用抗生素，禽流感(比如H5N1或“HPAl”)已变得非常耐抗生素。病人也较易获得用于对抗细菌的抗生素。不适当的剂量和不完全的治疗期也有助于耐药菌株的出现。有几个重要的临床分枝以解决耐药性问题。病原菌对抗生素的耐药性对传热性疾病的治疗具有严重的影响。被认为是特效药的许多药物，比如青霉素在首次引入时对有效控制细菌具有较大的潜力，但没想到有细菌适应了它们，从而极大降低了它们的可用性。

[586]目前，抗生素抗性问题是一个全球问题。目前已知一些常见的高度致病菌比如金黄葡萄球菌，特别是在医院中发现的菌株对除了万古霉素之外的所有抗生素是耐药性的，并且可预期其很快也将是耐万古霉素的。MRSA(耐2，6-二甲氧苯青霉素金黄葡萄球菌)和VRE(耐万古霉素肠道球菌)导致严重的院内感染，于是当发现时经常关闭甚至销毁医院病房。

[587]为解决该问题，迫切需要寻求替换物比如新的抗生素以代替旧的抗生素或有效利用现有的抗生素。耐多药菌增长的威胁也是考虑本发明的银/水组合物的充分理由。

[588]用于处理细菌对抗生素日益增长的抗性的方法包括使用组合治疗，其中同时使用具有不同作用方式的两种或多种不同的抗生素。可用各种体外方法测定抗生素组合的协同效应，但采用不同的测试方法时结果可能显示出差异，同时也不能完全排除细菌发展对它们的抗性。

[589]目的及目标

[590]进行本研究的目的及目标如下所述：

1.确定临床分离菌的耐多药(MDR)模式。

2.确定临床分离菌对本发明的银/水溶液的敏感度。

3.通过圆环估计试验确定抗生素组合(协同作用)。

4.确定抗生素和本发明的银/水组合物的最低抑菌浓度(MIC)。

5.通过棋盘分析研究抗生素和本发明的银/水溶液之间的协同作用。

[591]材料及方法

临床分离菌的收集

由P.D.Hinduja医院(Cadellroad，Mahim，孟买-400016，印度)收集到如下耐多药临床分离菌。

·大肠杆菌(从大便中分离)

·绿脓杆菌(从痰中分离)

·耐2，6-甲氧苯青霉素金黄葡萄球菌(MRSA，从腰部脓包中分离)。

[592]培养基、溶液和抗生素圆环：

[593]培养基：

·营养肉汤。

·营养琼脂。

·Muller及Hinton琼脂。

[594]溶液：

·抗生素溶液。

·银/水溶液(22ppm)。

用于该研究中的各个试验的培养基组合物和溶液如表26所列(如下)。

使用合适浓度的较易获得的抗生素圆环。各种抗生素的圆环含量如表27所列(如下)。

接种物制备：

在营养肉汤内接种生长的接种环量的纯培养物，接着在约37℃处培养一整夜。将500mcl的过夜培养物转入到5ml新的营养肉汤中，接着在约37℃处培养4～6小时。将培养物的密度调节至约10⁵～10⁶fu/ml。

[595]抗生素敏感度试验-Kirby Bauer方法(纸片扩散试验)：

在该方法中，将抗生素浸润圆环置于预先用细菌悬浮液接种的琼脂平板上。抗生素扩散到周围介质中。抗生素浓度随其距圆环的距离增加而在数值上减小。圆环周围的透明区指示有机体对抗生素的敏感度。按毫米测定透明区，接着将其与标准NCCLS图进行比较。

[596]方法：

1.将无菌的药棉签浸入上述接种物肉汤试管中，接着将其涂抹在M.H.琼脂平板上的表面以获得汇合生长。

2.在使接种物吸附在培养基上之后，借助于无菌的镊子将抗生素圆环置于表面涂布平板上。

3.在约37℃处培养平板约24小时。

4.圆环周围的透明区指示有机体的敏感度。记录该区直径，接着根据NCCLS提供的标准图(Koneman，第5版，1997)进行解释(参照表27)。

[597]确定分离菌对10ppm的银水溶液-琼脂扩散法的敏感度：这通过孔分析法确定，其中在琼脂培养基中大量接种分离菌，接着将10ppm的银/水溶液添加到在固体接种培养基中冲压出的孔中(10mm)。然后记录抑制区尺寸。

[598]方法：

1.将0.5ml的接种物添加到20ml的Muller及Hinton琼脂的熔化斜面底中，接着将其注入培养皿平板中，从而使其固化。

2.在琼脂层冲压孔。

3.然后将不同浓度的银/水组合物添加到各个孔中。

4.在约37℃处培养平板约24小时。

5.记录抑制区的尺寸。

[599]通过纸片扩散试验确定抗生素组合。

这是一个简单、定量的试验，用于测试临床分离菌与抗生素组合物之间的相互作用。在该测试中，将抗生素圆环置于用Kirby-Bauer技术接种的琼脂平板上。圆环应该相隔某一距离，该距离等于或略大于由各圆环单独产生的抑制区的平均直径。获得的抑制区的形状表明临床分离菌与抗生素的组合物之间相互作用的类型。

[600]方法：

1.将无菌的药棉签浸入上述接种物肉汤试管中，接着将其涂抹在M.H.琼脂平板上的表面以获得汇合生长。

2.在使接种物吸附在培养基上之后，借助于无菌的镊子将两个抗生素圆环(待研究的组合物)相隔某一距离置于表面涂抹的平板上，该距离等于或略大于各圆环单独产生的抑制区的直径的总和。

3.在约37℃处培养平板约24小时。

4.抑制区的形状表明相互作用的类型，即协同作用、拮抗作用或不相关。

图25所示为在用于细菌协同作用的纸片扩散试验中可能的相互作用。

[601]具体地说，部分A说明加合性或无关效应，各种抗生素产生的抑制区不受相邻区的影响；部分B说明拮抗效应，其中在存在另一抑制区时，各种抗生素的抑制区减小；而部分C说明协同交互作用的两种可能表现。在左边平板上，抑制区扩大发生在两种抗生素相遇的位置。在右边平板上，两种抗生素本身右侧均不具有抑制性，但在两种抗生素扩散到一起的位置细菌繁殖受到抑制。

[602]确定抗菌剂的最低抑菌浓度(MIC)。这是一个大量稀释的肉汤敏感度试验。在其中添加了标准的细菌悬浮液的肉汤中，制备一系列抗菌剂的稀释液。在培养末期，肉眼观察试管的繁殖。将抑制可视繁殖的抗菌剂的最低浓度视为MIC。

使用的抗生素：

阿米卡霉素：Mikacin inj(250mg)，Aristo labs，孟买，印度。

批次no.02D054，2004年4月制备。

头孢哌酮：Magnamycin inj(250mg)，辉瑞(Pfizer)有限公司，孟买，印度

批次no.32035153A，2003年3月制备。

环丙沙星：Cifran(200mg/ml)，Ranbaxy Labs，Jaipur，印度

批次no.9042601，2004年3月制备。

[603]方法：

1.将大量的抗菌剂在适当的范围内逐次稀释。

2.无抗菌剂的试管用作培养对照。

3.然后用标准的细菌悬浮液接种各个试管，接着在约37℃处将其培养约24小时。

4.在培养末期，肉眼观察试管的混浊性。混浊表明包含在培养基中的一定浓度的抗菌剂没有抑制细菌生长。

5.MIC是抑制可视生长的抗菌剂的最低浓度。

[604]通过棋盘分析研究协同作用。棋盘分析是在测试多个抗生素和/或多个稀释液时所使用的方法。选用两倍逐级稀释的稀释液，从而使其浓度为MIC的1/16～2倍。沿纵坐标逐次稀释药物A，同时沿横坐标逐次稀释药物B。获得的方格盘产生试管中两种抗生素的各个组合，其中在对角处包含最高浓度的各种抗生素。

方案：

棋盘分析中药物稀释方案。

第一行及第一列的仅具有一种药物的试管用于确定试验分离菌各自的MIC值。

没有抗生素的试管是阳性对照。

1.将在肉汤中稀释的抗菌药物从合适备用液中添加到各个试管中，添加的最终体积为5ml。

2.添加0.1ml的培养物悬浮液。

3.在37℃处培养24小时。

4.通过将代表相同效果的所有组合的点连接起来，获得等效应图，来描述试验结果，该相同效应包括单独使用的抗生素的等效浓度。

[605]计算：

Elion等人(1954)描述了一种用于量化MIC结果的方法，该MIC结果由分部抑制浓度(FIC)指数获得，该指数被定义为组合物中两种药物的FIC值的和。

FIC指数＝药物A的FIC+药物B的FIC。

药物A的FIC＝与药物B的组合中药物A的MIC/药物A的MIC

指数低于0.5被认为是协同作用的证据；指数大于2.0是拮抗作用的证据。

(Koneman，第5版，1997)

图26所示为抗菌协同作用的棋盘滴定。

每个正方形代表一个试管。抗菌剂A的浓度沿横轴增加，抗菌剂B的浓度沿纵轴增加。有阴影的正方形表明细菌繁殖。在方格盘A中，抗菌剂显示相加效应，右边的等效应图是直线。方格盘B代表协同作用，其中等效应图是凹曲线。方格盘C代表拮抗结果，其具有凸曲线。

通过Kirby-Bauer方法确定抗生素敏感度图案。

表22 用于研究的分离菌的抗菌图(区域以毫米计)

注意：-：不抑制

确定临床分离菌对ASAP琼脂扩散法的敏感度。

注意：-：不抑制

参见照片图27。

[607]通过圆环估计试验确定抗生素组合。

在检查各种抗生素组合对分离菌的协同效应或相加效应中，就MRSA来说，仅在阿米卡霉素与头孢哌酮的组合以及阿米卡霉素与四环素的组合中观察到表示可能存在协同作用的抑制区(见图28)。就其他的两种分离菌即大肠杆菌和假单胞菌来说，没有观察到预示协同组合的抑制区(见图29和30)。

[608]确定抗生素的最低抑菌浓度。

确定显示出抑制区的抗生素的MIC，该抑制区预示可能存在协同作用。

表23：

阿米卡霉素的MIC

备用液：125mcg/ml

营养液：营养肉汤

培养物：MRSA

注意：+：生长

      -：不生长

发现用于MRSA的阿米卡霉素的最低抑菌浓度是0.8mcg/ml。

头孢哌酮的MIC

备用液：100mcg/ml

稀释液：营养肉汤

培养物：MRSA

 

试管号浓度mcg/ml生长10.2+20.4+30.6+40.8-51-62-73-84-95-10+ve+11-ve

注意：+：生长

      -：不生长

发现用于MRSA的头孢哌酮的MIC是10mcq/ml。

银/水的MIC

备用液：20ppm的银/水溶液

稀释液：营养肉汤

培养物：MRSA

 

试管号浓度(ppm)生长15+210-315-420-525-630-735-840-945-1050-11+ve+12-ve-

表23a

 

试管号浓度(ppm)生长11+22+33+44+55+66+77+88-99-1010-11+ve+12-ve-

注意：+：生长

      -：不生长

发现用于MRSA的银/水的MIC是8ppm。

银/水的MIC

备用液：20ppm

稀释液：营养肉汤

培养物：大肠杆菌

表24

 

试管号浓度(ppm)生长11+22+33-44-55-66-77-88-99-10+ve+11-ve-

注意：+：生长；-：不生长

发现用于大肠杆菌的银/水的MIC是3ppm。

银/水的MIC

备用液：20ppm的银/水

稀释液：营养肉汤

培养物：假单胞菌

表25

 

试管号浓度(ppm)生长11+22+33-44-55-66-77-88-99-10+ve+11-ve-

注意：+：生长；-：不生长

发现用于假单胞菌的银/水的MIC是3ppm。

通过棋盘分析研究协同作用。

I.阿米卡霉素与银/水的组合。

阿米卡霉素的MIC＝0.8mcg/ml。

银/水的MIC＝8ppm。

培养物：MRSA

注意：+：生长

      -：不生长

发现用于MRSA的协同浓度是0.05mcg/ml的阿米卡霉素与1ppm的本发明的银/水。

FIC指数的计算：

阿米卡霉素的FIC＝组合中的阿米卡霉素的MIC/单独的阿米卡霉素的MIC

＝0.05/0.8

＝0.0625.

ASAP的FIC＝组合中的银/水的MIC/单独的银/水的MIC

＝1/8

＝0.125。

FIC指数＝阿米卡霉素的FIC+银/水的FIC

＝0.0625+0.125

＝0.1875。

FIC指数预示阿米卡霉素与银/水之间的协同作用

[609]II.头孢哌酮与银/水的组合。

头孢哌酮的MIC＝10mcg/ml

银/水的MIC＝8ppm

培养物：MRSA

注意：+：生长

      -：不生长

发现用于MRSA的协同浓度是0.625mcg/ml的头孢哌酮与1ppm的银/水。

FIC指数的计算：

头孢哌酮的FIC＝组合中的头孢哌酮的MIC/单独的头孢哌酮的MIC

＝0.625/10

＝0.0625。

ASAP的FIC＝组合中的银/水的MIC/单独的银/水的MIC

＝1/8

＝0.125。

FIC指数＝头孢哌酮的FIC+银/水的FIC

＝0.0625+0.125

＝0.1875.

FIC指数预示头孢哌酮与银/水之间的协同作用

[610]III.头孢哌酮与阿米卡霉素的组合。

头孢哌酮的MIC＝10mcg/ml

阿米卡霉素的MIC＝8ppm

培养物：MRSA

注意：+：生长

      -：不生长

发现添加的头孢哌酮的浓度是1.25，添加的阿米卡霉素的浓度是0.4。

FIC指数的计算：

头孢哌酮的FIC＝组合中的头孢哌酮的MIC/单独的头孢哌酮的MIC

＝1.25/10

＝0.0625。

阿米卡霉素的FIC＝组合中的阿米卡霉素的MIC/单独的阿米卡霉素的MIC

＝0.4/0.8

＝0.5

FIC指数＝阿米卡霉素的FIC+头孢哌酮的FIC

＝0.125+0.5

＝0.625

FIC指数预示头孢哌酮与银/水之间的加合性

[611]讨论：

[612]在该实施例中，取自印度孟买的P.D.Hinduja医院的三种临床分离菌中，革兰氏阴性分离菌显示出对早期的抗生素比如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、和早期的喹诺酮如萘啶酮酸以及第三代头孢菌素-头孢他啶和头孢哌酮具有抗性。用于研究的假单胞菌的临床分离菌也对近来的环丙沙星以及半合成的氨基糖苷类、阿米卡霉素具有抗性。MRSA的格兰氏阳性分离菌也对早期的抗生素和第三代头孢菌素如头孢他啶具有抗性。

[613]它们对本发明的银/水组合物的敏感度的研究结果显示，如琼脂扩散法及大量稀释肉汤方法所确定的结果一样，革兰氏阴性分离菌对约3ppm的银/水溶液容易敏感，MRSA分离菌受8ppm的银/水溶液抑制。

[614]通过纸片扩散法确定与分离菌结合的两种抗生素的相互作用，结果显示，在头孢哌酮与阿米卡霉素之间存在抑制MRSA的协同作用。进行棋盘分析以确认该点。通过纸片扩散试验，没有观察到抗生素之间存在对革兰氏阴性分离菌的加合性或协同作用。

[615]进行棋盘分析，发现两种抗生素的FIC指数是0.625，从而表明阿米卡霉素与头孢哌酮的组合有加合性而无协同作用。

[616]还进行了棋盘分析，以研究银/水溶液与阿米卡霉素以及银/水溶液与头孢哌酮的组合。结果表明，在存在本发明的银/水组合物时，抗生素的有效浓度减少到约四倍。在各种情况下发现这些组合的FIC指数是0.1875，这表明银/水与阿米卡霉素的组合以及银/水与头孢哌酮的组合具有协同作用。

[617]研究结果表明，在上述临床MDR分离菌中，在存在银/水时，能极大地降低抗生素剂量，这在其他抗生素组合中没有观察到。

[618]这些结果表明，本发明的银/水组合物将在抗生素组合疗法尤其在抑制耐多药菌株中扮演重要的角色。

表26

1.营养肉汤

蛋白胨            10.0gm

氯化钠            5.0gm

肉汁              3.0gm

葡萄糖            5.0gm

苯酚红(指示剂)    0.001％

蒸馏水            900ml

2.营养琼脂：

蛋白胨            10.0gm

氯化钠            5.0gm

肉汁              3.0gm

蒸馏水            900ml

琼脂              2.0％

pH                7.2

3.Muller及Hinton  琼脂

酪蛋白酸水解物    29.0gm

牛肉淀粉          10.0gm

马铃薯淀粉        2.5gm

琼脂              1.2％

蒸馏水            1000ml

PH                7.6

表27

抑制区直径说明

(NCCLS公文，1988)

[619]庆大霉素和银/水组合物的组合作为伤口敷粉

[620]引言

[621]伤口敷粉是用于防止或治疗伤口、烧伤皮肤溃疡的表面细菌感染、或者切割后阻止表面细菌进入的化合物。

[622]伤口敷粉通常是广谱的抗生素/杀菌剂制品。使用该粉末并不排斥用抗生素在合适的位置处伴随治疗。

[623]目前市场上可用的大多数治伤产品皆基于聚维酮-碘。聚维酮碘在开口创伤处是高度细胞毒性的，特别禁用于糖尿病患者的伤口中。此外，碘会升华，于是必须每隔约6～8小时重新使用碘。

[624]另一潜在的应用领域是在兽医领域中。宠物由于抓挠以除去寄生虫以及与其他动物冲突而经常引起切口、擦伤、以及伤口。温和的但广谱性抗菌剂在该应用领域是有帮助的。

[625]我们决定配制由缓释剂型制品组成的伤口敷粉，该缓释剂型制品由庆大霉素和设计的本发明的银纳米颗粒组成。在此将包含约200ppm的银纳米颗粒和约100ppm的庆大霉素的滑石基制品称为SILDUST。

[626]结果

[627]SILDUST-敏感度

[628]目的：确定SILDUST和它的组分抑制微生物的敏感度。

[629]工序：

[630]所需的装置：

·培养箱，无菌工作台

[631]所需的材料：

·无菌营养琼脂平板、无菌的药棉签、微吸管(容积100μl～1000μl)、16小时培养的如下菌株(近似密度为10⁸CFU/ml)，即大肠杆菌(MDR)、绿脓杆菌(MDR)、耐2，6-二甲氧苯青霉素金黄葡萄球菌。

[632]方法：

·用无菌药棉签在营养物琼脂表面上表面涂抹0.1ml的培养物。搁置15分钟。

·15分钟后，借助于10mm的打孔器，无菌地在琼脂表面中打孔。

·将10mg的SILDUST(200ppm的银滑石+100ppm的庆大霉素)装入一个孔中。

·将100μl、100ppm的庆大霉素装入到另一个孔中。还装入200ppm的银滑石+100μl的蒸馏水。两个孔用作对照。

·在约37℃处培养平板24小时，接着进行观察。

·用HiMedia区域阅读器测定抑制区(mm)。

[633]结果：如下表28和图38所示。

表28：SILDUST的敏感度

SILDUST^*→200ppm的ASAP滑石+100ppm的庆大霉素

[634]结论：观察到观察到SILDUST(包含200ppm的银滑石和100ppm的庆大霉素)有协同活性。

[635]注意：

SILDUST1—200ppm的银滑石+50ppm的庆大霉素

SILDUST2—200ppm的银滑石+100ppm的庆大霉素

[636]SILDUST—抗菌活性

[637]目的：确定SILDUST抑制微生物的杀菌时间

[638]工序：

[639]所需的装置：

·培养箱、无菌工作台、称重天平。

[640]所需的材料：

·无菌的苯酚红葡萄糖肉汤、16小时培养的如下菌株(近似密度为10⁸CFU/ml)：大肠杆菌(MDR)、绿脓杆菌(MDR)、耐2，6-二甲氧苯青霉素金黄葡萄球菌。

[641方法：

·在无菌试管中制备5ml包含2g SILDUST的等分试样。

·在上述溶液中接种0.1ml的培养物。充分涡旋溶液。

·在间隔0、5、10...、50分钟时，在5ml无菌的苯酚红葡萄糖肉汤中接种一接种环量的待测试试样。充分涡旋溶液。

·在约37℃处培养约24小时。

·观察生长情况。

·对于阴性对照，一接种环量的未接种的SILDUST悬浮在5ml无菌的苯酚红葡萄糖肉汤中，接着在约37℃处培养约24小时。

·对于阳性对照，在5ml无菌的苯酚红葡萄糖肉汤中接种一接种环量的待测试的培养物，接着在约37℃处培养约24小时。

[642]结果：见表29、30、和31

表29 大肠杆菌(MDR)

 

时间间隔(分钟)100ppm的庆大霉素200ppm的ASAP滑石SILDUST^*WOKADINE^*0+++-5+++-10+++-15+++-20+++-25+++-30+++-35+++-40+++-45+++-50++--阳性对照++++阴性对照----

SILDUST^*→200ppm的ASAP滑石+100ppm的庆大霉素

Wokadine^*→200ppm的商品碘

注意：+→生长

      -→不生长

[643]结论：组合物显示协同活性。由于碘释放，具有WOKADINE的试管(如最后一个实施例所述)在将粉末添加到培养基中的几秒内变为褐色。虽然WOKADINE显示更快的杀菌速率，但其较高的细胞毒性对于伤口治疗是不希望有的。

[644]表30 绿脓杆菌(MDR)

 

时间间隔(分钟)100ppm的庆大霉素200ppm的ASAP滑石SILDUST^*WOKADINE^*0+++-5+++-10+++-15+++-20+++-25+++-30+++-35+++-40++--45++--50----阳性对照++++阴性对照----

SILDUST^*→200ppm的ASAP滑石+100ppm的庆大霉素

Wokadine^*→200ppm的商品碘

注意：+→生长

      -→不生长

[645]结论：组合物显示协同活性。

[646]表31 MRSA

 

时间间隔(分钟)100ppm的庆大霉素200ppm的ASAP滑石SILDUST^*WOKADINE^*0+++-5+++-10++--15-+--20-+--25-+--30----35----40----45----50----阳性对照++++阴性对照----

SILDUST^*→200ppm的ASAP滑石+100ppm的庆大霉素

Wokadine^*→200ppm的商品碘

注意：+→生长

      -→不生长

[647]结论：组合物显示协同活性。

[648]SILDUST-抗菌活性

[649]目的：确定噬菌体寄主对SILDUST的敏感度。

[650]原理：必须获得适当的稀释液以排除因SILDUST杀死寄主导致的假阳性。

[651]工序：

[652]原理：

·将噬菌体寄主和大肠杆菌寄主用作检测系统。必须通过稀释液以中和SILDUST中的银浓度，以便不杀死寄主。按如下所述制备实验用等分试样；

1.试验—噬菌体+SILDUST

2.控制—噬菌体+盐水

[653]所需的装置：

·称重天平、无菌工作台、培养箱。

[654]所需的材料：

·平板、标识器、刮刀、微吸管。

[655]方法：

·在单独的无菌试管中制备2.5ml包含约1gm的SILDUST(显示无杀菌效果)和盐水的等分试样。

·向各个试管中添加约0.1ml的噬菌体溶菌液(每毫升约10¹⁰传染性的噬菌体颗粒)。

·在涡旋混合器上适当混合，接着在约37℃处培养。

·在t＝0、1小时以及其后每隔1小时取出0.5ml等分试样，接着将其稀释成不显示杀菌效果的SILDUST的实验性稀释液。

·将该稀释液点在新制备的寄主菌苔上。必须进行该步骤以用于测试和对照。

·在约37℃处培养平板24小时。

·将0.1ml的该稀释液与0.5ml按指数生长的寄主混合在一起，接着在约37℃处培养约15分钟。

·向上述溶液中添加7ml熔化的软琼脂。

·充分涡旋溶液，接着覆盖在标准的营养琼脂平板上。

·在约37℃处培养平板约24小时。

·检查菌苔上的噬菌斑，接着计算覆盖层上噬菌斑形成数。

[656]结果：见表32

表32— SILDUST实验

 

稀释液结果10^-1+10^-2-10^-3-10^-4-

注意：

+→存在噬菌体活性颗粒。

-→不存在噬菌体颗粒。

[657]SILDUST—抗病毒活性

[658]目的；使用噬菌体检测系统确定SILDUST的抗病毒活性。

[659]工序：与“SILDUST-抗菌活性，第2部分”相同

[660]结果：见表33和34

[661]表33 SILDUST的杀菌时间

 

时间间隔(小时)盐水SILDUST^*0++1++2+-3+-

SILDUST^*→200ppm的ASAP滑石+100ppm的庆大霉素

注意：

+→存在噬菌体活性颗粒。

-→不存在噬菌体颗粒。

[662]表34 噬菌体计算值

 

时间间隔(小时)盐水(pfu/ml)SILDUST^*(pfu/ml)0TNTC1.15×10⁶1TNTC1.0×10⁴2TNTC3.0×10³3TNTC0

SILDUST^*→200ppm的ASAP滑石+100ppm的庆大霉素

注意：

TNTC→数目太多难以计数

pfu/ml-传染性噬菌体颗粒的滴定度

[663]结论：发现10^-2稀释度的SILDUST对寄主不显示灭菌活性。对具有相同稀释度的SILDUST的抗病毒活性进行检验，结果发现其是有效的。发现噬菌斑形成单位在3小时内从10⁵减少到0，这证明SILDUST也可能有抑制动物病毒的活性。

在紧接着上述试验的试验中使用如下组合物。

[664]培养基组合物

营养琼脂：

蛋白胨 100gm

氯化钠 5.0gm

肉汁 30gm

蒸馏水 900ml

琼脂 2.5gm

pH 7.2±02

苯酚红葡萄糖肉汤：

朊蛋白胨 10.00g/lt

牛肉汁 1.00g/lt

氯化钠 5.0g/lt

葡萄糖 5.0g/lt

苯酚红 0.018g/lt

pH 7.4±0.2

软琼脂：

琼脂 1.0％

盐水：

氯化钠 0.9％

WOKADINE

生产许可证编号：AD/200-A

批号：WNR5008

生产日期：2005年3月

到期日：2008年3月

活性成分：

聚维酮碘(IP)5％w/w，

制造商：

Navketan Research and Lab有限公司

[665]向10％的聚维酮碘溶液中添加银/水

[666]与本发明的银/水组合物较好地一起作用的添加剂的另一个例子是聚维酮碘。碘是一种医学中众所周知的预防剂用于治疗很宽范围的病原体。可用各种浓度的商品碘，但通常使用且优选使用的浓度是10％。在本发明的该优选实施方式中，协同的组合物包括约25～50％v/v的银/水混合物的替换物，用于替代10％的碘溶液。虽然银/水混合物与碘之间可能发生一些反应，但由随后论述的试验结果可知银/水与聚维酮碘的协同组合物可作为局部消毒剂(比如一种软膏)，并且/或者作为预防剂抑制伤口、烧伤和/或擦伤中的感染。

[667]具体地说，对与不同百分比的聚维酮碘(PI)组合的32ppm的银/水组合物抑制众多细菌的协同活性进行了研究。测试方法和结果如下。由这些结果可以推定通过将这两种材料添加在一起，存在协同关系。可以利用该协同效应以生产出色的局部杀菌剂。

[668]于是应当将如下权利要求理解为包括如上所述具体说明的内容、概念上等效的内容、明显能被替换的内容以及实质上结合了本发明的主要构思的内容。本领域的技术人员对上述优选实施方式所作的各种改进和修改均不超出本发明的保护范围。已列举的实施方式仅用于说明实施例，不应看作是对本发明的限制。因此，应当理解，在附后的权利要求的范畴内，可以用不同于此处具体所述的那样实现本发明。