用于检测分析物的支持物以及制造和利用该支持物的方法

摘要

描述了用于检测分析物的支持物以及制造和利用该支持物的方法。

说明书

相关申请的交叉参考资料

本申请要求2005年12月29日提交的，题为“用于检测分析物的支持物以及 制造和利用该支持物的方法”的美国申请系列号60/754,747的优先权，该申请 作为参考资料结合在本申请中。

背景技术

利用标记独立检出(LID)平台(例如，表面等离子共振(SPR)或谐振波 导光栅传感器)的检测，典型地采用两步法来进行：(i)使结合伙伴中的一个 (例如，蛋白质)固定在传感器的表面上；和(ii)使一个配体(例如，药， 蛋白质，寡核苷酸)与被固定的蛋白质结合。传统上，生物分子偶联到表面上 涉及羧酸基团在表面上被活化成活性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯类，然后， 它们与所关心的蛋白质上的氨基偶联。该方法已被生物核心(Biacore)公司、 亲和生物传感器(Affinity Biosensors)公司和人工传感仪器(Artificial Sensing Instruments)公司成功地用于它们各自的LID平台并商业化。尽管有效，但该活 化步骤不仅费时还涉及处理和使用带一定毒性的化学品。

该方法的一种替代方法涉及利用”预激活”的化学过程。例如，提供醛基的 表面已被用于结合生物分子。但是，在偶联之后需要一个还原步骤以稳定所生 成的席夫碱。带环氧化物和异氰酸酯官能团的表面也已被利用；但是，环氧基 反应速度较慢，所以需要在很强的碱性条件下长时间孵育，而异氰酸酯基的反 应性极高，所以存在储存稳定性的问题。由于存在这些问题，几乎没有关于将 预激活的化学过程用于LID平台的报告。事实上，Biacore，Affinity Biosensors和 ASI---这是提供最通用的LID平台的三家公司，都不提供带预激活化学过程的 传感器。

马来酐容易与诸如氨基那样的亲核体反应。虽然已经描述了用马来酐共聚 物层对表面进行修饰以固定小分子，DNA，糖类和肽类，但是由于马来酐的水 解稳定性极差，所以并未获得广泛应用。马来酐的水解稳定性可以通过与憎水 侧链(如苯乙烯)共聚而得到提高；但它导致生物分子与表面的非特异性结合。 尽管这一点对某些应用，例如质谱是有益的，但对于LID来说是有问题的。

LID检定有一个独特的问题，通常它以严格需要生物专一性为条件。在分 析物溶液中掺入“封端剂”(如牛血清白蛋白，BSA)是不合乎要求的，这是 因为特异性(由于分析物)和非特异性(由于封端剂)结合都会导致界面折射 率改变，从而不能区分它们。该问题在使用复杂的样品或分析物不纯时只会变 得更严重。用酐类来固定例如蛋白质这样的生物分子时，担心由于生成了剩余 的负电荷以及聚合物中其他基团(如苯乙烯，乙烯，甲基乙烯基醚等)的影响 而造成的非特异性结合。因为这些原因，将酐聚合物用于LID的可行性存在潜 在的担忧。

本发明描述的支持物(support)和方法有诸多优点。例如，该支持物毋须 被活化，这就节省了使用者的时间，成本和减少了复杂性。本发明描述的支持 物和方法允许负载大量的生物分子，这就使得分析物检测的灵敏度更高。另外， 生产支持物的方法允许大量制造该支持物。一般说来，该支持物是稳定的，可 以储存较长时间(约6个月)而几乎不或不损失它们的结合能力。此外，涂覆 的基材(substrate)在酸性条件下水解缓慢，这样就允许在采用以往针对例如 酐类聚合物那样的聚合物的技术尚未描述过的条件下结合各种各样的生物分 子。最后，该支持物和方法还以及时且经济的方式增加了阵列信号的强度，灵 敏度和测定质量，还进一步改善了测定的特异性。

发明简述

本发明描述了用于分析物测定的支持物以及制造和利用该支持物的方法。 这里描述的材料，方法和制品的优点将在以下的说明书中加以部分地陈述，或 通过以下描述的各方面的实践而认识到。特别是通过在所附的权利要求书中指 出的元素与组合，可以认识到和获知以下描述的优点。需要理解的是，以下的 一般描述和详细描述只是示范性和说明性的，而非限制性的。

附图的简要说明

包括在本说明书中并构成本说明书一部分的附图说明了以下描述的几个 方面。要意识到这些附图只是叙述了这里描述的材料、制品和方法的典型实施 例，因此，不能认为是限制了它们的范围。

图1为预封端(pre-block)步骤以及将该预封端马来酐基聚合物附着到支持 物的示意图。

图2为在涂覆有EMA的金芯片上的SA固定的SPR响应曲线，该EMA用乙醇 胺预封端(的程度)至0，10，15，20，25和30摩尔％。

图3为与未预封端EMA相比较，4-fl生物素(Biotin)与固定的SA结合的结 合曲线，其中支持物由用乙醇胺进行不同程度预封端的EMA制成。

图4显示用甲氧基乙胺预封端对4-fl生物素结合的影响。

图5显示用异丙胺预封端对4-fl生物素结合的影响。

图6显示用丁胺预封端对4-fl生物素结合的影响。

图7显示用丙胺预封端对4-fl生物素结合的影响。

图8显示用己胺预封端对4-fl生物素结合的影响。

图9显示利用以不同预封端程度进行乙醇胺预封端的马来酐共聚物涂覆的 平板(plate)、由康宁Epic^TM系统(Corning Epic^TM System)测定的fl-生物素 的结合曲线。

图10显示利用以不同预封端程度进行甲氧基乙胺预封端的马来酐共聚物 涂覆的平板、由Corning Epic^TM System测定的fl-生物素的结合曲线。

图11显示采用Corning Epic^TM System用乙醇胺和甲氧基乙胺预封端测定 fl-生物素结合时的优化曲线。

图12显示预封端剂对链霉抗生物素蛋白(Streptavidin)固定以及fl-生物素 结合的影响。

图13显示部分水解的EMA和在140℃下真空干燥1小时的EMA的FTIR光谱 图。

发明详述

在公开和描述目前的材料、制品和/或方法之前，应该理解下述的情况并不 限于具体的化合物、合成方法或用途，因为这些都可能变化。还应该理解的是， 这里使用的术语只是为了描述特殊的情况，而并不是为了限制。

在本说明书及后续的权利要求书中，会提到很多术语，这些术语定义为具 有以下含义：

在整个说明书中，除非上下文有另外的需要，“包括”或其变化形式应被 理解为包括所述的整数或步骤，或一组整数或步骤，而不排除任何其他的整数 或步骤或一组整数或步骤。

需要指出的是，用于说明书和权利要求书中的单数形式“一”和“该”包 括复数的被谈到的事物，除非上下文另外明确指出。因此，例如提及“一种药 用的载体”包括两种或多种这样的载体的混合等。

“可选的”或“可选地”意味着其后描述的事件或情况可能发生或者可能 不发生，描述包括了事件或情况发生的例子以及事件或情况不发生的例子。

范围可以被表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。当 这样的一个范围被表示时，其它的情况包括从这一个特定值和/或至这另一个特 定值。同样，当数值被表示为近似值时，通过采用先行词“约”，应该理解到 该特定数值构成另外一种情况。还要进一步理解的是，每一个范围的两个端点 的意义都与另一个端点有关，而不依赖于另一个端点。还要理解的是，公开了 若干数值，除了该数值本身，还公开了“约”该特定数值。例如，若公开了 数值“10”，那么，也公开了“约10”。还要理解的是，如本领域技术人员恰 当地理解的那样，当公开了一个数值时，也公开了“小于或等于”该数值，“大 于或等于”该数值，以及数值之间可能的范围。例如，若公开了数值“10”， 那么，也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还要理解的是，在 整个申请中，数据以若干不同的格式提供，该数据表示终点和起点，以及数据 点任意组合的范围。例如，公开了一个特定的数据点“10”和一个特定的数据 点“15”，可以理解大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及 10和15之间被认为公开了。还要理解的是，两个特定单位之间的每个单位也被 公开。例如，若10和15被公开，则11，12，13，和14也被公开。

所谓“接触”指的是至少一种物质通过与另一物质紧密的物理接触而暴露 的情况。

这里使用的术语“附着的(attached)”是指两个组分或两个化合物之间的 任何化学相互作用。可以形成的化学相互作用的类型因所选的起始物质和反应 条件而异。这里描述的附着包括但不限于共价键，静电作用，离子键，氢键， 或疏水键合。

公开了化合物、组合物和组分，它们可被用于所公开的方法和组合物、与 所公开的方法和组合物联用、用于制备所公开的方法和组合物、或是所公开的 方法和组合物的产品。本文公开了这些和其他的材料，要理解的是，当这些材 料的组合、亚组、相互作用、类组等被公开时，对于每个个别的或集合的组合 和这些化合物的置换可能没有明确地空开，(但)每种材料这里进行了特定地 仔细考虑和描述。例如，如果公开和讨论了若干个不同的聚合物和生物分子， 聚合物和生物分子的每个和所有组合和置换都被专门地仔细考虑，除非专门指 出相反的意见。例如，一组分子A、B、和C以及一组分子D、E和F以及一个组 合分子的例子A-D被公开了，尽管每一个分子组合并未个别地列举，但每一个 分子组合都被个别地和集合地仔细考虑了。因此，在这个例子中，组合A-E， A-F，B-D，B-E，B-F，C-D，C-E和C-F都被专门地仔细考虑过，根据公开了A， B，和C；以及D，E，F；以及作为例子的组合A-D，应该被认为是被公开了。 同样，任何亚组以及它们的组合也被专门地仔细考虑过和被公开。因此，例如， 小组A-E，B-F，和C-E都被专门地仔细考虑过，根据公开了A，B，和C；以及 D，E，F；以及作为例子的组合A-D，应该被认为是被公开了。这个概念适用 于本发明公开的全部方面，包括但不限于制备和利用所公开的组合物的方法中 的步骤。因此，若有大量附加的步骤可以实施，要理解的是，这些附加的步骤 可以通过该被公开的方法的任何特定的实施方式或者实施方式的组合来加以 实施，每个这样的组合都被专门仔细考虑过，应该认为是被公开了。

I.支持物和制造支持物的方法

本文公开了用于检测的支持物。一方面，本文公开了一种用于检测的支持 物，它包括基材和直接或间接地附着在该基材上的粘结(binding)聚合物，其 中，该粘结聚合物具有多种能附着生物分子的活性基团和多种可离子化基团， 其中，活性基团与可离子化基团的比例为从0.5至10，其中，该粘结聚合物不含 有光致激活基团。

本文还公开了用于检测的支持物的制造方法，它包括将粘结聚合物直接或 间接地附着在基材上，其中，该粘结聚合物具有多种能附着生物分子的活性基 团和多种可离子化基团，其中，活性基团与可离子化基团的比例为从0.5至10.0， 其中，该粘结聚合物不含有光致激活基团。

另一方面，本文公开了用于检测的支持物的制造方法，它包括

a.将粘结聚合物直接或间接地附着在基材上，其中，该粘结聚合物具有 多种能附着生物分子的活性基团，其中，该粘结聚合物不含有光致激 活基团，和

b.将该活性基团转化成可离子化基团以使活性基团与可离子化基团的 比例为从0.5至10.0。

a.基材

这里可用的基材包括但不限于微量培养板、载玻片、或者任何其他能与粘 结聚合物附着的物质。一方面，当基材是一种微量培养板时，加样孔的数量以 及加样孔的容积会根据分析的规模和范围的不同而不同。其他可用的基材包括 但不限于细胞培养表面，诸如384孔微量培养板，96孔微量培养板，24孔培 养皿，8孔培养皿，10cm培养皿，或者T75培养瓶。

对于光或电检测的应用，基材可以是透明的，不透光的(impermeable)， 或者反射的，导电的，半导体或者绝缘体。对于生物用途的基材材料可以是多 孔的或无孔的，可以选自有机或无机的材料。

另一方面，基材包括塑料，聚合物或共聚物，陶瓷，玻璃，金属，结晶材 料，贵金属或半贵金属，金属氧化物或非金属氧化物，无机氧化物，无机氮化 物，过渡金属，或者任何它们的组合。此外，可构建该基材以便能被置于任何 的检测仪中。一方面，传感器可被整合到基材的底部/下侧(underside)用于后 续的检测。这些传感器可包括但不限于光栅，棱镜，电极和石英晶体微量天平。 检测方法可包括荧光，磷光，化学发光，折射率，质量，电化学。在一种情况 下，该基材是一种谐振波导光栅传感器。

另一方面，基材由无机材料组成。无机基材材料的例子包括但不限于金属， 半导体材料，玻璃，和陶瓷材料。可用于基材材料的金属包括但不限于金，铂， 镍，钯，铝，铬，钢，和砷化镓。用于基材材料的半导体材料包括但不限于硅 和锗。用于基材材料的玻璃和陶瓷材料可包括但不限于石英，玻璃，瓷，碱土 金属铝硼硅酸盐(aluminoborosilicate)玻璃以及其他的混合氧化物。无机基材材 料进一步的例子包括石墨，硒化锌，云母，二氧化硅，铌酸锂，以及无机单晶 材料。另一方面，基材可以由金制成，例如金传感器芯片。

另一方面，基材包括多孔的无机层。全部并入参考资料的美国专利No. 6,750,023中所公开的任何的多孔基材以及制备这样的基材的方法都可以在这 里使用。在一个情况下，基材上的该无机层包括玻璃或金属氧化物。在另一种 情况下，该无机层包括硅酸盐，硅铝酸盐，硼硅铝酸盐(boroaluminosilicate)， 硼硅酸盐玻璃，或者它们的组合。在另一些情况下，该无机层包括TiO₂，SiO₂， Al₂O₃，Cr₂O₃，CuO，ZnO，Ta₂O₅，Nb₂O₅，ZnO₂，或者它们的组合。另一方面，该 基材包括SiO₂以及含有Ta₂O₅，Nb₂O₅，TiO₂，Al₂O₃，氮化硅或它们的混合物的 层，其中，该层与SiO₂的表面邻接(adjacent)。氮化硅可用式SiNx示之，硅和 氮的化学计量是可变的。

另一方面，该基材可由有机材料组成。这里有用的有机材料可以由聚合物 材料制成，这是因为聚合物材料的尺寸稳定性和耐溶剂的缘故。有机基材材料 的例子包括但不限于聚酯，例如聚对苯二酸乙二酯和聚对苯二酸丁二酯；聚氯 乙烯；聚偏氟乙烯；聚四氟乙烯；聚碳酸酯；聚酰胺；聚(甲基)丙烯酸酯； 聚苯乙烯；聚乙烯；或者乙烯/醋酸乙烯酯共聚物。

另一方面，该基材可由一种具有能附着一种或多种生物分子的基团的材料 组成。例如，该基材可由这里描述的一种或多种粘结聚合物组成，再模制成任 意的形状。在这种情况下，生物分子和其他的组分可以直接附着在该基材上。

b.粘结聚合物

在各种情况下，包括一种或多种能将生物分子结合到基材上的活性基团的 粘结聚合物可以直接或间接地附着在基材上。粘结聚合物上的“活性基团”使 粘结聚合物可以附着生物分子。活性基团也能促进粘结聚合物附着在基材上。 另一方面，粘结聚合物可以共价地和/或通过静电附着在基材上。粘结聚合物可 以有一种或多种不同的活性基团。也仔细考虑到可以有两种或多种不同的粘结 聚合物附着到基材上。

在各种情况下，活性基团能与诸如胺或硫醇那样的亲核体形成共价键。该 胺或硫醇可从附着在基材表面(即连接层(tie layer))的生物分子或分子那里 获得，用于间接地将粘结聚合物附着在基材上。活性基团的例子包括但不限于 酐基，环氧基，醛基，活化的酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，它是带 有离去基团的酯)，异氰酸酯，异硫氰酸酯，磺酰氯，碳酸酯，卤化芳基或卤 化烷基，氮丙啶，或者马来酰亚胺。仔细考虑到粘结聚合物中存在两种或多种 不同的活性基团。

多种可离子化基团也存在于粘结聚合物中。这里，可离子化基团被定义为 在特殊的反应条件下可转化成带电基团(即，离子)的基团。例如，羧酸(可 离子化的基团)通过碱处理可转化成相应的羧酸根(带电基团)。带电基团可 以带正电也可带负电。带正电基团的一个例子是铵基。带负电基团的例子包括 羧酸根，磺酸根，和磷酸根。仔细考虑到粘结聚合物中可存在两种或多种可离 子化基团。

根据将粘结聚合物附着在基材上所采用的技术，粘结聚合物可以是水溶的 或水不溶的。粘结聚合物可以是线性的，也可以是非线性的。例如，当粘结聚 合物为非线性时，该粘结聚合物可以是分枝的，超分枝的，交联的，或者树枝 状的聚合物。粘结聚合物可以是均聚物或者是共聚物。

在一种情况下，粘结聚合物包括由马来酐和第一单体获得的共聚物。在这 种情况下，粘结聚合物中的马来酐含量为该第一单体化学计量(即摩尔量)的 从5％至50％，从5％至45％，从5％至40％，从5％至35％，从5％至30％，从5％至 25％，从10％至50％，从15％至50％，从20％至50％，从25％至50％，或从30％至 50％。在一种情况下，所选择的第一单体有助于粘结聚合物中马来酐基的稳定 性。在另一种情况下，该第一单体减少了生物分子在基材上的非特异结合。在 又一种情况下，粘结聚合物中的马来酐含量约为该第一单体化学计量的50％。 在另一种情况下，该第一单体包括苯乙烯，十四碳烯，十八碳烯，甲基乙烯基 醚，三甘醇甲基乙烯基醚，丁基乙烯基醚，二乙烯基苯，乙烯，二甲基丙烯酰 胺，乙烯基吡咯烷酮，可聚合的低聚(乙二醇)或者低聚(环氧乙烷)，丙烯， 异丁烯，醋酸乙烯酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺， 或者它们的组合。

在一种情况下，粘结聚合物包括聚(醋酸乙烯酯-马来酐)，(苯乙烯-马 来酐)共聚物，(异丁烯-马来酐)交替共聚物，(马来酐-1-十八碳烯)，(马 来酐-1-十四碳烯)交替共聚物，(马来酐-甲基乙烯基醚)交替共聚物，(三 甘醇甲基乙烯基醚-马来酐)共聚物，(乙烯-马来酐)交替共聚物，或者它们 的组合。

这里所用的粘结聚合物不含有光致激活基团。光致激活基团对特定的所施 加的外部刺激作出响应来产生活性形式，结果共价键合到例如，由同一分子或 不同分子所提供的邻接的化学结构上去。光致激活基团是分子中的那些在储存 条件下共价键维持不变、但是在受到外部能源的激活时与其他分子形成共价键 的原子基团。光致激活基团在吸收电磁能量时形成活性形式，诸如自由基，尤 其是氮宾，卡宾，和酮类的激发态。

c.活性基团与可离子化基团的比例

在一种情况下，活性基团与可离子化基团的比例为从0.5至5.0。在其他情 况下，该比例的下限端点为0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0， 4.5，或5.0，上限端点为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0， 8.5，9.0，9.5，或10.0，任何的下限端点和上限端点可形成比例范围。在另一种情 况下，活性基团与可离子化基团的比例为从0.5至9.0，从0.5至8.0，从0.5至7.0， 从0.5至6.0，从0.5至5.0，从0.5至4.0，从0.5至3.0，从0.6至3.0，从0.65至3.0，或 从0.67至3.0。

存在于粘结聚合物中的活性基团和可离子化基团的生成和数量可通过几 种办法来控制。在一种情况下，粘结聚合物可由具有活性基团的单体和带可离 子化基团的单体来合成。在这种情况下，所选择的单体的化学计量可以控制活 性基团与可离子化基团的比例。在另一种情况下，可以处理只具有活性基团的 聚合物，从而在粘结聚合物附着在基材上之前使部分活性基团转化成可离子化 基团。起始聚合物可以是市售品或者是采用本领域熟知的技术来合成。在另一 种情况下，可将聚合物附着在基材上，采用各种试剂对该附着了的聚合物进行 处理，以增加活性基团和可离子化基团，或者把活性基团转化成可离子化基团。 在另一种情况下，可以将具有活性基团的粘结聚合物附着在基材上，基材与活 性基团反应生成可离子化基团。

例如，参照图1，当具有重复单元R’-马来酐的一聚合物与W-R反应，酐开 环生成羧酸(可离子化基团)，式中，R’可以是不饱和单体的残基，所述单体 选自能与马来酐共聚的单体，诸如乙烯，丙烯，异丁烯，十八碳烯，十四碳烯， 醋酸乙烯酯，苯乙烯，乙烯基醚类如甲基乙烯基醚，丁基乙烯基醚，三甘醇乙 烯基醚，(甲基)丙烯酸酯，(甲基)丙烯酰胺，乙烯基吡咯烷酮，可聚合的 低聚(乙二醇)或低聚(环氧乙烷)；W是亲核基团，诸如NH₂，OH或SH，R 可以是氢或少于6的取代的或未取代的烷基(线性的或分枝的)，低聚(乙二 醇)或低聚(环氧乙烷)，或者二烷基胺，诸如二甲氨基丙基或二乙氨基丙基。 这个步骤称之为预封端。然后，预封端了的聚合物可被涂覆到基材表面。参照 图1，若基材具有亲核基团Z，其中，Z可以是例如NH₂，OH或SH，这些基团可 以与存在于预封端了的聚合物中的马来酐基团反应，形成预封端聚合物与基材 之间的共价键。

活性基团与可离子化基团的比例可通过使用特定量的试剂来控制。粘结聚 合物的其他性质(如疏水性)可以通过控制用于制备粘结聚合物的起始物质(如 选择疏水单体)或恰当选择衍生/封端试剂来按照需要加以改变。在某些情况下， 活性基团与可离子化基团的比例可通过将一种或多种活性基团转化成非活性 基团来加以控制。在又一种情况下，存在于粘结聚合物上的约10％至约50％的 活性基团被封端或被失活。这里用的术语“封端的(blocked)”是指将存在于 粘结聚合物中的活性基团转变成非活性基团，此处的非活性基团不与生物分子 形成共价键。在各种情况中，被封端的活性基团的数量约为10％，约为12％， 约为14％，约为16％，约为18％，约为20％，约为22％，约为24％，约为26％， 约为28％，约为30％，约为32％，约为34％，约为36％，约为38％，约为40％， 约为42％，约为44％，约为46％，约为48％，或约为50％，任何一个数值可以构 成一范围的上限和下限端点。在又一种情况下，从约10％至约45％，从约10％ 至约40％，从约10％至约35％，从约15％至约35％，从约20％至约35％，或从约 25％至约35％的活性基团被封端。

考虑可以在粘结聚合物附着在基材上之前封端剂就与粘结聚合物反应，或 者，另外的方式，粘结聚合物可以先被附着在基材上，接着，用封端剂进行封 端。在又一种情况下，封端剂至少包括一种亲核基团，粘结聚合物至少包括一 种亲电基团，通过亲核基团与亲电基团之间的反应，封端剂附着于粘结聚合物。 在又一种情况下，封端剂以共价键形式被附着在粘结聚合物上。例如，当封端 剂包含胺基，羟基，或巯基，它能与存在于粘结聚合物中的亲电基团(例如， 环氧基，酐基，活化的酯基)反应形成共价键。

在又一种情况下，封端剂包括烷基胺，烷基羟胺，或烷氧基烷基胺。这里 所用的术语“烷基”是指碳原子数为1至25的分枝的或不分枝的饱和烃基，诸 如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基，戊基，己基，庚 基，辛基，癸基，十四烷基，十六烷基，二十烷基，二十四烷基等。长链烷基 的例子包括但不限于油酸基(oleate group)或者十六烷酸基(palmitate group)。 用于这里的“低级烷基”是指含有一个至六个碳原子的烷基。这里使用的术语 “烷基羟基”是在如上定义的烷基中至少一个氢原子被羟基所取代。这里使用 的术语“烷基烷氧基”是在如上定义的烷基中至少一个氢原子被烷氧基-OR 所取代，其中R为如上定义的烷基。

在又一种情况下，封端剂包括氨，2-(2-氨基乙氧基)乙醇，N，N-二甲基 乙二胺，乙醇胺，乙二胺，羟胺，甲氧基乙胺，乙胺，异丙胺，丁胺，丙胺， 己胺，2-氨基2-甲基-1-丙醇，2-(2-氨乙基氨基)乙醇，2-(2-氨乙氧基)乙醇， 二甲基乙醇胺，二丁基乙醇胺，1-氨基-2-丙醇，聚乙二醇，聚丙二醇、4，7，10- 三氧杂(trioxa)-1，13-十三烷基二胺，聚乙二醇，或者胺封端的(terminated) 聚乙二醇，盐酸Trizma，或者它们的组合。在另一种情况下，封端剂包括水， H₂S，醇(ROH)，或烷基硫醇(RSH)，式中R为如以上定义的烷基。

这里描述的具有存在于粘结聚合物上的活性基团与可离子化基团之比的 支持物呈现出若干胜过现有技术传感器的优点。活性基团与可离子化基团的比 例可使粘结聚合物增加对基材的加载与附着(直接或间接地利用连接层)。如 以下将要讨论的那样，粘结聚合物附着在基材上是在温和的条件下进行，毋须 用例如，EDC/NHS来预先激活。这最终节省了支持物制造的时间和成本。还可 能在控制活性基团/可离子化基团比例的同时控制粘结聚合物的其他性质，诸如 疏水性/亲水性，最终它能提高支持物的效率。

这里描述的支持物的另一种特性是支持物与生物分子之间更高的结合能 力。相信如果加载在基材上的粘结聚合物越多，则有更多的生物分子能被附着 在粘结聚合物上。另外，如果附着在基材上的生物分子越多，则支持物的性能 也被增强了。在某些情况下，一旦有生物分子被附着在粘结聚合物上，被固定 的生物分子更加可以用来结合。例如，固定的蛋白质当被固定在本发明的支持 物上时，与不具有这里陈述的活性基团与可离子化基团之比的支持物相比，它 的空间位阻较小。还有，这里描述的粘结聚合物具有更大的柔性(flexibility)， 这也使粘结聚合物与生物分子之间的结合更多。最后，这里使用的粘结聚合物 提供了增加的结合检测灵敏度/信嘈比，当进行生物分子测定时这是一项非常令 人满意的特点。

d.支持物的制备

附着在基材上的粘结聚合物的数量，可以随着粘结聚合物的选择，生物分 子，以及要检测的分析物的不同而变化。在一种情况下，粘结聚合物至少包括 一单分子层。在又一种情况下，粘结聚合物的厚度约为10至约2,000。在 另一种情况下，粘结聚合物的厚度下限端点为 10＇，20＇，40＇，60＇，80＇，100＇，150＇，200＇，300＇，400＇或500＇，上 限端点为750＇，1,000＇，1,250＇，1,500＇，1,750＇，或2,000＇，任何的下限端 点可与任何上限端点形成厚度范围。

粘结聚合物可采用本领域熟知的技术被附着在基材上。例如，基材可浸渍 在粘结聚合物的溶液中。在另一种情况下，粘结聚合物可被喷涂，气相淀积， 丝网印刷，或机器人喷印针(pin)印刷或压印在基材上。这可以在一全组装 的基材上进行，或者可以在一底衬垫(bottom insert)上进行(在底衬垫附 着在一多洞的板上形成微量培养板之前)。

在又一种情况下，支持物可通过将粘结聚合物直接或间接地附着在基材上 来制备，其中，该粘结聚合物具有多种能附着生物分子的活性基团。当粘结聚 合物直接或间接地被附着在基材上，粘结聚合物可以共价键形式被附着或以非 共价键形式(如静电方式)被附着。图1说明了粘结聚合物附着在基材上的一 种情形，即亲核基Z(如氨基，羟基，或巯基)与粘结聚合物的酐基反应生成 新的共价键。

在另一种情况下，当粘结聚合物间接的被附着在基材上时，可利用连接层。 连接层可以共价键形式或静电形式被附着在基材的外表面上。术语基材的“外 表面”是基材暴露并能进行处理的区域。例如，与溶剂或试剂接触时，基材上 任何能与溶剂或试剂接触到的表面都是认为是基材的外表面。这样，连接层就 能被附着在基材和粘结聚合物上。

在各种情况下，这里描述的基材具有以共价形式与基材结合的连接层；但 是，也考虑到可以将不同的连接层通过其它方式附着到基材，并与以共价键形 式与基材结合的连接层相联合。例如，一个连接层可以共价键形式与基材结合， 而第二连接层可以静电形式与基材结合。在又一种情况下，当连接层是以静电 形式与基材结合时，用来制备连接层的化合物带正电，基材的外表面被处理成 带净负电，这样，连接层化合物与基材外表面形成静电结合。

在又一种情况下，基材的外表面可被衍生以便有能与连接层形成共价键的 基团。连接层可以共价键形式直接或间接地与基材结合。在连接层间接地与基 材结合时，可以利用具有能共价附着于基材以及连接层的基团的连接剂 (linker)。连接剂的例子包括但不限于醚基，聚醚基，多胺基，或聚硫醚基。 如不利用连接剂，连接层以共价形式与基材结合，这称为直接共价附着。

在又一种情况下，连接层是从包括一个或多个能与粘结聚合物反应的活性 官能团的化合物衍生出来的。这里关于连接层“衍生自”被定义为当连接层被 附着在基材上时所得到的连接层化合物的残基或片段。官能团使粘结聚合物与 连接层附着。在又一种情况下，连接层化合物的官能团包括氨基，巯基，羟基， 羧基，丙烯酸，有机酸和无机酸，活化的酯，酐，醛，环氧化物，异氰酸酯， 异硫氰酸酯，它们的衍生物或盐类，或者它们的组合。

在一种情况下，基材用例如包括至少一个氨基的聚合物进行胺修饰。这样 的聚合物的例子包括但不限于聚赖氨酸，聚乙烯亚胺，聚烯丙胺，或甲硅烷基 化聚乙烯亚胺。在另一种情况下，基材用氨基硅烷进行修饰。在又一种情况下， 连接层从直链或支链的氨基硅烷，氨基烷氧基硅烷，氨基烷基硅烷，氨芳基硅 烷，氨基芳氧基硅烷，或者它们的衍生物或盐衍生出来。在又一种情况下，连 接层衍生自3-氨丙基三甲氧基硅烷，N-(β-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷， N-(β-氨乙基)-3-氨丙基三乙氧基硅烷，N’-(β-氨乙基)-3-氨丙基甲氧基硅 烷，或者氨丙基倍半硅氧烷(aminopropylsilsesquixoxane)。

在另一种情况下，当基材由金组成，粘结聚合物通过氨基硫醇，例如盐酸 11-氨基-1-十一烷硫醇，被附着到基材上。

连接层可以采用本领域熟知的技术被附着到这里描述的任何基材上。例 如，基材可浸渍在粘结聚合物的溶液中。在另一种情况下，粘结聚合物可被喷 涂，气相淀积，丝网印刷，或机器人喷印针印刷或压印在基材上。这可以在全 组装的基材上进行，或者可以在底衬垫(bottom insert)上进行(例如，在 底衬垫附着在多洞的板上形成微量培养板之前)。

在一种情况下，基材包括金芯片，粘结聚合物包括(乙烯-马来酐)交替 共聚物，其通过氨基硫醇间接地附着在基材上，粘结聚合物中的活性基团与可 离子化基团的比例从0.67至3.0。在另一种情况下，基材包括玻璃基材，它带 有含Ta₂O₅，Nb₂O₅，TiO₂，Al₂O₃，氮化硅，SiO₂或它们的混合物的层，粘结聚合 物包括(乙烯-马来酐)交替共聚物，其通过连接层被间接地附着在基材上， 其中，该连接层从氨丙基硅烷(例如，γ-氨丙基硅烷)衍生而来，粘结聚合物 中的活性基团与可离子化基团的比例从0.67至3.0。在上述各情况中，(乙烯- 马来酐)交替共聚物在聚合物附着在基材上之前用甲氧基乙胺预封端。

II.利用的方法

这里公开的是检测分析物的方法。在一种情况下，该方法包括：

a.令包含分析物的样品与包含基材和粘结聚合物的支持物接触，该粘结聚 物直接或间接地附着在基材上，其中，该粘结聚合物具有多种能附着生物分子 的活性基团和多种可离子化基团，其中活性基团与可离子化基团的比例为从0.5 至10，以及

b.对被结合的分析物进行检测。

考虑可将一种或多种不同的生物分子附着在基材上以产生各种各样的生 物传感器。在又一个情况下，生物分子可以共价或静电附着在粘结聚合物上。 生物分子可能会通过共价的或非共价的键合对于另一分子显示出特异性亲和 力。用于这里的生物分子的例子包括但不限于核酸分子，抗体，肽，小分子， 外源凝集素，改性多糖，合成的复合大分子，功能化的纳米结构，合成聚合物， 修饰过的/封端的核苷酸/核苷，修饰过的/封端的氨基酸，荧光团，生色团，配 体，螯合物，适体，药(例如小分子)，或者半抗原。

在又一种情况下，生物分子可以是蛋白质。例如，该蛋白质可包括肽，蛋 白质或肽的片段，膜结合的蛋白质，或者核蛋白质。蛋白质可以是任意长度的， 可以包括一个或多个氨基酸或它们的变体。在分析之前蛋白质可以被诸如蛋白 酶消化断裂开。待分析的蛋白质样品可以经分级或分离以降低样品的复杂性。 断裂和分级可以在同一个检测中一并使用。这样的断裂和分级可简化和扩展蛋 白质的分析。

在又一种情况下，生物分子是一种病毒。病毒的例子包括但不限于1型单 纯疱疹病毒，2型单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，埃巴病毒，水痘带状疱疹病毒， 人疱疹病毒6，人疱疹病毒7，人疱疹病毒8，天花病毒，疱疹性口腔炎病毒， 甲肝病毒，乙肝病毒，丙肝病毒，丁肝病毒，戊肝病毒，鼻病毒，冠状病毒属， 甲型流感病毒，乙型流感病毒，麻疹病毒，多瘤病毒，人乳头瘤病毒，呼吸道 合胞病毒，腺病毒，柯萨其病毒，登革病毒，腮腺炎病毒，脊髓灰质炎病毒， 狂犬病毒，劳斯肉瘤病毒，黄热病毒，埃伯拉病毒，马尔堡病毒，拉沙热病毒， 东方马脑炎病毒，日本脑炎病毒，圣路易病毒性脑炎病毒，墨累山谷脑炎病毒， 西尼罗脑炎病毒，裂谷热病毒，A型轮状病毒，B型轮状病毒，C型轮状病毒， 辛德比斯病毒，猿猴免疫缺陷病毒，1型人类T细胞白血病病毒，汉坦病毒，风 疹病毒，猿猴免疫缺陷病毒，1型人类免疫缺陷病毒，痘苗病毒，SARS病毒， 2型人类免疫缺陷病毒，慢病毒，杆状病毒，腺伴随病毒，或者它们的任何毒 株或变体。

在又一种情况下，生物分子包括核酸。核酸可以是寡核苷酸，脱氧核糖核 酸(DNA)或它们的片段，核糖核酸(RNA)或它们的片段，或者肽核酸(PNA) 或它们的片段。该核酸可以是任何来源的核酸，诸如从存在于自然界中的细胞 所获得的核酸，重组产生的核酸，或化学合成的核酸。例如，该核酸可以是cDNA 或基因组DNA或具有与天然存在的DNA相应的核苷酸序列的合成DNA。该核酸 也可以是从核酸突变或改变的(例如，通过改变，缺失，取代或添加至少一个 核酸残基，不同于自然界存在的DNA的一种DNA)或者自然界中不存在的DNA。

在又一种情况下，核酸可存在于诸如表达载体的载体中(例如，一种质粒 或病毒基的载体)。在又一种情况下，该载体是一种染色体整合的载体。用于 这里的核酸可以是线性的或环状的，大小任意。在又一种情况下，核酸可以是 单链或双链的DNA或RNA。

在又一种情况下，核酸可以是功能核酸。功能核酸是具有特定功能的核酸 分子，诸如结合一靶分子或催化某一特定反应。功能核酸可以被分成以下的几 类，但这并不意味着限制于此。例如，功能核酸包括反义分子，适体，核酶， 三链结构分子，RNAi，和外部指导序列。功能核酸分子可以起到对于靶分子具 有的特定活性的影响剂，抑制剂，调节剂，和刺激剂的作用，或者，功能核酸 能独立于任何其他分子而具有全新的(de novo)活性。

一旦粘结聚合物已被附着在基材上，利用上述的技术可将一种或多种生物 分子附着到粘结聚合物上。在又一种情况下，当生物分子是核酸或蛋白质时， 可以利用本领域熟知的技术将核酸或蛋白质印在粘结聚合物上。能附着在聚合 物层上的生物分子的数量可以根据所选择的生物分子和粘结聚合物，以及要检 测的分析物的不同而变化。在又一种情况下，一种或多种不同的生物分子可以 被置于支持物上的不同位置。在使用不同的生物分子的情形下，生物分子可同 时或不同时地被印迹。

在又一种情况下，生物分子可以这样的被沉积(即附着)在支持物上，即， 通过将针尖浸渍在含有生物分子的组合物中；将针尖从组合物中取出，其中， 针尖就包括有该组合物；将该组合物转移到支持物上。可以采用例如印针阵列 来完成该阶段的操作。该沉积步骤可利用一台自动的机器人印刷机来进行。这 样的机器人系统有市售产品，例如可购自智能自动化系统(Intelligent Automation System(IAS))，Cambridge，Mass.。

针可以是实心的或空心的。实心针的针尖通常是扁平的，针的直径决定了 转移到基材上的液体数量。也可以用具有凹底的实心针。在一种情况下，为了 能经一次加样就能印上多个阵列，可以使用空心针，空心针比实心针能持有更 大的样品量，所以，一次加样就能印上一个以上的阵列。空心针包括印刷毛细 管，夹子(tweezer)和开口针(split pins)。一个优选的开口针的例子是通讯 化学国际公司(TeleChem International)(Sunnyvale，Calif.)开发的一种微型点 样针(micro-spotting pin)。在一种情况下，可采用点科技公司(Point Tech) 出品的针。这里描述的点样溶液可用于多个市售的点样仪，它包括但不限于 Genetix和Biorobotics点样仪。

这里描述的附着了一种或多种生物分子的任意一种支持物在分析物与支 持物接触时都可用来检测分析物。在分析物与支持物接触时，在生物分子与分 析物之间发生了化学的相互作用，产生了结合的分析物，但在粘结聚合物与分 析物之间某种程度上也有可能发生相互作用。生物分子与分析物之间的相互作 用的性质根据所选择的生物分子和分析物而变化。在一种情况下，生物分子与 分析物之间的相互作用会导致形成静电键合，氢键，疏水键合，或者共价键。 在另一种情况下，生物分子与分析物之间形成了静电相互作用。

分析物可以是任何存在于自然界的或合成的化合物。能与基材上的生物分 子结合的分析物的例子包括但不限于药，寡核苷酸，核酸，蛋白质，肽，抗体， 抗原，半抗原，或者小分子(如医药)。任何上述的生物分子都能成为这里 描述的各种方法的分析物。在一种情况下，制备有一种或多种分析物的溶液， 将该溶液加到微量培养板的一个或多个加样孔中，微量培养板的外表面已经附 着了生物分子。在此情况下，考虑到可将不同的生物分子附着到微量培养板的 不同加样孔上；这样就有可能检测到不同生物分子与分析物之间多个不同的相 互作用。在一种情况下，蛋白质可被固定在微量培养板上来研究该蛋白质与第 二种蛋白质或小分子之间的相互作用。另一种方法是将小分子固定在微量培养 板上，采用这里描述的技术来研究该小分子与第二种小分子或蛋白质之间的相 互作用。在又一种情况下，生物分子可以是寡核苷酸，其可杂交第二种寡核苷 酸。在又一种情况下，当基材是微量培养板时，检测可以是高通量检测。

在又一种情况下，在任何这里描述的方法中可利用阵列。在一种情况下， 阵列包括在基材上的多种生物分子，其中，生物分子处于支持物上离散和确定 的位置上。阵列已被广泛用于各种用途，诸如基因发现，疾病诊断，新药发现 (基因组药学)，和毒理学研究(基因组毒理学)。阵列是生物分子的有序排 列。典型的方法涉及使生物分子阵列与一感兴趣的靶接触，来确认阵列中那些 与靶结合的化合物。阵列通常被描述成宏阵列或微阵列，区别在于样品点的大 小。在一种情况下，阵列包括至少96个或是384个不同的(distinct)、确定的 位置。

产生阵列的方法是本领域所熟知的。例如，Fodor等，1991，Science 251:767-773描述了一种原位方法，它利用光防护的氨基酸和光刻掩模策略来 合成微型化的，空间可寻址的肽阵列。这种原位方法最近已被扩展到寡核苷酸 微型化阵列的合成(U.S.Pat.No.5,774,305)。另一种制备固定的寡核苷酸的空 间可寻址阵列的原位合成方法由Southern，1992，Genimics 13:1008-1017，所描 述；也见Southern & Maskos，1993，Nucl.Acids Res.21:4663-4669；Southern & Maskos，1992，Nucl.Acids Res.20:1679-1684；Southern & Maskos，1992，Nucl. Acids Res.20:1675-1678。在该方法中，常规的寡核苷酸合成试剂被分散在物理 掩蔽的玻璃载物片上形成固定的寡核苷酸的阵列。美国专利号5,807,522描述了 制备生物样品微型阵列的沉积方法，它涉及通过在能有效地将给定量的液体引 到基材上的条件下、在基材上吸打毛细管给料器，从而将已知量的试剂分散到 阵列的每个地址上。

在一种情况下，核酸或蛋白质的阵列可以被印到任何这里描述过的基材 上。在授予Sabatini的美国公开的专利申请No.2003/0228601中描述的技术可以 用于此，它被结合到参考有关能用于本文所述方法的不同的阵列和核酸库中。

在另一种情况下，这里描述的支持物的表面有参比区和样品区。有几种 不同的沉积技术(例如，触针印刷，非接触印刷，微接触印刷，丝网印刷，喷 印，印模，喷射)可用来在一个支持物上形成参比区和样品区。样品区容许检 测分析物与固定的生物分子之间的相互作用，而参比区容许消除会给检测分析 物与固定的生物分子之间的相互作用带来不利影响的虚假变化。在一个实施方 式中，样品区和参比区被结合在微量培养板的一个加样孔中。

在一种情况下，带有粘结聚合物的支持物的一个预先确定的区域通过沉积 封端剂/去活化剂被特异性失活。例如，当粘结聚合物是胺活性涂层，如EMA， 上述封端剂的任何一种都可用作去活化剂。另外一种办法是用不含胺的试剂水 解存在于粘结聚合物中的活性基团使其失活。这样一来，生物分子仅结合到传 感器上未用去活化剂处理过的区域。

在另一种情况下，生物分子被附着在粘结聚合物上，支持物被暴露于去活 化剂使支持物的未印刷区域失活/封端，这样可被用做参比区。

一旦带有附着的生物分子的支持物与分析物接触，就检测结合的分析物。 如上所述，在这里描述的基材的优点之一是减少了分析物的非特异性结合。

在又一种情况下，为了检测的目的，结合的分析物可被标记。根据所用的 检测技术，在一种情况下，分析物在检测之前用可检测的示踪剂进行标记。分 析物与可检测的示踪剂之间的相互作用可包括任何化学或物理的相互作用，它 包括但不限于共价键，离子相互作用，或者路易斯酸-路易斯碱相互作用。这里 讲的“可检测的示踪剂”被定义为任何的化合物，它(1)具有至少一种能与 如上所述分析物发生相互作用的基团，以及(2)具有至少一种能用本领域已 知技术检测出来的基团。在又一种情况下，分析物可在与支持物接触之前就被 标记。在另一种情况下，分析物可在与支持物接触之后才被标记。可检测的示 踪剂包括但不限于荧光示踪剂和酶示踪剂。

在另一种情况下，结合的分析物的检测可以采用其他技术来完成，它们包 括但不限于荧光，磷光，化学发光，生物发光，拉曼光谱，光散射分析，质谱 等以及其他本领域技术人员所熟知的技术。在又一种情况下，结合的分析物通 过标记独立检出，即LID来测定。LID的例子包括但不限于折射率传感器(例如 表面等离子共振，谐振波导光栅系统，或椭圆光度法)，声波传感器，或者质 量传感器，诸如质谱仪或者石英晶体微天平。

总之，这里描述的支持物和方法容许负载上大量的生物分子，对于分析物 的检测，这产生了更高的灵敏度。这里描述的支持物和方法还与许多其他的基 材相容，具有广泛的用途。支持物的制备条件温和，所得到的支持物呈现出优 良的储存稳定性，而且生物分子能一贯地，可重现地附着在基材上。最后，该 支持物和方法还以及时和经济的方式提高了阵列信号强度，灵敏度和检测质 量，并进一步提高了检测的专一性。

实施例

给出以下的实施例以为本领域技术人员完整地公开和描述本文所述并要 求保护的材料、制品和方法是如何制备和评价的，这些完全是示范性的，而无 意限制发明者认为是他们的发明范围。已努力确保数字(例如数量，温度等) 的准确性，但还是会有一些错误和偏差。除非另外指出，份指重量份，温度是 ℃或室温，压力是大气压或接近大气压。反应条件有许多变更和组合，例如， 组分浓度，理想的溶剂，溶剂混合物，温度，压力和其他的可用来优化产品纯 度和从所述反应过程中得到的产率的反应范围与条件。只需要合理的和常规的 实验来优化这些反应过程条件。

实施例1.制备用乙醇胺预封端的乙烯马来酐共聚物

图13显示了部分水解的和在140℃下真空干燥1小时的(乙烯-马来酐)交 替共聚物(EMA)的FTIR图谱。部分水解的EMA光谱图清楚地显示出羧酸基的 存在(位于1790cm^-1处的肩峰)，这是由于储存时发生了水解的缘故。真空干 燥后的EMA光谱图表明所有的羧基都转化成了酐(不见肩峰)。该无羧酸的EMA 特别适合于作为原料以确保预封端反应得到良好控制。

购自西格马奥得瑞奇(Sigma Aldrich)(商品号(ref.)18,805-0)的干燥 EMA0.2克在搅拌约1小时下溶于14.80克的无水1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中。同 时，将239μl的纯乙醇胺加入到50克的无水NMP中制备乙醇胺溶液。然后，将 5克的乙醇胺/NMP溶液(根据原料组成它相当于对25摩尔％的酐基进行封端所 需要的数量)，尽快加入到EMA溶液中。室温下温和搅拌3小时后，往18克的 无水异丙醇(IPA)中加入2克的该溶液并搅拌。

除了加入适量的乙醇胺/NMP溶液以对15，20和30摩尔％的马来酐基进行封 端外，重复同样的步骤，维持溶液的固体含量恒定。采用同样的步骤但不加乙 醇胺以完成0％预封端。

实施例2.制备用于SPR检测的金传感器芯片

Biacore金传感器芯片用乙醇和水清洗，然后在温和氮气流中干燥。将芯 片浸在11-巯基十一烷基胺的1mM的乙醇溶液中1小时，用乙醇清洗，再用水清 洗，最后在氮气流中干燥。

在每个金芯片上贴上硅橡胶垫圈(Flexperm)，往每个加样孔中加入100μl 实施例1制得的预封端的EMA溶液。偶联10分钟后，芯片用乙醇清洗，在氮气 流中干燥。干燥之后将硅橡胶垫圈取走。此时，涂覆过的金芯片已准备就绪， 可固定生物分子而毋须任何活化步骤。

实施例3.LID涂覆板的制备

用去离子水由20重量％的市售溶液制备氨丙基倍半硅氧烷(APS)的5重量 ％溶液。往每个加样孔中加入100μl的该稀释过的溶液，然后孵育10分钟。孵育 导之后，移走APS溶液，板用水清洗三遍，用乙醇清洗三遍，然后用温和氮气 流干燥。

干燥之后，往加样孔中加入100μl由实施例1得到的预封端过的乙烯-马来酐 交替共聚物溶液，室温下孵育10分钟。移走多余的溶液，板用乙醇清洗三遍。 清洗之后，用温和氮气流对板进行干燥。此时，该板不需任何进一步活化即可 用。

实施例4.蛋白质(链霉抗生物素蛋白)在金传感器芯片上的固定

将由实施例2得到的涂覆过的金传感器装入一台Biacore SPR装置中。两个 流动池(flow cell)用5mM的醋酸钠(pH 5.5)以5μl/分钟的流量冲洗几分钟， 然后往一个流动池中花7分钟以5μl/分钟的流量注入35μl的250μg/ml的链霉 抗生物素蛋白(SA)在5mM醋酸钠中的溶液。这两个流动池用在50mM的硼酸盐 缓冲液(pH9)中的200mM乙醇胺封端，用PBS中的0.05％Tween20清洗。

图2显示在金芯片上的SA固定曲线，金芯片用分别在0，10，15，20，25， 30摩尔％预封端的EMA涂覆过。预封端的强烈效果清晰可见。在20，25，和30％ 预封端过的EMA涂覆的传感器表面与未封端的EMA相比，链霉抗生物素蛋白的 固定高两倍。

实施例5.结合到固定了的蛋白质上的小分子SPR评价

为了评价生物素的结合能力，每个在实施例4中固定了SA的芯片被用来进 行结合检测。生物素结合通过用100μl的4-荧光素-生物素在醋酸盐缓冲液中的 100nM溶液以10μl/分钟的流量监测10分钟。一个无链霉抗生物素蛋白且用乙 醇胺封端过的流动池被用来作为参比。图3显示4-fl-生物素与固定在传感器表面 上的SA结合的结合曲线，传感器表面由不同封端程度的EMA构成，在参比被减 去之后，曲线对比了无预封端的EMA的情形。图11显示了采用康宁(Corning) 公司的Epic^TM系统检测的fl-生物素结合测定时用乙醇胺预封端的优化值。图12 显示了乙醇胺作为预封端剂对比无预封端EMA对链霉抗生物素蛋白固定和fl- 生物素结合的影响。

由实施例4和5获得的结果证明了用本发明的支持物固定的蛋白质的较好 的“小分子结合的易接近性”。数据总结在下表中。数据表明，当预封端增加 时，结合在每个固定的蛋白质上的小分子的比例提高了。

 

％封端       活性/可离子 化         固定的蛋白 质(实施例  4)        小分子结合 (实施例5) 小分子/蛋白 质         0-4,0001400.035155.666,5003400.052204.009,0005250.058

实施例6.制备用甲氧基乙胺预封端的乙烯-马来酐交替共聚物，SA固定以 及小分子结合测定

重复如实施例2描述的同样步骤，但用甲氧基乙胺替代乙醇胺，根据原料 组成马来酐共聚物的预封端程度为33，40，和55摩尔％。SA固定如实施例4那样 操作。结合在固定了的蛋白质上的小分子的评价依照实施例5进行。图4显示用 甲氧基乙胺作预封端对4-fl生物素结合的影响。图11显示采用LID检测来测定 fl-生物素结合时用甲氧基乙胺作预封端的优化值。图12显示了甲氧基乙胺作为 预封端剂对比无预封端EMA对链霉抗生物素蛋白固定和fl-生物素结合的影响。

实施例7.制备用异丙胺预封端的乙烯-马来酐交替共聚物，SA固定以及小 分子结合测定

重复如实施例1描述的同样步骤，但用异丙胺替代乙醇胺，根据原料组成， 乙烯-马来酐交替共聚物的预封端程度为40和50摩尔％。SA固定如实施例4那样 操作。结合在固定了的蛋白质上的小分子的评价依照实施例5进行。图5显示用 异丙胺作预封端对4-fl生物素结合的影响。图12显示了异丙胺作为预封端剂对 比无预封端EMA对链霉抗生物素蛋白固定和fl-生物素结合的影响。

实施例8.制备用丁胺预封端的乙烯-马来酐交替共聚物，SA固定以及小分 子结合测定

重复如实施例1描述的同样步骤，但用丁胺替代乙醇胺，根据原料组成，乙 烯-马来酐交替共聚物的预封端程度为25和40摩尔％。SA固定如实施例4那样操 作。结合在固定了的蛋白质上的小分子的评价依照实施例5进行。图6显示用丁 胺作预封端对4-fl生物素结合的影响。图12显示了丁胺作为预封端剂对比无预 封端EMA对链霉抗生物素蛋白固定和fl-生物素结合的影响。

实施例9.制备用丙胺预封端的乙烯-马来酐交替共聚物，SA固定以及小分 子结合测定

重复如实施例1描述的同样步骤，但用丙胺替代乙醇胺，根据原料组成，乙 烯-马来酐交替共聚物的预封端程度为40和50摩尔％。SA固定如实施例4那样操 作。结合在固定了的蛋白质上的小分子的评价依照实施例5进行。图7显示用丙 胺作预封端对4-fl生物素结合的影响。图12显示了丙胺作为预封端剂对比无预 封端EMA对链霉抗生物素蛋白固定和fl-生物素结合的影响。

实施例10.制备用己胺预封端的乙烯-马来酐交替共聚物

重复如实施例1描述的同样步骤，但用己胺替代乙醇胺，根据原料组成，乙 烯-马来酐交替共聚物的预封端程度为0，25，33，40，和50摩尔％。SA固定如 实施例4那样操作。结合在固定了的蛋白质上的小分子的评价依照实施例5进 行。图8显示用己胺作预封端对4-fl生物素结合的影响。图12显示了己胺作为 预封端剂对比无预封端EMA对链霉抗生物素蛋白固定和fl-生物素结合的影响。

实施例11.制备用乙醇胺预封端的乙烯-马来酐交替共聚物以及在康宁 Epic^TM微量培养板上进行康宁Epic^TM系统(fl-生物素与固定的链霉抗生物素 蛋白结合)测定

用乙醇胺预封端的EMA的预封端程度为15，25，35，45摩尔％，除了EMA 在120℃下真空干燥数小时以确保聚合物无任何水解产物之外，其制备依照实 施例1描述的步骤进行。实施例3描述的步骤被用来制备带这些聚合物的板。链 霉抗生物素蛋白的固定以50μg/ml流量无监测进行(离线固定)。小分子结合 能力的评价是用75μl的在1XPBS中的200nM荧光素-生物素，将它加入到加样 孔中去，加样孔先前已经用75μl的1XPBS充满以获得最终100nM的荧光素-生 物素浓度。结合信号在搅拌下记录10分钟以上，然后在无搅拌下记录2分钟。 图9显示在参比孔被减去之后，从fl-生物素测定试验中获得的各预封端程度下的 结合曲线。

实施例12.制备用甲氧基乙胺预封端的乙烯-马来酐交替共聚物以及在康 宁Epic^TM微量培养板上进行康宁Epic^TM系统(fl-生物素与固定的链霉抗生 物素蛋白结合)测定

重复实施例11的步骤，只是将乙醇胺换成甲氧基乙胺。图10显示测定fl-生 物素时在参比孔被减去之后所获得的各预封端程度下的结合曲线。

实施例13

该实施例描述了利用本发明以固定不同的蛋白质。康宁96孔Epic^TM微量培 养板用EMA或者用被35摩尔％甲氧基乙胺预封端过的EMA(EMA/MEA)涂覆。 人血清白蛋白(HSA)，免疫球蛋白(IgG)，胰凝乳蛋白酶原，和溶菌酶被 固定在各板上的多个孔内，固定的数量在Epic^TM仪器上监测。固定HSA，IgG， 胰凝乳蛋白酶原，和溶菌酶时的pH值分别为5.5，6.5，8.5，和9.2。如下表所示， 对每种蛋白质，在EMA/MEA上观察到的固定水平高于EMA上的固定水平。固 定水平的增量的变化从对于胰凝乳蛋白酶原有28％到对于HSA达175％。这些数 据表明本发明适用于各种各样的生物分子。

 

信号 (pm)SD％CV增量HSA在EMA上817526-HAS在EMA/MEA上224416372.75IgG在EMA上2082623-IgG在EMA上448026962.15胰凝乳蛋白酶原在 EMA上           1584735-胰凝乳蛋白酶原在 EMA/MEA上       202710151.28

 

溶菌酶在EMA上1759885-溶菌酶在EMA/MEA 上             24878741.41

在本申请中参考了种种出版物。这些出版物的公开内容通过参考整体并入 本申请中以更完全地描述本文所述的化合物，组合物和方法。

可以对本文描述的材料，方法和制品进行种种的改变和调整。根据对这里 所公开的材料，方法，和制品的说明以及实施的讨论，这里所描述的材料，方 法和制品的其他方面是显而易见的。这意味着，说明书和实施例被认为是示范 性的。