基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法

摘要

本发明提供了基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，属于分析化学技术领域。首次利用免标记银纳米探针发展了一种简便但灵敏度好、选择性高的酶反应比色检测方法。用此比色方法，可以通过银纳米探针颜色的变化来监测牛小肠碱性磷酸酶催化的去磷酸化反应和牛心蛋白激酶A催化的磷酸化反应。该方法对牛小肠碱性磷酸酶的检测限为1unit/mL，对牛心蛋白激酶A的检测限为0.022unit/mL。尤为重要的是，该方法还可用于酶活性抑制的分析和复杂生物样品中酶含量的检测。本发明的方法具有的简单、灵敏、便宜等优点外，且用银纳米而不是金纳米作为比色探针，进一步拓宽了比色传感器的研究和应用范围。

说明书

技术领域

本发明涉及基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

金属纳米粒子因其独特的表面等离子体共振效应，受到了研究人员的广泛关注。利用金纳米独特的表面等离子体共振效应，人们制备了各类比色传感器用于核酸、小分子、金属离子、糖类、蛋白质等的检测。这些传感器一般基于如下原理，即分散的金纳米溶液呈酒红色而聚集后的金纳米溶液为紫色(或蓝色)。金纳米比色传感器的优点在于：其一、金纳米制备简单；其二、由于金纳米表面等离子体共振谱的消光系数非常大，因而检测灵敏度高；其三、因无需使用特殊的仪器设备而使得实验成本大大降低。

在生物分析领域，银纳米粒子也占有一席之地。譬如，研究人员利用“纳米球光刻技术”制备了三角形银纳米粒子，并将此三角形银纳米粒子用于扩散性β类淀粉蛋白配位子等的检测(参考文献：Haes，A.J.；Hall，W.P.；Chang，L.；Klein，W.L.；Van Duyne，R.P.，A localizedsurface plasmon resonance biosensor：First steps toward an assay forAlzheimer′s disease.Nano Lett.2004，4，(6)，1029-1034)。就比色分析而言，因为银纳米粒子的消光系数较金纳米粒子的大，故原则上银纳米粒子探针更为灵敏(参考文献：Lee，J.S.；Lytton-Jean，A.K.R.；Hurst，S.J.；Mirkin，C.A.，Silver nanoparticle-oligonucleotide conjugates basedon DNA with triple cyclic disulfide moieties.Nano Lett.2007，7，(7)，2112-2115)。可事实上，和金纳米粒子比色分析相比较，人们对银纳米粒子比色分析的关注很少。目前，只有少数几个涉及核酸(参考文献：Liu，S.H.；Zhang，Z.H.；Han，M.Y.，Gram-scale synthesis andbiofunctionalization of silica-coated silver nanoparticles for fastcolorimetric DNA detection.Anal.Chem.2005，77，(8)，2595-260)、金属离子(参考文献：Yoosaf，K.；Ipe，B.I.；Suresh，C.H.；Thomas，K.G.，In situ synthesis of metal nanoparticles and selective naked-eye detectionof lead ions from aqueous media.J.Phys.Chem.C 2007，111，(34)，12839-12847)和蛋白质(参考文献：Schofield，C.L.；Haines，A.H.；Field，R.A.；Russell，D.A.，Silver and gold glyconanoparticles forcolorimetric bioassays.Langmuir 2006，22，(15)，6707-6711)检测的例子。而这些银纳米粒子比色分析中所用的银纳米粒子探针均修饰了特定的功能化配体。

发明内容

为了解决已有技术存在的问题，本发明提供了一种基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法。利用免标记的银纳米粒子作为探针发展了一种酶比色测定的方法。该方法因无需额外的修饰、分离等操作，故更为简便，有好的灵敏性和选择性。磷酸化和去磷酸化作用在细胞水平的调控、细胞内内信号传递和生物医学等研究方面有着十分重要的意义，故我们选择与磷酸化和去磷酸化作用相关的两种酶来验证我们银纳米粒子比色方法的性能。其一为催化三磷酸腺苷去磷酸化的牛小肠碱性磷酸酶，另一为催化其多肽底物磷酸化的牛心蛋白激酶A。我们知道，银纳米粒子探针的分散/聚集状态不同，其颜色也不同。银纳米粒子探针分散时为亮黄色，而聚集时为棕红色。若没有酶的时候，未反应的底物三磷酸腺苷能有效地保护银纳米粒子不被盐诱导聚集，故银纳米粒子探针溶液呈亮黄色；酶催化三磷酸腺苷反应后，其产物(牛小肠碱性磷酸酶的产物为腺苷，牛心蛋白激酶A的产物为二磷酸腺苷)无法有效地保护银纳米粒子，故银纳米粒子探针溶液会被盐诱导聚集而呈棕红色。借助于此方法中银纳米粒子探针的颜色变化能够灵敏、选择性地监测磷酸化和去磷酸化作用，也就方便快捷地地实现了酶的银纳米粒子比色检测。

本发明的目的之一是提供基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛小肠碱性磷酸酶的方法，其步骤如下：

(1)参考文献方法合成银纳米探针(参考文献；Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely stable water-solubleAg nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635)；

(2)将5mM三磷酸腺苷和牛小肠碱性磷酸酶加入到反应缓冲溶液中，混合均匀，37℃水浴反应20min；

所述的5mM三磷酸腺苷∶牛小肠碱性磷酸酶∶反应缓冲溶液的体积比为1∶1∶4；

所述的反应缓冲溶液为含1mM MgCl₂的pH 9.0的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液；

所述的牛小肠碱性磷酸酶浓度为0.001unit/μL到0.1unit/μL；

若进行比色反应的特异性测定，将牛小肠碱性磷酸酶替换为25μM牛血清白蛋白、或10μM α-凝血酶、或2.1μM胰蛋白酶即可；

(3)向(2)中的反应液中加入银纳米探针和0.5M NaCl水溶液；

所述的5mM三磷酸腺苷∶银纳米探针∶0.5M NaCl水溶液的体积比为1∶40∶3；

(4)将(3)中反应液，与水混合均匀，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化，完成基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛小肠碱性磷酸酶的方法；所述的(3)中反应液∶水的体积比为1∶3。

本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛小肠碱性磷酸酶的方法，对牛小肠碱性磷酸酶检测的表征如图1、图2、图3和图4所示。

从图1和图2数据可以看出，本发明的方法对于牛小肠碱性磷酸酶有很好的比色响应；通过银纳米探针溶液的颜色变化，很容易用肉眼进行牛小肠碱性磷酸酶的比色检测。

从图3数据可以看出，比色的响应与牛小肠碱性磷酸酶的浓度有很好的相关性；该方法对于牛小肠碱性磷酸酶的检出限为1unit/mL。

从图4数据可以看出，将比牛小肠碱性磷酸酶浓度高出1到2个数量级的牛血清白蛋白、α-凝血酶和胰蛋白酶对该比色方法没有响应，这证明该方法对牛小肠碱性磷酸酶的比色检测有好的特异性。

本发明的目的之二是提供基于银纳米探针无标记比色测定酶，具体涉及测定抑制剂对牛小肠碱性磷酸酶活性的抑制的方法，其步骤如下：

(1)参考文献方法合成银纳米探针(参考文献；Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely stable water-solubleAg nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635)；

(2)将1unit/μL牛小肠碱性磷酸酶与Na₃VO₄混合均匀，37℃水浴反应10min；

所述的1unit/μL牛小肠碱性磷酸酶∶Na₃VO₄的体积比为1∶1；所述的Na₃VO₄浓度为0.5微摩尔每升到100毫摩尔每升。

(3)将5mM三磷酸腺苷加入到(2)的反应液中，混合均匀，37℃水浴反应20min；

所述的1unit/μL牛小肠碱性磷酸酶∶5mM三磷酸腺苷的体积比为1∶1；

(4)向(3)中的反应液中加入银纳米探针和0.5M NaCl水溶液；

所述的5mM三磷酸腺苷∶银纳米探针∶0.5M NaCl水溶液的体积比为1∶40∶3；

(5)将(4)中反应液，与水混合均匀，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化，完成基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定抑制剂对牛小肠碱性磷酸酶活性的抑制的方法；所述的(4)中反应液∶水的体积比为1∶3。

本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定抑制剂对牛小肠碱性磷酸酶活性的抑制的方法，测定抑制剂对对牛小肠碱性磷酸酶活性抑制的表征如图5和图6所示。

从图5数据可以看出，本发明的比色方法可以完成牛小肠碱性磷酸酶活性抑制的分析。

从图6数据可以看出，5mM Na₃VO₄能够有效地抑制0.5units/μL牛小肠碱性磷酸酶的活性，而50mM Na₃VO₄能够完全抑制0.5units/μL牛小肠碱性磷酸酶的活性。

本发明的目的之三是提供基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定生物样品中牛小肠碱性磷酸酶的含量的方法，其步骤如下：

(1)参考文献方法合成银纳米探针(参考文献；Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely stable water-solubleAg nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635)；

(2)将牛小肠碱性磷酸酶和1％胎牛血清(水∶胎牛血清的体积比为1∶100)混合，得到生物流体中牛小肠碱性磷酸酶样品；

所述的牛小肠碱性磷酸酶∶1％胎牛血清的体积比为1∶1；

此处，1％胎牛血清也可以用其它生物流体替代；

(3)向(2)中含牛小肠碱性磷酸的1％胎牛血清中加入5mM三磷酸腺苷和反应缓冲溶液，混合均匀，37℃水浴反应10min；

所述的5mM三磷酸腺苷∶牛小肠碱性磷酸酶∶反应缓冲溶液的体积比为4∶1∶7；

所述的反应缓冲溶液为含1mM MgCl₂的pH 9.0的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液；

(4)向(3)中的反应液中加入银纳米探针和0.5M NaCl水溶液；

所述的5mM三磷酸腺苷∶银纳米探针∶0.5M NaCl水溶液的体积比为1∶40∶3；

(5)将(4)中反应液，与水混合均匀，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化，完成基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定生物样品中牛小肠碱性磷酸酶的含量的方法；所述的(4)中反应液∶水的体积比为1∶3。

本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定生物样品中牛小肠碱性磷酸酶的含量的方法测定生物样品中牛小肠碱性磷酸酶浓度的表征如图7和图8所示。

从图7数据可以看出，本发明的方法对于生物样品中牛小肠碱性磷酸酶有很好的比色响应；通过银纳米探针溶液的颜色变化，很容易用肉眼进行生物样品中牛小肠碱性磷酸酶的比色检测。这些结果说明，本发明发展的免标记银纳米比色方法有很好的抗干扰能力，有望用于临床样品的酶活性分析。

从图8数据可以看出，比色的响应与生物样品中牛小肠碱性磷酸酶的浓度有很好的相关性。

本发明的目的之四是提供基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛心蛋白激酶A的方法，其步骤如下：

(1)参考文献方法合成银纳米探针(参考文献；Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely stable water-solubleAg nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635)；

(2)将2mM多肽底物、1mM环单磷酸腺苷、1mM MgCl₂水溶液、10mM三磷酸腺苷和不同浓度牛心蛋白激酶A混合均匀，37℃水浴反应2h；

所述的2mM多肽底物∶1mM环单磷酸腺苷∶1mM MgCl₂水溶液、∶10mM三磷酸腺苷∶牛心蛋白激酶A的体积比为4∶1∶1∶1∶2；

所述的多肽底物序列为H-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-OH；

所述牛心蛋白激酶A的浓度为0.022unit/mL到22unit/mL；

(3)向(2)中的反应液中加入银纳米探针，30℃水浴反应10min；

所述的(2)中的反应液∶银纳米探针的体积比为1∶10；

(4)将(3)中反应液，与水混合均匀，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化，完成基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛心蛋白激酶A的方法；所述的(3)中反应液∶水的体积比为1∶8。

本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛心蛋白激酶A的方法对牛心蛋白激酶A检测的表征如图9、图10和图11所示。

从图9和图10数据可以看出，我本发明的方法对于牛心蛋白激酶A有很好的比色响应；通过银纳米探针溶液的颜色变化，很容易用肉眼进行牛心蛋白激酶A的比色检测。

从图11数据可以看出，比色的响应与牛心蛋白激酶A的浓度有很好的相关性；该方法对于牛心蛋白激酶A的检出限为0.022unit/mL。

本发明的有益效果：本发明首次利用免标记银纳米探针发展了一种简便但灵敏度好、选择性高的酶反应比色检测方法。用此比色方法，可以通过银纳米探针颜色的变化来监测牛小肠碱性磷酸酶催化的去磷酸化反应和牛心蛋白激酶A催化的磷酸化反应。该方法对牛小肠碱性磷酸酶的检测限为1unit/mL，对牛心蛋白激酶A的检测限为0.022unit/mL。尤为重要的是，该方法还可用于酶活性抑制的分析和复杂生物样品中酶含量的检测。本发明的免标记银纳米比色方法除有一般比色方法所共同有的简单、灵敏、便宜等优点外，还有如下特点：其一、该方法因无需额外的修饰、分离等操作，故对酶检测而言更为简便；其二、用银纳米而不是金纳米作为比色探针，进一步拓宽了比色传感器的研究和应用范围。

附图说明

图1为本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛小肠碱性磷酸酶的方法，利用银纳米探针进行牛小肠碱性磷酸酶比色测定的照片。左，不含牛小肠碱性磷酸酶；右，含0.1unit/μL牛小肠碱性磷酸酶。

图2为本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛小肠碱性磷酸酶的方法，利用银纳米探针进行牛小肠碱性磷酸酶比色测定的吸收光谱图。黑色线，不含牛小肠碱性磷酸酶；红色线，含0.1unit/μL牛小肠碱性磷酸酶。

图3为本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛小肠碱性磷酸酶的方法，所测的吸收比率(A550/A397)与牛小肠碱性磷酸酶浓度的关系图。

图4为本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，用银纳米探针测定不同蛋白质所得吸收比率(A550/A397)的柱状图。1号样品，200nM(即0.1unit/μL)牛小肠碱性磷酸酶；2号样品，25μM牛血清白蛋白；3号样品，10μMα-凝血酶；4号样品，2.1μM胰蛋白酶；5号样品，空白缓冲溶液。

图5为本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，利用银纳米探针比色测定抑制剂对牛小肠碱性磷酸酶的活性抑制所得的吸收光谱图。黑色线，不含Na₃VO₄；红色线，含100mM Na₃VO₄。

图6为本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，所测的吸收比率(A550/A397)与Na₃VO₄浓度的关系图。

图7为本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，不含牛小肠碱性磷酸酶(左)或含0.08unit/μL牛小肠碱性磷酸酶(右)的1％胎牛血清样品与2.7mM ATP反应后，用银纳米探针比色测定所得的比色照片。

图8为本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，银纳米探针溶液的吸收比率(A550/A397)与1％胎牛血清中牛小肠碱性磷酸酶浓度的关系图。1号样品，不含牛小肠碱性磷酸酶；2号样品，含有0.008unit/μL牛小肠碱性磷酸酶；3号样品，含有0.08unit/μL牛小肠碱性磷酸酶。

图9为本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，利用银纳米探针进行牛心蛋白激酶A比色测定的照片。左，不含牛心蛋白激酶A；右，含22unit/μL牛心蛋白激酶A。

图10为本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，利用银纳米探针进行牛心蛋白激酶A比色测定的吸收光谱图。黑色线，不含牛心蛋白激酶A；红色线，含22unit/μL牛心蛋白激酶A。

图11为所本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，测的吸收比率(A520/A402)与牛心蛋白激酶A浓度的关系图。

具体实施方式

实施例1

基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛小肠碱性磷酸酶的方法，其步骤如下：

(1)参考文献方法合成银纳米探针(参考文献；Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely stable water-solubleAg nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635)；

(2)将5mM三磷酸腺苷和牛小肠碱性磷酸酶加入到反应缓冲溶液中，混合均匀，37℃水浴反应20min；

所述的5mM三磷酸腺苷∶牛小肠碱性磷酸酶∶反应缓冲溶液的体积比为1∶1∶4；

所述的反应缓冲溶液为含1mM MgCl₂的pH 9.0的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液；

所述的牛小肠碱性磷酸酶浓度为0.001unit/μL到0.1unit/μL；

若进行比色反应的特异性测定，将牛小肠碱性磷酸酶替换为25μM牛血清白蛋白、或10μM α-凝血酶、或2.1μM胰蛋白酶即可；

(3)向(2)中的反应液中加入银纳米探针和0.5M NaCl水溶液；

所述的5mM三磷酸腺苷∶银纳米探针∶0.5M NaCl的体积比为1∶40∶3；

(4)将(3)中反应液，与水混合均匀，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化，完成基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛小肠碱性磷酸酶的方法；所述的(3)中反应液∶水的体积比为1∶3。

本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛小肠碱性磷酸酶的方法，对牛小肠碱性磷酸酶检测的表征如图1、图2、图3和图4所示。

从图1和图2数据可以看出，本发明的方法对于牛小肠碱性磷酸酶有很好的比色响应；通过银纳米探针溶液的颜色变化，很容易用肉眼进行牛小肠碱性磷酸酶的比色检测。

从图3数据可以看出，比色的响应与牛小肠碱性磷酸酶的浓度有很好的相关性；该方法对于牛小肠碱性磷酸酶的检出限为1unit/mL。

从图4数据可以看出，将比牛小肠碱性磷酸酶浓度高出1到2个数量级的牛血清白蛋白、α-凝血酶和胰蛋白酶对该比色方法没有响应，这证明该方法对牛小肠碱性磷酸酶的比色检测有好的特异性。

实施例2

基于银纳米探针无标记比色测定酶，具体涉及测定抑制剂对牛小肠碱性磷酸酶活性的抑制的方法，其步骤如下：

(1)参考文献方法合成银纳米探针(参考文献；Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely stable water-solubleAg nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635)；

(2)将1unit/μL牛小肠碱性磷酸酶与Na₃VO₄混合均匀，37℃水浴反应10min；

所述的1unit/μL牛小肠碱性磷酸酶∶Na₃VO₄的体积比为1∶1；所述的Na₃VO₄浓度为0.5微摩尔每升到100毫摩尔每升。

(3)将5mM三磷酸腺苷加入到(2)的反应液中，混合均匀，37℃水浴反应20min；

所述的1unit/μL牛小肠碱性磷酸酶∶5mM三磷酸腺苷的体积比为1∶1；

(4)向(3)中的反应液中加入银纳米探针和0.5M NaCl水溶液；

所述的5mM三磷酸腺苷∶银纳米探针∶0.5M NaCl的体积比为1∶40∶3；

(5)将(4)中反应液，与水混合均匀，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化，完成基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定抑制剂对牛小肠碱性磷酸酶活性的抑制的方法；所述的(4)中反应液∶水的体积比为1∶3。

本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定抑制剂对牛小肠碱性磷酸酶活性的抑制的方法，测定抑制剂对对牛小肠碱性磷酸酶活性抑制的表征如图5和图6所示。

从图5数据可以看出，本发明的比色方法可以完成牛小肠碱性磷酸酶活性抑制的分析。

从图6数据可以看出，5mM Na₃VO₄能够有效地抑制0.5units/μL牛小肠碱性磷酸酶的活性，而50mM Na₃VO₄能够完全抑制0.5units/μL牛小肠碱性磷酸酶的活性。

实施例3

基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定生物样品中牛小肠碱性磷酸酶的含量的方法，其步骤如下：

(1)参考文献方法合成银纳米探针(参考文献；Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely stable water-solubleAg nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635)；

(2)将牛小肠碱性磷酸酶和1％胎牛血清混合，得到生物流体中牛小肠碱性磷酸酶样品；

所述的牛小肠碱性磷酸酶∶1％胎牛血清的体积比为1∶1；

此处，1％胎牛血清也可以用其它生物流体替代；

(3)向(2)中含牛小肠碱性磷酸的1％胎牛血清中加入5mM三磷酸腺苷和反应缓冲溶液，混合均匀，37℃水浴反应10min；

所述的5mM三磷酸腺苷∶牛小肠碱性磷酸酶∶反应缓冲溶液的体积比为4∶1∶7；

所述的反应缓冲溶液为含1mM MgCl₂的pH 9.0的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液；

(4)向(3)中的反应液中加入银纳米探针和0.5M NaCl；

所述的5mM三磷酸腺苷∶银纳米探针∶0.5M NaCl的体积比为1∶40∶3；

(5)将(4)中反应液，与水混合均匀，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化，完成基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定生物样品中牛小肠碱性磷酸酶的含量的方法；所述的(4)中反应液∶水的体积比为1∶3。

本发明的基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定生物样品中牛小肠碱性磷酸酶的含量的方法测定生物样品中牛小肠碱性磷酸酶浓度的表征如图7和图8所示。

从图7数据可以看出，本发明的方法对于生物样品中牛小肠碱性磷酸酶有很好的比色响应；通过银纳米探针溶液的颜色变化，很容易用肉眼进行生物样品中牛小肠碱性磷酸酶的比色检测。这些结果说明，本发明发展的免标记银纳米比色方法有很好的抗干扰能力，有望用于临床样品的酶活性分析。

从图8数据可以看出，比色的响应与生物样品中牛小肠碱性磷酸酶的浓度有很好的相关性。

实施例4

基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛心蛋白激酶A的方法，其步骤如下：

(1)参考文献方法合成银纳米探针(参考文献；Doty，R.C.；Tshikhudo，T.R.；Brust，M.；Fernig，D.G.，Extremely stable water-solubleAg nanoparticles.Chem.Mater.2005，17，(18)，4630-4635)；

(2)将2mM多肽底物、1mM环单磷酸腺苷、1mM MgCl₂、10mM三磷酸腺苷和不同浓度牛心蛋白激酶A混合均匀，37℃水浴反应2h；

所述的2mM多肽底物∶1mM环单磷酸腺苷∶1mM MgCl₂∶10mM三磷酸腺苷∶牛心蛋白激酶A的体积比为4∶1∶1∶1∶2；

所述的多肽底物序列为H-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-OH；

所述牛心蛋白激酶A的浓度为0.022unit/mL到22unit/mL；

(3)向(2)中的反应液中加入银纳米探针，30℃水浴反应10min；

所述的(2)中的反应液∶银纳米探针的体积比为1∶10；

(4)将(3)中反应液，与水混合均匀，马上测定反应溶液的吸收光谱，或者直接用肉眼观察溶液的颜色变化，完成基于银纳米探针无标记比色测定酶的方法，具体涉及测定牛心蛋白激酶A的方法；所述的(3)中反应液∶水的体积比为1∶8。