一种高密度脂蛋白胆固醇分数酯化速率的测定方法

摘要

本发明公开了一种高密度脂蛋白胆固醇分数酯化速率的测定方法，包括a)在新鲜全血样本中加入卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性抑制剂；b)加入沉淀剂得到只含有高密度脂蛋白的样品；c)将样品分成两份，一份加入卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性恢复剂，一份不加，同时在37℃温育1小时；d)利用高效液相色谱分别测定两份样品的高密度脂蛋白游离胆固醇，计算两者之差，差值除以测得的未加入卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性恢复剂的样品高密度脂蛋白游离胆固醇的百分数即为高密度脂蛋白胆固醇分数酯化速率。本发明公开的方法，具有简单、安全、费用低廉且样品可以贮存的特点。

说明书

技术领域

本发明属于检测领域，更具体地，本发明属于一种脂蛋白胆固醇分数酯化速率的测定方法。

背景技术

卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)是循环中胆固醇酯化的主要酶，它转移卵磷脂sn-2位的脂肪酰基至胆固醇，生成胆固醇和溶血卵磷脂，LCAT与高密度脂蛋白(HDL)结合，故胆固醇酯化主要发生于HDL。LCAT在HDL代谢和胆固醇逆转运中发挥重要作用(Glomset JA.The plasma lecithin：cholesterolacyltransferase reaction.J Lipid Res，1968，9：155-167；，Sviridov D，Nestel P.Dynamics of reverse cholesterol transport：protection against atherosclerosis.Atherosclerosis，2002，161：245-254.)。研究LCAT活性的方法有多种，其中一种是测定胆固醇酯化速率(Pritchard PH.Measurement and clinical significance oflecithin：cholesterol acyltransferase.In：Rifai N，Warnick GR，Dominiczak MH，eds.Handbook of Lipoprotein Testing.2nd ed.AACC Press：Washington DC，2000.507-520)，其原理为血浆(或血清)在适当温度下温育，由于LCAT的作用，血浆游离胆固醇降低，胆固醇酯等幅升高，游离胆固醇降低或胆固醇酯升高速率可在一定程度上指示LCAT活性(Pritchard PH.Measurement and clinicalsignificance of lecithin：cholesterol acyltransferase.In：Rifai N，Warnick GR，Dominiczak MH，eds.Handbook of Lipoprotein Testing.2nd ed.AACC Press：Washington DC，2000.507-520.Yen FT，Nishida T.Rapid labeling of lipoproteins inplasma with radioactive cholesterol.Application for measurement of plasmacholesterol esterification.J Lipid Res.1990，31：349-53.)。

由于底物(脂蛋白上的游离胆固醇、卵磷脂等)性质等因素，体外胆固醇酯化速率呈非线性变化，故采用初始酯化速率，如37℃下30min内的游离胆固醇下降，并认为在此期间游离胆固醇浓度呈线性变化。酯化速率可用单位时间、单位血浆体积内被酯化的胆固醇摩尔数(摩尔酯化速率，MER)表示(如lμmol/L/h)，也可用单位时间内被酯化胆固醇的百分数(分数酯化速率，FER)表示(如％/h)。由于胆固醇在上述假设的线性范围内的变化很小，准确测定有困难，故迄今为止胆固醇酯化速率测定几乎都使用少量放射性同位素标记的胆固醇作示踪剂(Pritchard PH.Measurement and clinical significance oflecithin：cholesterol acyltransferase.In：Rifai N，Warnick GR，Dominiczak MH，eds.Handbook of Lipoprotein Testing.2nd ed.AACC Press：Washington DC，2000.507-520；Yen FT，Nishida T.Rapid labeling of lipoproteins in plasma withradioactive cholesterol.Application for measurement of plasma cholesterolesterification.J Lipid Res.1990，31：349-53；Stokke，K.T.，and K.R.Norum..Determination of lecithin：cholesterol acyltransferase in human blood plasma.1971，Scand.J.Clin.Lab.Invest.2E 21-27；Ohta T，Saku K，Takata K，et al.Fractionalesterification rate of cholesterol in high density lipoprotein(HDL)can predict theparticle size of low density lipoprotein and HDL in patients with coronary heartdisease.Atherosclerosis，1997，135：205-212；Dobiasova M，Stribrna J，Sparks DL，etal.Cholesterol esterification rates in very low density lipoprotein-and low densitylipoprotein-depleted plasma：relation to high density lipoprotein subspecies，sex，hyperlipidemia，and coronary artery disease.Arterioscler Thromb，1991，11：64-70。)测定过程一般是先将血浆样品与少量放射性同位素标记的胆固醇在低温下温育，使放射性胆固醇与内源胆固醇平衡，再在较高温度(37℃)下温育一定时间(一般30或60min)，提取脂类物质，用薄层色谱分离胆固醇和胆固醇酯，测定放射性在胆固醇和胆固醇酯中的分布，计算酯化速率。

由于测定结果受样品中各种脂蛋白浓度和性质的影响，显然上述方法不能测定真正LCAT活性水平。理论上，LCAT只酯化HDL上的胆固醇，分布在其他脂蛋白上的放射性胆固醇与LCAT接触的机会与HDL上的放射性胆固醇会有不同，血浆胆固醇水平不同，放射性胆固醇与内源性胆固醇的比例也会不同，因此由此法测定的无论MER或FER都会出现偏差。此法已出现多年，除在有关研究中由若干应用外，其临床应用可能仅限于不同LCAT缺乏疾病的鉴别诊断(Pritchard PH.Measurement and clinical significance of lecithin：cholesterolacyltransferase.In：Rifai N，Warnick GR，Dominiczak MH，eds.Handbook ofLipoprotein Testing.2nd ed.AACC Press：Washington DC，2000.507-520)。

鉴于上述全血浆胆固醇酯化速率测定的问题，捷克学者Dobiasova等(Dobiasova M，Stribrna J，Sparks DL，et al.Cholesterol esterification rates in verylow density lipoprotein-and low density lipoprotein-depleted plasma：relation to highdensity lipoprotein subspecies，sex，hyperlipidemia，and coronary artery disease.Arterioscler Thromb，1991，11：64-70.Dobiasova M，Frohlich J.Measurement offractional esterification rate of cholesterol in plasma depleted of apoprotein Bcontaining lipoprotein：methods and normal values.Physiol Res，1996，45：65-73)提出去除极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)的血浆HDL胆固醇FER。测定方法与上述方法类似，只是在用放射性胆固醇标记脂蛋白前，先用沉淀法去除VLDL和LDL，这样放射性胆固醇就仅限于HDL，很大程度上消除或减小了全血浆酯化速率测定中的问题。

由于LCAT对胆固醇的酯化，体外高密度脂蛋白游离胆固醇(HDLFC)持续下降，且这种变化呈非线性，故高密度脂蛋白胆固醇分数酯化速率(以下简称FER_HDL)测定最好采用初始酯化速率，如新鲜样本37℃下30min或1小时内的游离胆固醇下降。这需严格控制样品采集、处理和制备，很难允许任何形式的样品贮存。这种样品要求给FER_HDL研究和应用造成不便，因而目前迫切需要可适用于样品贮存、简单、安全且费用低廉地测定FER_HDL的方法。

发明内容

本发明的目的之一是公开一种高密度脂蛋白胆固醇分数酯化速率的测定方法。

更进一步，本发明公开的方法是通过以下步骤实现的：

1)在全血样本中加入卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性抑制剂；

2)加入沉淀剂得到只含高密度脂蛋白的样品；

3)将样品分成两份，一份加入卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性恢复剂，一份不加，同时在37℃温育1小时；

4)利用高效液相色谱分别测定两份样品的HDL游离胆固醇水平，计算两者之差，差值除以测得的未加入卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性恢复剂的样品高密度脂蛋白游离胆固醇的百分数即为高密度脂蛋白胆固醇分数酯化速率。

更具体地，卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性抑制剂可以为5，5′二硫双-2-硝基苯甲酸(以下简称DTNB)，全血中卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性抑制剂的浓度为0.5-8mmol/L，最优为1mmol/L。

沉淀剂可以为硫酸葡聚糖镁、磷钨酸镁，肝素锰，聚乙二醇之一，本发明优选硫酸葡聚糖镁，MgCL₂浓度为0.35mol/l，硫酸葡聚糖浓度为10mg/ml。

卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性恢复剂为2-巯基乙醇(以下简称ME)，卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性恢复剂的浓度可以为4-16mmol/L，最优为8mmol/L。

更具体地，采集人新鲜血样本，向样本中立即加入卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性抑制剂以抑制全血中LCAT活性，使HDLFC稳定在初始水平；室温放置1小时，离心分离血清后即可低温保存标本。

测定前，先用沉淀剂制备HDL，然后将样品分成两份，一份加卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性恢复剂恢复HDL中LCAT活性，一份不加，加和不加卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性恢复剂的样品同时37℃温育1小时，高密度脂蛋白游离胆固醇(以下简称HDLFC)在LCAT的作用下被酯化为胆固醇酯，用高效液相色谱(HPLC)测定含和不含卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性恢复剂条件下，HDL在37℃温育1小时后的HDLFC，HDLFC被酯化的百分数即为FER_HDL。

FER_HDL＝[HDLFC_(-)-HDLFC₍₊₎]/HDLFC_(-)×100％

其中下标(-)表示不加卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性恢复剂的样品，下标(+)表示加卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性恢复剂的样品。

本发明抛弃了传统的同位素标记法，使FER_HDL的测定更为简单，安全，费用也相对低廉，较之同位素标记法，该法的测定结果更符合体内的真实情况。同时，对于本发明，在步骤2)前可以对样品进行低温冷冻，需要测定时取出样品，恢复到室温后再进行测定，这是由于在血离体后即加入LCAT抑制剂，使该酶在体外能够相对稳定在体内等同水平，从而这使得样本贮藏和远距离的运输成为可能。

附图说明

图1：37℃温育不同的时间HDLFC的变化结果：其中A、B、C、D、E分别代表5个不同个体的样本。

图2：不同DTNB浓度下HDLFC结果。

图3：不同ME浓度下HDLFC结果。

具体实施方式

以下实施例仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。

HP1100高效液相色谱仪(Hewlett Packard，德国)、MicroLab 500稀释器(Hamilton Company，美国)、LAUDR p18水浴(LAUDR，德国)、涡旋振荡器(Glas-col，美国)。

DTNB：瑞士Fluka公司产品，ME：Sigma公司，内标物豆甾醇：Sigma。

配置标准溶液的胆固醇：GBW09203a：卫生部北京医院老年医学研究所生物化学研究室。

色谱纯乙腈、异丙醇和正己烷：Fisher Scientific(美国)，其它未言明的试剂均为市售分析纯试剂。

标准溶液和内标溶液的配制：标准溶液为胆固醇乙醇溶液，浓度0.1293，0.2586，0.5172，1.0344，1.5516mmol/L。内标溶液为豆甾醇乙醇溶液，浓度0.7758mmol/L。

样品制备采集健康志愿者空腹静脉血，置含有DTNB的具盖试管中，使DTNB的终浓度为1mmol/L，轻轻颠倒混匀，室温放置1h，在离心力为850g，温度为4℃条件下离心15min，分离血清，-80℃保存。

测定前从-80℃取出血清样品，置混匀器上混匀、在室温下融化约1h，使之恢复到室温。用加样器吸取0.9mL血清样品，加入0.09mL沉淀剂，vortex(涡旋混合)10秒，室温放置15min，在离心力为1400g，温度为4℃条件下离心30分钟，制备HDL。

HPLC检测高密度脂蛋白游离胆固醇(HDLFC)步骤(如非特别言明，本发明中的HDLFC的检测方法均用此方法检测)：用稀释器的稀释功能取各种标准溶液、质控溶液(这里“质控”是检验领域常用术语，其作用在于监测每次测定的结果是否可靠，对于本实验，它是一种新鲜混合血清，分装后低温冰冻贮存。每次实验均取出一支与样本同时测定，质控结果的一致程度，可说明方法的稳定性(或者说变异)。若某次实验质控结果偏离很大，则说明本次实验的结果不可靠，需要重复)和样品(HDL血清样品)0.1ml，冲入2ml安瓿中，冲洗液为无水乙醇-50mmol/L KOH(1∶1体积比，50mmol/L KOH溶液为KOH的水溶液)，体积1ml。用稀释器的稀释功能向各试管中加内标溶液0.1ml，冲洗液为正己烷(1ml)。在涡旋振荡器上振荡15min。取正己烷层0.5ml，置2ml试管中，50℃下减压挥发至干。

向各管加丙酮0.4ml，三氧化铬-硫酸的水溶液(两者浓度均为2mol/L)0.02ml，混匀，室温放置5分钟，无水乙醇0.04ml终止反应，加正己烷0.5ml，混合，加水0.5ml，在旋涡式混合器上快速混合5分钟。取正己烷层0.2ml，置HPLC进样瓶中，减压挥发至干。

HPLC分析采用Nova-Pak C₁₈色谱柱(5μm，3.9mm×150mm)，流动相为乙腈-异丙醇(90∶10体积比)，流速1ml/min，紫外(250nm)检测。取上述样品，用0.2ml流动相溶解，进样10μl。将标准溶液浓度对胆固醇/内标峰高比进行线性回归，得到线性回归方程，将样品的胆固醇/内标峰高比代入回归方程，计算HDLFC浓度(陈文祥，李培英，王抒，等。高效液相色谱法测定血清胆固醇的研究。中华医学检验杂志，1993，16：146-151。张江涛，董军，李红霞，等。高效液相色谱检测全血贮存对血清总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的影响。中华检验医学杂志，2005，28：349-353.)。

实施例1：37℃温育不同的时间血浆高密度脂蛋白游离胆固醇变化实验

FER_HDL的测定类似酶学检验，是催化活性测定，测定结果依赖于测定程序。本研究的内容是温育时间对血浆高密度脂蛋白游离胆固醇的影响。取五名健康志愿者(A，B，C，D，E)静脉血(用量15mL)，分别置入含EDTA抗凝剂的试管中，混合，立即放入0℃水浴中，30min后离心分离血浆；向每种血浆中按1∶10的体积比加入硫酸葡聚糖镁沉淀剂(MgCL₂浓度0.35mol/l，硫酸葡聚糖为10mg/ml，均为水溶液。)，制备血浆HDL；将HDL等分成6管(每管500μl)，第1管保持在0℃中，第2，3，4，5，6管分别在37℃温育0.5，1，2，4，8小时，所有管达到时间后立即置于0℃中，然后利用高效液相色谱测定其HDLFC。不同温育时间HDLFC的变化见图1，结果发现血浆HDL在37℃温育不同的时间其HDLFC均下降，且这种变化呈非线性，随着时间的延长，其下降的速度也越来越慢。鉴于此，我们选定最初的1小时作为条件测定样本的FER_HDL

实施例2：DTNB对LCAT的活性抑制实验：

全血样本中加入一定浓度的DTNB，DTNB可以与LCAT的2个游离巯基之间形成二硫键，抑制LCAT的活性，使HDLFC稳定在初始水平。分别在全血样本中加入0.125，0.25，0.5，1，2，4和8mmol/LDTNB溶液(为DTNB粉末加入Tris缓冲溶液配制而成，Tris溶液的浓度应为DTNB目的浓度的2倍)，室温放置1小时分离血清，制备HDL，将HDL在37℃温育2小时，HPLC测定温育后的HDLFC。不同DTNB浓度下HDLFC水平见图2，结果表明当全血DTNB较低时，HDL温育后其FC也低，说明LCAT的活性未被完全抑制，部分HDLFC被酯化；随着DTNB浓度升高，HDLFC升高。当DTNB＞0.5mM时，HDLFC基本稳定。说明此时LCAT的活性可被完全抑制。

实施例3：不同浓度的ME对抑制后的LCAT活性的恢复实验：

取志愿者血，加入DTNB，使终浓度为1mmol/L，分离血清后制备HDL。将血清HDL分为8管，置冰水浴中，分别加入ME水溶液使其浓度为0，0.25，0.5，1，2，4，8和16mmol/L，Vortex(涡旋混合)，将各管同时置37℃水浴中，2小时后取出，置冰水浴中，Vortex(涡旋混合)，测定HDLFC。不同ME浓度下HDLFC的结果见图3。由图3可见，当不含ME或ME浓度较低时，HDLFC较高，随着ME浓度升高，HDLFC水平下降，当ME＞4mmol/L时，HDLFC保持稳定。此结果表明，ME可以恢复LCAT的活性，使HDLFC下降，ME＞4mmol/L时可以完全恢复LCAT的活性。我们选用8mmol/L ME进行实验。

实施例4：FER_HDL的测定：

1、样品准备和HDL制备：抽血时将DTNB的Tris溶液加入到试管中，与全血混合，使DTNB的浓度为1mmol/L，室温放置1小时，离心分离血清后即可低温保存。

将标准溶液、质控和样品血清置混匀器上混匀、融化并使之恢复到室温。约1h后，用加样器精密吸取0.9mL血清样品，加入0.09mL硫酸葡聚糖镁(浓度同上)，vortex(涡旋混合)10秒，室温放置15min，离心制备HDL。

2、HDL温育：将HDL转移至两只具盖冻存管中，每管400uL，置0℃水浴中，分别加入0.045mL去离子水和0.045mL 80mmol/L ME水溶液，涡旋混合。各试管置37℃水浴1h，试管架放入水浴的同时用计时器开始计时，1h后取出立即置冰水浴中，涡旋混合，用高效液相色谱(HPLC)测定含和不含ME条件下，HDL在37℃温育1h后的HDLFC，HDLFC被酯化的百分数即为FER_HDL。

FER_HDL＝[HDLFC_ME(-)-HDLFC_ME(+)]/HDLFC_ME(-)×100％

实施例5精密度实验

抽取FER高、中、低不同的三位者愿者血，加入DTNB使终浓度为1mmol/L。分离血清并分装到2mL安瓿中，1mL/支，融封安瓿，-80℃贮存。

每次取不同血清各一支按实施例4的步骤测定FER_HDL。每个样品测定三次，每次测定三份。结果见表1。FERHDL测定的批内CV％＜2.1％，总CV％＜3.74％。

表1FER_HDL测定的精密度结果

实施例6对比实验

本发明的发明人利用上述实施例4中的方法测定34例正常人的FER_HDL结果见表2。

表2

注：数值均以“均数±标准差”的形式给出

Dobiasova M用同位素标记的方法测定35例正常人的FER_HDL的结果见表3。

表3

表3数据来源：M Dobiasova，J Stribrna，DL Sparks，et al.Cholesterolesterification rates in very low density lipoprotein-and low density

Lipoprotein-depleted plasma.Relation to high density lipoprotein subspecies，sex，hyperlipidemia，and coronary artery disease.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.1991；11；64-70

利用两个不同方法测得的数据结果基本一致。

对于本发明，也可以取新鲜全血样本，加入DTNB，然后加入抗凝剂以离心制备出血浆，按照实施例中公开的程序进行操作，同样可以得到需要的数据。