含木轮毂刺桐衍生物的药物组合物以及生产这些物质的方法

摘要

本发明提供分子对于胆碱能、5－羟色胺能和/或γ－氨基丁酸能系统模型的用途，给出了用于治疗焦虑症的药物组合物，所述组合物包含11－OH－erythravine、erythravine、刺桐亭和/或它们的可药用的电子等排体、盐、副产物和/或溶剂合物，任选地包含其他刺桐副产物；还给出了用于获得所述药物组合物的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及对胆碱能、5-羟色胺能和/或γ-氨基丁酸能系统起作用的分子。更具体而言，本发明涉及可用于制备抗焦虑药物的刺桐副产物(Erythrine byproduct)。还提供了含有所述分子的药物组合物以及制备所述药物组合物的方法。

背景技术

木轮毂刺桐(Erythrina mulungu)(蝶形花科(Papilionaceae)-豆科(Leguminoseae))为具有红色花朵的木本植物(高10-14米)，生长在巴拉那盆地的半落叶性阔叶森林以及主要在圣保罗州的西部地区和米那斯三角洲的灌木丛林地区(LORENZI，1992)。该植物的树皮被当地人用作安定药和镇静药。一般称之为木轮毂(mulungu)、珊瑚树、珊瑚木轮毂和珊瑚灌木(种族名称包括capa-homem，suiná-suiná，tiriceiro等)(LORENZI，1992)。巴西出产八个品种的刺桐：木轮毂刺桐(E.mulungu)、E.velutina、鸡冠刺桐(E.crita-galli)、E.poeppigiana、褐花刺桐(E.fusca)、E.falcata、象牙花(E.speciosa)和E.verna(LORENZI，1992)。

已进行很多工作以确认该刺桐属的其他物种的植物化学(fitochemical)和药理学性质，所述其他物种还因为被广泛地用作镇静药、安定药并且还用作轻泻剂、抗炎剂和抗利尿剂而广为人知(-AGUILAR et al.，2000)。尽管对木轮毂刺桐种的研究很少，但其提取物是巴西和国际药物市场上销售的植物治疗制剂的部分成分，由于缺乏与所述产品质量相关的标准，可能会对所述消费者的健康造成危险。

植物化学(Fitochemistry)

对刺桐属种的研究产生兴趣始于1877年，当时Domínguez和Altamirano发现美国刺桐(E.americana)的种子提取物的药理学作用与右旋氯筒箭毒碱(从南美防己(Chondodendron tomentosum)中提取得到的物质)的作用相似(HARGREAVES et al.，1974；HIDER et al.，1986；-AGUILAR et al.，2000)。此后进行了对不同刺桐物种的提取物的植物化学和药理学性质的研究。数年之后，在确认了不同刺桐物种的提取物所展示的药理学作用后，研究致力于分离和鉴定这类植物中的生物碱(SARRAGIOTO et al.，1981)。直到此时药理学测试依然是用粗提产物进行。1937年，Folkers和Major(1937)对美国刺桐(E.americana Mill.)的种子进行了化学研究，并分离了结晶生物碱-刺桐定(erythroidine)，刺桐定呈现出与右旋氯筒箭毒碱相似的胆碱能活性。随后的分析(BOEKELHEIDE and GRUNDON，1953；BOEKELHEIDE etal.，1953)表明刺桐定是命名为α-刺桐定和β-刺桐定的两种同分异构生物碱的混合物，后者由于其能够拮抗外周的烟碱受体而具有胆碱能活性(HARGREAVES et al.，1974；HIDER et val.，1986；-AGUILAR，et al.，2000)。

分离了美国刺桐的α和β-刺桐定，并且发现了其药学性质之后，有大量的研究兴趣针对其他种的刺桐，并分离出新的刺桐骨架生物碱(FOLKERS and KONIUSZY，1940；FOLKERS et al.，1944；BOEKELHEIDEand GRUNDON，1953；BOEKELHEIDE et al.，1953；TANDON et al.，1969；ITO et al.，1970；BARTON et al.，1970；GHOSAL，1970；GHOSAL etal.，1971；ITO et al.，1971；MIANA et al.，1972；GHOSAL et al.，1972a，b；BARTON et al.，1973；ITO et al.，1973，a，b，c，d；GHOSALand SRIVASTAVA，1974；MILLINGTON et al.，1974；GAMES et al.，1974；ITO et al.，1976；BARAKAT et al.，1977；EL-OLEMY et al.，1978；AHMAD et al.，1979；TIWARI and MASSOD，1979a，b；SARRAGIOTO et al.，1981)。

对刺桐生物碱的基本结构的了解可通过降解和合成实现(GRUNDONand BOEKELHEIDE，1953；GRUNDON et al.，1953；WEINSTOCK andBOEKELHEIDE，1953；BOEKELHEIDE et al.，1953)。证实了这些生物碱的结构中存在螺旋胺骨架(spiroaminic skeleton)，所述碱具有如下通式，有助于后面对新化合物的鉴定。

对该结构的了解有助于随后鉴定新的化合物。目前，已知有三类刺桐生物碱：1)二烯类(Dienoid)代表A环和B环中的二烯系统；2)生物碱在A环中具有双键Δ^1，6；3)第三组刺桐碱包括：刺桐二烯酮碱(erysodienone)、3-去甲氧基刺桐替定酮碱(3-desmethoxyerythratidinone)、α-刺桐定和β-刺桐定。还分离了并不存在刺桐骨架的某些刺桐物种的一些生物碱，这些生物碱包括：东罂粟灵(orientaline)、N-降东罂粟灵(N-Noorientaline)、原汉防已碱(protosinomenine)、N-降原汉防己碱(N-Norprotosinomenine)、异波尔定碱(isoboldine)、刺桐双定(erybidine)、scoureline、异种荷包牡丹碱(coreximine)、hypaforin、可啉。

使用由干花制得的乙醇提取物对木轮毂刺桐进行植物化学研究分离得到五种生物碱(erysothrina、N-erysothrina oxide、刺桐阿亭(erythrartine)、N-氧化刺桐阿亭(N-erythrartine oxide)和hypaforin)和萜类化合物fithol(SARRAGIOTO et al.，1981；SARRAGIOTO，1981)。最近的植物化学研究表明刺桐物种还富含其他类物质，如黄烷酮、异黄烷酮、异黄酮和紫檀碱(pterocarpane)(DA-CUNHAet al.，1998；TANAKA et al.，1996，1997a，b；1998；2001；OH et al.，1999；YENESEW et al.，2000；NKENGFACK et al.，2001)。

药理学活性

刺桐的主要药理学作用是其对胆碱能系统的外周活性，该活性已与右旋氯筒箭毒碱的作用相比较(HARGREAVES et al.，1974；HIDER et al.，1986；-AGUILAR，et al.，2000)。该作用归因于生物碱二氢-β-刺桐定(DHBE)，它是从美国刺桐(E.americana)(BOEKELHEIDE andGRUNDON，1953；BOEKELHEIDE et al.，1953)和E.tholloniana(CHAWLAet al，1985)分离获得的烟碱样拮抗剂受体(HIDER et al.，1986)。近来，在一个体外实验中，DHBE被表征为5-羟色胺3拮抗剂受体(5-HT₃)(et al.，1993)。在其他研究中也观察到了所述5-羟色胺能系统的活性(ROGER et al.，2001)，在文中作者已经证明E.vespertilio的粗提取物抑制血小板血清素的钙依赖释放，这种抑制作用是所述5-HT₃受体拮抗剂的主要的活性之一。然而，所述工作的大多数仍然是使用不同种的刺桐的粗提取物完成的，没有对被观察到活性的物质进行鉴定。作为对所述中枢神经系统活性的实例，可以提及抗惊厥、催眠、麻醉、镇静和抗焦虑效果(GHOSAL et al.，1972；HARGREAVES et al.，1974；RATNASOORIYA and DHARMASIRI，1999；ONUSIC et al.，2002，2003)。

对E.velutina的研究表明，用水醇提取物(hydroalcoholicextract)短暂处理降低了小鼠在旷场试验中的活动情况(剂量为250和500mg/kg，口服摄入)，并且还增加了由戊巴比妥引起的睡眠时间以及毛果云香碱引起惊厥的起始时间(剂量为500和1000mg/kg，口服摄入)，这表明它对中枢神经系统有抑制作用(CABRAL et al.，2000)。另一项研究工作(-AGULIAR et al.，2000)表明，与地西泮相似，用美国刺桐的己烷(hexanic)级分短暂处理(3mg/kg，i.p)降低了雄性小鼠的攻击行为。最近，对木轮毂刺桐的水醇提取物的研究(ONUSIC etal.，2002)观察到，在高架式T迷宫试验的抑制逃避学习中，用200mg/kg的剂量短暂处理(口服摄入)表现出对小鼠的抗焦虑作用，这与苯二氮卓类抗焦虑药(BDZ)-地西泮的作用相当。ONUSIC及其同事(2002)还在明暗箱模型中观察到相同剂量木轮毂刺桐的抗焦虑效果，包括在两模型箱之间的穿越次数以及在明箱里停留的时间方面。另一项研究工作表明，通过口服摄入剂量为50、100和200mg/kg的木轮毂提取物的长期处理(9天)，在抑制逃避学习和从高架式T迷宫的开放臂逃避中表现出抗焦虑效果(ONUSIC et al.，2003)。在明暗箱模型中，剂量为50mg/kg的木轮毂刺桐提取物在长期处理14天后也表现出抗焦虑效果(ONUSICet al.，2003)。

尽管已有很多方法，但是迄今为止，目前并没有报道将分离得到的刺桐活性成分通过标准的制剂方法(或者以粗提取物或者以纯化组分的形式)或通过进行化学合成开发为抗焦虑药剂，也没有任何制备该药剂的方法。

发明内容

本发明的一个目标是提供含有来自所述刺桐属植物的物质的标准化的药物组合物。在一方面，本发明的所述药物组合物可以包含标准的粗提取物、刺桐生物碱富集纯化的级分(F2)或分离的生物碱刺桐阿亭(erytrartine)、erytravine和11-OH-erytravine，或者还有它们组成的能够直接或间接地作用于所述胆碱能的、5-羟色胺能和γ-氨基丁酸能系统的组合物。

在另一方面，可以提供一种获得所述相关的药物组合物的方法，以及包含它们的药物组合物。

在一方面，本发明所述粗提取物、所述生物碱的富集纯化级分(F2)和所述分子在动物模型中已经显示作为抗焦虑剂的活性。因此，本发明的一个目的是提供与焦虑或其他需要使用抗焦虑剂的临床表现相关的紊乱的治疗中使用的提取物、级分和/或分子。

在另一方面，所述标准化的粗提取物的制备、所述生物碱的富集纯化级分(F2)和所述分子的分离和结构描述，以及本发明的药理学活性的评估，使得用于焦虑紊乱治疗中的标准化的药物组合物的开发成为可能。因此，本发明的另一个目标是提供包含具有抗焦虑性质的天然制剂和分子的药物组合物。

在又一方面，本发明所述提取物的制备、所述纯化的级分和分子的分离和/或合成可以提供制备药物组合物的方便的方法，所述药物组合物包含所述的天然制剂和/或分子。因此，本发明的一个另外的目的是提供生产药物组合物的方法。

附图说明

图1示出木轮毂刺桐水醇粗提产物的提取和分级以及使用木轮毂刺桐水醇粗提产物分离生物碱刺桐阿亭、erythravine和11-OH-erythravine的步骤的总体示意图。

具体实施方式

就本发明的目的而言，“药物组合物”应该意味着含有活性成分、具有预防、姑息和/或治疗目的、起着维持和/或恢复稳态作用的全部和任何一种组合物，并且可被外部给药、肠胃外给药、肠内给药和/或鞘内给药。

本发明中所说的药物组合物属于刺桐副产物类，包括11-OH-erythravine和/或其可药用的电子等排体(isotheral)、盐、副产物和/或溶剂合物，任选地包含从粗提取物或者从木轮毂刺桐的所述纯化的级分或从化学合成中分离的刺桐阿亭和/或erythravine。

本发明化合物的治疗应用在多个阶段进行。下文给出的所进行实验及其各自的结果仅为示例性的，并不限定所附权利要求的范围。

实施例1：植物化学

植物收集和提取物制备

在冬季例如在阿拉拉夸拉(Araraquara)(SP)地区收集成年树的花。通过采用乙醇/水(EtOH/H₂O)(7∶3)的浸渍法对新鲜植物材料(6kg)处理7天进行提取。然后过滤提取物并借助旋转蒸发器将其浓缩，得到292g干燥水醇提取物。

它在总生物碱中的标准化根据药物方法通过中和的容积进行，并且确定在生物碱中至少包含0.1％的erythravine。

所述化学组成的生物监控分级和分离

进行酸碱萃取以纯化所述粗提取物并产生一个具有最优刺桐生物碱浓度的级分。为实现该目的，将干的水醇提取物(120g)溶于乙酸的水溶液(10％)中，并用氯仿(CHCl₃)进行液/液萃取。

将氯仿相与水相分离并将溶剂蒸发得到级分1(7.83g)。然后，用足以获得9-10之间pH的体积的氢氧化铵(NH₄OH)碱化水相，然后再用CHCl₃萃取。

将氯仿相分离并将溶剂蒸发得到富含生物碱的纯化的级分2(F2)(670mg)。通过HPLC技术评估该级分，并且被标定为至少包含20％的总生物碱和10％的erythravine。所述F2也可以被应用于高架式T迷宫(高架式T迷宫)的药理学测试中。

实施例2：色谱法、仪器操作和光谱测定法

使用Degree溶剂用于“分析”。

为进行分析，使用二氧化硅薄层色谱法(CCD)，CHCl₃/甲醇(MeOH)(9∶1)用作溶剂系统。F2中的生物碱的Dragendorf测试为阳性，将所述F2进行空心柱色谱分析(open-column chromatography，CCA)(直径为5cm，高为15cm)。

为进行CCA(0,035-0,070mm，Φ6ηm)，将硅胶用作固定相，CHCl₃/MeOH(10∶0-8∶2)用作流动相。为进行分离，使用了670mg F2，并收集到约20ml的101级分。

对101级分进行了流动相为CHCl₃/MeOH(7∶1)的分析性CCD并用Dragendorf分析显示后，101级分被分为级分A(FA-136.2mg)(1-27)、级分B(FB-93.4mg)(28-50)、级分C(FC-148.3mg)(51-69)、级分D(FD-284.5mg)(70-101)。

为分离和纯化生物碱，使用制备型薄层色谱法(CCDP)，将荧光素(fluoresceine)用于硅胶固定相(Merck)，将甲苯、丙酮、乙醇和NH₄OH(45∶45∶7∶3)用作流动相。从级分B分离刺桐亭(48mg)；从级分C和D分离eritravine(分别是61和34,82mg)；并且从级分D分离11-OH-eritravina(36,98mg)。

为了对从CCDP分离得到的物质进行光谱测定分析，使用在500MHz进行的核磁共振(NMR)光度计Varian Unit。将氘化氯仿(CDCl₃)用作溶剂。

实施例3：药理学

3.1动物试验

使用自圣保罗州立大学(UNESP/Araraquara)的中心动物实验室获得的、重25-35g的Swiss小鼠。

动物被分为10-12只/组、在底部填有木屑的聚丙烯笼中饲养，给予足量的食物和水。将动物实验室保持在22±1℃的恒定温度，光照控制为12小时的昼夜循环，从7:00am至7:00pm，湿度保持在50-60％之间。

实施例4：粗的标准提取物和富含碱的纯化的级分、标准的药物和载体

因此，除了使用F2(3、6、10、17和30mg/kg)和生物碱刺桐阿亭、erythravine和11-OH-erythravine(3和10mg/kg)外，还使用了冷冻干燥的水醇提取物(50、100、200和400mg/kg)，通过采用管饲法的口服摄入给药。所使用的标准药物是剂量为2mg/kg的地西泮(DZP)(通过腹膜内给药，i.p)。

所有溶液在实验当天用0.9％氯化钠(0.9％NaCl)配制得到，并对其进行超声处理15分钟。地西泮溶于0.9％NaCl和Tween-80的溶液中。

实验在11:00am和5:00pm之间进行。

实验仪器和步骤

高架式T迷宫由透明玻璃壁和木质地板制成，包括两个开放臂(30×5×0.25cm)和与其垂直连接的一个封闭臂(30×5×15cm)，由木质支持物使其距离地面38.5cm。在该测试中，对抑制逃避进行了五次连续测量(基础反应时间、逃避1、2、3和4)并对从开放臂逃避进行了一次测量，每次测试之间间隔30秒钟。在逃避测量中，将动物置于封闭臂的远端，记录从该封闭臂爬行至开放臂的逃避时间。在逃避测量中，将动物置于右手侧开放臂的端部，并测量从该开放臂离开的时间。在这些测量中动物停留在迷宫的臂中的最长时间为300秒。对每只动物进行测量之后，用20％乙醇清洗该装置。

为了避免假阳性或假阴性，在高架式T迷宫中测试后，立即在活动场所对动物进行活动度测试。

所述装置由具有30cm高的壁体围绕的矩形基底(40×48cm)的白色聚丙烯盒组成。将其底面分为30个正方格(8×8cm)。

在该测试中，将动物置于盒中央，并将其活动情况录像记录五分钟，用于随后进行对穿过方格区域(quadrant area)的数目以及伸展(stretch-attend)姿势的次数的分析(WALSH and CUMMINS，1976)。模型结果分析

为测定分离出的生物碱的化学结构，使用¹H和¹³C的NMR光谱测定法，以及HMQC、HMBC和COSY二维光谱测定法。将结果与已经存在于文献中的关于刺桐生物碱的信息相比较。

来自动物模型的结果首先进行Levene同质性检验。将异质性结果转化为对数尺度，随后进行统计分析。

自高架式T迷宫获得的数据用于双因子方差分析(ANOVA)，处理情况作为独立因子，测试情况作为非独立因子。处理效果被证明为显著时，使用单因子ANOVA然后使用Duncan post hoc检验对数据进行分析。

将得自活动场所的结果进行单因子ANOVA检验，然后进行Duncanpost hoc检验。

p≤0.05的数值被当作显著结果。

结果

1)植物化学的(核磁共振-RMN)

通过含FB的CCDP分离得到生物碱1，自FC和FD分离出生物碱2。通过FD还可分离得到生物碱3。

物质1、2和3在CDCl₃中的¹H和¹³C NMR光谱(表2)表明存在具有刺桐碱骨架特征的信号。在这一点上，可以鉴定与氢H-14和H-17相关的芳香族质子的两个单峰信号以及由碳C-15和C-16位的甲氧基氢所引起的两个单峰信号。三个烯属质子信号(较宽单峰(sl)，H-7；较宽双峰(dl)，H-1；两个双峰(dd)，H-2)的存在可能是由于刺桐骨架的二烯系统氢所导致。

Sarragioto et al.(1982)已报道C-1和C-2分别在δ125.3和δ131.2发生共振。但是，在本发明的开发工作中，HMQC二维光谱的化学位移之间的关系表明这些共振分别发生在δ131.5和δ125.5。化学位移和耦合的值显示于表1中。

表1：刺桐阿亭、erythravine和11-OH-erythravine的¹H和¹³C(在CD₃Cl中)的NMR(500MHz)的化学位移测量值(δ)和耦合常数(J)。

1.1)刺桐阿亭

在鉴定所述刺桐骨架的氢特征信号之后(表2)，本发明人注意到只有所述物质1显示所述信号δ3,24，该信号指的是甲氧基的三个氢位于C-3。根据在生物碱11-氧的文献中发现的数据，记录到在C-11中存在一个羟基，考虑到¹H(4,64中的较宽的三峰(t))和¹³C(δ64.55)的NMR谱中观察到的位移，以及用HMQC测定显示出的相关性。在这一点上，生物碱1被鉴定为刺桐亭。同时，与以前的工作不同，H_10a-11e(J＝3.54Hz)和H_10e-11e，(J＝3.07Hz)之间耦合常数的值预测C-11中的所述羟基为一个水平的方向。

所述从EM花的粗提取物中分离的生物碱刺桐亭的化学结构显示如下。

1.2)Erythravine

与以前的物质不同，物质2的¹H RMN谱在所述C-3位置不存在甲氧基的信号(表2)。在δ4,37处观察到的多峰(m)以及所述¹³C谱的δ67.73处观察到的化学位移表明在这个位置存在一个氧取代。

对于所述C-11位置，在δ2.9(J_H11ax-H10ax＝10,0Hz；J_H11ax-H11eq＝6,5Hz)处观察到的双峰和在所述δ2.65-2.69区中观察到的多重峰分别归因于轴H-11(ax)和中纬线(eq)。这个物质被鉴定为erythravine，它是一种在EM中还没有被分离出来的erhitrinic生物碱(图4)。

所述生物碱erhytravine从EM花的粗提取物中分离，化学结构显示如下。

1.3)11-羟基-erythravine(11-OH-erythravine)

在11-OH-erythravine的¹H的NMR谱中(表2)，与erythravine类似，在所述C-3位没有观察到甲氧基氢的信号，仅在δ4.5处观察到一个与C-3位的氧合取代相关的多峰。与在刺桐阿亭观察到的相同，¹H和¹³CNMR光谱反映在δ4.74(t)和δ63.69分别存在化学位移，这是由于在C-11存在羟基。这些结果首次公开，因此物质3被认为是新的刺桐生物碱，并被称为11-羟基-erythravine(11-OH-erythravine)。

表2：用11-OH-erythravine进行短暂处理对进行高架式T迷宫测试的小家鼠的影响(平均值±EPM)

*p＜0,05。

分离自木轮毂刺桐的花的粗提产物的生物碱11-OH-erythravine的化学结构如下图所示。

2)药理学

粗提取物

2.1)高架式T迷宫(或高架式T迷宫测试)

如表3所示，在高架式T迷宫的开放臂的抑制逃避中，标准的EM粗提取物的短暂处理损害了动物的行为表现。

双因子ANOVA显示处理(F(5,49)＝5,44；p＜0,0001)和测试(F(4,196)＝27,37；p＜0,0001)有显著作用，但处理和测试的交互没有显著作用(F(20,196)＝0,87，p＝0,628)。单因子ANOVA表明处理组次基础反应时间(LB)(F(5,49)＝2,34；p＝0,056)、逃避1(E1)(F(5,49)＝3,97；p＝0,004)、逃避2(E2)(F(5,49)＝3,75；p＝0,005)；逃避3(E3)(F(5,49)＝3,39；p＝0,01)和逃避4(E4)(F(5,49)＝2,62；p＝0,03)有显著差异。

在表3中，可以观察到根据Duncan post hoc检验的、与对照组相比的所述组次之间的差异。

在高架式T迷宫的开放臂的测量中，单因子ANOVA表明，组之间有显著的不同(F(5,49)＝3,48；p＝0,009)。Duncan post hoc检验显示，该不同指的是，与对照组相比，用400mg/kg的EM的剂量处理的组表现出离开开放臂进入封闭臂的反应时间的缩短(表3)。

表3：EM粗提取物进行的短暂处理对进行高架式T迷宫测试(n＝9-10)的小家鼠的影响(平均值±EPM)。

*p＜0,05，Duncan检验。

2.2)活动度-活动场所

在活动场所测量的活动度没有受到任何剂量的所述EM粗提取物的短暂处理的改变(表4)。

单因子ANOVA没有显示出组之间测定的混合的数目中的任何显著差异(F(5,49)＝0.78；p＝0.56)以及测定的调查的数目中的任何显著差异(F(5,49)＝1.90；p＜0.11)。

表4：用EM粗提取物进行短暂处理对小家鼠在活动场所的活动性的影响(n＝9-10)(平均值±EPM)。

  处理  混合  升高  盐水  159.0±14.8  32.5±3.7  DZP 2mg/kg  167.4±23.6  27.33±2.3  EM 50mg/kg  178.8±8.7  40.4±3.1

  EM 100mg/kg  166.1±4.4  37.8±2.5  EM 200mg/kg  199.4±19.5  40.67±4.2  EM 400mg/kg  167.3±18.3  38.4±5.37

3)纯化的级分-富含Eritrinic生物碱(F2)

3.1)高架式T迷宫

在高架式T迷宫的开放臂中，用F2的短暂处理损害了抑制逃避的获得，如表5所示。双因子ANOVA显示处理(F(4,40)＝7.00；p＜0.0001)和测试(F(4,160)＝11.18；p＜0.0001)有显著作用，但处理和测试的交互没有显著作用(F(16,160)＝1.48，p＝0.112)。单因子ANOVA表明处理组LB(F(6,69)＝2.7；p＝0.02)、E1(F(6,69)＝4.86；p＜0.0001)、E2(F(6,69)＝7.49；p＜0.0001)；E3(F(6,69)＝5.60；p＜0.0001)和E4(F(6,69)＝7.83；p＜0.0001)之间有显著差异。根据Duncan posthoc检验的所述组之间的差异在表5中显示。

在高架式T迷宫的开放臂的逃避学习中，单因子ANOVA表明，组之间没有显著的不同(F(4,40)＝0.96；p＝0.46)(表5)。

表5：用F2进行短暂处理对进行高架式T迷宫测试(n＝8-16)的小家鼠的影响(平均值±EPM)。

*p＜0,05，Duncan检验。

3.2)活动度-活动场所

在活动场所测量的活动度没有受到任何剂量的F2的短暂处理的改变(表6)。

单因子ANOVA没有显示出组之间测定的混合的数目中的任何显著差异(F(4,40)＝0.30；p＝0.87)，以及测定的升高的数目中的任何显著差异(F(4,40)＝0.81；p＝0.52)。

表6：用富含生物碱的纯化级分(F2)进行短暂处理对小家鼠在活动场所的活动性的影响(n＝8-16)(平均值±EPM)。

  处理  混合  升高  盐水  173.75±19.0  27.25±4.0  DZP 2mg/kg  169.11±33.2  21.11±6.7  F2 3mg/kg  164.54±12.5  31.18±4.5  F2 6mg/kg  116.0±16.8  21.5±4.1  F2 10mg/kg  145.00±9.8  31.11±3.5  F2 17mg/kg  146.22±25.1  22.5±5.5  F2 30mg/kg  161.00±16.4  26.00±2.8

分离的生物碱的新结果

1)Erhytravine

用Erythravine处理的小家鼠进行明暗箱模型测试获得的结果在表7中显示。

单因子ANOVA显示，处理对于测量的位于明箱的时间长度有显著的影响(F(3,39)＝4.27；P＝0.01)。Duncan post hoc检验显示，用口服剂量3mg/kg和10mg/kg的erythravine以及用DZP处理的动物组在明箱中的时间长度比对照组明显地高。对于测量的在两个箱之间转移的次数，单因子ANOVA没有在组之间显示出显著的差异(F(3,39)＝1.13；P＝0.34)。

表7：用erythravine进行短暂处理对进行明暗箱模型测试(n＝10-12)的小家鼠的影响(平均值±EPM)。

  处理  在明箱中的时间  在两个箱之间转移的次数  盐水  69.67±14.51  14.69±2.73  DZP(2mg/kg)  144.20±17.52*  20.10±2.93  ERI(3mg/kg)  115.40±18.58*  19.70±2.96  ERI(10mg/kg)  112.00±10.95*  19.80±1.32

*与盐水比较p＜0,05，(Duncan post hoc检验)

2)11-OH-ERYTHRAVINE

在表8中显示用11-OH-erhytravine进行的明暗箱模型测试获得的结果。

单因子ANOVA显示，所述处理对于测量的动物位于明箱的时间长度有显著的影响(F(3,38)＝3.14；P＜0.05)，并且对在两个箱之间转移的次数也有显著影响(F(3,38)＝3.36；P＜0.05)。Duncan post hoc检验揭示，与对照组相比，剂量为10mg/kg的11-OH-erythravine和DZP显著地增加动物在明箱中的时间。施以剂量为3mg/kg的11-OH-erythravine也增加在模型的两个箱之间转移的次数(P＜0.05)。

表8-用11-OH-erythravine进行短暂处理对进行明暗箱模型测试(n＝8-10)的小家鼠的影响(平均值±EPM)。

  处理  在明箱中的时间  在两个箱之间转移的次数  盐水  72.33±11.27  15.58±2.48  DZP(2mg/kg)  130.00±16.76*  13.92±1.34  11-OH(3mg/kg)  98.67±13.35  22.67±2.66*  11-OH(10mg/kg)  127.22±21.83*  14.00±1.93

*与盐水比较p＜0,05，(Duncan post hoc检验)

3)刺桐亭

用刺桐亭进行明暗箱模型测试获得的结果通过表9中的数据显示。

单因子ANOVA显示，处理对于测量的动物位于明箱的时间有显著的影响(F(3,49)＝3.66；P＜0.01)。根据Duncan检验(P＜0.05)，这个影响仅在用DZP(2mg/kg)处理的动物组中被观察到。然而，单因子ANOVA显示，处理对测量的在两个箱之间转移的次数没有显著的影响(F(3,49)＝1.19；P＜0.31)。

表9-用刺桐亭进行短暂处理对进行明暗箱模型测试(n＝8-9)的小鼠的影响(平均值±EPM)。

  处理  在明箱中的时间  在两个箱之间转移的次数  盐水  70.59±6.48  16.65±1.67

  DZP(2mg/kg)  140.67±18.59*  17.42±2.40  ERIT(3mg/kg)  67.67±8.33  13.00±1.56  ERIT(10mg/kg)  83.42±14.17  14.25±1.59

*与盐水比较p＜0,05，(Duncan post hoc检验)

从木轮毂刺桐的水醇粗提取物中分离三种刺桐生物碱：刺桐亭、erhytravine和11-OH-erhytravine。以前，Sarragioto et al.(1981)已经报道，在木轮毂刺桐的甲醇粗提取物中含有刺桐亭、N-氧-刺桐亭、刺桐春(erhysotrine)和N-氧-刺桐春。然而，通过该二维的gHMQC检测，本工作已经修正了碳原子C-1和C-2耦合常数的值。

已经从E.folkersii(MILLINGTON et al.，1973)和E.cochleata(CHAWLA et al.，1985)的种子提取物中分离出erythravine。这是在文献中第一次报道11-OH-erhytravine的分离。

本发明的结果可以显示，木轮毂刺桐的富含生物碱纯化的级分可以对高架式T迷宫的焦虑动物模型有抗焦虑的效果。在高架式T迷宫的开放臂的抑制逃避和逃脱中，已经观察到木轮毂刺桐的粗提取物的抗焦虑效果。100、200和400mg/kg的短暂施药的剂量损伤了所述开放臂的抑制逃避的获得。这些结果也证实最近的证明木轮毂刺桐提取物的抗焦虑效果的证据，所述证据也是用200mg/kg的剂量测量所有小鼠在高架式T迷宫中的逃避而得到的(ONUSIC et al.，2002)。在该工作中，木轮毂刺桐提取物的抗焦虑效果也与明暗箱模型相关联(ONUSIC et al.，2002)。当对小鼠短暂施药的时候，200和400mg/kg的剂量被观察到可以提高在所述两个模型箱之间的转移次数，以及提高动物处于明箱中的时间。

考虑到某些化合物在药物疗法中被应用于治疗广泛性焦虑症，如BDZ、地西泮、和5-羟色胺受体A型激动剂、丁螺环酮(LADER，1998；DAVIDSON JR.，2001；RICKELS et al.，2001)，它们在高架型T迷宫的开放臂的抑制逃避的测量中(GRAEFF et al.，1993；VIANA et al.，1994；GRAEFF et al.，1998；CARVALHO NETTO e NUNES DE SOUZA，2004)，以及在明暗箱模型中(MERLO PICH e SAMANIN，1989；CHAULOFF et al.，1997；e BOURIN，1998)表现出抗焦虑效果，一些作者建议，这些试验可以为一般性焦虑症的研究提供有效性预期(GRAEFF et al.，1993；VIANA et al.，1994；GRAEFF et al.，1998；GRAEFF e ZANGROSSI，2002；BOURINe2003)。

用F2(富含刺桐生物碱的纯化的级分为主要成分)获得的结果表明，在测量的开放臂的抑制逃避中有抗焦虑的效果。以3、6、10和17mg/kg的剂量的F2短暂施药损害抑制逃避的获得，与以前使用的标准药物地西泮相似，这表明F2有一种抗焦虑的效果。这些结果支持如下的结论，即观察到的所述粗提取物的抗焦虑效果与在其组成中存在的刺桐生物碱有关。这可以通过实施试验(realized test)进行确认，所述试验是在明暗箱模型中使用所分离的生物碱而进行的。

所述明暗箱试验是一种经典的用于γ-氨基丁酸能和5-羟色胺能的药物研究中的焦虑动物模型，明暗箱试验被应用于评估所述刺桐亭、erythravine和11-OH-erhytravine的抗焦虑效果。

观察了标准的粗提取物(100和200mg/kg)和生物碱erythravine(3和10mg/kg)和11-OH-erhytravine(10mg/kg)对测量的动物在明箱中的时间的抗焦虑效果。最近报道了用木轮毂刺桐提取物在这个模型中的阳性结果(ONUSIC et al.，2002)。观察到当200和400mg/kg的剂量被短暂施于小鼠的时候增加了在模型的两个箱之间的转移次数和动物在明箱中的时间。

在本发明中也观察到，低剂量(3mg/kg)的11-OH-erhytravine的施药增加了在模型的两个箱之间的转移次数。这种转移次数的增加可以被认为是一种抗焦虑效果，是行为的缺乏抑制的结果而不是所述动物的活性被刺激的结果，在活动场所的活动度测试的反应时间没有增加。可以得出如下结论：

——本发明描述了用高架式T迷宫得到的新结果，所述结果证明了，当通过口服的时候，木轮毂刺桐水醇提取物(EM)(100-400mg/kg)以及从中提取的生物碱的抗焦虑效果，所述生物碱为11-OH-erhytravine、erythravine和刺桐亭(3和10mg/kg)；

——通过所述活动场所的测试获得的描述的结果证明，EM和所述测试的物质并不会改变所述动物的活动度；

——所述结果显示，至少包含0.1％的总刺桐生物碱的粗提取物，和至少包含20％的总刺桐生物碱和10％的刺桐生物碱erythravine以及其他微量的生物碱和其他极性和非极性物质的纯化的级分(F2)在LTE(3-30mg/kg；v.o)中也表现出了抗焦虑效果，并且不改变小家鼠的运动度；

——用明暗箱模型(一种体内药物筛选的经典装置)获得的结果证明，当以3和10mg/kg的剂量口服施药的时候，11-OH-erhytravine和erythravine表现出了抗焦虑效果；

---项探索性的短暂毒性试验(7天，口服)证明，在所用剂量(200-3600mg/kg)下的所述粗提取物没有引起雄性或雌性的小家鼠的死亡，因此表明所述粗提取物的低毒性。

因此，本文档中的数据可以支持以前的结果，这表明分离的木轮毂刺桐的生物碱，即11-OH-erhytravine、erythravine和刺桐亭是与所述水醇提取物的抗焦虑效果相关的主要活性物，并且当以粗提取物或纯化的级分(F2)施药的时候它们保持这个活性，这可以解释这种植物普遍地被应用作镇静剂；还提供标准化的药物组合物的制剂，所述制剂对具体的治疗需求有合适的药理作用，而且可以避免以天然形式使用植物通常会遇到的问题。除此之外，以前研究中观察到的粗提取物的抗焦虑效果可以说是在其组成中存在刺桐生物碱的结果，可以或者通过用分离的生物碱的测试或者通过富集生物碱的纯化的级分观察到这个结果。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.活性物质在制备一种药剂中的用途，所述药剂用于调节脊椎动物的胆碱能和/或5-羟色胺能和/或γ-氨基丁酸能系统，所述活性物质特征为具有通式：

或者为它们的电子等排体、盐、衍生物和/或它们的可药用的溶剂合物。

2.根据权利要求1的用途，其特征在于所述的一种药剂还包含物质erythravine和/或刺桐亭。

3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述的活性物质存在于一种粗的标准化的植物提取物中，所述提取物包含：

-至少0.1％的总刺桐生物碱，其中一种纯化的级分包含至少20％的总刺桐生物碱；和

-至少10％的以erythravine或者它们的电子等排体、盐和/或它们的可药用的溶剂合物形式存在的总刺桐生物碱。

4.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗与胆碱能和/或5-羟色胺能和/或γ-氨基丁酸能系统功能障碍相关的紊乱，其特征是包含一种药用载体和至少一种具有通式：

的活性物质或者它们的电子等排体、盐、衍生物和/或它们的可药用的溶剂合物。

5.根据权利要求4的药物组合物，其特征在于还包含物质erythravine和/或刺桐亭。

6.根据权利要求4或5的药物组合物，其特征在于所述的活性物质存在于一种粗的标准化的植物提取物中，所述提取物包含：

-至少0.1％的总刺桐生物碱，其中一种纯化的级分包含至少20％的总刺桐生物碱；和

-至少10％的以erythravine或者它们的电子等排体、盐和/或它们的可药用的溶剂合物形式存在的总刺桐生物碱。

7.根据权利要求4、5或6的药物组合物，其特征在于所述粗的标准化的植物提取物是木轮毂刺桐的一种水醇提取物。

8.一种方法，所述方法用于制备一种用于调节脊椎动物的胆碱能和/或5-羟色胺能和/或γ-氨基丁酸能系统的药物组合物，其特征在于包含以下步骤：

a)制备一种药物载体；以及

b)在所述载体中掺入至少一种具有通式：

的活性物质或者它们的电子等排体、盐、衍生物和/或它们的可药用的溶剂合物。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述步骤b)的掺入还包含所述物质erythravine和/或刺桐亭的掺入。

10.根据权利要求8或9的方法，其特征在于所述步骤b)的活性物质是通过化学合成获得的。

11.根据权利要求8或9的方法，其特征在于所述步骤b)的活性物质是通过刺桐属植物的水醇提取物获得。

12.根据权利要求11的方法，其特征在于所述步骤b)的活性物质是通过木轮毂刺桐植株的水醇提取物获得。