人丙肝病毒的人工假病毒及其制备和应用

摘要

本发明公开了人丙肝病毒的人工假病毒，为反转录病毒，由pLXSN质粒载体所转化的PT67细胞产生，其中，pLXSN质粒载体含有SEQ ID NO：1的多核苷酸序列。本发明的人工假病毒易于获得且安全廉价，可用作HCV病毒PCR、RNA提取和逆转录的阳性参考品或HCV病毒标准品。

说明书

技术领域

本发明涉及人丙肝病毒的人工假病毒。

背景技术

HCV检测时，有以下三个主要步骤需要阳性参照：

1.从标本中提取HCV RNA，包括：病毒外膜、核衣壳打开/破碎，核酸释放。

2.HCV RNA被逆转录(也称反转录)为cDNA。

3.cDNA与PCR反应液和DNA多聚酶混合，在PCR仪中扩增并得到信号。

现有的阳性参照，主要有下述几种来源：病人血清(/血制品)；体内或体外转录RNA；质粒或化学合成。

所有阳性参照中，最准确贴切的阳性参照应该是含该HCV病毒的天然样本(如病人血液、肝组织)，同质性可充分保证其作为前述三个步骤的阳性参照，但其缺陷在于天然样本来源少，且由于含有天然病毒，因此具有传染性和危害性。

要克服天然病毒来源少且具有传染性的缺点，本质上可通过离体培养来解决，即把HCV(尤其是基因组经过无害化改造的HCV)导入合适的人工培养宿主细胞系，重组HCV颗粒即可从细胞中产生并分泌至培养基上清。然而，该技术的关键步骤为保密状态，目前只为少数实验室所拥有；另一方面，这种HCV生产方法可能尚存在若干缺陷，如成本高、病毒数量仍然较低、结构不天然、重复性差等。

体外转录的HCV RNA，因为它与标本中待测指标一样，都是RNA，因此可以作为逆转录的阳性参照；但是，由于其不具备病毒外壳，因此不适合作为从标本中提取病毒RNA操作的阳性参照。

用质粒作为阳性参照，其优点是制备纯化容易，但由于质粒是闭合环状超螺旋双链形式，非单线性，不是RNA，因此它只能作为PCR参照，而无法作为RNA提取和逆转录的参照。

至于化学合成法制备RNA阳性参照，目前技术尚不成熟，且成本高，还会因为没有核衣壳、膜的保护而容易降解，因此到目前为止还无实际应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种易于获得，安全，廉价的人丙肝病毒的人工假病毒，其制备及应用。

假病毒即指反转录病毒载体，为经过基因改造的反转录病毒，具有原始病毒的基本结构和部分生活史，而不具有多数调节基因及主要致病成份。所谓基本结构，乃假病毒的外膜蛋白及脂类、衣壳蛋白、复制酶(起切割、逆转录、整合作用的蛋白)、RNA基因组，分别由来源于天然病毒的env、gag、pol、目的基因(序列)所编码/代表。所谓部分生活史，乃假病毒仅可在宿主细胞中产生组件、组装，且只能一次性的感染靶细胞，不产生新病毒。

本发明利用反转录病毒系统(Clontech公司的RetroX^(R)system)，将经筛选获得的目的DNA片段重组(分子生物学常规技术)入pLXSN(plasmid-LTR-X-SV40 promoter-Neomycin)质粒载体，然后导入(方法：脂质体转染)病毒生产细胞(Clontech公司的PT67)，携带目的序列(以RNA形式)的假病毒便可以从生产细胞中产生，分泌到液态的培养基中。收集此培养基，2000RPM离心10分钟去除大部分细胞碎片和杂质，就得到假病毒粗制品。

RetroX^(R)system反转录病毒系统包括PT67生产细胞、2种克隆载体pLXSN和pLNCX2供选择、载体附带正反向测序引物、正对照克隆(AP基因)质粒pLAPSN，即X＝AP，Alkalinephosphatase(碱性磷酸酯酶报告基因)。PT67细胞来源于常见的小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3，已经稳定转染了莫洛尼逆转录病毒(Mo-MLV，Moloney murine leukemia virus，莫洛尼株型鼠科白血病病毒)的gag-pol基因，10A1逆转录病毒(10A1-MLV，10A1株型鼠科白血病病毒)的env基因(也称10A1)，形成稳定转染(整合入细胞染色体)的辅助筛选基因分别是TKgene(thymidine kinase，胸腺激酶)和DHFR gene(dihydrofolate reductase，二氢叶酸还原酶)。采用RetroX^(R)system反转录病毒系统制作反转录病毒的步骤为：把目的序列重组进某一载体，扩增重组质粒，转染PT67细胞，收获上清。

本发明第一方面公开了一种人丙肝病毒的人工假病毒，为反转录病毒，由pLXSN质粒载体所转化的PT67细胞产生，其中，pLXSN质粒载体含有SEQ ID NO：1的多核苷酸序列。

较佳的，SEQ ID NO：1位于pLXSN载体的EcoRI和XhoI位点之间。

pLXSN质粒载体为Clontech公司开发的逆转录病毒载体，pLXSN质粒载体是plasmid-LTR-X-SV40 promoter-Neomycin的缩写，LTR＝Long terminal repeat，反转录病毒特有的长末端重复序列，即在10000nt全长基因组的两端500nt左右相同序列的碱基，能够引导中间体DNA的产生及整合进人细胞的基因组/染色体中，也能够引导从中间体DNA产生新的病毒RNA基因组/长RNA链，X＝Sequence of Interest，感兴趣的序列/目的序列，本专利中为独特的~1200nt HCV病毒序列，SV40 promoter＝Simian vacuolating virus 40promoter，猴空泡病毒的启动子序列，在人细胞中仍具有启动下游序列产生RNA的很强能力，Neomycin＝Neomycin resistant gene，新霉素抗性基因，细胞若含有此基因，且表达产物蛋白，则能够抵御环境中的新霉素毒性，SV40-Neomycin与目的序列合放一起，就可通过新霉素筛选来挑出(/使存活)含目的序列的细胞株——筛稳定转染/生产细胞株。pLXSN质粒载体的序列为SEQ ID NO：2。

本发明第二方面公开了一种pLXSN质粒载体，它含有SEQ ID NO：1的多核苷酸序列。

本发明第三方面公开了一种宿主细胞，它是被pLXSN质粒载体所转化的PT67细胞，其中，pLXSN质粒载体含有SEQ ID NO：1的多核苷酸序列。

本发明第四方面公开了上述人丙肝病毒的人工假病毒的制备方法，包括下列步骤：

1)培养上述宿主细胞；

2)从培养物中分离出人丙肝病毒的人工假病毒。

上述步骤1可采用细胞培养领域的常规配方培养，如：

DMEM，90％；小牛血清，10％；4mM L-谷酰胺；100U/ml青霉素G钠；100μg/ml硫酸链霉素；1mM丙酮酸钠。

本发明第五方面公开了上述人丙肝病毒的人工假病毒在制备HCV病毒检测的阳性参考品或HCV病毒检测的标准品中的应用。

上述HCV病毒检测的阳性参考品包括HCV病毒检测的PCR阳性参考品、RNA提取阳性参考品及逆转录阳性参考品。

本发明第六方面，公开了一种HCV检测试剂盒，该HCV检测试剂盒的阳性参考品中含有前述人丙肝病毒的人工假病毒。

要获得适合作为阳性对照或标准品的人丙肝病毒的人工假病毒，合适的目的序列选取是关键，目的序列的选取主要需要考虑以下几个方面的因素，首先，目的序列的序列在各种不同基因型的丙肝病毒中应该是保守的，即绝大多数基因型的HCV，也就是绝大多数病人所携带的HCV病毒，都具有这一段特定碱基序列，其次，对于PCR和病毒包装来说，片段越短效率越高，而对于模拟HCV的目的/功能来说，则越接近基因组全长越有代表性。

综合考虑上述因素，本发明选取了SEQ ID NO：1的序列作为目的序列，按照标准NCBIreference sequence(NC_004102)，该碱基序列为HCV病毒52到1319位的序列，含有5’UTR(5’Untranslated Terminal Region，5’非翻译区)和Capsid/Core ORF(Open ReadingFrame，开放读码框/读码框)，选取该序列首先是因为该序列包含了HCV的基因组序列最为保守的序列，以此作为HCV通用定量检测试剂盒的检测参数/指标/对象，可以提高检出率，降低漏检率，且目前主要的商用和实验室PCR检测方法都针对此区域。其次，该序列PCR和病毒包装效率高，与其他长片段相比，相对容易亚克隆进假病毒载体pLXSN，且其对应的病毒产率高达10⁷~10⁸，且滴度、稳定性、灵敏度等均能满足要求。

本发明的人工假病毒易于获得且安全廉价，可用作HCV病毒PCR、RNA提取和逆转录的阳性参考品或HCV病毒标准品。

附图说明

图1：以HCV cDNA为模板，PCR扩增得到的HCV DNA序列电泳图

左泳道：DNA分子量标记，从上往下为2000，1000，750，500，250，100bp。

右泳道：PCR产物，模板是HCV cDNA。

图2：实时PCR定量图

图3：DNA标准模板PCR曲线和Ct值标准曲线图

图4：假病毒定量曲线图

图5：实施例1假病毒作为阳参/标准品，梯度稀释real time PCR图

图6：实施例1假病毒稀释曲线

图7：实施例2国家标准品real time PCR检测结果

图8：实施例2国家标准品real time PCR检测的标准曲线

图9：实施例2假病毒real time PCR检测结果

图10：实施例2假病毒real time PCR检测的稀释曲线

图11：实施例2阴性对照real time PCR检测结果

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1 人丙肝病毒的人工假病毒的制备

1.1 临床标本中提取HCV RNA。

向200μL HCV临床样本中加TRIzol(Invitrogen公司)1mL，充分摇匀，静置5-15min加200μL三氯甲烷(氯仿，CHCl₃)，剧烈摇匀，静置10-20min。

离心，12000rpm，15min.

小心地吸取离心管上层清澈液体，体积为V(通常600μL左右)。

加异丙醇，体积0.8V(500μL左右)；加糖原(Glycogen)助沉，约1μL(20μg/μL母液)。

离心，12000rpm，15min.

留沉淀，加70％~80％乙醇洗涤。

离心，7000-8000rpm，10-15min，留沉淀。

离心，3000-5000rpm，1min，留沉淀。

30μL DEPC水溶解RNA沉淀。

1.2 HCV RNA进行逆转录，得到HCV cDNA。

混合液A：RNA 15μL，5×RT buffer 5μL，随机引物hexamer 3μL，混匀，70℃处理5min，立即冰浴5min。

混合液B：混合液A 23μL，dNTPs(10mM each)1μL，RTase(Promega公司MMLV逆转录酶)1μL，混匀，25℃ 10-20min，42℃ 30-80min，70℃ 10-20min。即为病毒cDNA产物。

1.3 HCV cDNA作为模板，PCR扩增到足够HCV DNA序列(结果如图1所示)。

混合：

H₂O                             ——34μL，

10×PCR buffer                  ——5μL，

dNTPs                           ——5μL，

Mg²⁺                            ——2μL，

HCV sense 52-76-c1              ——1μL，

HCV antis 1319- 1295-c5              ——1μL，

KOD+                                 ——1μL，

cDNA模板                             ——1μL，

PCR热循环条件：

第一步：94℃ 3min。

第二步：94℃ 25sec，57℃ 30sec，68℃ 1min 30sec；50循环。

第三步：68℃ 3min。

电泳，紫外光下切胶回收：按照胶回收试剂盒说明书操作。

引物序列：

HCV sense 52-76-c1：GAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC

HCV antis 1319-1295-c5：CCAGTTCATCATCATRTCCCAWGCC

简并碱基R＝A，G，W＝A，T.

注：

DNA聚合酶：TOYOBO公司(株式会社)的KOD+DNA polymerase。及其对应的10×PCRbuffer，Mg²⁺(25mM，25×)和dNTPs(2mM each of dATP，dTTP，dCTP，dGTP，10×)。

PCR管：普通薄壁PCR管(0.2mL型)

PCR仪：博日定性PCR仪。

1.4 HCV DNA PCR产物和质粒载体酶切。

PCR产物酶切：

PCR产物(c1c5)                  ——17μL

10×H buffer                   ——2μL

EcoRI                          ——0.5μL

XhoI                           ——0.5μL

37℃处理10-20hr。

载体酶切：

H₂O                            ——16μL

pLXSN载体                      ——1μL

10×H buffer                   ——2μL

EcoRI                          ——0.5μL

XhoI                           ——0.5μL

37℃处理10-20hr。

注：EcoRI，XhoI，及配套的10×H buffer，为宝生物(大连)株式会社产品。

1.5 酶切后的HCV DNA PCR产物和质粒载体进行连接反应。

酶切后PCR产物(c1c5)                     ——16μL

酶切后pLXSN载体                         ——1μL

10×T4 ligation buffer                  ——2μL

T4DNA ligase                            ——1μL

16℃处理10-20hr。

注：T4 DNA ligase，及配套的10×T4 ligation buffer，为宝生物(大连)株式会社产品。

1.6 连接产物转化感受态大肠杆菌。

从-70℃冰箱取出一管(100μL)感受态细胞(DH-5α大肠杆菌)，解冻。

加连接产物(步骤1.5)，混匀。

冰浴30min.42℃热激90sec。冰浴2min。

加1mL LB，150-200rpm摇40-60min.37℃。

离心，3000rpm，3min。

吸走部分上清，留下100-300μL，用移液器混匀上清和沉淀，涂布于Amp平板(氨苄青霉素LB琼脂平板)。

37℃培养14-16hr。

1.7 从菌落中筛选/鉴定预期的重组质粒。

1.7.1 菌落PCR鉴定。

挑选6-10个菌落，悬于无菌水中，取1μL进行PCR，条件同(1.3)。阳性克隆判断标准：电泳条带有单一明亮条带，位置1268bp附近。

1.7.2 测序鉴定。

把一个阳性菌落送测序公司进行鉴定，测序引物用载体附带的pLXSN5’primer和pLXSN3’primer。测定结果符合预期。

1.8 提取高质量的重组质粒用于细胞转染。

摇阳性菌于10mL LB，按照Qiagen说明书提取质粒。(碱裂解/硅基质吸附法。)

1.转染宿主细胞

靶细胞是35mm皿的PT67细胞(clontech公司)，细胞汇合度在50-80％时换液，开始转染。A液：DMEM 250μL+脂质体10μL，混匀，静置5min；B液：DMEM 250μL+质粒4μg[20μL(0.2μg/μL)]，混匀，静置5min；混合A液和B液，混匀，静置20min；加入到细胞上清。4-7hr后再次换液。转染48-72hr后收获粗病毒(细胞培养基上清)。

注：脂质体是Lipofectamine2000(Invitrogen).

2.细胞培养及假病毒的获得

2.1 细胞的复苏。将液氮冻存的细胞(冻存管中)于37℃水浴融解，立即用酒精棉擦拭，移入培养皿(如60mm直径的培养皿)，添加合适体积的完全培养基(如5mL)。12-24hr后换液，去除未贴壁的细胞。此后正常培养(完全培养基用于PT67细胞，条件培养基用于稳定转染了目标质粒的PT67细胞)。

2.2 细胞的培养

贴壁的细胞用完全培养基(PT67细胞)或条件培养基(稳定转染了目标质粒的PT67细胞)培养，每2-3天换液，即移去旧培养上清，加入等体积新鲜培养基。细胞在70-90％汇合度时应该消化，然后传代或冻存。

注1：完全培养基：

DMEM(含L-Glutamine 4mM和sodium pyruvate acid 1mM)+FBS(10％)+penicillin(100U/mL)+streptomycin(100μg/mL)

注2：条件培养基：

DMEM(含L-Glutamine 4mM和sodium pyruvate acid 1mM)+FBS(10％)+G418(0.6mg/mL)。

注3：FBS(Fetus Bovine Serum，胎牛血清)是Invitrogen(澳大利亚)公司的产品，品牌为Gibco；其余均为Sigma-Aldrich公司产品。

2.3 细胞的消化。

贴壁细胞用DMEM洗涤一次，加胰酶(0.25％)1mL，1-2min后，吸去胰酶。

胰酶消化液：0.25％ Trypsin(牛胰蛋白酶，Invitrogen公司，Gibco品牌)。

2.4 细胞的传代。

消化后，加完全培养基，用移液器轻轻吹起细胞，分至所需培养皿，一般1份传3-10份。

2.5 细胞的冻存。

消化后，加细胞冻存液，转移至冻存管，立即存于-20℃，1-2hr，此后转移到-70℃，5-24hr，此后冻存于液氮。

细胞冻存液：DMEM(含L-Glutamine 4mM和sodium pyruvate acid 1mM，70％体积)+FBS(20％体积)+DMSO(Dimethyl sulphoxide，10％体积)

2.6 细胞的筛选。

使用条件培养基培养细胞。G418含量为0.6mg/mL，基于浓度梯度敏感实验(killingcurve)。

2.7 假病毒的获得和目的核酸的定量/滴度测定。

2.7.1 对瞬时转染的细胞，转染48-72hr后收获粗病毒(细胞培养基上清，离心2000rpm10min后，取上清)。

2.7.2 对稳定转染的细胞，则当细胞密度达到50-90％，培养48-72hr后收获粗病毒(细胞培养基上清，离心2000rpm 10min后，取上清)。

取DNA标准模板(HCV线性化DNA/cDNA的PCR产物，经OD/吸光度测量和电泳条带光密度扫描测定浓度)稀释一定倍数后，得到10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶数量的模板。与2.7.2获得的假病毒同时进行Real time PCR，扩增曲线如图2所示，假病毒定量曲线如图4所示，设定阈值为0.10，得到各自的Ct值(Threshold Cycle)。把各数量级标准品的Ct与数量的对数(10为底)作图，得到标准曲线，如图3。并得到线性关系方程，Y＝-3.77X+38.836，相关系数R²接近1.00，说明线性非常好。经过计算(标准曲线和稀释度)，假病毒滴度(假病毒颗粒数量)约1.6×10⁷。

3.获得的假病毒理化性能测试，致病性评估试验

3.1 理化性能测试：蛋白印记实验(Western Blot Assay)。

取100μL假病毒原液，用20μL裂解液(250mM Tris-HCl，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)处理。进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，然后把蛋白条带转膜至硝酸纤维素膜，分别用anti-p24 mAb(抗-逆转录病毒核衣壳蛋白capsid/p24单抗)和anti-10A1 mAb(抗-逆转录病毒膜蛋白10A1单抗)进行孵育，1-2小时后，添加HRP-pAb(辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗)进行显色。

结果——得到阳性信号(在预期的位置出现单一条带)，该试验表明病毒核衣壳蛋白、膜蛋白，以及病毒RNA(见定量结果)共同存在，这符合逆转录假病毒的特征。

3.2 致病性测试：细胞培养实验。

在正常培养的A549(人肺细胞系)和HepG2(人肝细胞系)中，各投入1mL假病毒，第1，3，5，10，15天用显微镜观察细胞形态，以及检查细胞活力(MTT法)。

结果——细胞形态正常，活力也正常。说明假病毒对细胞无明显毒性。

4.稀释实验：

假病毒原液(1)----取100μL假病毒原液进行HCV RNA定量(之江公司HCV试剂盒，下同)。数量约为1×10⁶。

稀释(2)----取100μL(1)，加900μL完全培养基，取100μL定量。数量约为1×10⁵。

稀释(3)----取100μL(2)，加900μL完全培养基，取100μL定量。数量约为1×10⁴。

稀释(4)----取100μL(3)，加900μL完全培养基，取100μL定量。数量约为1×10³。

稀释(5)----取100μL(4)，加900μL完全培养基，取100μL定量。数量约为1×10²。

结果：稀释液的real time PCR图及稀释曲线参考图5和图6，结果表明，假病毒数量的对数与假病毒Ct值呈线性相关，并且此直线接近real time PCR标准曲线。这说明：假病毒符合作为新标准品的条件。

实施例2 人丙肝病毒的人工假病毒的应用

(1)作为RNA提取的对照。

取下述样品：

a，100μL假病毒原液(按实施例1的方式制备)。

b，以10μL假病毒原液+90μL牛血清进行10倍稀释，假病毒总量相当于10μL原液。

c，以10μL上级病毒液+90μL牛血清进行10倍稀释，假病毒总量相当于1μL原液。

d，以10μL上级病毒液+90μL牛血清进行10倍稀释，假病毒总量相当于0.1μL原液。

e，以10μL上级病毒液+90μL牛血清进行10倍稀释，假病毒总量相当于0.01μL原液。

f，100μL牛血清。作为阴性对照。

g，100μL HCV RNA国家定量标准品，HCV RNA理论浓度为10⁶IU/mL，含量为10⁵IU。

h，以10μL上级标准品+90μL牛血清进行10倍稀释，HCV RNA理论浓度为10⁵IU/mL，含量为10⁴IU。

i，以10μL上级标准品+90μL牛血清进行10倍稀释，HCV RNA理论浓度为10⁴IU/mL，含量为10³IU。

j，以10μL上级标准品+90μL牛血清进行10倍稀释，HCV RNA理论浓度为10³IU/mL，含量为10²IU。

上述10种样本同时提取RNA，方法与″实施例1-1.1″中相同。提取所得RNA的逆转录及检测结果分别参见下述的(2)和(3)。

注1：HCV RNA国家标准品包括1个定量标准品、10个阴性对照、10个阳性对照)，是目前唯一法定的HCV RNA诊断试剂参考品。由中国药品生物制品检定所制备，全部为人血浆。

定量标准品浓度为10⁶IU/mL。

注2：牛血清为Invitrogen(澳大利亚)公司的产品，品牌为Gibco。

(2)作为逆转录反应的对照。

取(1)中所述10份样品的RNA提取物，进行逆转录，方法与″实施例1-1.2″中相同。检测结果参见下述的(3)。

(3)作为real time PCR的对照。

取(2)中所述10份样品的RNA逆转录产物(即cDNA产物)，进行real time PCR定量。方法参见仪器(Applied Biosystems公司ABI7000定量PCR仪、上海宏石SLAN定量PCR仪)及试剂盒说明书(之江公司HCV RNA/cDNA定量试剂盒)。

反应液：

PCR mix                ——30uL

Taq DNA polymerase     ——0.4uL

cDNA样本               ——10uL

反应条件：

第一步，95’C——4min，

第二步，95’C——15sec，60’C——1min，荧光检测；循环40次。

结果(如图7-12所示)：

表格：

结论：由定量结果可知，本公司(之江公司)的假病毒在核酸提取、逆转录反应、real timePCR过程中，效果与国家标准品(代表临床样本)相近，提示其可以作为参考品或标准品使用。但拷贝数转换为国际单位(IU)约为10:1。即，假病毒原液浓度1.6×10⁷拷贝/mL(根据公司标准品)，相当于国际浓度1.6×10⁶IU/mL。

序列表

<110> 上海之江生物科技有限公司

<120> 人丙肝病毒的人工假病毒及其制备和应用

<130> PCNZY080553

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1268

<212> DNA

<213> Hepatitis C virus

<400> 1

<210> 2

<211> 5874

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pLXSN载体

<400> 2