监测血栓形成的装置和监测血栓形成的方法

摘要

本发明涉及一种监测血栓形成的装置，其中使抗凝血液流经模拟血管的通道，且同时释放抗凝处理或促进血液凝固，由此监测血栓形成。所述监测血栓形成的装置包括：血栓形成腔，在其至少一部分中提供诱发血栓形成的血栓诱发剂；入口管，其与血栓形成腔连接且血液经其流入血栓形成腔；以及药物管，其与入口管连接且经其供应释放抗凝处理的药物或促进血液凝固的药物。本发明涉及一种监测血栓形成的方法，其包括：使抗凝血液流入血栓形成腔，在血栓形成腔的至少一部分中提供诱发血栓形成的血栓诱发剂，同时释放抗凝处理或促进血液凝固，由此监测血栓形成。

说明书

技术领域

本发明涉及一种监测投与患者等的抗血栓形成药物的功效的方法，且具体来说，涉及一种在血流等效环境下用全血或含血小板的血浆全面评价血液凝固和血小板血栓形成的装置和方法。

背景技术

举例来说，动脉粥样化血栓形成(诸如心肌梗塞)引起严重的血栓形成，以致粥样斑块在动脉硬化部位破损，血小板粘附在包含暴露于血流的组织因子的胶原上。此外，血小板聚集、凝血系统的活化等联合发生引起严重的阻塞性血栓。心脏病(诸如心肌梗塞)是严重的疾病，且在日本是总体死亡的第二主要病因。

然而，血栓形成仅发生在心肌梗塞的动脉粥样硬化区，且全身血栓形成趋势并不极常发生。活体外检查不适合评价此类血栓症的血栓形成趋势和监测抗血栓形成疗法中的抗血栓形成效应。因此，重要的是获得在血流存在下对凝固和血小板(粘附和凝集)的全面评价。

迄今为止，血液凝固性已通过使用血浆测定活化部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、促凝血酶原激酶时间(thromboplastin time，PT)来评价。APTT主要反映内因性凝固，且PT主要反映外因性凝固。血小板检查通过使用富含血小板的血浆且添加诸如二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)或胶原的血小板活化物质来进行，由此根据血小板渗透速率等的改变评价血小板凝固性。另外，全血的凝固时间可用全血凝血时间、再添加钙后的全血凝血时间等来确定。

此外，使用全血的检查系统采用凝血弹性图(thromboelastogrm)，其监测凝血因子的活化、血小板凝集等。

然而，血栓在活体内血液中增长。不同的是，上述检查方法等是在处于封闭状态下的活体外测定。因此，不能观测到活体内血栓增长的状况。

作为对于解决上述问题的提议，专利文献1和非专利文献2和3揭露包含将具有待评价的抗血栓形成药物的血液传递到胶原细胞，和通过荧光标记血小板而用共焦显微镜监测血小板的粘附或凝集的方法。

然而，在文献中所述的发明中，观测是在抗凝药物的存在下进行。因此，由凝血系统中存在的血小板的粘附或凝集引起的血栓没有形成或血栓产生能力降低的实情是通过监测血小板的形态变化来评价。因此，所述评价没有反映出与凝固系统联锁的血小板活化。因此，这一发明有利于评价抗血小板药物的功效，但不能监测血栓本身和血栓形成的全过程。另外，荧光显微镜价格昂贵，因此其很少能用于一般检查。

此外，在专利文献2中，抗凝血液的流动性是通过使血液流经细齿梳样硅电池来测定。同样，专利文献2的方法也使用抗凝血液，因此不能确定凝固系统的影响。另外，在所述方法中血液的粘度具有极大个体差异和昼夜差异，因此其难以反映血液粘度的药物疗法。

血小板通过凝固系统活化，而凝固系统通过活化的血小板得到促进。换句话说，抗凝血液也抑制血小板的活化，因此不能观测到抗血栓形成药物的功效。另外，除非不进行任何抗凝处理，否则血液会迅速凝固，因此其不能用于检查中。

专利文献1：JP 2004-251630A

专利文献2：JP 2006-145345A

非专利文献1：Blood.1990；75：390-398

非专利文献2：Blood.1999；Aug 1：94(3)：968-75

发明内容

鉴于上述情况，已获得本发明且本发明意欲提供一种当监测投与患者等的抗血栓形成药物的功效时，在血流等效环境下用全血或含血小板的血浆(在本发明的说明书中，其可涵盖性地被称为“血液”)全面评价血液凝固和血小板血栓形成的装置和方法。

为了解决上述问题，本发明提供一种监测血栓形成的装置，其通过使抗凝血液流经模拟血管的通道，同时释放抗凝处理或促进血液凝固来监测血栓形成，所述装置包括：血栓形成腔，在其至少一部分中提供诱发血栓形成的血栓诱发物质；入口管，其与血栓形成腔连接且血液经其流入血栓形成腔；以及药物管，其与入口管连接且经其供应促进血液凝固(在下文中可称为“凝固促进”)的药物或释放抗凝处理的药物。在本发明中，术语“监测”不仅指用眼睛、成像目测评价血栓形成，而且也指通过压力测定等以数值项评价血栓形成度。

此外，本发明提供一种监测血栓形成的装置，其包括：血栓形成腔，在其至少一部分中提供诱发血栓形成的血栓诱发物质；入口管，其与血栓形成腔连接且血液经其流入血栓形成腔；以及血栓形成抑制剂入口管，其与血栓形成腔连接且使血栓形成抑制剂在穿过血栓形成腔后与血液混合。

在这种情况下，监测血栓形成的装置优选在基底材料上形成。

本发明的监测血栓形成的装置优选进一步包括对入口管和/或药物管加压的泵或抽吸与血栓形成腔连接且为从血栓形成腔排出血液而提供的排出管的泵。

本发明的监测血栓形成的装置优选进一步包含用于获取压力测量装置和血栓形成腔的图像的照相机。

此外，所述血栓诱发物质优选包括胶原。

所述血栓诱发物质更优选进一步包括组织因子(组织促凝血酶原激酶)。

此外，本发明提供一种监测血栓形成的方法，其包括：使抗凝血液流入血栓形成腔，在血栓形成腔的至少一部分中提供诱发血栓形成的血栓诱发物质，同时释放抗凝处理或促进血液凝固，由此监测血栓形成。在本发明中，术语“使血液流动同时释放抗凝处理或促进血液凝固”可为在通道中正发生抗凝-释放反应或凝固-促进反应的状况，且包含使释放抗凝释放剂或凝固促进剂的药物流动的同时使其与血液在通道中混合的状况或在与血液混合之后抗凝释放剂或凝固促进剂迅速流动的状况。

在本发明的监测血栓形成的方法中，优选地，抗凝处理为用诸如柠檬酸的钙螯合剂进行的处理且抗凝处理用游离钙供体释放。

在本发明的监测血栓形成的方法中，优选地，抗凝处理为用凝血酶适体进行的处理且抗凝处理用凝血酶适体的反义脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)释放。

在此，在本发明的监测血栓形成的方法中，优选通过使抗凝血液流入血栓形成腔，同时促进血液凝固而不释放抗凝处理来监测血栓形成。在这种情况下，促进血液凝固的方式优选为添加组织促凝血酶原激酶。

另外，在本发明的监测血栓形成的方法中，优选用至少一种相应于所用的抗凝处理剂的抗凝处理释放剂，使已用一种或一种以上抗凝剂抗凝的血液从抗凝处理中释放。在此，优选地，所述抗凝处理剂为接触相因子抑制剂和钙螯合剂，且所述抗凝处理释放剂为游离钙供体。此外，同样优选地，所述抗凝处理剂为接触相因子抑制剂和肝素，且所述抗凝处理释放剂为肝素酶。此外，同样优选地，所述抗凝处理剂为诸如凝血XII因子、激肽释放酶(kallikrein)等的接触相因子的抑制剂和凝血酶适体，且所述抗凝处理释放剂为凝血酶适体的反义DNA。凝血XII因子的抑制剂优选为玉米源胰蛋白酶抑制剂。

在本发明的监测血栓形成的方法中，优选测定血液流入血栓形成腔时和/或血液流出血栓形成腔时的压力。

在本发明的监测血栓形成的方法中，血栓诱发物质优选包括胶原和组织因子。

根据本发明的权利要求1所述的监测血栓形成的装置，所述装置包括：血栓形成腔，在其至少一部分中提供诱发血栓形成的血栓诱发物质；入口管，其与血栓形成腔连接且血液经其流入血栓形成腔；以及药物管，其与入口管连接且经其供应释放抗凝处理的药物或促进血液凝固的药物。因此，为防止在向患者投与抗血栓形成药物之后收集的血液在延伸到血栓形成腔的通道中凝固，处理抗凝血液，使其可通过在血栓形成腔中有意形成血栓来监测。因此，可在类似于人体内部的环境中，逐一监测抗血栓形成药物的功效。另外，可在采血时使用抗凝处理剂。优点在于采血之后的样品可储存一定时期且检查时间可任意选择。

根据本发明的权利要求2所述的监测血栓形成的装置，所述装置包括：血栓形成腔，在其至少一部分中提供诱发血栓形成的血栓诱发物质；入口管，其与血栓形成腔连接且血液经其流入血栓形成腔；以及血栓形成抑制剂的入口，其与血栓形成腔连接且使血栓形成抑制剂在穿过血栓形成腔后与血液混合。因此，血栓观测可以与如上所述类似的方式进行。另外，血液凝固不在血栓形成腔下游发生，因此，可防止对压力测定的影响且可监测更加细微的压力变化。

当本发明的监测血栓形成的装置在基底材料上形成时，可监测少量血液。另外，所述装置具有对入口管和/或药物管加压的泵或抽吸与血栓形成腔连接且为从血栓形成腔排出血液而提供的排出管的泵。因此，血液和促进血液凝固的药物可在预定压力或预定流速下，在预定时段内稳定地流动。

如果本发明的监测血栓形成的装置包括压力测量装置，则血栓形成度可转化成数值，因此可执行定量评价。

当血栓诱发物质包括胶原时，可容易地安置所述装置。当血栓诱发物质进一步包括诸如组织促凝血酶原激酶的组织因子以及胶原时，可高效地诱发血栓形成。

此外，如果本发明的监测血栓形成的装置包括用于获取血栓形成腔图像的照相机，则血栓形成的出现可以图像形式观测且随后可储存所述图像。

此外，根据本发明权利要求9所述的监测血栓形成的方法，所述方法包括：通过使抗凝血液流经血栓形成腔(在其至少一部分中提供诱发血栓形成的血栓诱发物质)且同时释放抗凝处理或促进血液凝固来监测血栓形成。因此，关于血栓诱发物质的血栓形成可通过使抗凝血液流动，同时促进血液凝固来监测，所述抗凝血液是通过使在向患者投与防止凝固的抗血栓形成药物之后收集的血液抗凝来获得。因此，可在类似于人体内部的环境中，逐一监测抗血栓形成药物的功效。另外，可于采血中用抗凝剂。优点在于采血之后的样品可储存一定时期且检查时间可任意选择。如果抗凝处理是用诸如柠檬酸的钙螯合剂进行，且抗凝处理是通过游离钙供体释放，则可容易地获得所述试剂且因此其为优选的。如果抗凝处理为用凝血酶适体进行的处理且抗凝处理是通过凝血酶适体的反义DNA释放，则可在执行检查的同时反映血液的生理学钙离子浓度。

另外，根据本发明的权利要求12所述的监测血栓形成的方法，其能够通过使抗凝血液流入血栓形成腔，不执行释放抗凝处理的操作，同时使血液迅速凝固来监测血栓形成。因此，可用少量血液来观测血栓形成，且可降低受检者的负担。此外，在这种情况下，药物管并不总是需要，因此可简化监测血栓形成的装置。在此，如果使用组织促凝血酶原激酶作为凝血促进剂，则血液凝固可通过活化避免XII因子活化和激肽释放酶活化的替代途径中的凝固系统来促进，由此监测血栓形成腔中的血栓形成。

另外，血栓形成可用简单操作来监测，通过用至少一种相应于所用的抗凝处理剂的抗凝处理释放剂释放使用一种或一种以上抗凝处理剂获得的抗凝血液。在这种情况下，当抗凝处理是用接触相因子抑制剂和钙螯合剂进行且抗凝处理是用游离钙供体释放时，或当抗凝处理是用接触相因子抑制剂和肝素进行且抗凝处理是用肝素酶释放时，在监测血栓形成时发挥效应的抗凝处理是用接触相因子抑制剂进行的抗凝处理，因此血栓形成监测可在更多生理条件下执行，尤其同时反映与血栓症相关的二价金属离子，诸如钙或镁离子。在这种情况下，当抗凝处理是用诸如凝血XII因子或激肽释放酶的接触相抑制剂和凝血酶适体进行且随后抗凝处理是由凝血酶抑制适体的反义DNA释放时，血液可长期储存。此外，当使用玉米源胰蛋白酶抑制剂作为凝血XII因子的抑制剂时，可高效地进行抗凝处理。

如果本发明的监测血栓形成的方法在血液流入血栓形成腔和/或血液流出血栓形成腔时执行压力测量，则血栓形成度可转化成数值，因此可通过极其简单的装置容易地执行定量评价。

此外，如果血栓诱发物质包括胶原和组织因子，则可容易地安置所述装置且可有效地诱发血栓形成。

附图说明

图1是说明根据本发明的第一实施例的监测血栓形成的装置的示意图。

图2(a)是说明根据本发明的第一实施例的实例3、5和6的血栓诱发物质15的安置情况的示意图，以及图2(b)是说明根据本发明的第一实施例的实例3、5和6的血栓形成结果的示意图。

图3(a)是说明根据本发明的第一实施例的实例4的血栓诱发物质15的安置情况的示意图，以及图3(b)是说明根据本发明的第一实施例的实例4的血栓形成结果的示意图。

图4是说明根据本发明的第二实施例的监测血栓形成的装置的主要部分(微芯片主体)的示意图。

图5是说明根据本发明的第二实施例的监测血栓形成的装置的主要部分(微芯片盖)的示意图。

图6是说明根据本发明的第二实施例的实例7的血栓形成位置的示意图。

图7是说明根据本发明的第二实施例的另一实例的监测血栓形成的装置的主要部分(微芯片主体)的示意图。

图8是说明根据本发明的第二实施例的另一实例的监测血栓形成的装置的主要部分(微芯片盖)的示意图。

图9(A)至图9(C)是说明根据本发明的第三实施例的另一实例的监测血栓形成的装置的主要部分的示意图，其中图9(A)说明整体图，图9(B)说明微芯片主体以及图(C)说明微芯片盖。

图10是说明使用本发明的监测血栓形成的装置系统化的血栓监测系统的示意图。

图11(A)是通过分析通过向血液中添加exocyt I适体以及exocyt II适体各10μM且在室温下储存血液15分钟后，添加两种适体的反义DNA各40μM产生的凝血弹性图波形获得的结果。图11(B)说明恰在采血之后得到的血液凝血弹性图波形。

图12(A)至图12(C)是说明根据本发明的第四实施例的监测血栓形成的装置的主要部分的示意图，其中图12(A)说明整体图，图12(B)说明微芯片盖以及图12(C)说明微芯片的基底材料。

图13是绘示实例17(对照)、实例18(肝素)以及实例19(Reopro)的压力测量结果的曲线图。

图14是绘示在添加0(对照)、0.2、0.5以及1单位/毫升肝素的情况下压力测量结果的曲线图。

图15是绘示在添加0(对照)、2、5以及10μg/ml肝素的情况下压力测量结果的曲线图。

1                       监测血栓形成的装置

10/110/311/411          血栓形成腔

11/111                  入口管

12/112/312              药物管

13/313/413              排出管

14/114                  缩窄部分

15/115/315              血栓诱发物质

16                      所产生的血栓

20/21/320/420           注射器

30/31/330/331/414/423   泵

40/41/340       压力传感器

100             基底材料(微芯片主体)

200             基底材料(微芯片盖)

100A/100B/100C  连接件

100D            连到压力计的线路

100E            调控阀

300/400         微芯片(监测血栓形成的装置)

306             泵控制单元

307             计算机

308             具有电荷耦合器件(Charge Coupled Device，CCD)照相机的荧光立体显微镜

317             增压管

322/422         凝血抑制剂入口

412             连接管

430CCD          照相机

431             镜头

432             照明光源

433             移动照相机的轨道

A/B             血栓监测系统

具体实施方式

在下文中，将参看附图依照最佳方式描述本发明。

图1是说明本发明的监测血栓形成的装置的第一实施例的示意图。

如图1所示，这一实施例的监测血栓形成的装置1包括血栓形成腔10；入口管11，其与血栓形成腔连接且血液经其流入血栓形成腔；以及药物管12，其与入口管连接且经其供应释放抗凝处理的药物或促进血液凝固的药物。

血栓形成腔10是呈实质上圆柱形状的形式，在其内部的一部分中具有诱发血栓形成的血栓诱发物质，且其可由透明玻璃、热塑性树脂等制造。血栓诱发物质的实例包含胶原、温韦伯氏因子(von Willebrand factor，vWF)、预先制备的血栓以及丝状物、棉花等的纤维基底材料。这些物质可单独使用或以其两种或两种以上的组合形式使用。其中，尤其优选的是胶原，因为胶原可容易获得，容易操作且以与实际血管类似的模型提供。胶原可包括组织因子。血栓诱发物质胶原或vWF优选处于涂布于血栓形成腔10内部的状态，以防止血栓诱发物质与血流一起流出。涂布可容易地执行，例如，如JP 05-260950 A或Blood.1995 Apr 1；85(7)：1826-35中所述，通过将胶原溶解于酸性溶液中，且于其中浸渍诸如玻璃或聚苯乙烯的具有亲水性的基底材料，接着洗涤且干燥来涂布材料表面。

此外，优选地，纤维材料或预先制备的血栓的血栓诱发物质可处于固定于血栓形成腔10内部的状态。此外，通过用胶原浸渍诸如棉花、无纺织物或纤维布的吸湿性薄纤维材料且将其干燥，可获得具有较高血栓诱发能力的血栓诱发物质。另外，可将基底材料浸入含有组织促凝血酶原激酶的胶原溶液中且随后干燥，以进一步提高其血栓诱发能力。

血栓诱发物质可根据血栓形成腔10的内径和监测目标来选择。当为模型提供诸如心肌梗塞的动脉粥样化血栓形成时，优选单独含有胶原或含有胶原与组织促凝血酶原激酶。另外，更优选地，缩窄部分可在血栓形成腔的通道上形成，以提供具有剪切应力的血栓形成腔。此外，在心脏脑梗塞等的血栓检查情况下，其中血栓可随血流从另一部分转移且粘附，以使另一部分的血管堵塞，优选地，使少量血栓预先粘附到血栓形成腔10上且作为血栓诱发物质而提供，接着，监测其上形成的血栓的增长。在毛细血管的血栓症检查情况下，血栓形成腔中的通道内部可分成多个通道，各通道具有10到30μm的狭窄宽度或厚度。如果血栓形成腔10具有宽度或厚度为100μm或以下的缩窄部分，则通道可被在所述缩窄部分中形成的少量血栓堵塞。因此，无需使用其他血栓诱发物质，从而血栓形成可通过凝血促进剂或抗凝释放剂监测。因此，本发明包含作为血栓诱发物质的这一缩窄部分。

血栓诱发物质可仅用胶原或vWF涂布。血栓形成腔10的涂布部分优选可经缩窄且提供为缩窄部分14，从而可监测高剪切应力诱发的血小板凝聚。在用作为血栓诱发物质的胶原涂布的情况下，优选基底材料为至少在提供为基底的部分处由平坦玻璃或塑料制成，以获得优良粘着性。另外，血栓形成腔10上的部分或待形成血栓形成腔10的血栓诱发物质的部分可构造为可拆卸盒。这一情况为优选的，因为所得血栓可容易地洗涤或观测，或血栓诱发物质可容易地交换为一种新物质。在这种情况下，所述盒可与硅橡胶O-环等一起形成不透液连接。优选地，与连接血栓形成腔10的入口管11的盒末端相对的盒末端可与容许排出血液的排出管13连接。优选地，排出管13可用垫片(cheese)分开，且因此可向其顶端提供压力计41，诸如膜片型压力计。另一方面，排出管13的顶端优选与储存容器(未绘示)连接。

与血栓形成腔10连接的入口管11可使用透明玻璃、热塑性树脂等制成。入口管11末端(其与入口管11连接至血栓形成腔10的另一末端相对)与供应血液的注射器20连接。注射器20与泵30和加压构件(未绘示)连接，以便以预定压力向注射器20的活塞加压。所述泵可为一般市售泵。或者，所述泵可为通过在恒压下用空气挤压注射器或使注射器反转以便活塞处于顶部且放置重物于活塞上而构造的注射器泵。

入口管11优选可由垫片分开，且其末端在入口管11靠近血栓形成腔10的一部分处优选具有诸如膜片式压力计的压力计40。

使注射器20中的血液经受抗凝处理。用于抗凝处理的抗凝处理剂的实例包含柠檬酸钠或柠檬酸钾、草酸钠或草酸钾、酸性柠檬酸盐葡萄糖(AcidCitrate Dextrose，ACD  )和乙二胺四乙酸盐(ethylenediaminetetraacetate，EDTA)。所述抗凝处理剂可以粉末、冻干制品或诸如水溶液的溶液形式使用。在这些抗凝剂中，一般优选3.2％柠檬酸钠，因为其容易获得。在这种情况下，优选将1体积抗凝处理剂与9体积血液混合。

通常，无抗凝处理剂的全血或血浆会在数分钟内凝固。凝固可通过添加诸如柠檬酸盐的钙螯合剂降低或消除。具体来说，已报道柠檬酸盐可抑制凝血酶原酶和外源性和固有X复合酶(tenase)的凝集和功能。

经柠檬酸盐处理的血液可以液态储存预定时段(例如，数小时到数天)且加工成血液制品，诸如细胞净化产物、富含血小板的血浆和缺乏血小板的血浆。含有柠檬酸盐的血浆可在约-70℃或-70℃以下长期(数月到数年)储存。在本发明中，也可使用全血和血浆，且在这种情况下，可优选再次添加钙等。

然而，通常，经再次添加钙的全血或血浆会自发凝固，这归因于在大多数储存容器中的任一者中的接触活化作用。在这种情况下，接触活化作用可在约2到4分钟内发生。因此，在本发明中，采血后，通过柠檬酸盐处理新制备的血液、经冷冻以便储存，且随后解冻后通过柠檬酸盐处理制备的血液或含有血小板的血浆可与诸如钙的抗凝释放剂一起添加，此后即刻监测血栓。

其他抗凝剂可包含肝素、水蛭素(hirudin)、水蛭肽(hirulog)(水蛭素C末端区的肽)、抑肽酶(aprotinin)、抗凝血酶抗体、凝血酶适体、玉米源胰蛋白酶抑制剂(1977，J.Biol.Chem 252，8105)。这些物质通过由于抑制凝血因子抑制凝固级联而抑制血液凝固，因此在本发明的说明书中有时将其称为“凝固因子抑制剂”。

用于监测的血液可通过任何方法取样，诸如将凝固因子抑制剂预先放置于注射器或真空血液收集容器中且随后收集血液的方法，或将凝固因子抑制剂快速添加到血液中，此后即刻采血的方法，以由此获得抗凝血液。

此外，将血液收集于含有诸如肝素的凝固因子抑制剂的真空血液收集容器中，且随后添加肝素酶和适于监测目标的抗凝处理剂以分解肝素，以使糖原经适于监测目标的抗凝处理剂置换。另外，将血液收集于含有柠檬酸的真空血液收集容器中，且随后添加适于监测目标的凝固因子抑制剂，诸如氯化钙、玉米源胰蛋白酶抑制剂或凝血酶适体。因此，抗凝血液可根据监测目标来收集。

与血栓形成腔10连接的药物管12可使用透明玻璃、热塑性树脂等制成。药物管12的末端(其与药物管12连接至血栓形成腔10的另一侧相对)与供应释放抗凝处理的药物或促进血液凝固的药物的注射器21连接。注射器21可与泵31和加压构件(未绘示)连接以便可以预定压力下向注射器21的活塞加压。所述泵可为一般市售泵。或者，所述泵可为通过在预定压力下用空气挤压注射器且使注射器反转以使活塞处于顶部且放置重物于活塞上而构造的注射器泵。如随后所述，将药物管12用抗凝释放剂或凝固促进剂填充。

对于用本发明的监测血栓形成的装置进行监测血栓来说，例如，将注射器20用经受用柠檬酸钠处理(溶液A)进行的抗凝处理的全血或血小板血浆填充。将注射器21用释放抗凝处理的药物(诸如氯化钙溶液(溶液B))填充。溶液A和溶液B分别经泵30和31供应到入口管11中，如此溶液B可达到5到20mmol的浓度，在此浓度下可引发溶液A的凝固级联。随后，将溶液A和溶液B在入口管11中混合，以使混合物流入血栓形成腔10。此外，例如，将能够诱发血栓形成的胶原等预先涂覆到血栓形成腔10的内部的一部分上，以形成血栓诱发物质。血栓形成腔可使用(例如)透明塑料管制成。血栓形成可通过监测穿过所述透明可见血栓形成腔10的血液的装置来容易地监测。

血栓形成的监测可通过使血液经预定时段流经用胶原处理的单元(血栓形成腔10)，且随后移除由此而来的血液通过目测评价。当馈送溶液A和溶液B的泵为气动泵时，溶液A和溶液B可在恒压下馈入。因此，关于胶原的血栓形成可通过从排出管13排出的血液流速的降低来监测。或者，当将压力计安装在入口管11和排出管13靠近血栓形成腔10的部分上时，关于胶原的血栓形成可通过观测血栓形成腔10的内部压力的变化来监测。或者，可在显微镜下通过提供厚度为500μm或500μm以下的血栓形成腔10来观测。具体来说，富含血小板的血浆的血栓可容易地观测，因为其高度可见且其血栓形成也可由肉眼观察到。此外，也可能通过专利文献1中所述的方法来荧光标记血小板且用荧光显微镜监测其荧光。

释放由诸如柠檬酸的螯合剂进行的抗凝处理的药物的实例包含：卤化钙，诸如氯化钙、溴化钙和碘化钙；无机钙盐，诸如磷酸钙、硫酸钙、硝酸钙和碳酸氢钙；和以下有机酸的钙盐，诸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、海藻酸、乳酸、葡糖酸、甘油酸和甘油磷酸，其为以游离钙供体形式提供的钙化合物。

当抗凝处理是用凝固因子抑制剂(抗凝处理剂)进行时，抗凝释放剂可根据凝固因子抑制剂来选择和使用。举例来说，当抗凝处理是用肝素进行时，可使用鱼精蛋白、肝素酶或抗肝素抗体作为抗凝释放剂。当抗凝处理是用水蛭素、水蛭肽和抑肽酶进行时，可分别使用诸如抗水蛭素抗体、抗水蛭肽抗体和抗抑肽酶抗体的抗凝释放剂作为抗凝释放剂。

当抗凝处理是使用抗凝血酶抗体作为凝固因子抑制剂进行时，抗凝释放剂的实例包含：完全失活的凝血酶，诸如D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-精氨酸氯甲基酮(D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginine chloromethylketone，PPACK)凝血酶；凝血酶的降解片段和含有凝血酶的抗体识别抗原决定基的合成多肽。

用于抗凝处理或释放抗凝的抗体优选包含以下抗体，其Fc结构域由木瓜蛋白酶等移除，以使其对补体系统或诸如鸡蛋抗体的抗体的效应最小化，没有活化人类补体系统的能力。

当将凝血酶适体(Blood.1993 Jun15；81(12)：3271-6或J Mol Biol.1997 Oct 10；272(5)：688-98.)(其为单链寡聚DNA)用作抗凝处理剂时，结合凝血酶适体且抑制其功能的物质(诸如反义DNA或反义核糖核酸(ribonucleic acid，RNA))可用作抗凝释放剂。当两种凝血酶适体(一种识别exocyt I且另一种识别exocyt II)组合使用时，与单独使用其中一者的情况相比，可获得极高的抗凝处理效应。在这种情况下使用的反义DNA可为针对凝血酶适体的一部分的反义DNA，只要其使凝血酶适体的抗凝血酶功能实质上失活即可。

另外，凝血酶适体和其反义DNA分别有效作为抗凝处理剂和抗凝释放剂的实况将参考如下所述的参考实例加以描述。

当抗凝处理是用肝素进行时，凝固系统不能在数小时内活化。因此，在监测血栓形成中血液可长期储存。然而，例如，存在抗凝处理不适于检查从经受肝素投药的患者收集的血液的情况。

另一方面，水蛭素、水蛭肽和抗凝血酶抗体是通过抑制作用于凝固系统的最后阶段的凝血酶来抑制纤维蛋白原转化为纤维蛋白的抑制剂。然而，凝固级联的接触相因子(诸如前激肽释放酶或XII因子)即使在完全抑制凝血酶的情况下也会逐渐活化，因此会发生凝固级联上游的活化。因此，存在不适于长期储存血液的情况。

同样，抑肽酶抑制激肽释放酶在接触相中的活性，以延迟内因性凝血级联。然而，凝固级联即使在抑制激肽释放酶活性的情况下也会逐渐活化，因此即使在抑肽酶存在的情况下血液也会在数小时后凝固。

因此，在约数十分钟后监测血液的血栓形成的过程中，有可能通过用凝血酶和/或抑肽酶的抑制剂进行抗凝处理来监测血栓形成。然而，在需要长时间开始监测或需要长时间监测的情况下，这可能不优选。

当血栓形成是在采血后1小时或1小时以上监测时，抗凝处理可使用凝血酶适体组合玉米源胰蛋白酶抑制剂、水蛭素和抑肽酶进行。或者，可将少量肝素(例如，小于1单位/毫升，其为不对凝固时间产生重大影响的含量)与接触相因子或血栓抑制剂组合使用。

当凝血酶适体与针对exocyt I和exocyt II的两种适体组合使用时，可获得极高的抗凝处理效应。此外，各别适体的反义DNA可立即释放抗凝处理。

同样，将接触相因子抑制剂(诸如玉米源胰蛋白酶抑制剂(XII因子抑制剂)或抑肽酶(激肽释放酶抑制剂))和凝血酶抑制剂(诸如凝血酶适体)预先添加到样品(血液)中，且随后添加凝血酶适体的反义DNA(凝血酶适体抑制剂)等。因此，仅血栓抑制剂的功能受到抑制，以释放凝血酶的功能性抑制作用，接着使样品快速流入血栓形成腔。结果，例如，外因性凝固级联可通过组织因子(组织促凝血酶原激酶)等活化，从而促进血液凝固且可监测生理学血栓形成。

或者，抗凝处理可用两种抗凝处理剂进行，且随后可提供能够释放抗凝处理(诸如螯合剂(柠檬酸)、肝素等)的玉米源胰蛋白酶抑制剂和游离钙供体(诸如氯化钙)或肝素酶，以释放相应抗凝处理，接着使血液流入血栓形成腔，以通过活化外因性凝固级联促进血液凝固。

在这种情况下，血栓诱发物质可优选含有适当量的组织因子(组织促凝血酶原激酶)。尤其优选地，血栓诱发物质可涂有通过混合胶原与组织促凝血酶原激酶且随后干燥制备的混合物，因为血栓形成仅在血栓形成腔中得到促进。当将涂有含有组织因子(组织促凝血酶原激酶)的胶原溶液的血栓诱发物质用作动脉粥样化血栓模型时，可进行反映病理学机制的监测。

另外，血栓形成可通过以下方式监测：向经受用诸如柠檬酸的钙螯合剂进行的抗凝处理的血液中添加游离钙供体和胰蛋白酶抑制剂，且使血液快速流入血栓形成腔，或向经受用肝素进行的抗凝处理的血液中添加肝素酶和胰蛋白酶抑制剂，且随后使血液快速流入血栓形成腔。如上所述的方法(其中血栓通过混合使用一种或一种以上抗凝处理剂获得的抗凝血液与至少一种相应于所用抗凝剂的抗凝处理释放剂混合且随后使血液快速流入血栓形成腔来监测)可采用如下文所述的如图9(A)至图9(C)所说明的监测血栓形成的装置。

与任何与钙等形成螯合物的抗凝处理剂，诸如柠檬酸和EDTA相比，上述血栓抑制剂，诸如水蛭素和凝血酶适体、接触相因子的合成低分子抑制剂和蛋白质的抗凝处理剂价格昂贵。然而，其不改变诸如钙、镁和锌的二价金属离子的浓度，因此监测可反映患者血液中具有原始浓度的这些离子的血栓形成。因此，更多反映患者临床情况的监测变得可能。

血液凝固可通过抑制诸如活化因子XII或激肽释放酶的接触相因子而加以抑制。然而，已报道XIIa和激肽释放酶的活化并不非常有助于实际生理学血栓或止血。实际上，即使在先天性缺乏因子XII、前激肽释放酶等的患者中也没有发现出血等。尤其，在诸如心肌梗塞的动脉粥样化血栓形成中，普遍认识到凝固系统是通过组织因子活化，这归因于由动脉硬化造成的斑块。因子XII可主要通过对活化血小板起作用的凝血酶活化。因此，在执行抗凝处理的过程中，当将抑制因子XII或前激肽释放酶活化的抑制剂或抑制活化因子XII或激肽释放酶的抑制剂用作抗凝剂时，无需添加抗凝释放剂。通过向血液中添加任何活化外因性凝固的物质，诸如组织因子(例如，组织促凝血酶原激酶)或血栓诱发物质而不是抗凝处理剂或通过向血栓诱发物质中添加所述物质，以替代途径活化凝固系统，以避免XII因子活化和激肽释放酶活化促进血液凝固，因此可在血栓形成腔中监测血栓。

可在通过添加活化外因性凝固的物质(诸如组织因子)而不添加抗凝释放剂促进血液凝固后监测血栓形成中所用的抗凝处理剂的实例为合成低分子抑制剂，诸如激肽释放酶抑制剂PKSI-527(Thromb Res 57：889，1990)和D-Phe-Arg-CK(其为活化的因子XII抑制剂，Cal Biochem，Co.，Ltd.)。另外，蛋白质抑制剂包含针对凝固级联中接触相蛋白酶的抗体，诸如抗激肽释放酶抗体、抗前激肽释放酶抗体、抗凝固因子XII抗体、抗活化凝固因子XII抗体和玉米源胰蛋白酶抑制剂。

对于在通过添加活化外因性凝固的物质而不添加抗凝释放剂促进血液凝固后监测血栓形成来说，尤其就可用性和抗凝能力的观点来说，优选使血液经受一次用柠檬酸与玉米源胰蛋白酶抑制剂的组合或凝血酶适体与玉米源胰蛋白酶抑制剂的组合进行的抗凝处理，且此后将血液储存，因为可提高监测操作的自由度。此外，临到血栓监测前，维持用玉米源胰蛋白酶抑制剂进行的抗凝处理，同时由游离钙供体或凝血酶适体的反义DNA部分释放另一抗凝处理。在这种情况下，作为动脉粥样化血栓的模型，优选通过使用涂有胶原或含组织促凝血酶原激酶的胶原的血栓诱发物质来活化外因性凝固以促进血液凝固。

用于血栓监测的容器(诸如供应血液的注射器和真空血液收集容器)优选涂有肝素或具有抗血栓能力和血液相容性的物质，诸如聚乙烯内酯酰胺(polyvinyl lactoamide，PVLA)或聚丙烯酸2-甲氧基乙酯(poly-2-methoxyethyl acrylate，PMEA)。

在根据本发明的另一实施例的监测血栓形成的装置中，管和血栓形成腔可在基底材料上通过诸如微芯片的细通道彼此整合。

图4是根据本发明的第二方面监测血栓形成的装置的主要部分的平面图。在图4中，将基底材料100开槽且于其上形成线路。如下配置所述实施例。在小基底材料上，使作为监测血栓形成的装置的主要部分的血栓形成腔、与血栓形成腔连接且血液经其流入血栓形成腔的入口管和与入口管连接且抗凝释放剂或促进血液凝固的药物经其引入血栓形成腔的药物管彼此整合，且以微芯片线路形式提供。在这一实施例中，除主要部分之外，在基底材料上整合的部分与第一实施例的部分相同。

在图4中，基底材料100为微芯片的主体，且其材料可为金属、玻璃、塑料、硅酮等中的任一种。考虑到观测血栓等，优选透明材料。考虑到形成线路，优选塑料。因此，尤其优选透明塑料。当其由诸如聚二甲基硅氧烷(polydimethyl siloxane，PDMS)的硅树脂制成时，其粘着性优良。因此，线路可通过与盖接触粘结而不粘着等形成。当使用由聚苯乙烯制成的基底材料时，通道可容易地用PVLA涂布且经受抗血栓处理。此外，PMEA也可允许简单有效的抗血栓处理(参见，参考实例4)。

图5为以微芯片盖形式提供的基底材料的平面图，其与图4的基底材料100重叠且粘结。图5的基底材料200为透明玻璃片或由塑料等形成的板或薄片。基底材料200以盖形式提供，且与基底材料100重叠且粘结，因此基底材料的线路可由血栓形成腔110、入口管111和药物管112形成。

为了提供具有血栓诱发物质115的血栓形成腔110的内表面，例如可将胶原等涂覆到基底材料200的预定安置位置上。当基底材料100和基底材料200通过接合或装配彼此粘结同时使基底材料200的胶原-涂覆表面导向内时，可获得具有血栓形成腔的监测血栓形成的装置。因为应用简单，所以可优选将胶原涂覆到没有凹槽的平坦基底材料200上。另外，组织促凝血酶原激酶优选在与胶原混合之后涂覆，因为可获得具有较高血栓诱发能力的血栓诱发物质。此外，为了用涂覆胶原容易地形成血栓，可使具有胶原涂覆部分的玻璃经受其他处理，诸如用磨砂玻璃等置换所述玻璃，以使得可增加表面积。

基底材料100的连接件100A、连接件100B和连接件100C分别与形成入口管、药物管和排出管的部分的管(未绘示)连接。因此，连接件100A和连接件100B各自经所述管与泵(未绘示)连接。抗凝血液从连接件100A注入，且相应于抗凝处理剂的抗凝释放剂从连接件100B注入。

根据此实施例，血栓形成可用极少量的血液监测，因此可使受检者的负担变小。另外，从基底材料200侧面附着于基底材料200上的血小板可通过用诸如米帕林(mepacrine)的荧光试剂标记血小板来监测。

此外，线路100D具有可密封末端，其中封闭有空气。因此，线路100D提供为压力计。当线路100D提供为压力计时，线路100D的末端优选可具有用于释压或增加灵敏性的调控阀100E。调控阀100E可经帽或粘合带封闭，且其体积可根据所需灵敏性随诸如树脂的包装而变。线路100D形成为狭窄的，以便防止血液与空气混合且防止空气逸散。线路100D的厚度取决于基底材料100的材料，但为约0.1mm到0.5mm。如果监测血栓形成的装置的入口管111的内部压力因血栓形成而增加，则线路100D中的空气受血液压缩，从而抗凝血液可就此引入线路100D中。内部压力可通过线路100D中血液的不时移动来监测。

血小板与胶原的粘附、凝固系统对于活化的血小板的活化和活化的血小板因血小板凝集的累积可分别通过本发明监测血栓形成的装置和/或监测血栓形成的方法监测。

此外，为再现动脉粥样化血栓形成的血栓形成，缩窄部分14和114分别在血栓形成腔10和110上形成。因此，可监测也反映产生血小板凝集的高剪切应力的监测。

图9(A)至图9(C)是表示根据本发明的第三实施例的监测血栓形成的装置的主要部分的示意图。图9(A)至图9(C)描绘凝血抑制剂入口管322和增压管317，增压管317使凝血抑制剂与位于血栓形成腔下游的血液混合。在此实施例中，在血栓形成腔上游没有提供药物管。

根据第三实施例，临到测量前向在添加抗凝处理剂(例如，柠檬酸和玉米源胰蛋白酶抑制剂)之后收集的血液中进一步添加抗凝释放剂(例如，游离钙供体)，且随后将其引入注射器320中。随后，将用于加压填充血液的液体(诸如矿物油)从与注射器320连接的增压管317压入注射器中，由此将血液挤压到微芯片300。

施加于样品注射器320上的压力的增加显示通道因血栓形成的堵塞状况，因此用压力变化进行的血栓形成的监测尤其适于监测形成阻塞性血栓的强动脉粥样化血栓模型。血栓诱发物质可为(但不特定限于)由胶原和组织因子制备的物质。举例来说，当血液凝固通过活化外因性凝固而促进时，所述血栓诱发物质有效监测血栓。

在测量压力时，为了得到伴随血栓形成的更准确的通道中的压力测量结果，如图9(A)至图9(C)所示，使凝血抑制剂经凝血抑制剂入口管322引入，且使其经在微芯片300中形成的通道与位于血栓形成腔下游的血液混合。因此，可防止在血栓形成腔之后的通道中的血液形成血栓。因此，所述配置为优选的，因为可特别准确地测量通道中压力的变化，所述变化归因于随着血栓形成腔中血栓形成而使通道变狭窄或闭合。

所述凝血抑制剂可优选为(但不特定限于)本发明所用的抗凝处理剂。考虑到成本有效性和操作性能，优选合适地选择任何防止因蛋白质变形而引起的血液凝固的凝血抑制剂，包含碱性或酸性溶液、醇、尿素和十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)。

在此，在图9(A)至图9(C)所说明的实施例中，本发明的监测血栓形成的装置包括在排出管313上而不是增压管317上提供的抽吸泵，从而所述装置可测定基于抽吸压力(负压)变化的血栓形成度。这一配置可产生更高效的测量，同时防止压力馈送矿物油等的液体与血液在接触区中混合且当在使用经分隔于随后描述的层中的液体间接挤出血液的泵的情况下血液量较小时馈入混合物的情况发生。

此外，无需使用诸如注射器的密闭容器作为供应血液到本发明的监测血栓形成的装置中的容器(样品槽)形式。因此，所述容器可没有盖且可对空气敞开。结果，可简化监测血栓形成的装置。此外，在本发明的监测血栓形成的装置中，通道的内部压力为负的。因此，当本发明的监测血栓形成的装置由微芯片制备时，例如，即使在微芯片主体与微芯片盖之间不完全粘附，也根本不会泄漏血液。在一些情况下，可直接以仅通过微芯片主体与微芯片盖装配在一起得到的监测血栓形成装置形式使用，只要所述装配准确即可。

图10说明另一系统化血栓监测系统A。

图10的血栓监测系统A用密度小于血液的液体填充微馈料泵330。随后，将液体压入血液通过增压管317置入其中的样品注射器320中且随后与血液分层，由此将血液挤压到微芯片300中。使挤出的血液与从药物管312注入的抗凝释放剂混合，接着使其到达血栓形成腔311。在微馈料泵330中用以泵送血液的液体可为油或脂肪中的任一种，诸如液体石蜡、矿物油和硅油，以及生理盐水溶液。以此方式，有可能防止微馈料泵330和压力传感器340因间接挤出血液而受血液污染。

此外，这一通过相对于血液分隔于层中的液体间接挤出血液的泵可用于根据本发明的任何实施例的监测血栓形成的装置中。

此外，压力传感器340可测定通过微馈料泵330施加到样品注射器320上的压力。

此外，在所述血栓监测系统A中，血栓形成的状况可通过图像分析更详细地识别。具体来说，在用奎吖因(quinacrine)标记血小板和白血球且随后监测其与胶原的粘附和凝集的情况下，通过图像分析监测归因于荧光显色的每单位面积的亮度。因此，可评价监测结果且将其储存为数据。图像分析可通过由计算机307处理由具有CCD照相机的荧光立体显微镜308捕获的图像且在显示器上表现图像来进行。

因此，在血栓监测系统A中，有可能从图像分析结果和施加到样品注射器320上的压力的变化确定血栓形成的全面状况。

此外，所述血栓监测系统可使用本发明的任何实施例的监测血栓形成的装置系统化。

图12(A)至图12(C)是说明根据本发明的第四实施例监测血栓形成的装置的示意图。所述监测血栓形成的装置具有用于观测血栓形成的照相机。

在监测血栓形成的装置中，例如，向用柠檬酸和玉米源胰蛋白酶抑制剂抗凝的血液中添加抗凝处理释放剂(例如，游离钙供体)且使其快速填充于注射器420中。注射器420通过与排出管413连接的泵414抽吸，以使血液穿过血栓形成腔411，由此形成血栓。血栓形成度可通过抽吸压力(负压)的变化来确定。

同样，为了防止血液在穿过血栓形成腔后凝固由此堵塞排出管413，或防止影响压力测量，血栓形成抑制剂入口管422使血栓形成抑制剂与穿过血栓形成腔后的血液混合。

此外，将照相机430(例如，CCD照相机)配置在微芯片400下面以获取血栓形成腔的图像，因此可有效使用微芯片上方的空间。轨道433能够在血栓形成腔下面来回移动照相机430。通过使用具有储存其位置的量化为X轴和Y轴的函数的照相机430，可在绕多个特定点规则地移动的同时获取图像。如上配置，即使将照相机430的放大率设定为高水平，也有可能监测在血栓形成腔411的广阔区域上血栓随时间的形成过程。此外，光源432(例如，发光二极管(Light Emitting Diode，LED)优选位于照相机430周围，因为在保持光源432与照相机430的位置关系的同时，可同时移动光源432。优选地，光源432能够发射可激发特定荧光物质的波长的光以及白光，这取决于将作为成像目标而提供的荧光物质，由此允许激发各种荧光物质。

实例

在下文中，将以特定实例详细描述本发明。然而，本发明不局限于这些实例。

实例1

使用图1中所说明的监测血栓形成的装置，以用50ml经柠檬酸盐处理的血液(溶液A)填充注射器20，其中在采血后立即将9体积份血液与1体积份3.2％柠檬酸钠混合，且用10ml 0.2M CaCl₂(溶液B)填充注射器21。使注射器20和21与内径为3mm的透明尼龙管(入口管11和药物管12)连接。使两个管在T形接头(垫片)处连在一起，且随后经内径为3mm且长度为3cm的单个尼龙管(入口管11)与内径为3mm且长度为1cm的聚碳酸酯血栓形成腔10连接。血栓形成腔10本身构造为可移动盒。所述盒与尼龙管(入口管11)之间的接头部分经由硅橡胶制成的O形环而不透液。玻璃部件通过基于环氧树脂的粘着固定于盒内部，由此形成缩窄部分14。缩窄部分14经设计以便缩窄部分14的最窄部位可具有1.5mm的内径(缩窄部分14与内壁之间的最大间隙)。另外，血栓形成腔10经由硅橡胶制成的O形环与具有相同直径且由相同材料形成的作为排出管13的管不透液连接，且因此制成如图1所说明的血栓监测装置1。应注意到凸缘型压力计40和41分别经由接头(垫片)安装在入口管11和排出管13靠近血栓形成腔10的部分上。另外，预备血栓形成腔10的内表面上缩窄部分的玻璃材料，以使得通过浸入含有1％I型不可溶胶原(由Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造)的0.1N乙酸溶液中且随后干燥使胶原作为血栓诱发物质15涂布于在内部的玻璃缩窄部分上。使注射器20和21反转以便活塞处于顶部且随后放置重物于活塞上，以使溶液A和溶液B分别以5ml/min和0.5ml/min流入注射器泵。

当溶液A和溶液B流动10分钟时，在数分钟后，在入口管11的压力计40与排出管13的压力计41之间出现差异，且随后这一差异随时间而增加。同时，证实从排出管13排出的血液也逐渐减少。当所有溶液都流完时，使生理盐水溶液流入监测血栓形成的装置1中以洗涤血栓形成腔10。因此，可通过目测在血栓形成腔10中发现血栓形成。

实例2

以与实例1类似的方式制备监测血栓形成的装置1且随后监测血栓形成，例外之处在于向实例1的溶液A中进一步以1mg/ml的浓度添加未分级分离肝素(由猪粘液制备)。

在这种情况下，不存在压差且没有发生血液流动减少，且在用生理盐水溶液洗涤后通过目测不能在血栓形成腔10中发现血栓。

实例3

以与实例1类似的方式制备监测血栓形成的装置1，例外之处在于：提供直径为3mm且长度为5cm的玻璃管作为盒型血栓形成腔10；注射器20和21各自与由电动机驱动的注射器泵连接；且，如图2(a)所示，代替缩窄部分14和作为血栓诱发物质15涂布在狭窄部分14上的胶原，将浸于实例1的胶原中且在4℃下空气干燥的长度为1.5cm的丝状物作为血栓诱发物质15通过粘着剂附着在血栓形成腔10的内表面上，血栓形成腔10深入玻璃管与入口管11的连接部分的内部5mm。

在溶液A以3ml/min流入注射器20且溶液B以0.3ml/min流入注射器21历时15分钟之后，卸下血栓形成腔10且随后将其内部用生理盐水溶液洗涤。结果，目测证实长度为约1cm且厚度为约1mm的呈如图2(b)所示的彗星形状形式的血栓16附着在玻璃管的内表面上，血栓16似乎由丝状物的下游侧作为开始点形成且延伸至下游。在此，认为血流的影响可导致彗星形状的血栓。

血栓的最宽部分的宽度为约3mm。

实例4

以与实例3类似的方式制备监测血栓形成的装置1，例外之处在于：如图3(a)所示，将50μl未经抗凝处理的血液通过Pasteur移液管滴到玻璃管内表面上且随后使其在室温下静置15分钟，由此获得直径为约2mm的盘状血栓代替丝状物作为血栓诱发物质15。

以与实例3类似的方式，在使溶液A和溶液B流入后，移出血栓形成腔10且随后用生理盐水溶液洗涤其内部。结果，目测证实长度为约1cm且厚度为约1mm的呈如图3(b)所示的彗星形状形式的血栓16附着在玻璃管的内表面上，血栓16向下游延伸，同时环绕作为血栓诱发物质15的血栓。在此，认为血流的影响可导致所产生的血栓呈彗星形状。

血栓的最宽部分的宽度为约3mm。

实例5

以与实例3类似的方式制备监测血栓形成的装置1且随后监测血栓形成，例外之处在于：相对于实例3的溶液A来说，向溶液A中进一步以0.1mg/ml的浓度添加作为抗凝处理剂的阿加曲班(Argatoroban，注册商标，由Daiichi Pharmaceutical Co.，Ltd.制造)。

结果，目测未证实在用生理盐水溶液洗涤后的玻璃管中存在血栓。

实例6

以与实例3类似的方式制备监测血栓形成的装置1且随后监测血栓形成，例外之处在于：相对于将全血用作溶液A来说，通过以1μg/ml的浓度添加水蛭素，且相对于将全血用作溶液B来说，通过添加以1mg/ml的浓度溶解于生理盐水溶液中的抗水蛭素多克隆抗体(由COSMO BIO CO.，LTD.制造)来制备抗凝血液。

在这种情况下，证实与实例3几乎相同的血栓形成。

实例7

存在制备的10ml全血(溶液A)，使其通过采血后立即向血液中添加10μg抑肽酶和1μg/ml重组水蛭素(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)经受抗凝处理；和1ml溶液(溶液B)，其是通过向1小瓶/毫升作为促进血液凝固的药物的促凝血酶原激酶试剂(由Sysmex Corporation制造)的1000倍稀释的生理盐水溶液中添加Fc结构域由木瓜蛋白酶固定树脂移除的抗水蛭素多克隆抗体(由COSMO BIO CO.，LTD.制造)来制备。

对于制造监测血栓形成的装置来说，使用如图4所示的基底材料100，其由聚二甲基硅氧烷制成，其宽度为40mm，长度为70mm且厚度为1.5mm；和图5所示的基底材料200，其厚度为1mm且由具有相同尺寸的玻璃制成。

含有血栓形成腔110的线路由在具有如图4所示的图案的基底材料100的表面上切割深度为0.5mm的凹槽形成。提供为入口管111的凹槽部分的深度为1mm。线路100的长度为30mm。直径为1mm的通孔在凹槽末端形成且提供为经可操作且可封闭帽封闭的调控阀100E。血栓形成腔110长度为30mm且在较宽部分处的宽度为2.5mm且具有宽度为0.5mm的缩窄部分114。随后，提供直径为1mm的通孔作为各连接件100A和100B。另外，提供直径为2.5mm的通孔作为连接件100C。

如图5所示，在覆盖基底材料100的缩窄部分114的位置上将呈宽度为10mm的条带形式的胶原作为血栓诱发物质115涂覆到基底材料200上。可进行胶原的涂覆以使相应于基底材料200的缩窄部分114的矩形遮蔽带附着且随后在其上涂布基于硅酮的剥离剂SRX-211(Dow Corning Toray Co.，Ltd.)。随后，剥去遮蔽带。随后，将溶解于0.1N乙酸中的1型胶原(WakoPure Chemical Industries，Ltd.)溶液滴下，以使其1％在不含剥离剂的玻璃区上且随后使其在25℃下静置1小时。此后，将剥离剂层上的胶原用纯水洗去，且使胶原仅涂覆到相应于缩窄部分114的未涂覆剥离剂的矩形玻璃区。

随后，使基底材料200的胶原涂覆表面与基底材料100的线路形成表面面对面粘结在一起。

连接件100A和100B从基底材料100的背面(无线路侧)与内径为1mm的硅胶管连接，且随后分别与用溶液A填充的10-ml注射器和用溶液B填充的1-ml注射器连接。这些注射器分别各自附着注射器泵。应注意的是，另一连接件100C与内径为2.5mm的硅管连接，所述硅管提供为排出管。

溶液A以0.3ml/min的流速从连接件100A注入。溶液B以0.03ml/min的流速从连接件100B注入。

使溶液A和溶液B分别从连接件100A和连接件100B处流出历时5分钟。从连接件100A注入生理盐水溶液以洗去血液。结果，证实血栓主要形成在基底材料200的胶原处理表面上的图6的区域a和区域b上。

实例8

以与实例7类似的方式制备监测血栓形成的装置且监测血栓形成，具有下列例外之处：如此制备溶液A：在采血后立即向血液中以0.3mg/ml的浓度添加Fc结构域由木瓜蛋白酶截断的抗因子XII多克隆抗体(由COSMOBIO CO.，LTD.制造)和0.3单位的未分级分离肝素(猪来源，Wako PureChemical Industries，Ltd.)；溶液B通过稀释促凝血酶原激酶试剂(由Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.制造)50倍来制备；通过用滴下的通过溶解高锰酸钾于浓硫酸中制备的浓度为2g/l的溶液预处理图8所示的透明聚苯乙烯基底材料200的胶原涂覆区(厚度为1mm)，在25℃下使反应物经受10分钟，接着用水快速洗涤来进行胶原的涂覆，胶原通过在预处理区上滴下1型胶原(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)已以浓度1％溶解的溶解于0.1N乙酸中的溶液，且使其在25℃下静置1小时，接着用纯水洗去来涂覆；且对于图7所示的血栓形成腔110使用无缩窄部分的基底材料100。应注意的是，将基底材料100的连接件100C提供为直径为1mm的通孔且使其与作为排出管的直径为1mm的硅酮管连接。

使溶液A和溶液B流动10分钟后，从连接件100A注入生理盐水溶液以洗去血液，由此证实红色血栓附着在基底材料200的胶原涂覆区的通道部分上。

实例9

以与实例7类似的方式制备监测血栓形成的装置且监测血栓形成，例外之处在于：

如此制备溶液A：在采血后立即通过以0.05mg/ml的浓度添加抑肽酶且以1μg/ml的浓度添加重组水蛭素(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)使血液经受抗凝处理且随后添加奎吖因(Sigma Co.，Ltd.)；且

连接件100B经帽封闭且随后以1ml/min的流速仅从连接件100A注入溶液A。

当用聚焦在胶原涂覆表面上的荧光立体显微镜从基底材料200侧观测时，确认绿色奎吖因在胶原涂覆表面的部分上荧光显色且这一区域随时间扩散为斑点区。10分钟后，证实在大多数胶原涂覆表面上有可归因于血小板粘附的绿色荧光显色。

实例10

以与实例9类似的方式制备监测血栓形成的装置且监测血栓形成，例外之处在于溶液A是在不添加喹喔啉的情况下制备。

血液以1ml/min的流速从连接件100A注入。当在注入期间将连接件100C的管捏住以封闭管2秒时，血液立即从线路100D中的分支点上升20mm，伴随内部压力增加。即使在开放连接件100C之后，血液也未从20-mm点处移开，因此可证实压力增加的迹象。

实例11

以与实例8类似的方式制备监测血栓形成的装置且监测血栓形成，例外之处在于：添加Fc结构域由木瓜蛋白酶移除的抗凝血酶多克隆抗体(COSMO BIO CO.LTD.)以便以30μg/ml的浓度代替实例8的溶液A的肝素；且向实例8的溶液B中进一步以5mg/ml的浓度添加PPACK凝血酶。

使溶液A和溶液B流动15分钟后，从连接件100A注入生理盐水溶液以洗去血液。结果，证实红色血栓附着在基底材料200的胶原处理区的通道部分上。

实例12

以与实例7类似的方式制备监测血栓形成的装置且监测血栓形成，例外之处在于：

如此制备溶液A：在采血后立即将添加有0.5单位/毫升的肝素和10μg/ml的抑肽酶的50ml血液以800rpm离心且由上清液制备富含血小板的血浆(platelet-rich plasma，PRP)，由此获得溶液A；和

将1小瓶/毫升的促凝血酶原激酶试剂(Sysmex Corporation)用生理盐水溶液稀释30倍得到的溶液用作溶液B。

使用立体显微镜监测缩窄部分114的血栓形成15分钟。证实有多个血小板凝块附着在缩窄部分114周围。还监测到随着血小板凝块重复附着和脱离，凝块的数目增加，同时其尺寸也增加。

实例13

通过以与实例7类似的方式使溶液A和溶液B流动来监测血栓形成，具有下列例外之处：

溶液A是通过向20ml的实例12的溶液A的PRP中添加从离心的沉积物中收集到的500μg红血球来制备；

将1小瓶/毫升的促凝血酶原激酶试剂(Sysmex Corporation)用生理盐水溶液稀释30倍得到的溶液用作溶液B；

玻璃片通过用基于硅酮的剥离剂SRX-211(Dow Corning Toray Co.，Ltd.)涂布基底材料200的整个表面来制备；和

使约1μl的全血附着于在宽度上依次扩展至2.5mm的加宽部分的加宽终点附近，其接近基底材料100上血栓形成腔110的缩窄部分114的上游，随后使全血在室温下静置10分钟以使其凝固，且形成初步血栓以用作血栓诱发物质。

通过立体显微镜监测血栓附着区15分钟。在约5分钟后证实有新的红色血栓形成，其位于作为起源的初步血栓的下游，及至15分钟逐渐向下游延伸且其宽度扩展为2.5mm。证实血液沿所形成的血栓流动或流过所形成血栓之间的空隙。

实例14

以与实例7类似的方式制备监测血栓形成的装置且监测血栓形成，具有下列例外之处：

采血后立即将50ml添加有最终浓度为5μM的exocyt I凝血酶适体(GGTTGGTGTGGTTGG：SEQ ID NO.1)和最终浓度为30μg/ml的玉米源胰蛋白酶抑制剂(COSMO BIO CO.，LTD.)的血液以800rpm离心10分钟，由上清液形成富含血小板的血浆(PRP)且提供为溶液A。

将反义DNA(CCAACCACACCAACC：SEQ ID NO.2)溶解于生理盐水溶液中使其浓度为150μM且提供为溶液B；和

在安放血栓抑制剂115时，将通过混合实例7的胶原溶液与通过溶解1小瓶促凝血酶原激酶试剂(Sysmex Corporation)于1ml纯水中制备的溶液来制备且以5∶1比率渗析的溶液滴到未涂覆硅酮的区域上且在4℃下用空气干燥。

使用立体显微镜监测缩窄部分114的血栓形成5分钟。证实有多个血小板凝块附着在缩窄部分114周围。还监测到随着血小板凝块重复附着和脱离，凝块的数目增加，同时其尺寸也增加。

实例15

以与实例14类似的方式制备监测血栓形成的装置且监测血栓形成，具有下列例外之处：

在通过与实例14相同的程序制备PRP之后，添加反义DNA(CCAACCACACCAACC：SEQ ID NO.2)以使临到测量前浓度为15μM，由此释放抗凝血酶处理且提供为溶液A；

以与实例9类似的方式封闭连接件100B的注射开口；

使用I型胶原(用于用胶原A-1型储备溶液涂布细胞培养盘的胶原试剂，Cellmatrix Co.，Ltd.)代替实例14的胶原溶液；和

仅使溶液A以0.2ml/min的流速流动5分钟。

使用立体显微镜监测缩窄部分114的血栓形成。证实有多个血小板凝块附着在缩窄部分114周围。还监测到随着血小板凝块重复附着和脱离，凝块的数目增加，同时其尺寸也增加。

实例16

以与实例7类似的方式制备监测血栓形成的装置，具有下列列外之处：

通过以图7所示的图案切割在基底材料的表面上形成深度为0.1mm的凹槽，同时留下分隔壁，以使各自长度为1mm且宽度为40μm的凸行留置在血栓形成腔110中心周围的底部部分的整个表面上，各凸行间间隔为40μm。

以与实例9类似的方式封闭连接件100B的注射开口；和

基底材料200为未经表面处理的简单玻璃片。隔壁之间的间隙(通道)模拟毛细血管。

在采血后立即通过以30μg/ml的最终浓度添加玉米源胰蛋白酶抑制剂，且以10μM的最终浓度添加exocyt I凝血酶适体使全血经受抗凝处理。临到监测前，添加exocyt I凝血酶适体的反义DNA以使其浓度为30μM，接着以0.05ml/min的流速从100A注入5分钟。

使用立体显微镜监测隔壁之间间隙中的血栓形成。结果，在监测期间将通道顺次封闭5分钟。监测到约一半通道被形成的血栓封闭。

实例17

使用图9(A)至图9(C)所示的注射器型溶液馈料系统。使用微芯片300，其中分别由与实例7相同的材料制成的图9(B)和图9(C)所示的基底材料和微芯片盖经压力粘结。微芯片300包括凝血抑制剂入口管322和排出管313，如在具有实例7的排出管的情况下，凝血抑制剂入口管322和排出管313与基底材料100连接。然而，图9(A)至图9(C)的微芯片300的凹槽均以200μm的深度形成。同样，形成通道，以使得可将血液从样品注射器320引入通道中，而通道的宽度为1mm且长度为40mm且与由宽度为200μm且长度为10mm的窄通道和凝血抑制剂入口管322组成的血栓形成腔311连接。如此制备溶液，将1小瓶Sysmex Corporation PT试剂(组织促凝血酶原激酶)溶解于1ml纯水中且随后在纯水中渗析，使纯水中的渗析产物与I型胶原(由Nitta Gelatin Inc.制造)以1∶1混合。将溶液涂覆于如图9(A)至图9(C)所示的血栓诱发物质315的位置。此后，将所涂覆部分在4℃下在空气中干燥且覆盖血栓形成腔311，将其用作血栓诱发物质315。在添加抗凝处理剂后收集血液以使得注射器中各别组分：玉米源胰蛋白酶抑制剂的最终浓度为25μg/ml，exocyt I凝血酶适体的最终浓度为10μM，exocyt II凝血酶适体(5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’：SEQ ID NO.3)的最终浓度为10μM。临到监测前，向如此收集的血液中添加关于exocyt I和exocytII凝血酶适体的反义DNA以使其各自浓度达到40μM。随后，将注射器(1ml注射器，由Terumo Corporation制造)用血液填充且提供为图9(A)至图9(C)所示的样品注射器320。将My Flow(由Arbiotec Co.Ltd.制造，其为能够监测液体馈料泵的内部压力的微馈料泵)与图9(A)至图9(C)所示的增压管317连接。将矿物油从注射器320顶部压入微芯片300且将血液以50μl/min的流速推到微芯片300中，同时监测施加到样品注射器320上的压力。

使作为凝血抑制剂的1M Tris-HCl(pH 10)以50μl/min的流速从凝血抑制剂入口管322流动。在开始压力测量后6分钟，压力开始上升。

压力上升到80kPa，由于血栓移动使压力变化上下重复(图13所示的“对照物”)。

实例18

在添加抗凝处理剂的情况下以与实例17类似的方式进行采血。随后，进行与实例17相同的程序，例外之处在于以1单位/毫升的浓度添加未分级分离肝素。随后执行压力测量。在开始压力测量后13分钟，压力开始上升。压力升高到约10kPa(图13所示的“肝素”)。

实例19

在添加抗凝处理剂的情况下以与实例17类似的方式进行采血。随后，进行与实例17相同的程序，例外之处在于以50μg/ml的浓度添加ReoPro(LILLY Co.，Ltd.)。随后执行压力测量。测量18分钟仍不能证实压力增加(图13所示的“ReoPro”)。

实例20

在添加3.2％柠檬酸以使得柠檬酸与血液的比率为1∶9的情况下进行采血。此外，向血液中以25μg/ml的浓度添加玉米源胰蛋白酶抑制剂以进行抗凝反应。在向抗凝溶液中添加氯化钙以使其在监测血栓形成时于抗凝血液中达到15mM之后，立即将血液添加到注射器中(1-ml注射器，由TerumoCorporation制造)，接着使血液以40μl/min的流速流入与实例17相同的微芯片中。随后，使用与实例17相同的系统测量压力变化。在开始压力测量后15分钟压力开始上升且其升高到约60kPa。

实例21

在添加抗凝处理剂的情况下，以与实例20类似的方式进行采血。随后，进行与实例20相同的程序，例外之处在于分别以0.2单位/毫升、0.5单位/毫升和1单位/毫升的浓度添加肝素。随后执行压力测量。结果在图14中绘示。

实例22

在添加抗凝处理剂的情况下，以与实例20类似的方式进行采血。随后，进行与实例20相同的程序，例外之处在于以2μg/ml的浓度添加ReoPro(LILLY Co.，Ltd.)。随后执行压力测量。在开始压力测量后20分钟压力开始上升且其在25分钟后升高到约15kPa(图15)。

实例23

使用图12(A)至图12(C)所示的注射器型溶液馈料系统。另外，使用微芯片400，其中图12(B)所示的微芯片盖形式的基底材料200与图12(C)所示的微芯片体形式的基底材料100彼此经压力粘结。将由Teflon(注册商标)管制成的排出管413用矿物油填充，且其一端经由硅橡胶制成的连接管412与微芯片400连接，且其另一端与安装有压力传感器的抽吸泵414连接。形成微芯片400的通道的入口管经由硅酮橡胶制成的连接管412与注射器420连接。由Teflon(注册商标)制成的凝血抑制剂入口管422的一端与液体馈料泵423连接，且其另一端经由硅酮橡胶制成的连接管412与血栓形成腔的终端连接。以此方式，微芯片400与排出管413、注射器420和凝血抑制剂入口管422连接，且因此产生监测血栓形成的装置B。安装于轨道433上且可移动的具有照明光源432(LED)的CCD照相机430安置在血栓形成腔下面。

微芯片中所有凹槽的深度均为120μm。

血液得以引入其中的通道的宽度为800μm且长度为7mm。窄通道的宽度为200μm且长度为10mm。

如此制备溶液，将1小瓶PT试剂(组织促凝血酶原激酶，SysmexCorporation)溶解于1ml纯水中且随后以纯水渗析，使纯水中的渗析产物与I型胶原(由Nitta Gelatin Inc.制造)以1∶1混合。随后将溶液涂覆到面对与微芯片基底材料100压力粘结的表面上的缩窄部分的通道的微芯片基底材料200的区域上。此后，将涂覆部分在4℃下真空干燥，且随后使基底材料100与基底材料200彼此压力粘结，由此提供具有血栓形成腔411的微芯片400。

使用真空血液收集容器进行采血，所述容器中装入作为抗凝剂提供的柠檬酸钠。临到引入注射器420中之前，向血液中以12.5mM的最终浓度添加氯化钙且以25μg/ml的最终浓度添加玉米源胰蛋白酶抑制剂。

将My Flow(由Arbiotec Co.Ltd.制造，其为能够监测液体馈料泵的内部压力的微馈料泵)作为泵414与排出管413连接。因此，以15μl/min的速率执行抽吸，同时监测通道的内部压力。

使作为凝血抑制剂的1M Tris-HCl(pH 10)以8μl/min的流速从凝血抑制剂入口管422流动。开始压力测量4分钟后，主要观测到有白色血栓形成，同时证实内部压力降低。另外，证实在开始10分钟后内部压力降低30kPa。

此外，在使照相机430在通道中的血栓形成区周围移动的同时，通过获取图像观测到血栓形成。记录观测到血栓形成的位置，且照相机430在多个特定点周围规则移动的同时获取图像。结果，关于多个大血栓记录到血栓随时间的增长和破坏。

在下文中，将如下所述执行参考实验以显示凝血酶适体和其反义DNA分别作为抗凝处理剂和抗凝释放剂的有效性。

[参考实验1]

提供采血后即刻的血液、通过向第一血液中添加300μg/ml的十分之一量的玉米源胰蛋白酶抑制剂制备的血液和通过向第二血液中添加识别exocyt I的凝血酶适体以使其浓度为5μM制备的血液。随后，对于这三种血液，在Eppendorf管(由聚丙烯制成)中测量凝固所用的时间。每一分钟使样品上下颠倒且证实其流动性。不含添加剂的血液显示凝固时间为9分钟。相比之下，添加有胰蛋白酶抑制剂的血液显示凝固时间为22分钟。此外，添加有凝血酶适体的血液显示凝固时间为62分钟。

此外，当组合使用5μM识别exocyt I的凝血酶适体与5μM识别exocyt II的凝血酶适体时，即使在3小时后，即使在不含胰蛋白酶抑制剂的血液的情况下，也未证实血液凝固。Exocyt I识别凝血酶适体：5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’SEQ ID NO.1，Exocyt II识别凝血酶适体：5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’SEQ ID NO.3。

[参考实验2]

添加有10μM生理盐水溶液的样品A、添加有10μM 500-μM exocytI识别凝血酶适体的样品B和添加有10μl含有500-μM exocyt I识别凝血酶适体和1500-μM exocyt I识别凝血酶适体反义DNA的溶液的样品C各自对200μM血浆进行APTT测量。样品A为44秒，样品B为2分钟或2分钟以上且样品C为45秒。

[参考实验3]

图11(A)是通过在室温下储存添加有10μl的exocyt I和exocyt II的适体的血液15分钟且随后添加40μM两种适体的反义DNA得到的凝血弹性图的凝固波形的分析。图11(B)是采血后即刻得到的血液凝血弹性图波形。

如从图11(A)和图11(B)的结果明显可见，发现添加两种凝血酶适体使血液能够储存且反义可释放其抗凝处理。

从参考实验1至3的结果，明显可见玉米源胰蛋白酶抑制剂与凝血酶适体的组合可有效抑制全血的凝固且凝血酶适体的抗凝效应可因凝血酶适体的反义DNA而失活。

[参考实验4]

在下文中，将描述PMEA涂层对血液储存和血小板对基底材料的粘附的功效。

(1)将根据JP 04-152952A制备的含1％PMEA的甲醇溶液涂覆到2.5-ml丙烯酸树脂容器(内部尺寸：1cm×1cm×4.5cm)上且随后在90℃下干燥10分钟。随后，将760μl经受用2％柠檬酸进行的抗凝处理的血液添加到未涂布容器和PMEA涂布的容器中的每一者中，接着每5分钟用移液管抽吸以证实血液凝固。

因此，未涂布容器显示在30分钟时粘度明显增加且在60分钟时凝固。相比之下，PMEA涂布的容器显示粘度在35分钟时明显增加，但凝固延长至90分钟。

(2)将上述PMEA平坦涂布在透明丙烯酸树脂板上。使用其替代实例9的胶原涂布板(图8)且以与实例9类似的方式进行血液中奎吖因标记的血小板和白血球的粘附实验。

结果，在血液开始流动10分钟后，观测到血小板和白血球明显粘附或凝集。相比之下，即使在30分钟以后，在PMEA涂布的丙烯酸树脂板上也没有观测到血小板和白血球的粘附或凝集。

从上述结果可知，在本发明监测血栓形成的装置中，通过用PMEA涂布血液储存注射器、管、基底材料等，可在血栓监测腔以外的位置抑制血栓形成。因此，提示可获得对血栓监测腔有特效的血栓监测。

在上述描述中，已参考优选实施例描述了本发明。然而，本发明并不局限于如上所述的实例和实施例，且只要不悖离本发明的大意，就可应用各种改变。举例来说，可将泵压设定为较高且可将排出管的内径设定为较小。在这种情况下，可在入口管和排出管中产生背压，因此可监测血栓形成，同时控制在相应于血压的内部压力负荷下血液的流动体积。此外，可借助于泵压和排出管的节流程度随意地控制当时的血液流速。

工业实用性

本发明的监测血栓形成的装置和监测血栓形成的方法可有利地用于在血流等效环境下使用全血或含血小板的血浆全面评价血液凝固和血小板血栓形成，用于评价施用到患者等的抗血栓形成药物的功效。

序列表

<110>藤森工业株式会社(FUJIMORI KOGYO CO.，LTD.)

<120>监测血栓形成的装置和监测血栓形成的方法

<130>OP-C6262-PCT

<150>JP2005-302557

<151>2005-10-18

<150>JP2005-308065

<151>2005-10-24

<150>JP2005-334594

<151>2005-11-18

<150>JP2005-358448

<151>2005-12-13

<150>JP2006-36148

<151>2006-02-14

<150>JP2006-234270

<151>2006-08-30

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>exosite I凝血酶适体

<400>1

ggttggtgtg gttgg                        15

<210>2

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义DNA

<400>2

ccaaccacac caacc                        15

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>exosite I凝血酶适体

<400>3

agtccgtggt agggcaggtt ggggtgact         29