一种地被菊株型匍匐性分子标记辅助选择方法

摘要

本发明涉及一种地被菊株型匍匐性分子标记辅助选择方法，属于生物技术领域，用于地被菊株型匍匐性的分子标记辅助选择育种。用RAPD引物A－10，或者用SCAR引物，扩增地被菊或育种材料DNA，如果能够扩增出555bp的片段，均标志着地被菊匍匐基因的存在。本发明对以‘早意大利红’(P1)为母本、03(6)－12为父本(P2)杂交获得的152株F

说明书

一、技术领域

本发明公开了一种地被菊株型匍匐性分子标记辅助选择方法，属于生物技术领域，用于地被菊株型匍匐性的分子标记辅助选择育种。

二、背景技术

地被菊是上世纪八十年代由陈俊愉院士首先提出的菊花新品种群(王彭伟等，1990；Chen J Y et al.1995)。具有株型低矮或匍匐、多分枝、抗性强、适应性广、成型快、覆盖能力强、着花繁密等特点，同时具备绿化、美化、彩化和香化综合功能，园林应用前景极为广阔(于忠香，2004)。株型是地被菊的重要性状之一，匍匐型地被菊因枝条分枝角度小，匍匐地面生长，更适于地被景观营造。

目前，株型遗传控制和分子标记研究主要集中在模式植物拟南芥，及水稻、小麦、玉米等大田作物和番茄、菜豆等蔬菜作物上(嵇怡等，2006；张培通等，2006；李培金等，2003)，观赏植物株型遗传和分子标记鲜有研究，而地被菊株型匍匐性的分子标记尚未见报道。

SCAR标记是根据RAPD标记的片段序列，合成一对特异性引物，对基因组进行扩增，较长的引物有效地减少了非特异性扩增，提高了SCAR技术的稳定性。所以，在分子标记辅助选择育种实践中常常将RAPD标记转化为更为稳定的SCAR标记(许勇等，2000；马少芹等，2006；王道杰等，2006)。本研究将获得的与地被菊匍匐性状控制基因相连锁的分子标记转化为更稳定而有效的SCAR标记，为匍匐型地被菊新品种选育、分子标记辅助育种和匍匐性相关基因的克隆奠定了基础。

三、发明内容

技术问题本发明的目的是：筛选出一个或几个与地被菊株型匍匐性基因紧密连锁的分子标记，建立地被菊匍匐株型分子标记辅助选择体系，从而提高地被菊匍匐株型的选择效率，为匍匐型地被菊新品种选育奠定基础。

技术方案本发明的实施方案如下：

一种地被菊株型匍匐性分子标记辅助选择方法，其特征在于：

用RAPD引物A-10，序列为5’-GTGATCGCAG-3’

扩增匍匐型地被菊或育种材料DNA，如果能够扩增出555bp的片段，则标志着地被菊匍匐基因的存在；

或者用SCAR引物SCA10，

上游引物序列：5’-GTGATCGCAGGAACAACC-3’

下游引物序列：5’-GTGATCGCAGCCGCTTGA-3’

扩增匍匐型地被菊或育种材料DNA，如果能够扩增出555bp的片段，则标志着地被菊匍匐基因的存在；

2、根据权利要求1所述的一种地被菊株型匍匐性分子标记辅助选择方法，其中采用的RAPD引物A-10和SCAR引物SCA10两种分子标记引物是通过以下方法筛选获得的：

1)采用CTAB微量法提取基因组DNA；

2)根据BSA(Bulked Segregant Analysis)法原理，分别从F₁株型分离群体中选择极端匍匐和直立的单株各10株，将稀释的基因组DNA分别等量混合构成匍匐基因池和直立基因池；

3)标记引物的筛选：

PCR扩增反应在MJ Research公司生产的PTC-100^TM型PCR仪上进行。反应体系共20μL，包括：10×Buffer 2μL、1.625mmol·L^-1 MgCl₂、75μmol·L^-1dNTP、40ng模板DNA、1.5U Taq polymerase(TaKaRa)、1.5μmol·L^-1 RAPD引物(由南京生兴生物技术公司合成)、用ddH₂O补齐20μL。

反应程序为94℃预变性4min，然后进入下列循环：94℃变性15s，35℃复性15s，72℃延伸1min 15s，3个循环；94℃变性30s，40℃复性30s，72℃延伸1min 15s，40个循环；最后72℃延伸7min；4℃保温。

取7μL扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，电极缓冲液为1×TAE，电压5V/cm。利用JS-380凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)进行观察拍照，记录多态性片段。从而获得一个与地被菊匍匐性状控制基因相连锁的分子标记A-10₅₅₅。

利用大连宝生物公司的DNA纯化回收试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0)回收、纯化A-10₅₅₅特异DNA片段(555bp)。连接pGEM-T EasyVector质粒载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选、鉴定A-10₅₅₅特异DNA片段重组质粒，并委托上海英骏生物技术有限公司测序。

根据A-10₅₅₅特异DNA片段测序结果，利用软件Primer Premier设计的特异引物SCA10(上游引物序列：5’-GTGATCGCAGGAACAACC-3’，下游引物序列：5’-GTGATCGCAGCCGCTTGA-3’；委托上海英骏生物技术有限公司合成)，进行SCAR扩增，25μL的反应体系中含有2.5μL 10×Buffer，1.5μL 25mM MgCl₂，2.0μL 2.5mMdNTP，1U Taq DNA聚合酶，1.5μmol·L^-1SCAR引物，20ng模板DNA，用ddH₂O补齐25μL。

PCR反应程序为94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃变性1min，67℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保温。取7μL扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，电极缓冲液为1×TAE，电压5V/cm。利用JS-380凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)进行观察拍照，记录多态性片段555bp。

从而获得一个与地被菊匍匐性状控制基因相连锁的分子标记SCA10₅₅₅。

有益效果本发明选用的是以‘早意大利红’(P1)为母本、03(6)-12为父本(P2)杂交获得的152株F₁分离群体为试材，构建株型匍匐/直立基因池开展地被菊株型匍匐性分子标记的筛选及分子标记辅助选择体系的建立。与目前技术相比，其优点是：

(1)标记稳定。本研究以株型匍匐/直立基因池为材料，鉴定出RAPD标记1个，并转化为更稳定的SCAR标记，分别用这些标记对后代单株进行检测，表明该标记表现稳定，不受环境条件的影响。

(2)分子标记辅助选择体系操作方便，能够克服地被菊匍匐性状基因型鉴定的困难。选择范围更广，强度更大。匍匐型地被菊的常规选育方法周期长，费时又费力。通过本发明探索出了简易、快速提取地被菊DNA的方法；筛选出了与地被菊匍匐性状控制基因相连锁的1个RAPD标记及1个SCAR分子标记用于辅助选择，并建立了PCR产物的快速检测技术；建立的分子标记辅助选择方法可以实现苗期提早选择，减少工作量，大大提高匍匐型地被菊的选择效率，从而加快育种进程。

四、附图说明

图1RAPD引物A-10在两池、两亲本及F₁中部分单株DNA扩增结果C：匍匐基因池；E：直立基因池；P1：早意大利红；P2：03(6)-12；1-12：匍匐单株；M：Ladder DNA；13-24直立单株；21：重组单株

图2RAPD引物A-10对F₁群体内的部分单株DNA的PCR扩增产物

图3SCAR引物SAC10在两池、两亲本及F₁中部分单株DNA扩增结果

图4SCAR引物SAC10对F₁群体内的部分单株DNA的PCR扩增产物

五、具体实施方式

(一)材料与方法

供试材料为“中国菊花种质资源保存中心”公开对外提供的地被菊品种03(6)-12和盆栽小菊品种‘早意大利红’及其以‘早意大利红’(P1)为母本、03(6)-12为父本(P2)杂交获得的152株包括直立、匍匐和中间型的F₁株型分离群体。采用测分枝角度的方法(分枝角度的测定于苗期进行，用量角器测量一级主分枝延伸方向与地平面的角度，取平均值。将分枝角度分成9个等级差，0～10°为1级，11～20°为2级，以此类推，81～90°为9级。规定分枝角度在1、2、3级范围的为匍匐株型；4、5、6级为中间型；7、8、9级为直立株型)对单株株型进行鉴定，进行分子标记的筛选及连锁分析，重组率计算公式为：重组率＝重组型植株数/总株数×100％。利用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离(Centimorgan，cM)。

(二)分子标记筛选分析主要利用RAPD标记及SCAR标记。

本试验DNA的提取采用CTAB微量法(邹喻萍等，系统与进化学中的分子标记[M]，科学出版社，2001：9-17)、Lambda DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，最后将浓度调至20ng·μL^-1。

根据BSA(Bulked Segregant Analysis)法原理，分别从F₁分离群体152株中选择极端匍匐和直立的单株各10株，将稀释的基因组DNA分别等量混合构成匍匐基因池和直立基因池。

用200个RAPD引物(由南京生兴生物技术公司合成)对匍匐基因池和直立基因池进行扩增筛选。

PCR扩增反应在MJ Research公司生产的PTC-100^TM型PCR仪上进行。反应体系共20μL，包括：10×Buffer 2μL、1.625mmol·L^-1 MgCl₂、75μmol·L^-1dNTP、40ng模板DNA、1.5U Taq polymerase(TaKaRa)、1.5μmol·L^-1 RAPD引物(由南京生兴生物技术公司合成)、用ddH₂O补齐20μL。

反应程序为94℃预变性4min，然后进入下列循环：94℃变性15s，35℃复性15s，72℃延伸1min 15s，3个循环；94℃变性30s，40℃复性30s，72℃延伸1min 15s，40个循环；最后72℃延伸7min；4℃保温。

取7μL扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，电极缓冲液为1×TAE，电压5V/cm。利用JS-380凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)进行观察拍照，记录多态性片段。

其中A-10(5′-GTGATCGCAG-3′)引物在两基因池间检测到多态性，即在匍匐基因池中扩增出特异的555bp DNA片段，而在直立基因池中未扩增出相应的DNA片段。

从而获得一个与地被菊匍匐性状控制基因相连锁的分子标记A-10₅₅₅(图1)。

利用大连宝生物公司的DNA纯化回收试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0)回收、纯化A-10₅₅₅特异DNA片段(555bp)。连接pGEM-T EasyVector质粒载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选、鉴定A-10₅₅₅特异DNA片段重组质粒，并委托上海英骏生物技术有限公司进行测序，获得A-10₅₅₅片段序列如下(斜体加粗部分为RAPD引物序列，下划线部分为SCAR引物序列)：

5’-GTGATCGCAGGAACAACCTCGGAGACAATCCACTGACCAGAGTAGCAACCGTA

ACAACAACTACCGCGGCCAGGGGAGCGGACGGGATAATGACAGATATACCCACTA

ACCAAGACTCCAAAGGAGATATTCGCGACGGAAGGCGCGAACTTCCCAAGACCC

CCACCAATGCGCACCCCAGAGGATCGACGCGTGGGGAGTAGATACTGTGACTATC

ATGGGAAGAAGGGCCACACCACCAATGAATGTTTCCAATTGCGCCAGTTAATTGAT

AAACTAGTAAAAGAAGGCAGATTGGACCATCTGGTCAAGAACATCAAGGAGGGA

AAAGATAGGCAGAAAATTGGGAGAAAAAAAGAGGCACACAAAGATAAGGCCAA

CACCATCTACATGATACAATCATGGTAGCGAGTAACTAGGCAGAAGATCAGCCAGA

AGTTTTCCCGTGGAAGTGAAATTTCTTTCCCCACATTGACTGCGGACAACGCAGT

GGTTGAACCGCTCACCATTGAAATTAATGCAGGGGGTCACGATATCCACCGCATGT

ATGTTGATGGAGGAGCATATGCAGACATAATGTACGAACATTGTTTCAAGCGGCTG

CGATCAC-3’

根据测序结果，利用软件Primer Premier设计的特异引物SCA10(上游引物序列：5’-GTGATCGCAGGAACAACC-3’；下游引物序列：5’-GTGATCGCAGCCGCTTGA-3’；委托上海英骏生物技术有限公司合成)进行SCAR扩增，25μL的反应体系中含有2.5μL10×Buffer，1.5μL 25mM MgCl₂，2.0μL 2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，1.5μmol·L^-1SCA10引物，20ng模板DNA，用ddH₂O补齐25μL。

PCR反应程序为94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃变性1min，67℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保温。取7μL扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，电极缓冲液为1×TAE，电压5V/cm。利用JS-380凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)进行观察拍照，记录多态性片段，特异片段大小为555bp。

从而获得一个与地被菊匍匐性状控制基因相连锁的分子标记SCA10₅₅₅(图3)。

(三)应用结果与分析

用A10引物对除构建基因池的24个F1单株之外的128个F₁单株进行RAPD扩增验证(图2)，标记的分离情况见表1，发现标记A-10₅₅₅的有无在152个F₁中分离比为2.70：1，接近3：1，其中有12个单株发生了交换。采用Mapmaker/Exp3.0软件对所得RAPD标记和株型匍匐性基因之间的遗传关系进行连锁分析，结果表明：标记A-10₅₅₅与匍匐性基因存在连锁关系，重组率为7.89％，连锁距离为7.96cM。

利用设计的特异引物SCA10对两亲本及152个F₁单株进行SCAR分析验证(图3，图4)，其扩增结果与RAPD标记A-10₅₅₅在双亲及152 F₁单株中的分离相一致，特异片段大小为555bp，命名为SCA10₅₅₅，表明该RAPD标记已成功转化为更为稳定和便于应用的SCAR标记。

建立的分子标记辅助选择方法能够克服地被菊匍匐株型性状基因型鉴定的困难。选择范围更广，强度更大。可以实现苗期提早选择，减少工作量，大大提高匍匐型地被菊的选择效率，从而加快育种进程。

           表1 RAPD标记在F₁群体中的分离

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种地被菊株型匍匐性分子标记辅助选择方法

<130>说明书

<140>00

<141>2008-09-18

<160>4

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>10

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>RAPD引物A-10

<222>(1)..(10)

<223>

<400>1

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>SCAR引物SCA10上引物序列

<222>(1)..(18)

<223>

<400>2

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>者用SCAR引物SCA10下游引物序列

<222>(1)..(18)

<223>

<400>3

<210>4

<211>610

<212>DNA

<213>菊

<220>

<221>分子标记A-10555片段序列

<222>(1)..(610)

<223>

<400>4