肠癌富伴侣分子－抗原肽复合物瘤苗及其制备方法

摘要

本发明提供了一种富伴侣分子－抗原肽复合物的肠癌瘤苗及其制备方法，所述瘤苗为富含多种结合了抗原肽的蛋白分子(伴侣分子)的混合物，此混合物即为肠癌瘤苗。其制备方法如下：肠癌细胞加榄香烯后常规培养后经39℃～42℃热处理30分钟，常规培养；再以高能X线照射，常规培养1日。裂解细胞，透析去除分子量低于60kD和高于180kD的分子，凝胶过滤结合SDS－PAGE收取70、90、110和170kD峰段处蛋白液，合并浓缩得富伴侣分子－抗原肽复合物。本发明方法简便、成本低，且产量高，可较好提取制备各种伴侣分子－抗原肽；所得瘤苗具有较强的免疫效应和淋巴增殖效应，较高的NK和CTL活性，在治疗肠癌和预防其复发上有较好的应用价值，预期产生良好的经济和社会效益。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种肠癌富伴侣分子-抗原肽复合物瘤苗及其制备方法。

(二)背景技术

已知细胞毒性T淋巴细胞(CTL)作用在抗肿瘤免疫中起主要作用。但不同的肿瘤有不同突变的CTL表位，故CTL作用不具备通用性，且其分离和鉴定也较困难。近年来发现某些伴侣蛋白分子如多种热休克蛋白(HSP)在肿瘤抗原递呈中的作用。热应激下大量合成的这类伴侣分子，具有结合肿瘤细胞内各种由突变产生的肿瘤抗原多肽(CTL表位)的特性。由此形成HSP-抗原肽复合物。通过与抗原提呈细胞(APC)表面的HSP受体结合而进入APC。与通常的APC对外源性抗原的处理不同，此时的肿瘤抗原肽主要由MHC I分子途径以“多肽-HSP-MHC I”复合物提呈在APC表面供CD8⁺T细胞识别并活化。从而诱导特异的抗肿瘤CTL反应。这个过程，目前发现由多种伴侣分子蛋白如HSP70，HSP90，HSP110，gp96，grp170，在多环节、途径，相互协调完成。伴侣分子蛋白瘤苗的制备不必分离和鉴定肿瘤抗原。此外，HSP还具有诱导树突状细胞(DC)成熟活化，促分泌细胞因子，传递信号和增强肿瘤细胞免疫原性等作用。实验和临床肿瘤治疗也证明了其诸多优越性。

但目前的研究多着眼于某一种伴侣分子蛋白，不能充分考虑到多种HSP分子协调作用，也没兼顾到不同的肿瘤抗原在不同环节需要不同的伴侣分子；而且伴侣分子-抗原肽量少和弱免疫原性，影响着疗效。这些都限制了伴侣分子-抗原肽瘤苗的临床效果。故伴侣分子在诱导机体抗癌免疫特别是特异性抗癌免疫中起重要作用。提取伴侣分子制备的瘤苗携带个体肿瘤的抗原肽库，成为多价瘤苗，因无MHC-I类抗原限制，也无须分离抗原肽(抗原肽已结合在伴侣分子上)，而具有独特优越性。

为此，提高肿瘤细胞的免疫原性，考虑伴侣分子之间的协调性以及获取足够的肿瘤抗原，对于伴侣分子瘤苗抗肿瘤免疫是非常重要的。近年发现中药提取物榄香烯能提高肿瘤细胞的免疫原性肿，从而提高肿瘤抗原肽的合成；放疗以及模拟热疗的热应激不仅能提高肿瘤细胞的免疫原性，更可诱导肿瘤细胞大量合成热休克蛋白等伴侣分子；在先前的实验中，我们发现伴侣分子局部密度提高有利于抗肿瘤特异性免疫形成；又鉴于肿瘤特异性免疫的形成需多伴侣分子在多环节协调起作用，本发明以榄香烯、非致死量射线照射和不同温度的热应激处理结肠癌细胞，提取已知的在抗癌特异性免疫形成中具有重要作用的主要伴侣分子，去除部分可能抑制抗癌免疫的蛋白分子，浓缩制备富伴侣分子-抗原肽复合物的瘤苗。可望一定程度解决肿瘤抗原肽的量、密度及其呈递中对多伴侣分子的要求。

进一步地，综合治疗是肠癌治疗的发展方向，如何进行综合治疗并取得最佳协同效果一直是研究的热点和难点。在本发明中，榄香烯因其直接抑制肿瘤生长而作为化疗药物已应用于临床；放疗、热疗因能大量杀灭肿瘤细胞而成为临床常用的的抗肿瘤手段，所以，预期该实验有助于形成一种有效的综合治疗肠癌的新方法：榄香烯全身给药抗癌(新辅助化疗)，同时术前局部热疗，然后外科手术治疗；最后利用切除的大肠癌组织制备富伴侣分子抗原肽复合物，以其活化DC细胞回输病人，进一步治疗并预防癌症复发。

肠癌是常见的恶性肿瘤，位居前三，近年来其发病又呈持续上升态势。肠癌治疗难点是癌细胞化疗耐药和转移复发；免疫治疗有其独特的优势，对化疗后转移或耐药的癌细胞更为有效可靠。本发明正是从中凝练出来的应用开发性研究成果。预期在治疗大肠癌和预防其复发上有较好的应用价值，产生良好的经济和社会效益。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种含多种、大量的伴侣分子-抗原肽的肠癌瘤苗及其制备方法。

本发明采用的技术方案是：

一种肠癌富伴侣分子-抗原肽复合物瘤苗，由如下方法获得：肠癌CT26细胞细胞悬液加入榄香烯至榄香烯浓度为3μg/ml，5％CO₂、37℃培养3周，经39℃～42℃水浴处理40分钟后，5％CO₂、37℃培养8小时，再以高能X射线(30Mv)垂直照射处理30秒，5％CO₂、37℃培养24小时，冰浴中超声裂解细胞，4℃低温透析袋透析去除分子量低于60kD和高于180kD的蛋白分子，凝胶过滤结合SDS-PAGE分析收取70、90、110和170kD峰段处蛋白液并合并，浓缩(浓缩是为了除去蛋白液中大量的水分，一般浓缩至体积为蛋白液体积的1/15～1/10即可)得富伴侣分子-抗原肽复合物，作为抗肿瘤疫苗(瘤苗)，即为所述肠癌富伴侣分子-抗原肽复合物瘤苗。

化疗药榄香烯是从中药莪术中提取的有效成分，能提高肿瘤细胞抗原性，从而使肿瘤细胞诱导机体更强的抗癌免疫；热应激和放射可诱导肿瘤细胞大量合成热休克蛋白等伴侣分子、也能提高肿瘤抗原性(表现为肿瘤抗原肽合成增加)。因此，本发明以不同条件的榄香烯、热应激和放射，体外序贯处理肠癌细胞，来提高癌细胞的抗原性并促进各种伴侣分子——肿瘤抗原肽复合物的形成，以利于抗肿瘤特异性免疫反应的诱导。这一设想具有创新性，是本发明解决的第一个技术问题。进一步，本发明以不同条件榄香烯、热应激和放射，体外序贯处理下肿瘤细胞的抗原物质(伴侣分子-抗原肽)的合成，摸索最佳合成的条件。这是本发明解决的另一个技术问题，这在一定程度上解决了肿瘤抗原的抗原性及量的问题。

本发明的技术关键是从经上述处理后的肠癌细胞裂解液中提取、制备含多种、大量的伴侣分子-抗原肽。这可进一步解决激活机体抗癌免疫的肿瘤抗原量及密度的问题，以及抗原呈递中要求多伴侣分子协调的问题。

本发明还涉及所述的肠癌富伴侣分子-抗原肽复合物瘤苗的制备方法，所述方法如下：肠癌CT26细胞细胞悬液，加入榄香烯至榄香烯浓度为3μg/ml，5％CO₂、37℃培养3周，经39℃～42℃水浴处理30～40min后，5％CO₂、37℃培养8小时，再以高能X射线垂直照射处理30秒，5％CO₂、37℃培养24小时，裂解细胞，去除分子量低于60kD和高于180kD的蛋白分子，凝胶过滤结合SDS-PAGE分析收取70、90、110和170kD峰段处蛋白液合并，浓缩得富伴侣分子-抗原肽复合物(即瘤苗)。

优选的，所述方法如下：取细胞浓度1×10³个/mL的肠癌CT26细胞细胞悬液，加榄香烯至榄香烯浓度为0.003mg/mL，5％CO₂、37℃培养3周，经42℃水浴处理40分钟后，5％CO₂、37℃培养8小时，再以30Mv高能X射线垂直照射处理30秒，5％CO₂、37℃培养24小时，冰浴中超声裂解细胞，4℃低温透析袋透析去除分子量低于60kD和高于180kD的蛋白分子，凝胶过滤结合SDS-PAGE分析收取70、90、110和170kD峰段处蛋白液合并，浓缩得富伴侣分子-抗原肽复合物，即为所述瘤苗。

本发明以射线照射、榄香烯和热应激处理肠癌细胞，提高其抗原性并诱导大量合成伴侣分子，采用低温透析、凝胶过滤结合SDS-PAGE粗提这些伴侣分子，以减少伴侣分子-抗原肽的量的损失；去除部分可能抑制抗癌免疫的蛋白分子(主要为小分子量的蛋白)，混合浓缩后制备富伴侣分子-抗原肽复合物的瘤苗，以期在一定程度上克服抗原量及密度问题以及多伴侣分子协调问题。结果表明，与目前常用的亲和层析和离子交换方法相比，本发明的方法更简便、成本低，且产量高。较好提取制备各种伴侣分子-抗原肽。

本发明实验观察了不同的热应激对伴侣分子表达的影响，发现42℃诱导的肿瘤细胞合成伴侣分子效应最强烈。进一步地，观察了射线照射、榄香烯与不同温度处理组合诱导伴侣分子-抗原肽的免疫效应。实验证明，射线照射、不同温度热应激和榄香烯处理均能有效提高瘤苗诱导的免疫学效应，其中以射线照射、42℃+榄香烯组的瘤苗诱导的免疫效应最强，显示出最强的淋巴增殖效应，最高的NK和CTL活性。

肠癌是常见的恶性肿瘤，位居前三，近年来其发病又呈持续上升态势。瘤苗对化疗后转移或耐药的癌细胞更为有效可靠。本发明成功摸索出从肿瘤细胞裂解液提取高免疫原性的富伴侣分子-抗原肽复合物的制备方法。形成了新型肠癌瘤苗，目前动物模型试验结果预示瘤苗在治疗肠癌和预防其复发上有较好的应用价值，预期产生良好的经济和社会效益。

本发明的有益效果主要体现在：方法简便、成本低，且产量高，可较好提取制备各种伴侣分子-抗原肽；所得瘤苗具有较强的免疫效应和淋巴增殖效应，较高的NK和CTL活性，在治疗肠癌和预防其复发上有较好的应用价值，预期产生良好的经济和社会效益。

(四)附图说明

图1为不同热处理的细胞裂解液蛋白电泳图；1泳道：39.5℃；2泳道：37℃；3泳道：42℃，4泳道：43℃；

图2为不同序贯处理制备的富伴侣分子-抗原肽Western Blotting图；1泳道：蛋白Marker；2泳道：42℃；3泳道：37℃；

图3为各组瘤苗免疫鼠的瘤体生长；

图4为各组瘤苗对荷瘤鼠的生存延长作用；

图5为各瘤苗免疫保护作用中的NK活性；

图6为各瘤苗免疫保护作用中的CTL活性。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

试剂及材料：

无菌室，超净台，高速低温离心机，截留分子量分别为50KD和300KD的透析袋、葡聚糖凝胶G-200、低温透析装置及耗材(华东医药)；

DYCP-31D型电泳槽、DYCZ-40D型转移电泳槽，CO₂培养箱，10％的胎牛血清RPMI-1640、及胰酶购于GIBO公司；伴侣分子：HSP70，gp96，HSP110和HSP170的荧光单克隆抗体购于Sigma公司；考马氏亮蓝蛋白测定试剂，蛋白marker(上海生工公司)；乳酸脱氢酶试剂盒及BCA蛋白定量试剂盒(Sigma公司)；MTT(AMRESCO公司)；酶标仪EXL-800(BIO-TEK，美国)；榄香烯注射液购自上海金山制药厂；CT-26结肠癌细胞株购于中国科学院上海细胞研究所；BALB/c小鼠购于国家啮齿类实验动物中心上海分中心；离心机(HITACHI)、高速离心机(BECKMAN)、电泳仪(BIO-RAD)、细胞培养箱(SHELL)、倒置显微镜(NIK0N)和超声细胞破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)；

pH7.5的细胞裂解液组成：20mmol/L Tris-Cl；20mmol/L NaCl；0.1mmol/L乙二胺四乙酸(ED-TA)；0.1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)；0.5mmolHexadecyltrimethylammonium bromide。

实施例1：不同序贯处理癌细胞：

方法与过程：

CT26细胞常规培养传代(RPMI-1640培养基，5％CO₂，37℃)，EDTA-胰蛋白酶复合消化液(购自GIBICO)消化贴壁细胞。收获细胞，以PBS离心洗涤(2000g，5分钟)；以RPMI-1640培养基制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×10³/ml，于培养基中加榄香烯注射液至其终浓度为3mg/L，分装于50ml培养瓶，20ml/瓶，分4组分别置于37℃、39.5℃、42℃和43℃水浴处理30分钟，常规培养(5％CO₂，37℃)过夜，次日以高能X射线(30MV)从培养瓶上方垂直照射0.5分钟(达200cGy剂量)。常规培养(5％CO₂，37℃)24小时后，EDTA-胰蛋白酶复合消化液收获细胞；未加榄香烯的CT26细胞亦分4组同样热应激和射线处理。共形成8组细胞，每组培养瓶数相同。

实施例2：富伴侣分子肿瘤抗原肽复合物制备

方法与过程：

将各组细胞常规收获并低温(冰浴)超声粉碎裂解：300W，10秒/次，间隔10秒，200次/管，裂解液低温高速离心，取上清SDS-PAGE分析，结果(见图1)提示42℃组的伴侣分子蛋白表达最高。按组合并上清，饱和硫酸铵盐析法分离蛋白，所获沉淀物(即为蛋白质)用0.0002mol/LpH7.4 PBS溶解，移入截留分子量为50KD透析袋4℃低温透析48小时(透析液为0.00002mol/L pH7.4的PBS)，去除低于50KD大分子，透析袋内容物转移入截留分子量为300KD透析袋同样低温透析，收集已经去除高于300KD分子的透析液。再移入50KD透析袋4℃，外加6万分子量的聚乙二醇粉，以浓缩透析袋的液体体积至约250ml。以葡聚糖凝胶G-200常规装柱(柱直径2cm，长1米)，将此250ml透析液凝胶过滤，对各收集管液取样作SDS-PAGE分析，根据电泳条带，收取并合并近70、90、110和170KD峰段处管的过滤液，作以70、90、110和170KD的标记。各组每一峰段收集液均为30ml。

实施例3：富伴侣分子肿瘤抗原肽复合物鉴定

方法与过程：

上述8组细胞经过裂解透析，每组过滤分成近70、90、110和170KD峰段处的4大管过滤液(每一大管均为30ml)，每组合并4大管过滤液，得120ml混合液，聚乙二醇法浓缩液体体积至10ml。Western blotting对所获混合液蛋白定性，结果如图2所示，制备物富含伴侣分子蛋白HSP70、HSP90、HSP110和HSP170，以42℃热应激+照射组发光最著，含量最高。常规BCA法测量蛋白浓度，42℃热应激+照射组为3g/L，37℃热应激+照射组为0.1g/L。

实施例4：DC的分离、诱导与活化

处死7周龄BALBL/c小鼠6只，无菌操作取股骨并抽取骨髓细胞液，骨髓细胞液收集在一起，以0.83％tris-NH₄Cl破红；PBS洗涤。每组常规Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化单个核细胞：

方法：

1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液3ml；

2.取骨髓细胞液与等量RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。离心机转速的增加和减少均匀、平稳，使保持清晰的界面；

3.离心后管内分为三层，上层为不含细胞骨髓液和RPMI1640培养液液，下层主要为红系和粒系各期细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板；

4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞2次；

5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数；

单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)＝(4个大方格内细胞总数/4)×10⁴×2(稀释倍数)；

6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率；

活细胞百分率＝活细胞数/总细胞数×100％

结果：活细胞百分率在96％。

试剂和材料：

10％小牛血清RPMI1640购自杭州吉诺公司，0.2％台酚兰染色液，淋巴细胞分离液(比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺)购自上海生工公司。

磷酸缓冲液(PB)配制

原液：

A液：0.2M NaH₂PO₄溶液

NaH₂PO₄              27.6克

或NaH₂PO₄·2H₂O      31.2克

蒸馏水溶解至         1000毫升

B液：0.2M Ha₂HPO₄溶液

Ha₂HPO₄·12H₂O       71.6克

蒸馏水溶解至1000毫升

实际配制(0.1M，PH7.2 PBS)：

A液       28毫升

B液       72毫升

加蒸馏水  100ml

经10磅、10分钟高压灭菌。4℃保存备用。

用10％FCS的RPMI-1640调整到3×10⁶/ml，加入6孔培养板(2ml/孔)中，共10孔.5％CO₂，37℃培养两小时后，吸出未贴壁细胞，用培养基轻洗，吸出悬浮细胞-80℃冻存。贴壁细胞采用含GM-CSF(100μg/L)，IL-4(50μg/L)，10％FCS的RPMI-1640，5％CO₂，37℃培养，3天换液一次。一周后加入各组纯化的富伴侣分子肽复合物溶液0.2ml，继续培养5至7天收获细胞，即为活化的DC。

实施例5：瘤苗的动物体内抗癌实验

于8周龄BALB/c小鼠的右后肢背部皮下第3、6、9、12、15天分别注射100ul实施例4制备的DC细胞悬液(细胞浓度1×10⁴)，并相应分组(共5组，8只/组)。末次注射3天后处死3只鼠，取脾并分离脾细胞(详见实施例6)。其余5只小鼠以活CT26肠癌细胞的攻击(1×10⁵个活细胞/次，皮下接种)。观察小鼠肿瘤生长情况、小鼠生存时间等。结果(见图3、图4)提示：榄香烯预处理后不同温度的热应激+照射组的瘤苗均具有明显的抗瘤攻击作用。而以42℃热应激+照射组的瘤苗的抗瘤攻击作用最强，表现为最小的肿瘤生长和最长的小鼠生存时间。

实施例6：免疫鼠脾细胞的分离

每组脱颈椎处死BALB/C小鼠3只，共15只，75％乙醇浸泡消毒，无菌条件下剖腹取出脾脏，用无菌PBS洗三次，切成直径5～10mm小块，置于120目不锈钢网中，不锈钢筛网放在平皿中并加入RPMI-1640培养基，用无菌试管末端轻轻挤压组织，收获细胞，0.83％Tris-NH₄Cl破红，塑板黏附除去巨噬细胞，用RPMI-1640完全培养基重悬细胞，配成2×10⁶/ml浓度的淋巴细胞悬液待用。

实施例7：瘤苗(富伴侣分子-抗原肽复合物)的免疫效应

1)瘤苗的细胞增殖刺激效应：

刺激原为经过不同条件处理的伴侣分子-抗原肽复合物100ul，增殖细胞为正常的BALB/c鼠脾淋巴细胞，分离方法同实施例6，配成2×10⁶ml的淋巴细胞悬液。两者各取50μl混合加入96孔板细胞培养板，每组3个复孔，将培养板置于37、5％CO₂、100％湿度条件下培养3天后，用MTT比色法测定吸光值(A490nm)。以增殖指数(PI)表示，PI＝(实验孔A值-肿瘤细胞孔)、淋巴细胞孔A值。加入96孔板常规培养3天，用MTT比色法测定吸光值(A)，以增殖指数PI表示细胞增殖效应；PI＝实验组A值/对照组A值。结果如下表：

表1：瘤苗的体外细胞增殖刺激效应

表1结果显示：

体外淋巴细胞增殖刺激效应实验显示所研制的瘤苗：榄香烯预处理后不同温度的热应激+照射组的瘤苗均具有明显的淋巴细胞增殖刺激效应。而以42℃+射线+榄香烯组的这种细胞增殖刺激效应最强大。

2)NK细胞活性的检测

YAC-I细胞作为靶细胞；以实施例6中分离的免疫鼠脾细胞为效应细胞，乳酸脱氢酶释放法(LDH法)检测NK细胞活性：按试剂盒(购自promega公司)说明要求将靶细胞、效应细胞、1640和NP-40分别加入100μl于相应孔(使靶细胞和效应细胞均为2×10⁵个)，常规培养。1000转/分离心5分钟，取上清50μl至新孔，加入酶底物。置于37℃ 10min后每孔加终止液50μl，酶标仪测定其OD值(A)。杀伤活性＝(A杀伤孔-A靶细胞释放孔)/(A靶细胞最大释放孔-A靶细胞释放孔)×100％。

结果见图5：

结果显示：

所研制的瘤苗：榄香烯预处理后不同温度的热应激+照射组的瘤苗均具有明显的刺激免疫鼠的NK活性的效应。而以42℃+射线+榄香烯组的这种活化效应最强大。

3)CTL杀伤活性的测定

将1ml免疫鼠的脾细胞(2×10⁶/ml)分别与6种不同条件制备的伴侣分子-肿瘤抗原肽复合物1ml混合，加入6孔板于37℃、5％CO₂、100％湿度条件下培养7天，设立对照，收集培养孔中悬浮细胞作为CTL效应细胞。以活CT26细胞作为靶细胞进行4-h⁵¹Cr释放杀伤实验：CT26细胞用200uCi Na₅₁CrO₄标记2h，然后细胞用无血清培养基洗3遍，靶细胞按不同的效∶靶比(E∶T)与效应细胞共育。取上清于γ计数仪上测cpm值。BALB/c小鼠B淋巴瘤A20细胞作为对照靶细胞。最大释放组为靶细胞加1％SDS；自发释放组为靶细胞加培养基。杀伤活性＝(实验组cpm-自发释放组cpm)/(最大释放组cpm-自发释放组cpm)×100％。

结果见图6。

结果显示：

所研制的各瘤苗：榄香烯预处理后不同温度的热应激+照射组的瘤苗均具有明显的提高免疫鼠的CTL活性效应。而以42℃+射线+榄香烯组的这种效应最强大。