一种泰来藻提取物及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种泰来藻提取物及其制备方法和应用，其特征是通过将泰来藻用有机溶剂浸泡，得到的粗提取物用氯仿或乙酸乙酯、正丁醇分别依次萃取，收集水层进行大孔树脂常压柱层析，以水－甲醇溶剂体系或水－乙醇溶剂体系为洗脱液，收集用甲醇或乙醇洗脱的组分，再用甲醇冲洗，收集冲洗后不溶于甲醇，并且在紫光灯波长254nm下有强紫外吸收的组分，得到产物。本发明的泰来藻提取物具有很强的抗单纯疱疹病毒HSV－I病毒活性，体外抗CVB3病毒活性，昆虫拒食性活性，和很强的抑制多室草苔虫幼虫附着的活性，因此可用于制备抗病毒药物，生物农药和海洋绿色防污剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种泰来藻(Thalassia hemprichii)提取物，另外还涉及这种提取物的制备方法以及其在制备抗病毒药物，生物农药和海洋防污剂中的应用。

背景技术

泰来藻(也称泰莱草)属于水鳖科泰来藻属，是我国南海水域的海草床中的优势种，但目前其经济价值还未被开发出来。

发明内容

本发明的目的在于从泰来藻中提取出具有医药价值的化合物，从而实现泰来藻的经济价值。

我们通过有机溶剂提取，常压柱层析分离技术等，从泰来藻中分离得到一种主成分为黄酮苷化合物的提取物，这种化合物具有抗病毒，昆虫拒食活性和抗海洋污损生物幼虫附着的作用，因而可以应用于制备抗病毒药物，生物农药和海洋绿色防污剂，从而实现了本发明的目的。

本发明的泰来藻提取物，其特征是含有黄酮苷化合物并由以下的步骤制备得到：

(1)将泰来藻用有机溶剂在室温下浸泡，收集提取液，浓缩得粗提取物；

(2)将上述粗提取物悬溶于水，用氯仿或乙酸乙酯、正丁醇分别依次萃取，收集水层并浓缩；

(3)将上述浓缩的水层进行大孔树脂常压柱层析，以水-甲醇溶剂体系或水-乙醇溶剂体系为洗脱液，从体积比100∶0到0∶100进行梯度洗脱，收集用甲醇或乙醇洗脱的组分，浓缩得到粗组分；

(4)将上述粗组分用甲醇冲洗，收集冲洗后不溶于甲醇，并且在紫光灯波长254nm下有强紫外吸收的组分，得到泰来藻提取物。

步骤(1)所述的有机溶剂可以是甲醇、乙醇、甲醇-水混合溶剂或乙醇-水混合溶剂等，所述的浸泡可以是3次，每次5天，所述的浓缩可以采用常规的方法如减压浓缩。

步骤(2)所述的萃取可以是各3～4次，所述的浓缩可以采用常规的方法如减压浓缩。

步骤(3)所述的浓缩可以采用常规的方法如减压浓缩。

本发明泰来藻提取物为黄色无定形粉末，在紫光灯波长254nm下有强紫外吸收，其核磁共振氢谱[¹H NMR(500MHz，DMSO)]显示如下数据：δ_H 7.50～7.82ppm(多个芳香环氢)，6.10～6.80ppm(多个芳香环氢)，4.71～5.17ppm(多个糖端基氢)，3.20～3.82ppm(多个糖次甲基和亚甲基氢)，其¹H NMR谱与从泰来草中分离到的黄酮苷化合物luteolin3’-O-methyl-7-glucuronide相似(见参考文献：Stochmal A，Placente S，Pizza C，et al.JAgric Food Chem，2001，49：753-758.)，只是多了一些信号峰，结合黄酮类化合物是泰来藻的主要特征性化学成分这一研究事实，故推测该提取物的主要化学成分是黄酮苷类化合物。

本发明泰来藻提取物的制备方法及其优化条件同上述。

实验证明本发明的泰来藻提取物具有很强的抗单纯疱疹病毒HSV-I病毒活性，其IC50值约为6.25μg/mL，还具有体外抗CVB3病毒活性，在浓度为100μg/mL时能够抑制一半以上CVB3病毒的病变，另外本发明的化合物有较好的昆虫拒食性活性，在浓度为500μg/mL时对斜纹夜蛾2龄幼虫的拒食率为93％，在浓度为100μg/mL时对斜纹夜蛾SL细胞的细胞致死率为91％，此外，本发明的化合物还具有很强的抑制多室草苔虫幼虫附着的活性(EC₅₀为0.005μg/mL)。

本发明的泰来藻提取物可以用于制备抗病毒药物，可以用作生物农药和海洋防污剂。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

以风干干重4Kg的泰来藻(Thalassia hemprichii)为原料，切碎后用乙醇有机溶剂约35L室温浸泡3次，每次5天，将提取液减压浓缩得粗提取物。将粗提取物(70g)悬溶于水(1L)，用氯仿(600mL)和正丁醇(500mL)依次萃取各3次，收集水层并减压浓缩，将浓缩后的水层23g进行大孔树脂(D101大孔吸附树脂)常压柱(常压玻璃柱，直径9cm，长1.8m)层析，以水-甲醇溶剂系统为洗脱剂，从体积比100∶0到0∶100进行梯度洗脱，收集用甲醇洗脱的组分，减压浓缩得到粗组分。将粗组分在用甲醇冲洗，收集冲洗后不能溶解于甲醇，并且在紫光灯波长254nm下有强紫外吸收的组分，得到本发明泰来藻提取物。该提取物的核磁共振氢谱[¹H NMR(500MHz，DMSO)]显示如下数据：δ_H 7.50～7.82ppm(多个芳香环氢)，6.10～6.80ppm(多个芳香环氢)，4.71～5.17ppm(多个糖端基氢)，3.20～3.82ppm(多个糖次甲基和亚甲基氢)，其¹H NMR谱与从泰来藻中分离到的黄酮苷化合物luteolin3’-O-methyl-7-glucuronide相似，只是多了一些信号峰，结合黄酮类化合物是泰来藻的主要特征性化学成分这一研究事实，故推测该提取物的主要化学成分是黄酮苷类化合物。

实施例2：

收集对数生长期vero细胞，接种于96孔培养板，每孔细胞数为1.0×10⁵/100μL，置于5％，CO₂培养箱培养。次日将微孔中生长液吸出，每孔加入稀释好的实施例1的泰来藻提取物的溶液50μL，立即加入HSV-I病毒使用液50μL，同时设正常细胞对照，病毒对照，37℃，5％CO₂培养箱培养。观测细胞病变效应(CPE)，每天观察细胞长势，以-、+、++、+++、++++表示细胞病变情况。结果显示，本发明的化合物对vero细胞的最大无毒浓度为25ug/ml，其抑制单纯疱疹病毒I型病变的IC₅₀值为6.25ug/mL。

实施例3：

收集对数生长期HepG2细胞，接种于96孔培养板，每孔细胞数为1.0×10⁵/100μL，置于5％，CO₂培养箱培养。次日将微孔中生长液吸出，每孔加入稀释好的实施例1的泰来草提取物的溶液50μL，立即加入CVB3病毒使用液50μL，同时设正常细胞对照，病毒对照，37℃，5％CO₂培养箱培养。观测细胞病变效应(CPE)，每天观察细胞长势，以-、+、++、+++、++++表示细胞病变情况。结果显示，本发明的化合物对hela细胞毒性的最大无毒浓度为200μg/mL，在浓度为100μg/mL时能够抑制一半以上病毒的病变。

实施例4：

将实施例1的产物配成500μg/mL丙酮溶液(难溶物加了几滴二甲亚砜)，并以浓度为10μg/mL的印楝素作为对照。将木薯叶(Φ＝1.5cm)分别浸泡实验液和对照液1秒，晾干后放入培养皿中，每皿3片，接入2头斜纹夜蛾2龄幼虫。每样品处理设5个重复。处理48小时后调查取食叶面积，并更换新鲜甘蓝叶饲喂，记录处理后6天内试虫的死亡情况。结果显示，本发明的化合物在浓度为500μg/mL时对斜纹夜蛾2龄幼虫的拒食率为93％。

实施例5：

以斜纹夜蛾SL细胞为对象，用MTT法对实施例1的产物进行了细胞毒力试验。实施例1的产物的浓度均为100μg/mL(即100ppm)，溶剂为DMSO。结果显示，本发明的化合物在浓度为100μg/mL时对斜纹夜蛾SL细胞的细胞致死率为91％。

实施例6：

将实施例1得到的泰来藻提取物作为测试样品溶解于二甲亚砜(DMSO)，然后加入经高压灭菌器过滤(0.22μm)的海水(FSW)配成不同的浓度(0.05μg/mL，0.2μg/mL，1μg/mL，10μg/mL and 50μg/mL)。在聚苯乙烯24孔径板的每个孔板中加入20个游动的幼虫和1mL配制好的测试样品，每个样品做4个平行孔，用加有DMSO的FSW海水作为阴性对照物。将配有测试样品的24孔径板放于28℃的培养箱中放置1小时后，观察实验结果。通过显微镜计算：1)已附着在板壁上的幼虫个数，2)没有附着在板壁上的幼虫个数，3)已死了的幼虫个数。计算已附着在板壁上的幼虫个数占实验用的总幼虫个数的百分比，再通过EPAPROBIT ANALYSIS PROGRAM Version 1.5软件计算其抑制幼虫附着的半数有效抑制浓度EC₅₀。结果显示，本发明的化合物对多室草苔虫幼虫附着的半数有效抑制浓度EC₅₀为0.005μg/mL。