利用水稻转录因子OsbZIP23提高植物耐逆境能力

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控水稻抗逆境的转录因子基因OsbZIP23的克隆、功能验证及应用。本发明的特征是，OsbZIP23基因介导的赋予植物耐逆境能力的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO：1中第1－1828位所示的DNA序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列，也包括以合适启动子连接的本发明所述的转录因子基因的DNA序列。试验表明本发明克隆的基因在增加植物耐逆境能力方面具有良好应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。 所述的基因与植物耐逆境有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与玉米的组成型启动子 (Ubiquitin1)结合后直接转入一般植物体，转基因植株的脱落酸(ABA)敏感性和耐干旱和耐盐能力显著提 高。而OsbZIP23的T-DNA插入突变体对高浓度的ABA钝感，而且对干旱和高盐的耐性降低。

背景技术

植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱、盐害和低温往往导致农作物的大规模减产，在 许多地区是农业发展的瓶颈。为了抵抗或适应环境不利因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种 途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功 能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出相应的反应(Xiong 等Cell signaling during cold，drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。 而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到调控因子特别是转录因子的精细调节。而目前在 许多植物中发现AP2/EREBP，Zinc finger，Myb，bZIP和NAC类转录因子家族在不同的逆境胁迫下，可诱导 表达或被抑制，因而认为这些转录因子家族在植物对逆境的应答过程中起着非常重要的调控作用。因此分离 和鉴定对逆境起核心调控作用的转录因子，并用于作物抗逆境的遗传改良，对育种有着重要的意义。目前人 们已在植物抗性改良方面作了尝试，利用DREB1A和DREB2A培育的转基因拟南芥植株，其低温耐性和干旱， 高盐耐性都比野生型强(Liu Q等Two transcript ion factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.1998，10： 1391-1406.)。利用OsNAC1培育转基因水稻显著的提高了植株对干旱和高盐的耐受能力(Hu等Overexpressing a NAM，ATAF，and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice PNAS.2006，103：12987-12992.)

水稻是最重要的粮食作物之一，耐盐的水稻对申请人来说具有重要的意义，因而找出与耐干旱和耐盐相 关的功能基因，培育耐逆境的品种对提高水稻产量和种植面积具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是从水稻中分离克隆一个包含有耐逆境相关基因完整编码区段的DNA片段，利用这个基因 改良水稻或其它植物的抗逆性。对这个基因进行结构分析其属于植物bZIP转录因子家族，而且是与逆境相关 的，申请人将这个基因命名为OsbZIP23。

本发明涉及分离和应用一种包含OsbZIP23基因的DNA片段，该片段赋予植物在干旱、高盐等逆境条件下， 增强其耐受能力。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的高 度同源DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。

可以采用已经克隆的OsbZIP23基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。 同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的 OsbZIP23基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsbZIP23 基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得对高盐胁 迫耐受力得到增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任 何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子 区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的 翻译。

携带有本发明OsbZIP23基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射， 电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII， Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

可使用包括本发明的OsbZIP23基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育耐逆境的植物品 种。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的包含有OsbZIP23基因编码区DNA片段序列。

图1：OsbZIP23基因分离和鉴定流程图。

图2：用于水稻遗传转化的载体。将目标基因OsbZIP23序列通过BamHI和KpnI双酶切连接到图中标注 的相应酶切位点即得到OsbZIP23超量表达载体。

图3：图3A：用Northern检测OsbZIP23基因在干旱，高盐，低温胁迫和聚乙二醇(PEG)、脱落酸(ABA) 处理不同时间点的表达水平；图3B：实时定量PCR检测OsbZIP23基因在茉莉酸(JA)，水杨酸(SA)和2，4-D 等逆境胁迫不同时间点的表达水平；图3C：实时定量PCR检测OsbZIP23基因在不同组织中的表达量。

图4：OsbZIP23亚细胞定位和酵母生化试验。图4A：OsbZIP23亚细胞定位。其中图4A(i)(ii)为绿色荧 光下GFP表达的图像，(iii)(iv)为亮背景下的结果。图4A(i)(iii)为OsbZIP23的亚细胞定位结果，图4A(ii) (iv)为阳性对照的亚细胞定位结果。图4B：OsbZIP23转录激活功能验证。1、control A，2、control B，3、 control C，4、control D，5、control E，6、negative control，7、8、OsbZIP23pDEST32。C：N端和C端 缺失验证OsbZIP23转录激活区段。“+”和“-”表示X-gal显色的有无。

图5：OsbZIP23超量表达植株ABA敏感性检测。图5A：OsbZIP23超量表达T-DNA结构图。B：OsbZIP23 超量表达家系S20、S26、S35以及野生型对照(WT)在含0，1，2，3μmABA的培养基上发芽6天后的发芽 率统计。图5B-图5C：OsbZIP23在含3μmABA的培养基上生长14天后表型和生物量统计。

图6：OsbZIP23超量表达和突变体单株耐盐性检测。图6A，正常生长的OsbZIP23超量表达、突变体和 ZH11植株；图6B，盐胁迫后OsbZIP23超量表达、突变体和ZH11植株；图6C，盐胁迫后OsbZIP23超量表达、 突变体和ZH11绿叶面积统计。

图7：OsbZIP23超量表达植株耐干旱性能检测。图7A：OsbZIP23超量表达、突变体和ZH11植株PVC管 中严重干旱胁迫后的表型。图7B：OsbZIP23超量表达、突变体和ZH11植株PVC管中严重干旱胁迫后相对产 量统计。图7C：OsbZIP23超量表达家系和对照失水速率比较。

图8：OsbZIP23突变体植株ABA敏感性检测。图8A：OsbZIP23基因结构图和T-DNA插入位置。图8B- 图8C；OsbZIP23突变体家系及互补家系(compl.)以及野生型对照(WT)在含0，3，5，8μmABA的培养基 上发芽6天后的表型及发芽率统计。图8D：OsbZIP23突变体家系及互补家系(compl.)以及野生型对照(WT) 在含5μmABA的培养基上生长14天后生物量统计。

图9：实时定量PCR验证部分芯片数据。WT：野生型；OX1，OX2：两个独立超表达家系。以0s开头的编 号为TIGR数据库中水稻基因的系统编号。

具体实施方式

OsbZIP23基因的全长cDNA是从水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个 水稻品种)中扩增所得。OsbZIP23是一个抗逆境相关基因。主要依据有以下几个方面：(1)采用cDNA芯片技 术分析发现OsbZIP23(登录号为AK072062)对应的cDNA克隆在水稻品种“中旱5号”干旱胁迫处理后表达 量增加4.34倍，在盐胁迫后上升了10.91倍，在ABA处理后上升了3.73倍。(2)对其进行逆境条件下的表 达谱分析(图3)，发现在胁迫处理(干旱和盐胁迫)的过程中，表达量有明显的提高。(3)，将其全长基因在 植株中超量表达，转基因植株的脱落酸(ABA)敏感性、耐干旱和高盐的性能力大大增强(图7，8)。(4)将该 基因在植株中敲除，转基因植株的ABA敏感性、耐干旱和高盐的性能力下降(图7，8)(5)芯片杂交结果显示 OsbZIP23超量表达引起了大量抗逆基因的上升表达。这些结果都表明OsbZIP23基因是一个逆境相关调控基因， 参与植物对逆境的调控。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有OsbZIP23基因完 整编码区段的DNA片段以及验证OsbZIP23基因功能的方法(本发明流程如图1所示)。根据以下的描述和这 些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对 本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：分离克隆包含有OsbZIP23基因区段的DNA片段

通过水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的公开使用的一个水稻品种)的干旱诱导基因表达 谱分析，发现了一个受干旱强烈诱导(干旱胁迫后期表达量提高4.34倍以上)的基因，经序列分析发现，该 基因为bZIP转录因子家族的一个成员，其对应日本水稻全长数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)中 的cDNA克隆J013109E06。根据该克隆序列，设计引物OsbZIP23F(5’-TAAGGTACCATCCCACCTCTCCTCAGGTT-3’， 序列特异引物外加接头KpnI位点)和OsbZIP23R(5’-TAAGGATCCGGCAGCTTCACCATCCTACT-3’，序列特异引物外 外加接头BamHI)，将该克隆的序列从“中旱5号”品种中反转录扩增出来。扩增产物就是本发明的序列 67-1460bp。具体步骤为：采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)从干旱胁迫处理的水稻品种“中旱5号” 中提取叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶(购自Invitrogen公司)将其反 转录合成cDNA第一链。根据cDNA克隆J013109E06的序列设计的巢式引物将其从反转录产物中扩增出来，反 应条件为：94℃预变性2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃延伸5min。将扩增 获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。该克 隆被命名为PGEM-OsbZIP23。

实施例2：检测水稻内源基因OsCIK23的诱导表达

以水稻品种“中旱5号”为材料，在3叶期分别进行干旱、冷害和高盐胁迫以及脱落酸(ABA)，茉莉酸 (JA)，水杨酸(SA)，2，4-D和聚乙二醇(PEG)处理。干旱处理是将幼苗断水，并在0、3、6、12和24 小时后取样。冷害处理是将幼苗置于4℃生长箱，0、3、6、12和24小时后取样。高盐胁迫是将幼苗根部 浸泡在200mM/L NaCl溶液中并在0、5、14和24小时后取样。ABA处理是将幼苗根部浸泡在100μM/L ABA 溶液中并在0、3、6、12和24小时后取样。茉莉酸(JA)，水杨酸(SA)和2，4-D处理是将幼苗分别喷 施0.1μM/L的激素后分别在0、1、2、6和12小时后取样。PEG处理是将幼苗根部浸泡在20％的PEG6000溶 液中并在0、1、2、6和12小时后取样。提取叶片的总RNA(Trizol试剂，Invitrogen)后按《分子克隆》(科 学出版社，北京，1999年版)有关实验操作方法进行RNA转膜，并以OsbZIP23为探针做Northern杂交。由 于该基因本底表达较低，JA、SA和2，4-D是用实时定量PCR进行的。结果表明，本发明克隆的基因OsbZIP23 能被干旱、高盐和ABA、PEG诱导表达，但不受低温和其它激素诱导(如图3A-B所示)，是一个与逆境相关的 转录因子。

同时利用实时定量PCR申请人检测了OsbZIP23在各个组织的表达量，发现该基因在叶片中具有很高的表 达量(如图3C所示)。

实施例3，OsbZIP23亚细胞定位和酵母细胞的生化功能分析

利用洋葱表皮细胞的瞬时表达体系，申请人将包含预测为OsbZIP23核定位序列的cDNA片段同GFP融合， 通过玉米里的一个强启动子Ubiquitin的驱动在洋葱细胞表达，在荧光显微镜观察的结果说明OsbZIP23是一 个核蛋白(如图4A)。其基本程序为：将洋葱表皮细胞剥离并放置在常用的MS培养基上(如本说明书中的‘遗 传转化’部分所示)，将约1μg/μL的PUbiquitin：OsbZIP23-GFP融合表达质粒5μL在50μL金粉悬浮 液中在悬浮状态包被(依次加2.5mol/L氯化钙50μL，0.1mol/L亚精胺20μL)，无水乙醇清洗并重悬 后，利用基因枪(Bio-RAD，美国)将包被质粒的金粉打进洋葱表皮细胞内，28℃暗培养8-24h，在莱卡激 光共聚焦显微镜下观察、拍照记录。

OsbZIP23基因全长序列用引物(OsbZIP23y2hF：taagtcgacGATGGATTTTCCGGGAGGGA)和 (OsbZIP23y2hR：taagcggccgcTGGACCCGTCAGAGTCCT)扩增后，通过Sal I和Not I酶切连接到酵母 GALA-DB融合表达载体pDBLEU(购自Invitrogen公司)，将其转化酵母细胞MaV203(购自Invitrogen公司)， 经β-Galactosidase酶活性和colony-lift filter实验，发现转化的酵母细胞显蓝色，说明其能够激活报告基因LacZ 的表达(如图4B)，表明OsbZIP23蛋白具有转录激活功能。

为了鉴定OsbZIP23的转录激活功能域和准备下一步做蛋白互作的文库筛选，申请人分别从基因的N端和 C端进行了缺失，然后通过检测缺失片段的转录激活活性来确定其转录激活功能域。N端缺失的结果显示： OsbZIP23的转录激活的关键序列在其ORF的1-179bp，当缺失这一段后，OsbZIP23丧失了转录激活活性。从 C端开始缺失的结果显示：只有当OsbZIP23基因缺失了630-1069bp时，OsbZIP23才丧失转录激活活性，可 以推测630-720bp是OsbZIP23转录激活的关键序列。因此申请人认为OsbZIP23的转录激活活性受到两段序 列的控制，失去其中的任意一段，OsbZIP23就会失去转录激活活性(如图4C)。

实施例4，OsbZIP23基因超量表达载体的构建，转化

根据实施例2的结果，知道本发明基因OsbZIP23是能被干旱、高盐，PEG和ABA诱导表达的，为了能更 好地阐明此基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达，从转基因植株的表型来验证。方法是：首先将实施 例1中得到的阳性克隆pGEM-OsbZIP23质粒用BamHI和KpnI双酶切(见图2所示)，回收外源片段；同时，用 同样的方法酶切携带玉米强启动子Ubiquitin1的遗传转化载体pU1301(pU1301是在国际上常用的植物遗传转 化载体pCAMBIA1301，来自澳大利亚CAMBIA实验室，Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米强启动子Ubiquitin1 的农杆菌介导的遗传转化载体，酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含OsbZIP23 基因的酶切片段和酶切的pU1301载体(如图5A所示)做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(菌株购自Invitrogen 公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。

突变体互补载体的构建过程是这样的：

通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用 的一个水稻品种)中，经过预培养、浸染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽， 得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)基础上进行优化(遗传转化步骤、培养基及 培养筛选条件参见下面详细描述)。

将获得的转基因水稻植株被命名为S83。本发明总共获得独立转基因水稻植株34株。

农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系采用申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室建立的转化 体系(专利号ZL 200410013344.2；ZL 200410013345.7；专利申请号200610141702.7)。该体系的具体步骤 如下：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)； CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)； IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧 乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)； HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)； N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

硝酸钾(KNO₃)                        28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)                  4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)                   4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)                 1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)                 1.66g

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

碘化钾(KI)                          0.08g

硼酸(H₃BO₃)                         0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)                 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)                 0.15g

室温下溶解并定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶 解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

烟酸(Nicotinic acid)                0.1g

维生素B1(Thiamine HCl)              0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl)            0.1g

甘氨酸(Glycine)                     0.2g

肌醇(Inositol)                      10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

硝酸铵(NH₄NO₃)                      16.5g

硝酸钾                              19.0g

磷酸二氢钾                          1.7g

硫酸镁                              3.7g

氯化钙                              4.4g

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

碘化钾                              0.083g

硼酸                                0.62g

硫酸锰                              0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)               0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)                 0.0025g

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取2，4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml， 于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml， 4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml，4℃保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g。在另一个大 三角瓶中加入300ml蒸馏水用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(10X)                        100ml

N6mix母液(100X)                       10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)                  10ml

维生素贮存液(100X)                    10ml

2，4-D贮存液                          2.5ml

脯氨酸(Proline)                       0.3g

CH                                    0.6g

蔗糖(Sucrose)                         30g

Phytagel                              3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25 ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X)                        100ml

N6mix母液(100X)                       10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)                  10ml

维生素贮存液(100X)                    10ml

2，4-D贮存液                          2.0ml

脯氨酸                                0.5g

CH                                    0.6g

蔗糖                                  30g

Phytagel                              3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml /瓶)，封口灭菌。3)预培养基

N6max母液(10X)                    12.5ml

N6mix母液(100X)                   1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              2.5ml

维生素贮存液(100X)                2.5ml

2，4-D贮存液                      0.75ml

CH                                0.15g

蔗糖                              5g

琼脂粉(Agarose)                   1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/ 皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X)                 12.5ml

N6mix母液(100X)                1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)           2.5ml

维生素贮存液(100X)             2.5ml

2，4-D贮存液                   0.75ml

CH                             0.2g

蔗糖                           5g

琼脂粉                         1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/ 每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X)                    5ml

N6mix母液(100X)                   0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              0.5ml

维生素贮存液(100X)                1ml

2，4-D贮存液                      0.2ml

CH                                0.08g

蔗糖                              2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X)                25ml

N6mix母液(100X)               2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)          2.5ml

维生素贮存液(100X)            2.5ml

2，4-D贮存液                  0.625ml

CH                            0.15g

蔗糖                        7.5g

琼脂粉                      1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X)                25ml

N6mix母液(100X)               2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)          2.5ml

维生素贮存液(100X)            2.5ml

6-BA贮存液                    0.5ml

KT贮存液                      0.5ml

NAA贮存液                     50μl

IAA贮存液                     50μl

CH                            0.15g

蔗糖                          7.5g

琼脂粉                        1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X)                100ml

N6mix母液(100X)               10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)          10ml

维生素贮存液(100X)            10ml

6-BA贮存液                    2ml

KT贮存液                      2ml

NAA贮存液                     0.2ml

IAA贮存液                     0.2ml

CH                            1g

蔗糖                          30g

Phytagel                      3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X)                50ml

MSmix母液(100X)               5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)          5ml

维生素贮存液(100X)            5ml

蔗糖                          30g

Phytagel                      3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

4.1愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子(中花11，中国农业科学院作物科学研究所)去壳，然后依次用70％的 乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

(2)用灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

4.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

4.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

4.4农杆菌培养

(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)

两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

4.5农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

4.6愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400ppm，第 二 次以后为250ppm)

4.7分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，在培养室温度26℃下每天光照培养14小时(光照强度 1000-15001ux)，暗培养10小时。

4.8生根

(1)剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，培养条件同4.7的步骤(2)所述。

4.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

实施例5；OsbZIP23基因转基因T₂家系对ABA敏感性的检测

为了确定超量表达OsbZIP23基因是否也会提高转基因植株发芽时的ABA敏感性，申请人将野生型、阴性 对照和转基因家系的种子去壳消毒，将状态一致的种子放到分别含有浓度为0、1、2、3μmol/L ABA的MS培 养基生长，三天后开始每天观察种子的发芽率。结果申请人发现在ABA存在下，转基因植株发芽率明显低于 对照，说明超量表达OsbZIP23的转基因植株的发芽受到抑制(图5)。也就是说超量表达OsbZIP23导致转基 因植株发芽时对ABA的敏感性增强。

为了确定超量表达OsbZIP23基因是否也会提高转基因植株苗期生长对的ABA敏感性，申请人将野生型、 阴性对照和转基因家系的种子去壳消毒，在含有100mg/L潮霉素的MS培养基发芽后，将长势一致的幼芽转 至含有浓度为0μmol/L和3μmol/L ABA的MS培养基生长，分别测量生长1星期后的每株幼苗的根长和株高。 如图5所示，申请人发现在3μmol/L ABA存在下，转基因植株的根长和株高都明显短于对照，说明超量表达 OsbZIP23的转基因植株的生长受到抑制。也就是说超量表达OsbZIP23导致转基因植株生长时对ABA的敏感性 增强。

综上所述，OsbZIP23的超量表达在发芽和生长两个方面提高了植株对ABA的敏感性。

实施例6；OsbZIP23基因转基因T₂家系苗期耐盐性筛选

为了验证转基因水稻植株的耐盐性是否增强以及其增强是否与转入的OsbZIP23基因有关，本发明T2代 植株的部分家系进行了耐盐性筛选。具体步骤如下：申请人在小红桶中对植株进行了高盐胁迫处理。首先对 小红桶生长3个星期的植株，断水，表层干时，用200mmol/L NaCl溶液代替水浇灌小红桶，每3天浇灌一 次。在NaCl处理7d时，申请人观察到对照植株叶片已萎焉并开始失绿，转基因植株却才开始出现叶片萎焉； 在NaCl处理12d后，统计了各家系的植株叶片的绿叶面积并照相。从统计数据可看出，在200mmol/L NaCl 处理12d后，对照植株的绿叶面积只有35％，但转基因家系却还有85％以上的绿叶，说明OsbZIP23超量表 达提高了转基因植株的耐盐性(图6)。

实施例7：OsbZIP23基因转基因T₂家系成株期耐旱性筛选

本试验是在PVC管中进行了干旱胁迫试验，设2个重复，每个重复每个家系12株；对转基因植株在抽穗 灌浆期进行了胁迫，胁迫到抽穗基本完成后，复水让其继续生长。具体的胁迫方法详见材料与方法。从图21 可以看出，转基因植株在严重干旱胁迫复水后，还能恢复继续生长，而野生型叶片死亡较多，已不能恢复正 常。待水稻成熟后，对正常生长和胁迫生长的材料进行了考种，从统计结果可看出，在正常条件下，转基因 超量表达家系和野生型对照之间的结实率和单株产量有一定的差异。正常条件下，野生型的结实率有90.38％， 转基因的家系的结实率大约有70％，这可能是由于转基因过程(组培)引起的。在配有大棚的PVC管中干旱胁 迫后，野生型对照的结实率降为36％左右，而转基因超量表达家系的结实率还保持在60％以上，差异极其显 著。从每株的相对产量来看，在配有大棚的PVC管中干旱胁迫后，野生型对照的每株相对产量为15.29％左右， 而转基因超量表达家系的结实率还保持在50％以上，这些统计结果都表明在干旱胁迫下OsbZIP23超量表达转 基因家系比阴性对照或野生型植株有更高的结实率，具有更强的抗旱性(如图7A-B所示)。

一般来说，耐干旱的植物会在干旱条件下保持较低的水分蒸腾，维持生物体内正常生理活动所需的水分。 申请人取四叶期正常生长的水稻叶片在离体的条件检测了它们失水速率。申请人把水稻叶片剪下来，在室温 的条件下，分别在0、0.5、2、4、6、8、12和24小时在千分之一天平上称重，然后计算它们失水的速率。 实验结果如图7C所示，OsbZIP23超量表达植株能在干旱的条件下维持较低的水分丧失速率，大约比野生型对 照低5％左右。离体检测24小时后，两者基本没有差异，说明此时两者都已经丧失了保持水分的能力。以上结 果说明，OsbZIP23超量表达使植株能更好的保持体内的水分。

实施例8：OsbZIP23突变体的分离及表型鉴定

在突变体数据库RMD(http://rmd.ncpgr.cn/)中，申请人找到了OsbZIP23的T-DNA插入突变体osbzip23， 突变体编号为04Z11IJ69，经过基因型检测确定T-DNA插在OsbZIP23的第二个内含子区域(如图8A所示)。 通过实时定量PCR检测表达量，发现该基因的表达量只有背景信号，说明该基因已经被完全抑制，这个突变 体为申请人从另一个角度研究这个基因的功能提供了便利。

8.1 OsbZIP23突变体植株ABA敏感性分析

为了确定OsbZIP23基因的敲除是否也会影响转基因植株发芽时的ABA敏感性，申请人将野生型和突变体 家系的种子去壳消毒，将状态一致的种子放到分别含有浓度为0、3、5、8μmol/L ABA的MS培养基生长，三 天后开始每天观察种子的发芽率。结果申请人发现在ABA存在下，，突变体植株发芽率明显高于对照(图8B-C)， 说明敲除OsbZIP23基因植株的发芽受到抑制的程度要远低于对照。

为了确定敲除OsbZIP23基因是否也会提高转基因植株生长的ABA敏感性，申请人将野生型和突变体家系 的种子去壳消毒，在含有100mg/L潮霉素的MS培养基发芽后，将长势一致的幼芽转至含有浓度为0μmol/L 和5μmol/L ABA的MS培养基生长，分别测量生长1星期后的每株幼苗的根长和株高。图8D所示，申请人发 现在5μmol/L ABA存在下，突变体的生长量要明显高于对照。由于正常条件下，OsbZIP23的株高要短于对 照，因此申请人用在ABA存在的条件下植株的相对生长量来衡量植株受ABA抑制的程度，实验结果显示在5 μmol/L ABA存在的条件下，野生型的相对生长量只有20％，而OsbZIP23的相对生长量达到50％以上。

当申请人将该突变体互补以后，申请人发现互补突变体的ABA钝感得到了恢复。以上结果说明OsbZIP23 在植株ABA信号传导过程中起着重要的作用，它的敲除降低了植株对ABA的敏感性。

8.2 OsbZIP23突变体植株苗期抗盐性和抗旱性分析

同OsbZIP23超量表达耐盐性检测一样，申请人在小红桶中对植株进行了高盐胁迫处理。植株长到四叶期后， 用200mmol/L NaCl溶液代替水浇灌小红桶，每3天浇灌一次。在NaCl处理5天时，申请人观察到突变体植 株叶片已萎焉并开始失绿，野生型植株却才开始出现叶片萎焉；在NaCl处理12天后，统计了各家系的植株 叶片的绿叶面积并照相。从统计数据可看出，在200mmol/L NaCl处理12天后，对照植株的绿叶面积有35％， 但突变体家系只有15％左右的绿叶(如图6所示)，说明突变体植株的耐盐性下降了。OsbZIP23突变体植株成 株期干旱后没有明显的表型变化，但考种结果显示在配有大棚的PVC管中干旱胁迫后，野生型对照的每株相 对产量为15.29％左右，而突变家系的结实率只有6.63％(如图7所示)，说明突变体植株的耐旱性下降了。 以上结果说明OsbZIP23的敲除影响了植株的耐盐性和耐旱性。

实施例9 OsbZIP23转基因植株的基因表达谱分析

OsbZIP23是个转录因子，可能调控许多下游基因的表达，将其在植物超量表达后，应会引起植物中许多 基因表达量的变化。为了确定哪些基因表达量有变化或者哪些可能是OsbZIP23调控的下游靶基因，本研究利 用DNA chip技术分析了转基因植株和野生型植株的基因表达谱，通过基因表达的差异，来预测OsbZIP23的 可能下游靶基因。申请人将正常种植的2个OsbZIP23超量表达家系和1株野生型植株RNA与Affimatrix寡 核苷酸的水稻全基因组芯片杂交，来比较转基因植株和野生型植株的基因表达谱差异。

统计分析发现OsbZIP23超量表达植株与野生型对照相比，基因表达量上升的有237个基因，对这些差异 表达的基因进行功能预测和分类，并在实验室已发表和未发表的逆境胁迫(干旱，盐，ABA)芯片数据中查看 了这些基因的表达情况，申请人发现上升表达的基因中大约有80％的基因编码一些参与逆境应答反应的蛋白， 比如调控蛋白(包括转录因子，蛋白激酶和磷酸化酶)，编码渗透调节产物基因(LEA蛋白、脱水蛋白、脂质 转运子、P450蛋白等)，参与脱毒和还原反应的蛋白和一些保护大分子的蛋白。还有一些上升表达的基因功能 未知。

同时对OsbZIP23突变体芯片杂交中下降表达的基因也进行了分析，OsbZIP23突变体植株下降表达的基 因有80个，同样对这些下降表达的基因进行功能预测和分类，并在实验室已发表和未发表的逆境胁迫(干旱， 盐，ABA)芯片数据中查看了这些基因的表达情况，结果显示，在突变体中，一些表达下降的基因是受到干旱、 盐或ABA诱导的。

为了验证芯片结果的可靠性以及对启动子序列分析的正确性，本研究还对部分基因在转基因植株中的表 达量进行了分析(如图9所示)，结果显示在超量表达转基因植株中这些基因的表达量确实是上升的而在突变 体中大都没有变化或下降表达，个别的表达量有略微的上升。说明OsbZIP23确实能调控一系列与逆境相关基 因的表达，从而应对不利环境。

序列表

110>华中农业大学

<120>利用水稻转录因子OsbZIP23提高植物耐逆境能力

<130>

<141>2008-05-15

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1828

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1828)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(218)..(1288)

<223>

<400>1

ggtccggttt cctctcctcg cctcgccgcg gcgcccgcgt cctcctcacc aacgccagag     60

ctccacatcc cacctctcct caggttcccg tctctgatcc ctcgttgcgt tacggggaag    120

caggcgtggt ggttgctccc cgtgcggagt tttcgattgg tttggttggg tgagtttggt    180

gctggggtgt tggggattgg ttggttggag tttggag atg gat ttt ccg gga ggg     235

                                         Met Asp Phe Pro Gly Gly

                                         1               5

agc ggg agg cag cag cag ctg ccg ccg atg acg ccg ctg ccg ttg gcg      283

Ser Gly Arg Gln Gln Gln Leu Pro Pro Met Thr Pro Leu Pro Leu Ala

            10                  15                  20

agg cag ggg tcg gtg tac tcg ctc acg ttc gac gag ttc cag agc acg      331

Arg Gln Gly Ser Val Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Phe Gln Ser Thr

        25                  30                  35

ctg ggc ggg gtc ggg aag gac ttc ggg tcg atg aac atg gac gag ctc      379

Leu Gly Gly Val Gly Lys Asp Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Leu

    40                  45                  50

ctc cgc agc atc tgg acg gcc gag gag tcg cac gcc gtc ggc gcc gcc      427

Leu Arg Ser Ile Trp Thr Ala Glu Glu Ser His Ala Val Gly Ala Ala

55                  60                  65                  70

acg acg acg acg gcg acg acg gcg tcc gtg gcg gcg gcg gag cac gcg      475

Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ser Val Ala Ala Ala Glu His Ala

                75                  80                  85

gcg gtg ggg gcg ccg ccc gtt cag agg cag ggg tcg ctg acc ctc ccc      523

Ala Val Gly Ala Pro Pro Val Gln Arg Gln Gly Ser Leu Thr Leu Pro

            90                  95                  100

cgc acg ctc agc cag aag acc gtc gac gag gtc tgg cgc gac atg atg    571

Arg Thr Leu Ser Gln Lys Thr Val Asp Glu Val Trp Arg Asp Met Met

        105                 110                 115

tgc ttc ggt ggc ggc ggc gcc tcc acc gcg ccg gcc gcc gcg gag ccc    619

Cys Phe Gly Gly Gly Gly Ala Ser Thr Ala Pro Ala Ala Ala Glu Pro

    120                 125                 130

ccg ccg ccg gcg cac cgg cag cag acg ctc ggg gag atc acg ctg gag    667

Pro Pro Pro Ala His Arg Gln Gln Thr Leu Gly Glu Ile Thr Leu Glu

135                 140                 145                 150

gag ttc ctc gtg cgg gcc ggc gtg gtg agg gag gac atg tcg gtc ccg    715

Glu Phe Leu Val Arg Ala Gly Val Val Arg Glu Asp Met Ser Val Pro

                155                 160                 165

ccc gtc ccg ccg gcg ccg act cct acg gcg gct gct gta cct ccc ccg    763

Pro Val Pro Pro Ala Pro Thr Pro Thr Ala Ala Ala Val Pro Pro Pro

            170                 175                 180

ccg ccg ccg cag cag cag acg ccg atg ttg ttc ggt cag agc aat gtg    811

Pro Pro Pro Gln Gln Gln Thr Pro Met Leu Phe Gly Gln Ser Asn Val

        185                 190                 195

ttc cct ccg atg gtg cct ccg ctc tcg ctg gga aat ggg ctg gtc tcg    859

Phe Pro Pro Met Val Pro Pro Leu Ser Leu Gly Asn Gly Leu Val Ser

    200                 205                 210

gga gct gtc gga cac ggc ggt ggt ggt gcc gcg tcg ttg gtt tcg ccg    907

Gly Ala Val Gly His Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ser Leu Val Ser Pro

215                 220                 225                 230

gtg agg ccg gtc tcg tcc aat ggc ttc ggc aag atg gaa ggc ggg gac    955

Val Arg Pro Val Ser Ser Asn Gly Phe Gly Lys Met Glu Gly Gly Asp

                235                 240                 245

ctg tcg tcg ctg tcg cca tcg ccg gtg ccg tac gtt ttc aaa ggt ggg   1003

Leu Ser Ser Leu Ser Pro Ser Pro Val Pro Tyr Val Phe Lys Gly Gly

            250                 255                 260

ctg agg gga agg aag gca ccg ggc atc gag aag gtt gtc gag aga aga   1051

Leu Arg Gly Arg Lys Ala Pro Gly Ile Glu Lys Val Val Glu Arg Arg

        265                 270                 275

cag cgg cgg atg atc aag aac agg gag tct gcc gcg agg tcg cgc cag   1099

Gln Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Gln

    280                 285                 290

agg aaa cag gca tat atg atg gaa ttg gaa gct gag gta gca aaa ctt   1147

Arg Lys Gln Ala Tyr Met Met Glu Leu Glu Ala Glu Val Ala Lys Leu

295                 300                 305                 310

aag gag ctg aac gat gaa ctc cag aaa aag cag gat gaa atg ttg gag    1195

Lys Glu Leu Ash Asp Glu Leu Gln Lys Lys Gln Asp Glu Met Leu Glu

                315                 320                 325

cag caa aag aat gag gtt cta gag aga atg agc cga caa gtt gga ccg    1243

Gln Gln Lys Asn Glu Val Leu Glu Arg Met Ser Arg Gln Val Gly Pro

            330                 335                 340

aca gca aag aga att tgc ctt cgg agg act ctg acg ggt cca tgg        1288

Thr Ala Lys Arg Ile Cys Leu Arg Arg Thr Leu Thr Gly Pro Trp

        345                 350                 355

tgatcgaagc taaaggccta gttacctgta actagaacac agtcctttca atgtgagcag  1348

tgatcatagt agttgtagga tggtgaagct gaagacctgg ttacctgtaa ctagaacaca  1408

gtcctttcaa agtgagcagt gattacagta gtagtaggat ggtgaagctg ccagttacct  1468

gtaactagaa cacagtcctt tcaaagtgag tatagtagta ggttagttca gaatcgccag  1528

atcgatctgc ccttgtaggc caaccattag tccgtgggct tgtctcttgg gcggacaggc  1588

tgcctgagat attcactcga taggttttag ttgtctgagt tatatccaag cattgtatgt  1648

aacctattta accatggtgc ctgctacctg tattgtattt tgctgctgta ggaacctatg  1708

tcggtgttac catcttgttc ttaatttgtg tacttctctt gccattttgg ataagatgta  1768

tctgaactta tacatatgta cttttccttg ccattttgga caagatgtat ctgaatttac  1828

<210>2

<211>357

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Asp Phe Pro Gly Gly Ser Gly Arg Gln Gln Gln Leu Pro Pro Met

1               5                   10                  15

Thr Pro Leu Pro Leu Ala Arg Gln Gly Ser Val Tyr Ser Leu Thr Phe

            20                  25                  30

Asp Glu Phe Gln Ser Thr Leu Gly Gly Val Gly Lys Asp Phe Gly Ser

        35                  40                  45

Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Arg Ser Ile Trp Thr Ala Glu Glu Ser

    50                  55                  60

His Ala Val Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ser Val

65                  70                  75                  80

Ala Ala Ala Glu His Ala Ala Val Gly Ala Pro Pro Val Gln Arg Gln

                85                  90                  95

Gly Ser Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Gln Lys Thr Val Asp Glu

            100                 105                 110

Val Trp Arg Asp Met Met Cys Phe Gly Gly Gly Gly Ala Ser Thr Ala

        115                 120                 125

Pro Ala Ala Ala Glu Pro Pro Pro Pro Ala His Arg Gln Gln Thr Leu

    130                 135                 140

Gly Glu Ile Thr Leu Glu Glu Phe Leu Val Arg Ala Gly Val Val Arg

145                 150                 155                 160

Glu Asp Met Ser Val Pro Pro Val Pro Pro Ala Pro Thr Pro Thr Ala

                165                 170                 175

Ala Ala Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gln Gln Thr Pro Met Leu

            180                 185                 190

Phe Gly Gln Ser Asn Val Phe Pro Pro Met Val Pro Pro Leu Ser Leu

        195                 200                 205

Gly Asn Gly Leu Val Ser Gly Ala Val Gly His Gly Gly Gly Gly Ala

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Val Ser Pro Val Arg Pro Val Ser Ser Asn Gly Phe Gly

225                 230                 235                 240

Lys Met Glu Gly Gly Asp Leu Ser Ser Leu Ser Pro Ser Pro Val Pro

                245                 250                 255

Tyr Val Phe Lys Gly Gly Leu Arg Gly Arg Lys Ala Pro Gly Ile Glu

            260                 265                 270

Lys Val Val Glu Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser

        275                 280                 285

Ala Ala Arg Ser Arg Gln Arg Lys Gln Ala Tyr Met Met Glu Leu Glu

    290                 295                 300

Ala Glu Val Ala Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Glu Leu Gln Lys Lys

305                 310                 315                 320

Gln Asp Glu Met Leu Glu Gln Gln Lys Asn Glu Val Leu Glu Arg Met

                325                 330                 335

Ser Arg Gln Val Gly Pro Thr Ala Lys Arg Ile Cys Leu Arg Arg Thr

            340                 345                 350

Leu Thr Gly Pro Trp

        355