鱼类家系建立和抗病高产良种选育方法

摘要

一种鱼类家系建立和抗病高产良种选育方法，采用群体选育、家系选育、杂交以及人工感染、快速生长家系和抗病家系的筛选等技术，选育出了牙鲆抗病方强、生长快的家系，建立了鱼类抗病高产良种的选育方法。该技术具有针对性强、选育效率高、效果明显等特点，抗病牙鲆鱼苗的成活率为80％以上，成活率比普通牙鲆鱼苗提高了30％以上；抗病牙鲆的生长速度也提高了10％以上。为鱼类抗病品种培育开辟了新的技术途径，是一种能在鱼类良种选育中应用的抗病高产品种选育方法，适宜在所有养殖鱼类上推广应用，对养殖鱼类抗病高产良种培育具有重要意义和应用价值。

说明书

所属技术领域：

本发明属于水产养殖领域中的鱼类抗病高产品种的选育方法，是一种能在鱼类良种选育中应用的抗病高产良种选育方法。

背景技术：

鱼类是重要的水产养殖种类，也是人类重要的食品来源。我国是世界上水产养殖产量最高的国家。目前我国养殖鱼类的年产量达到2000多万吨，除满足我国国内市场外，每年约有30万吨鱼产品出口国外，为我国出口创汇的主要农产品之一。不过，近年来，随着鱼类养殖业的快速发展，病害频发、种质退化、苗种成活率低，给鱼类养殖业造成的经济损失每年高达150多亿元人民币，从而极大地限制了我国鱼类养殖业的发展。

目前危害鱼类的主要病害是细菌性和病毒性疾病，前者造成的危害更大，其中危害最大的一种细菌性疾病，是由鳗弧菌引起的弧菌病(周丽等，1997)。尽管采取抗菌素类药物等传统的防病措施，但仍无法从根本上解决牙鲆等鱼类养殖的病害问题；并且抗菌素类药物具有容易在鱼体内积累、对消费者的健康具有潜在危害、容易使病原菌产生抗药性以及严重污染养殖环境等问题，因而在鱼类养殖业中的应用越来越受到限制；同时抗菌素的使用也不能满足人们日益增长对无药物残留绿色水产品的需求。

因此，采用现代生物技术培育抗病力强、生长速度快的养殖鱼类新品种，已成为我国水产科技必须解决的重大课题，也是解决鱼类病害问题的根本途径。在鱼类遗传育种方面，国内自二十世纪8 0年代开始，在淡水鲤科鱼类上开展了一些杂交育种的研究工作，通过不同鲤鱼之间的杂交相继培育出快速生长的颖鲤(潘光碧等，1989)、建鲤(张建森等，1994)等新品种。在海水鱼类遗传育种研究方面，主要在牙鲆、大黄鱼和大菱鲆上开展了人工雌核发育培育单性苗种的研究工作(王新成等，1997；王晓清等，2006；苏鹏志等，2008)，同时，还开展了一些分子标记筛选和遗传多样性评价、种质鉴定以及抗病相关分子标记筛选等方面的研究工作，如邹曙明等(2000)采用RAPD技术对牙鲆和大菱鲆养殖群体遗传结构进行的检测分析；尤峰等(2001)采用同工酶技术对山东近海牙鲆和养殖牙鲆的遗传多样性进行的分析；Liuetal.(200 5a，b)利用微卫星标记和AFLP技术评价牙鲆养殖群体和野生群体的遗传结构，表明养殖群体的遗传多样性具有一定程度的下降；陈微等(2005)开展了牙鲆微卫星标记筛选和遗传多样性的分子研究；张玉喜等(2006)分析了牙鲆抗病鱼和不抗病鱼的MHC基因多态性，初步筛选到抗病相关的MHC基因型；但有关鱼类抗病家系建立以及抗病高产良种的选育，目前尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的是为了提供鱼类家系建立和抗病高产良种选育的技术方法，为鱼类抗病高产品种培育提供技术手段。

本发明其技术内容如下：包括鱼类家系建立和抗病高产良种选育的技术方法；

一、鱼类家系建立方法；包括：(一)、抗病群体的制备；(二)、鱼类家系的建立；(三)、不同家系的标记方法。

(一)、抗病群体的制备：采用自然选择和人工感染途径获得抗病群体(RS)。

自然选择：在发病旺季，收集弧菌病发病后存活的鱼苗和鱼种个体，进行培养；

人工感染途径：用病原菌鳗弧菌感染普通鱼苗：

鱼苗为牙鲆黄海群体普通鱼苗，体重为15-20克/尾；

鳗弧菌为本实验室保存的鳗弧菌菌株，鳗弧菌的培养基为2216E，将鳗弧菌接种在灭菌的2216E培养基(蛋白胨5g，酵母提取物1g，FePO₄·4H₂O 0.1g，陈海水1000mL)中，置于震动速度为200r/m的摇床上，于28℃下进行培养，20小时后测定OD600值，离心收集菌体，将原菌液用灭菌的0.9％NaC l生理盐水稀释成浓度为10OD的菌液。

用上述菌液进行预感染实验：先用生理盐水将10OD浓度的菌液分别稀释成不同的浓度(稀释50、100、120、150、240和300倍)进行预备实验，每个浓度注射10尾15-20克重的鱼苗，注射量为0.3-0.5mL。将引起注射的鱼苗中50-60％的鱼苗死亡的浓度确定为半致死浓度。上述规格的鱼苗的半致死浓度为0.3-0.5mL的稀释240倍的细菌溶液。

感染实验：正式感染试验用牙鲆共800多尾，体重约15-20g，牙鲆个体腹腔注射鳗弧菌，注射剂量控制在半致死浓度，鳗弧菌溶液的注射量为0.02ml菌液/克鱼。感染时水温控制在21-23℃。

抗病群体(RS)为自然选择或人工感染鳗弧菌后长期健康成活的个体。

(二)、鱼类家系的建立；鱼类为牙鲆日本群体(JS)和牙鲆黄海群体亲鱼(YS)：

1、牙鲆日本群体(JS)和黄海群体亲鱼(YS)的培育：

从日本引进牙鲆鱼苗50尾，体长5厘米左右，经过3-4年的培育，鱼苗达到性成熟，用于建立牙鲆家系；黄海野生群体亲鱼为捕捞的野生个体，采用常规方法进行驯养和繁殖。

采用电子标记法对抗病群体(RS)、日本群体(JS)以及黄海野生群体(YS)3个群体亲鱼进行个体标记，每尾亲鱼给一个标记号，以便配对繁殖时识别亲鱼来源。

2、精、卵的采集与人工授精：

利用人工挤压腹部法分别采集成熟卵，挤压并用吸管吸取成熟精子于干燥的玻璃瓶中。采用干法受精，即将挤出的精液加到盛卵的容器中，摇动混合，然后加入15-16℃海水激活，完成授精过程，再加10倍于卵量的海水，静置5-10分钟，好卵漂浮在上面，而未受精的死卵则沉于水底，将上浮卵移入孵化缸中孵化，胚胎发育至原肠早期统计受精率，发育至出膜前期统计孵化率。

3、家系的建立：

在牙鲆繁殖季节，采用抗病群体(RS)、日本群体(JS)和黄海野生群体(YS)3个繁殖群体作为亲本进行配对繁殖。采用抗病牙鲆♂x抗病牙鲆♀、抗病牙鲆♂x日本牙鲆♀；日本牙鲆♂x抗病牙鲆♀、日本牙鲆♂x日本牙鲆♀；黄海野生牙鲆♂x抗病牙鲆♀、黄海野生牙鲆♂x日本牙鲆♀，分别以1尾雄鱼对1尾雌鱼的交配方式构建家系，有时是1尾雄鱼分别对2-4尾雌鱼，或1尾雌鱼分别对2-5尾雄鱼的交配方式构建半同胞家系。精、卵采集及孵化按上述方法进行。将来自一尾雄鱼和一尾雌鱼交配产生的受精卵，即一个家系，放在一个3立方米体积的水槽中进行孵化，放养密度为20-30毫升受精卵，水槽实行24小时微流水、充气。家系的建立工作应在10-20天内完成。

(三)、不同家系的标记方法：

采用不同颜色的荧光染料注射鱼苗的不同部位，将配制好的不同颜色的荧光染料注入鱼体表皮下，每针注射剂量为3-5μl。选取黄、红、橙3种荧光颜料，在鱼体腹部上选取了背前、背后、腹后3个位置，利用排列组合法设计了标记组合，按1个部位1种颜色，1个部位2种颜色和1个部位3种颜色进行排列组合，共计有3375个排列组合，即利用3种颜色在3个不同部位注射，可以标记3375个家系。

二、抗病高产良种选育方法；包括：(一)、快速生长家系的筛选；(二)、抗病家系的筛选。

(一)、快速生长家系的筛选：

在家系建立后至荧光标记前，不同家系饲养在不同的养殖水槽内，不同家系的饲养密度应保持相同，3立方米的水槽中养殖5000-10000尾初孵仔鱼。当鱼苗生长20天后，水槽中鱼苗的密度调整为3000-5000尾；当鱼苗生长至45天后，其密度调整为1000-1500尾；当鱼苗生长至8-10厘米时，从每个家系中随机取200条鱼，按照上述方法进行荧光标记，标记后的不同家系的鱼即可放在同一水泥池中进行饲养，40平米的水泥池可以养殖4000-5000条鱼苗。混合养殖后每隔半年进行一次测量，利用测量3次的数据进行生长性能的评价。测量指标主要为全长(从吻端到尾鳍末端)、体宽(身体最宽处，不含背、腹鳍长度)、体重3个指标，每个家系测量40-60尾鱼。计算各个家系体长、体宽、体重的平均数。采用在家系建立中期由黄海野生牙鲆(YS)交配产生的家系作为对照组。比较不同家系与对照家系体长、体宽、体重的差异，将体重极明显大于对照家系的家系确定为快速生长家系(p＜0.01)，将体重明显大于对照家系的家系确定为较快生长家系(p＜0.05)；将体重极明显小于对照家系的家系确定为慢速生长家系(p＜0.01)；将体重明显小于对照家系的家系确定为较慢生长家系(P＜0.05)。将快速生长家系按常规方法进行培养、繁殖后代鱼苗，即可作为高产良种进行养殖和推广。

(二)、抗病家系的筛选：

当鱼苗生长至体长为9-11cm左右时进行感染实验，评价各家系的抗病性能。每个家系随机取样约100尾，每次感染50尾左右，重复实验1次。每个家系感染用鱼独立养殖在0.5m³的玻璃钢水槽中。感染用菌株为鳗弧菌菌株，将鳗弧菌在灭菌的2216E培养基(蛋白胨5g，酵母提取物1g，FePO₄·4H₂O 0.1g，陈海水1000mL)中，置于震动速度为200r/m的摇床上，于28℃下进行培养，培养时间约为18-20h；测定OD600值，将菌液首先用灭菌的0.9％的NaCl生理盐水稀释成10OD的浓度，采用腹腔注射稀释的鳗弧菌进行预感染实验。预感染时，用生理盐水再将10OD浓度的菌液稀释成不同浓度，每组用10-15尾鱼进行不同菌液浓度的预感染实验，摸索牙鲆鱼苗的半致死浓度，确定的牙鲆半致死浓度为49×10⁷CFU/ml，正式感染时，按照半致死浓度进行注射，注射剂量为0.02ml菌液/克鱼，感染时水温控制在21-23℃，保持循环水、感染期间正常饲喂并充气。

注射后定时观察鱼苗的存活状况，在注射鳗弧菌后约12h，鱼苗开始出现游动缓慢、活动力差等症状；20h开始出现少量死亡，30h开始出现死亡高峰，48h内死亡数占整个感染中死亡总数的绝大多数，96h后基本稳定。感染实验设立对照组，对照组为采用抗病群体(RS)和黄海群体(YS)交配的牙鲆鱼苗。根据感染后的鱼种成活率，结合与对照组成活率差异性检验的显著性水平，我们将成活率在60％以上的家系定义为抗病力强的家系，将成活率在39-60％的家系定义为抗病力比较强的家系，将成活率在17-39％的家系定义为抗病力一般的家系，将成活率在17％以下的家系定义为抗病力差的家系。

将抗病力强的家系按常规方法进行培养、繁殖后代鱼苗，即可作为抗病良种进行养殖和推广。

本发明与已有技术对比其特点是：

本发明采用群体选育、家系选育、杂交以及人工感染等技术，以牙鲆为材料首次建立了我国养殖鱼类抗病群体和家系建立的技术方法，初步建立了牙鲆抗病品种选育技术，获得了生长快、抗病力强的牙鲆家系。

该技术具有针对性强、选育效率高、效果明显等特点，抗病牙鲆鱼苗的成活率为80％以上，成活率比普通牙鲆鱼苗提高了30％以上；抗病牙鲆的生长速度也提高了10％以上。由此充分表明，我们建立的牙鲆抗病速生品种选育方法是十分有效的，为鱼类抗病品种培育开辟了新的技术途径，适宜在所有养殖鱼类上推广应用，对养殖鱼类抗病速生良种培育具有重要意义和应用价值。

附图说明：

图1：牙鲆家系建立的交配方式；

图2：不同亲本交配组合生长性能的比较；

交配组合分别表示为：1，日本群体♂×日本群体♀；2，抗病群体♂×抗病群体♀；3，日本群体♂×抗病群体♀；4，抗病群体♂×日本群体♀；5，黄海群体♂×抗病群体♀；6，抗病群体♂×黄海群体♀

图3：牙鲆三个基础群体杂交组合后代抗病力比较。

JS：日本群体；RS：抗病群体；YS：黄海野生群体。

具体实施方式：

下面以牙鲆抗病群体和家系建立及抗病高产良种选育为例，结合附图，对本发明的技术内容进行详细叙述：

本发明其技术内容如下：包括牙鲆家系建立和抗病高产良种选育的技术方法；

一、牙鲆家系建立方法；包括：(一)、抗病群体的制备；(二)、家系的建立；(三)、不同家系的标记方法。

(一)、牙鲆抗病群体(RS)的制备：采用自然选择和人工感染途径获得抗病群体(RS)。

自然选择：在2003-2004年夏季牙鲆发病的旺季，到莱州、日照、即墨等地的牙鲆养殖场，收集弧菌病发病后存活的鱼苗和鱼种个体，进行培养，共收集发病后存活的牙鲆鱼种250尾(规格为20-200克/尾)作为抗病群体(RS)材料。

人工感染途径：用病原菌鳗弧菌感染牙鲆普通鱼苗。鱼苗为黄海水产有限公司生产的牙鲆黄海群体普通鱼苗，体重为15-20克/尾。鳗弧菌为本实验室保存的鳗弧菌菌株，鳗弧菌的培养基为2216E，将鳗弧菌接种在灭菌的2216E培养基(蛋白胨5g，酵母提取物1g，FePO₄·4H₂O 0.1g，陈海水1000mL)中，置于震动速度为200r/m的摇床上，于28℃下进行培养，培养20小时后测定OD600值，离心收集菌体，将原菌液用灭菌的0.9％的NaCl生理盐水稀释菌液配制成浓度为10OD的菌液.用上述菌液进行预感染实验：先用生理盐水将10OD浓度的菌液分别稀释成不同的浓度(稀释50、100、120、150、240和300倍)进行预备实验，每个浓度注射10尾15-20克重的牙鲆，注射量为0.3-0.5mL。将引起注射的鱼苗中50-60％的鱼苗死亡的浓度确定为半致死浓度。上述规格的鱼苗的半致死浓度为0.3-0.5mL的稀释240倍的细菌溶液。

感染实验：正式感染试验用牙鲆共800多尾，体重约15-20g，牙鲆个体腹腔注射鳗弧菌，剂量控制在半致死浓度，鳗弧菌溶液的注射量为0.02ml菌液/克鱼，感染时水温控制在21-23℃；感染后有200尾鱼苗存活，按照常规方法将这些鱼苗培养成亲鱼，作为抗病群体(RS)材料。

抗病群体(RS)为自然选择或人工感染鳗弧菌后长期健康成活的牙鲆个体。

(二)、牙鲆家系的建立；

1、牙鲆日本群体(JS)和黄海群体(YS)的培育：

2003年10月，从日本引进牙鲆日本群体鱼苗50尾，引进时体长为5厘米左右。采用常规方法，对牙鲆日本群体鱼苗进行培育，经过3-4年的培育，这些鱼苗于2006年有少部分鱼达性成熟，其中少数鱼进行了繁殖产卵。2007年，大多数鱼达到性成熟，并被用于建立牙鲆家系。按照常规方法采用已发表的牙鲆微卫星标记对从日本引进的这批牙鲆鱼苗进行分析，分析表明，这批鱼具有较高的遗传多样性，为多个亲本的后代(邵长伟等，2008)。黄海野生群体亲鱼为从黄海中捕捞的野生个体培育而成的亲鱼，数量为60尾左右。

采用从美国West-North Marine Ltd.进口的电子标记枪和标记牌对牙鲆抗病群体、日本群体(JS)以及黄海野生群体(YS)等3个群体亲鱼进行个体标记，将标记子弹打在背部肌肉中，每尾亲鱼具有一个标记号，检测时，用该公司出产的携带式扫描器扫描背部肌肉处即可读出标记号码。这样即可将不同来源的亲鱼饲养在同一个池子内，以便于生殖调控和采卵的操作。

2、精、卵的采集与人工授精：

利用人工挤压腹部法分别采集成熟卵于干燥的量杯中，挤压并用吸管吸取成熟精子于干燥的玻璃瓶中。采用干法受精，即将挤出的精液加到盛卵的容器中，摇动混合，然后加入15-16℃海水激活，完成授精过程，再加10倍于卵量的海水，静置5-10分钟，好卵漂浮在上面，而未受精的死卵则沉于水底，将上浮卵移入孵化缸中孵化，孵化的管理按养殖场常规方法进行。胚胎发育至原肠早期统计受精率，发育至出膜前期统计孵化率。

3、牙鲆家系的建立：

牙鲆家系的建立主要在山东省海阳市黄海水产有限公司进行。在牙鲆繁殖季节，采用抗病群体(RS)、日本群体(JS)和黄海野生群体(YS)3个繁殖群体作为亲本进行配对繁殖，采用抗病牙鲆♂x抗病牙鲆♀、抗病牙鲆♂x日本牙鲆♀；日本牙鲆♂x抗病牙鲆♀、日本牙鲆♂x日本牙鲆♀；黄海野生牙鲆♂x抗病牙鲆♀、黄海野生牙鲆♂x日本牙鲆♀，采用1尾雄鱼对1尾雌鱼的交配方式构建家系(图1)，有时是1尾雄鱼分别对2-4尾雌鱼，或1尾雌鱼分别对2-5尾雄鱼的交配方式构建半同胞家系。精、卵采集及孵化按上述方法进行。将来自一尾雄鱼和一尾雌鱼交配产生的受精卵，即一个家系，放在一个3立方米体积的水槽中进行孵化，放养密度为20-30毫升受精卵，水槽实行24小时微流水、充气。家系的建立工作应在10-20天内完成，以尽可能减少家系建立时间上的差异对家系生长速率计算上造成的影响。

这次参与家系建立的雄性抗病牙鲆为13尾、雄性日本牙鲆为4尾、黄海野生雄性牙鲆为4尾；雌性抗病牙鲆为21尾，雌性日本牙鲆为7尾，雌性黄海野生牙鲆为2尾。本发明在15-20天内建立了半同胞和全同胞家系共计63个。

(三)、不同家系的标记方法：

采用从美国荧光标记公司购买的不同颜色的荧光染料注射鱼苗的不同部位，对不同家系进行标记，荧光颜料的配制和注射按照生产厂家的操作说明进行。荧光颜料的配制和注射参考“Manual Elastomer InjectionSystems Instructions for Use”。将配制好的荧光颜料注入鱼体表皮下，每针注射剂量为3-5μl。选取黄、红、橙3种荧光颜料，在鱼体腹部上选取了背前、背后、腹后3个位置，利用排列组合法设计了标记组合，按1个部位1种颜色，1个部位2种颜色和1个部位3种颜色进行排列组合，共计有3375个排列组合，计算公式为

[C(3，0)+P(3，1)+P(3，2)+P(3，3)]³＝3375

C(3，0)：不标记；

P(3，1)：1个部位1种颜色；

P(3，2)：1个部位2种颜色；

P(3，3)：1个部位3种颜色；

3次方：表示3个部位的所有排列组合，共计可有3375个排列组合。

即利用3种颜色在3个不同部位进行注射，可以标记3375个家系。本发明中只使用了其中63个组合对63个家系进行了标记。

二、牙鲆抗病高产良种选育方法；包括：(一)、牙鲆快速生长家系的筛选；(二)、牙鲆抗病家系的筛选。

(一)、牙鲆快速生长家系的筛选：

牙鲆家系的建立工作应在10-20天内完成，以尽可能减少不同家系建立时间对生长速率造成的影响。在家系建立后至荧光标记前，不同家系饲养在不同的养殖水槽内，不同家系的饲养密度应保持相同，3立方米的水槽中养殖5000-10000尾初孵仔鱼。当鱼苗生长20天后，水槽中鱼苗的密度调整为3000-5000尾；当鱼苗生长至45天后，其密度调整为1000-1500尾；当鱼苗生长至8-10厘米时，从每个家系中随机取200条鱼，按照上述方法进行荧光标记，标记后的不同家系的鱼即可放在同一水泥池中进行饲养，40平米的水泥池可以养殖4000-5000条鱼苗。鱼苗的养殖管理按常规方法进行。混合养殖后每隔半年进行一次测量，利用测量3次的数据进行生长性能的评价。测量指标主要为体长(从吻端到尾鳍末端)、体宽(身体最宽处，不含背、腹鳍长度)、体重3个指标，每个家系测量40-60尾鱼。计算各个家系体长、体宽、体重的平均数。采用在家系建立中期由黄海野生牙鲆(YS)交配产生的家系作为对照组。考虑到家系的建立时间不尽相同，故我们取与对照组同时或在其后面建立的家系进行生长性能分析。比较不同家系与对照家系鱼苗体重的差异，将体重极明显大于对照家系的家系确定为快速生长家系(p＜0.01)，将体重明显大于对照家系的家系确定为较快生长家系(p＜0.05)；将体重极明显小于对照家系的家系确定为慢速生长家系(p＜0.01)；将体重明显小于对照家系的家系确定为较慢生长家系(P＜0.05)(表1)。

按照上述标准，我们对63个家系进行了生长性能评估。其中，有8个家系鱼苗(分别为2、4、5、19、36、42、43和57号家系)的体重明显大于对照组体重，其间差异极其显著，因为家系的建立时间不尽相同，故我们将与对照组同时或在其后面建立的家系确定为快速生长家系，共计有4个家系(即36、42、43和57号家系)；有12个家系鱼苗(分别为3、12、21、27、28、35、39、41、51、60、65和76号家系)的体重也明显大于对照组鱼苗体重，其间差异显著，同样，考虑到建家系的时间因素，我们将家系27、28、35、39、41、51、60、65和76号等家系称为生长较快家系；另外家系75号明显比对照组生长慢，将其称为慢速生长家系；剩下的家系的生长与对照组差异不够显著，将其称为生长速度一般的家系，共计49个家系。我们筛选出的4个快速生长家系的体长比对照组高22-28％，体重比对照组高99％以上。

表1：牙鲆不同家系鱼苗生长性能比较：

注：*表示体重与对照组相比差异显著(P＜0.05)；**表示体重与对照组相比差异极显著(P＜0.01)

利用获得的测量数据对不同杂交组合后代的生长指标进行了初步比较，从图2可以看出作为分布于两个不同地理区域的日本群体与抗病群体的杂交后代的生长性能体现出了明显的杂交优势，而同一地理种群内部的自交(黄海群体和抗病群体也属同一地理区域)产生的后代与杂交后代相比则没有体现生长优势。

(二)、牙鲆抗病家系的筛选：

当鱼苗生长至体长为9-11cm左右时进行感染实验，评价各家系的抗病性能。每个家系随机取样约100尾，每次感染50尾左右，重复实验1次。每个家系感染用鱼独立养殖在0.5m³的玻璃钢水槽中。感染用菌株为本实验室保存并经过鉴定的鳗弧菌菌株。将鳗弧菌在灭菌的2216E培养基(蛋白胨5g，酵母提取物1g，FePO₄·4H₂O 0.1g，陈海水1000mL)中28℃，200r/m培养约18h。测定OD600值，将菌液首先用灭菌的0.9％的NaC l生理盐水稀释成10OD的浓度，采用腹腔注射稀释的鳗弧菌进行预感染实验。预感染时，用生理盐水再将10OD浓度的菌液稀释成不同浓度(浓度范围，待补充)，每组用10-15尾鱼进行不同菌液浓度的预感染实验，摸索牙鲆鱼苗的半致死浓度。正式感染时，按照半致死浓度进行注射。本发明确定的牙鲆半致死浓度为4.9×10⁷CFU/ml上述浓度的细菌溶液。注射剂量为0.02ml菌液/克鱼；感染时水温控制在21-23℃，保持循环水、感染期间正常饲喂并充气。

注射后应定时观察鱼苗的存活状况，一般在注射鳗弧菌后约12h，鱼苗开始出现游动缓慢、活动力差等症状；20h开始出现少量死亡，濒临死亡的鱼呈现体色发黑的症状，腹部肿大，体表粘液增多，内脏外露，部分个体出现白便拖粪现象。死亡后短时间内鱼体僵硬。30h开始出现死亡高峰，48h内死亡数占整个感染中死亡总数的绝大多数，96h后基本稳定。感染实验设立对照组。对照组为在家系建立中期采用抗病群体和黄海群体交配的牙鲆鱼苗。根据感染后的鱼种成活率，结合与对照组成活率差异性检验的显著性水平，我们将成活率在60％以上的家系定义为抗病力强的家系，将成活率在39-60％的家系定义为抗病力比较强的家系，将成活率在17-39％的家系定义为抗病力一般的家系，将成活率在17％以下的家系定义为抗病力差的家系。按此标准，我们从59个牙鲆家系中鉴定出抗病力强的家系3个(家系50，61和68号)，抗病力比较强的家系17个(家系21，22，28，45，49，51，52，53，57，58，59，60，63，64，66，70和79)，抗病力一般的家系33个，抗病力差的家系6个(表2)。抗病力强的家系的成活率比对照组分别高36.9-40.5％。

3个牙鲆基础群体杂交组合建立的家系其平均存活率的比较见图3，抗病群体♀×日本群体♂(SR＝0.4144±0.1217)以及黄海群体♀×抗病群体♂(SR＝0.4601±0.0173)两种杂交组合建立的家系其平均存活率显著高于其他杂交组合的平均存活率，为抗病力提高的牙鲆家系。

表2.牙鲆不同家系鱼苗抗鳗弧菌病能力比较：

注：*表示成活率与对照组相比差异显著(P＜0.05)。

2007年8月我们将培育出的体长为8-10厘米的抗病牙鲆鱼苗40000尾推广到山东荣成市大鱼岛养殖场，经过近一年的养殖表明，我们研制出的抗病牙鲆鱼苗的成活率为80％以上，比普通牙鲆鱼苗的成活率(50％)提高了30％以上；同时抗病牙鲆的生长速度也比普通牙鲆鱼苗快10％以上。由此充分表明，我们建立的牙鲆抗病速生良种选育方法是十分有效的。