阴离子聚合物接枝涂层毛细管及用于蛋白质在线富集分析方法

摘要

本发明涉及制备阴离子聚合物接枝涂层毛细管及其蛋白质在线富集毛细管电泳分析方法，包括毛细管预处理、乙烯基化毛细管内壁、甲基丙烯酸缩水甘油酯原位接枝反应以及磺酸基修饰反应，其中：磺酸基修饰反应是向制得的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝修饰的管柱中通入含0.1－0.3g/l亚硫酸钠及2－6％v/v异丙醇的水溶液，管柱两端封口后室温反应1－3天，随后用管柱分别用水、甲醇洗，最后氮气吹干，便制得了阴离子聚合物接枝涂层的毛细管柱。采用阴离子聚合物涂层的毛细管柱萃取样品溶液中的蛋白质溶质，并用反向电渗流将吸附的蛋白质洗脱并富集于管柱进口，随后进行毛细管电泳分离操作。本方法可以多倍柱体积样品进样，故可以用于低丰度蛋白质样品溶液的分离分析。

说明书

技术领域

本发明涉及制备阴离子聚合物接枝涂层毛细管及其蛋白质在线富集毛细管电泳分析方法，属于蛋白质分离分析技术领域。

背景技术

蛋白质的分离分析无论在医疗诊断领域还是在日益发展的蛋白质组学研究领域均具有十分重要的意义。毛细管电泳(capillary electrophoresis)技术因其具有高柱效、高选择性、低消耗、易于自动化等优点，已广泛的用于蛋白质的分离分析。毛细管电泳一般在内径为25～100微米的石英毛细管内进行，故溶质的进样量较小。此外，蛋白质毛细管电泳一般使用紫外检测器进行在线检测，因此检测光程较短。所以，毛细管电泳法检测灵敏度较差，溶质检测限较高。如何有效的提高毛细管电泳法的检测灵敏度及降低溶质检测限是当今毛细管电泳研究及应用领域的热点问题。

迄今，解决这一问题主要有三种方法：(1)改变与紫外检测器连接处毛细管柱的光路设计，如安捷伦公司研制的带有泡型检测池(bubble cell)的毛细管柱；(2)采用具有较高灵敏度的检测器如荧光检测器，质谱检测器等；(3)采用样品富集方法，这种方法又分为在线富集(on-line preconcentration)及离线富集(off-line preconcentration)两种。其中第一种方法虽然可以在一定程度上提高检测灵敏度，但是所用的毛细管柱往往价格较高。第二种方法往往需要毛细管电泳仪额外配备价格昂贵的检测器，此外，这种方法对样品或缓冲液均有特殊的要求，进而限制了其广泛应用。第三种方法中离线富集方法虽然可以使样品得到较大程度上的富集，但是这种方法往往需要富集柱同分离柱偶联起来使用，操作比较麻烦。

样品在线富集方法是当今解决毛细管电泳检测灵敏度差的主要方法，也是当今研究的热点问题。迄今，许多在线富集方法已用于蛋白质的毛细管电泳分析。其中，样品堆积方法(sample stacking method)是最常使用的方法。Bessonova等在《journal ofchromatography A》第1150卷中报道了采用五中样品堆积富集方法对人血清白蛋白(HAS)进行毛细管电泳分离分析(Electrophoretic determination of albumin in urine usingon-line concnetration techniques，Journal of Chromatography A，2007，1150，332-338)。其中采用大体积样品堆积方法(large volume sample stacking method)使HSA的检测灵密度提高了67倍，样品检出限为：15μg/ml。使用这种方法样品的进样量最多为一倍柱体积。然而对于极低浓度的样品，一倍柱体积的进样量也往往无法得到具有较强信号的溶质吸收峰。因此，这种方法不适用于极低浓度样品的分析检测。

在线样品萃取富集方法(on-line sample extraction and preconcentration method)可以通过多倍柱体积样品进样实现对样品的高倍富集。Li等用带有负电溶胶凝胶涂层管柱对肌红蛋白进行了在线萃取富集分离(Negatively charged sol-gel column with stableelectroosmotic flow for online preconcentration of zwitterionic biomolecules incapillary electromigration separations，Journal of separation science，28，2153-2164)。肌红蛋白在进样的过程中通过静电作用吸附在毛细管内壁上，随后用大于肌红蛋白等电点的缓冲液在正向电渗流的推动下将吸附的蛋白洗脱下来。该法对肌红蛋白的富集倍数达3000倍。然而，这种方法每次只可以富集分离一种蛋白质，不适用于蛋白质混合物的分离分析。

Qu等和Li等分别采用蚀刻后的毛细管柱和溶胶凝胶涂层的毛细管柱对氨基酸混合物进行了在线萃取及富集分离(Etched bare fused-silica capillaries for onlinepreconentration of amino acids in CE，Elelctrophoresis，27，4500-4507；Positivelycharged sol-gel coatings for on-line preconentration of amino acids in capillaryelectrophoresis，Analytical chemistry，2004，76，218-227)。这种方法中，通过进样吸附在管壁的样品先用反向电渗流洗脱至管柱进口端，随后用正向电渗流对洗脱下来的样品进行分离。这种方法可以很好的实现氨基酸混合物的富集分离，然而该法用于蛋白质混合物的分离分析中却未见报道。

用在线萃取富集分离蛋白质需要毛细管柱具有较高的蛋白质吸附容量。Xu和Sun用甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体在毛细管内壁接枝上了触须式聚合物长链，随后在接枝上的聚合物上修饰了苯丙氨酸制得苯丙氨酸修饰的触须式聚合物涂层毛细管柱。制得的毛细管柱具有较高的配基容量，已成功的用于苯类化合物、氨基酸及蛋白质的分离分析(Novel opentubular CEC with tentacle-type polymer stationary phase functionalized byphenylalanine，Electrophoresis，2008，29，880-888)。本专利在前人的研究基础上，成功的制备了新型阴离子聚合物接枝涂层的毛细管柱并将其用于蛋白质在线富集毛细管电泳法分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于蛋白质在线萃取富集的毛细管电泳分离分析方法。本方法采用阴离子聚合物涂层的毛细管柱萃取样品溶液中的蛋白质溶质，并用反向电渗流将吸附的蛋白质洗脱并富集于管柱进口，随后进行毛细管电泳分离操作。本方法可以多倍柱体积样品进样，故可以用于低丰度蛋白质样品溶液的分离分析。

本发明是通过下述技术方案加以实现的：

本发明的阴离子聚合物接枝涂层毛细管柱的制备方法，包括：毛细管预处理、乙烯基化毛细管内壁、甲基丙烯酸缩水甘油酯原位接枝反应以及磺酸基修饰反应，其中：磺酸基修饰反应是向制得的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝修饰的管柱中通入含0.1-0.3g/l亚硫酸钠及2-6％v/v异丙醇的水溶液，管柱两端封口后室温反应1-3天，随后用管柱分别用水、甲醇洗，最后氮气吹干备用，便制得了阴离子聚合物接枝涂层的毛细管柱。

本发明的制备的阴离子聚合物接枝涂层毛细管柱进行蛋白质在线富集分析方法，步骤如下：

第一步为大体积压力进样，进样条件为：20psi，3min；样品溶液在压力的驱动下进入毛细管，进样过程中带有正电荷的蛋白质分子会吸附到阴离子聚合物接枝涂层的毛细管内壁上；

第二步为反向电渗流洗脱富集蛋白质，反向电渗流富集电压为20kV，即将上步中吸附在管壁的蛋白质分子用pH大于蛋白质等电点的溶液将其反向洗脱下来，蛋白质样品会在样品溶液和洗脱缓冲液的界面处富集；当电流的绝对值为32.5μA时停止加压；

第三步为毛细管电泳法分离分析第二步中富集的蛋白质，运行缓冲液为pH 9.2的20mM磷酸缓冲液。

所述的样品溶液是为蛋白质溶于pH值小于蛋白质等电点的pH 4.2，5mM磷酸缓冲液。

所述的洗脱缓冲液为pH值大于分析蛋白质等电点的pH 9.2的20mM磷酸缓冲液。

所述的管柱管柱温度：25℃，检测波长200nm。

详细内容介绍如下：

首先制备阴离子聚合物涂层毛细管柱，制得的管柱可用于高容量萃取样品溶液中的蛋白质。管柱制备包括以下四步：毛细管预处理、乙烯基化毛细管内壁、甲基丙烯酸缩水甘油酯原位接枝反应以及磺酸基修饰反应。阴离子聚合物涂层毛细管柱的反应方程式可参见图1。未经任何修饰的毛细管首先用一定浓度的碱溶液处理除去管内碱溶性杂质以及将管壁硅氧键打开形成硅羟基，随后用一定浓度的酸溶液冲洗管柱除去管内酸溶性杂质。第二步反应为乙烯基化毛细管内壁，可参见图1(a)。向预处理后的毛细管柱内通入含1mg/ml1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)以及30％v/v γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)的二甲基呋喃溶液，管柱两端封口后在120℃油浴中反应6h。反应完成后，管柱用甲醇冲洗，随后氮气吹干。第三步接枝反应的反应方程式可参见图1(b)。反应过程为：首先，向上步制得的管柱中通入含有一定浓度接枝聚合反应单体和引发剂的溶液，管柱两端封口后80℃反应10h。所用的引发剂应为自由基聚合反应引发剂，如偶氮二异丁氰、过氧化二苯甲酰等。随后用分别用甲苯、甲醇冲洗管柱，最后管柱用氮气吹干。第四步磺酸基修饰反应的反应方程式可参见图1(c)。反应过程为：首先向上步制得的管柱中通入含0.1-0.3g/L亚硫酸钠及2-6％v/v异丙醇的水溶液，管柱两端封口后室温反应1-3天，随后用管柱分别用水、甲醇洗，最后氮气吹干备用。这样便制得了阴离子聚合物接枝涂层的毛细管柱。因为在管内壁接枝上了修饰有磺酸基的聚合物，故毛细管内壁便可以通过静电作用高容量吸附蛋白质。

采用上述制得的阴离子聚合物接枝毛细管柱在线萃取富集分离蛋白质方法为：配置pH小于分析物(蛋白质)等电点的磷酸缓冲液用于样品制备，配置pH大于蛋白质等电点的磷酸缓冲液作为毛细管电泳流动相。样品的富集分离分为三步(参见图2)：第一步为大体积压力进样，将样品溶液用20psi冲洗管柱3min，进样过程中带有正电荷的蛋白质分子会吸附到阴离子聚合物接枝涂层的毛细管内壁上。第二步为反向电渗流洗脱富集蛋白质，即将上步中吸附在管壁的蛋白质分子用pH大于蛋白质等电点的溶液将其反向洗脱下来，蛋白质样品会在样品溶液和洗脱缓冲液的界面处富集。在这步操作中，随着高pH值，高离子强度的洗脱缓冲液的引入，毛细管内电流会逐渐增加。当富集的蛋白质被洗脱到毛细管进口端后，电流值将不再发生变化。故在实际操作过程中，应仔细观察电流变化。当电流接近稳定值时应停止洗脱进行第三步操作。第三步为毛细管电泳法分离分析第二步中富集的蛋白质。通过上述操作，便可以实现对毛细管内壁吸附的蛋白质进行洗脱、富集并分离检测。因为制得的毛细管柱具有较高的吸附容量，且此法可将整个管柱上吸附的蛋白质进行洗脱富集，故该方法对蛋白质具有较好的富集效果，可以在很大程度上提高蛋白质毛细管电泳的检测灵敏度。

本发明所介绍的蛋白质富集分离分析方法与其它类型的富集分离分析方法相比有如下优点：第一，阴离子聚合物接枝涂层毛细管柱可以提供较大的比表面积和较高的离子交换配基修饰密度，因此可以在很大程度上提高蛋白质的吸附容量，近而提高富集倍数；第二，本发明介绍的蛋白质富集方法的样品进样量不局限于一倍柱体积，即可以多倍柱体积进样，故适用于低丰度蛋白质样品的分离分析；第三，本发明介绍的蛋白质富集分离方法可以对蛋白质混合物进行富集分离分析操作；第四，本发明介绍的方法操作简便，在现有的商品化的毛细管电泳设备上便可实现。

附图说明

图1：本发明介绍的阴离子聚合物接枝涂层毛细管柱制备图；

图2：本发明介绍的蛋白质在线富集毛细管电泳分析方法示意图；

图3：1.0μg/ml肌红蛋白样品的毛细管电泳在线富集分析谱图；

图4：0.4μg/ml肌红蛋白和0.4μg/ml胰岛素混合物的毛细管电泳在线富集分离谱图。

具体实施方式

下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。

实施例1：阴离子聚合物接枝涂层毛细管柱的制备用1M NaOH溶液冲洗未经任何处理的毛细管15min，随后两端用硅橡胶封口，100℃反应2h。反应完成后用水冲洗毛细管至管内流出的液体pH值为7，随后分别用1M HCl洗5min，水洗15min，甲醇洗15min，然后用氮气吹洗毛细管5h。接下来，向上步制得的毛细管内通入含1mg/ml DPPH以及30％v/vγ-MPS的二甲基呋喃溶液，管柱两端封口后在120℃的油浴中反应6h。反应完成后，管柱用甲醇冲洗，随后氮气吹干。随后，用含1mg/ml偶氮二异丁氰，10％v/v甲基丙烯酸缩水甘油酯的甲苯溶液冲洗管柱15min，然后管柱两端封口80℃反应10h。随后用分别用甲苯、甲醇冲洗管柱，最后管柱用氮气吹干。接下来，向上步制得的管柱中通入含0.1g/L亚硫酸钠及2％v/v异丙醇的水溶液，管柱两端封口后室温反应三天，三天后用管柱分别用水、甲醇洗，最后氮气吹干备用。阴离子聚合物接枝涂层毛细管柱的制备方法如图1所示。

实施例2：制得甲级丙烯酸缩水甘油酯接枝涂层的毛细管柱(制备方法如下来实施例1)，随后向制得的管柱中通入含0.2g/L亚硫酸钠及4％v/v异丙醇的水溶液，管柱两端封口后室温反应两天，两天后用管柱分别用水、甲醇洗，最后氮气吹干备用。

实施例3：制得甲级丙烯酸缩水甘油酯接枝涂层的毛细管柱(制备方法如下来实施例1)，随后向制得的管柱中通入含0.3g/L亚硫酸钠及6％v/v异丙醇的水溶液，管柱两端封口后室温反应一天，一天后用管柱分别用水、甲醇洗，最后氮气吹干备用。

实施例4：

采用实施例1的阴离子聚合物接枝涂层毛细管柱。

蛋白质样品阴离子聚合物接枝涂层毛细管柱上富集毛细管电泳分离分析毛细管柱为内径50μm，总长40.2cm，有效长度30cm的阴离子聚合物接枝涂层毛细管柱。蛋白质样品1：含有1μg/ml肌红蛋白的pH 4.2的磷酸缓冲液。蛋白质样品2：含有0.4μg/ml肌红蛋白和0.4μg/ml胰岛素的5mM pH 4.2的磷酸缓冲液。洗脱缓冲液为：20mM pH 9.2的磷酸缓冲液。实验过程中毛细管电泳仪循环冷却液的温度为25℃。紫外检测器的检测波长为：200nm。

蛋白质样品阴离子聚合物接枝涂层毛细管柱上在线富集毛细管电泳分析操作如下：首先将蛋白质样品溶液压力进样，20psi，3min。随后，将毛细管两端置于装有洗脱缓冲液的缓冲瓶内，在毛细管两端加上-20kv的电压。观察毛细管内电流变化，当毛细管内电流值为32μA时，停止加压。这步操作可将进样过程中吸附在管壁的蛋白质洗脱并富集于毛细管进口处。最后，在毛细管柱两端加上20kV电压，对富集的蛋白质进行毛细管电泳操作。对蛋白质样品1的富集分析结果如图3所示，1μg/ml肌红蛋白仍有较大的检测信号。对蛋白质样品2的富集分析结果如图4所示，0.4μg/ml肌红蛋白和0.4μg/ml胰岛素的混合物用本发明介绍的方法可以同时实现富集及分离。

本发明提出的阴离子聚合物接枝涂层毛细管及用于蛋白质在线富集分析方法，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。