淀粉酶前处理应用于猪粪沼气发酵方法

摘要

本发明涉及使用酶处理有机物产生沼气的方法，包括称取猪粪，按该猪粪总固体含量(TS)浓度配制发酵料液；将配制好的发酵料液加入α－淀粉酶处理；或者将配制好的发酵料液加入γ－淀粉酶处理；将处理后的发酵料液与接种物混和进行沼气发酵等步骤。本发明用淀粉酶在猪粪沼气发酵前处理，结果表明猪粪的TS和VS降解率、最大容积产气率、累积产气量及原料产气潜力与对照组相比有明显提高，其中经双酶处理的效果比经α－淀粉酶处理的效果要好，而经α－淀粉酶处理的效果又比经γ－淀粉酶处理的效果稍好。

说明书

技术领域

本发明属于使用酶在厌氧环境下处理有机物，产生沼气的沼气发酵方法。

背景技术

沼气发酵涉及多种微生物协同作用，共同降解复杂有机物，可分为水解、产氢产酸、产甲烷三个阶段(张无敌，刘士清，厌氧消化过程的多功能性[J]，天津微生物，1995(3)：24-26)。当沼气发酵使用的原料为大分子复杂有机物时，水解阶段将是整个过程的主要限制阶段(张记市，孙可伟，徐静，城市有机生活垃圾溶胞处理及其堆厌氧消化的影响研究[J]，生态环境，2006，15(4)：862-865)。因此，在沼气发酵前，对大分子原料进行前处理，有利于缩短水力滞留时间或发酵周期，提高沼气的产气速率和产气量。

猪粪是我国沼气发酵最普遍、最常见的原料，养殖场通常采用固液分离后，固体成分堆肥处理，液体成分进行连续发酵，而在农村则直接投入沼气池，原料利用率较低、产气潜力得不到应有发挥。同时，水解酶作为一种生物催化剂，广泛应用于脂肪，蛋白质，淀粉纤维素等有机物的降解处理，然而，利用水解酶对沼气发酵原料进行前处理报道少，缺少较为系统的研究。张无敌等研究了猪粪沼气发酵过程中的各种水解酶与沼气产量的关系，结果表明许多水解酶酶活与产气量是相关的，通过添加水解酶可提高沼气产量(张无敌，宋洪川，尹芳等，牛粪在沼气发酵过程中的水解酶酶活变化研究[J]，能源工程，2003(6)：21-23张无敌，宋洪川，李建昌等，水解酶提高猪粪沼气发酵产气率[J]，太阳能学报，2003，23(5)：674-677)。周岭等在牛粪沼气发酵中添加纤维素酶，得出了加纤维素酶量的最佳范围(周岭，祖鹏飞，沼气发酵中纤维素酶降解牛粪的试验研究[J]，新疆农垦科技，2006(4)：12-13)。但是，这些研究和实验均未涉及猪粪在沼气发酵前用水解酶进行处理来降解猪粪中的淀粉、纤维素等碳水化合物，以达到缩短发酵启动时间，提高产气率的目的。

发明内容

在上述研究基础上，本发明扬弃在发酵过程中添加水解酶的方法，其目的是结合水解酶最佳酶活条件，提出淀粉酶对猪粪原料首先进行前处理，然后再进行沼气发酵的方法。

本发明方法通过以下步骤实现：

(1)称取猪粪，按该猪粪总固体含量(TS)浓度8％配制发酵料液；

(2)将步骤(1)配制好的发酵料液在温度80℃恒温下，加入α-淀粉酶，处理45分钟；或者将步骤(1)配制好的发酵料液在温度60℃恒温下，加入γ-淀粉酶，处理90分钟；

上述α-淀粉酶为发酵料液含量百分数的0.03-0.06％，γ-淀粉酶为发酵料液含量百分数的0.01-0.02％；

(3)将步骤(2)处理后的发酵料液与接种物混和，进行沼气发酵。

所述的步骤(2)进一步为：将步骤(1)配制好的发酵料液置于温度至80℃恒温下，加入α-淀粉酶处理45分钟；然后使温度降至60℃，加入γ-淀粉酶，恒温处理90分钟。

所述的接种物为沼气发酵后产生的活性污泥，该活性污泥的总固体含量(TS)为13.4％，挥发性固体含量(VS)为9.86％，pH为7.19，接种物与步骤(2)处理后的发酵料液的重量体积比为：90g∶100ml，并补充水至总体积约450ml。

所述的沼气发酵采用中温发酵，控制发酵温度在35℃左右。

本发明结果表明：

(1)猪粪在厌氧发酵前，经淀粉酶处理后，其TS和VS降解率，最大容积产气率，累积产气量及原料产气潜力，与对照组相比有较明显的提高。其中经双酶处理的效果比经α-淀粉酶处理的效果要好，而经α-淀粉酶处理的效果又比经γ-淀粉酶处理的效果稍好。

(2)猪粪沼气发酵产气速率变化经历了四个阶段：延迟产气期、产气高峰期、次产气高峰期和产气衰竭期。次产气高峰过后，产气量已经很少。从两次产气高峰和甲烷含量变化来看，沼气发酵中的厌氧微生物，对原料有选择性降解的特性。

(3)水解酶前处理技术涉及到的水解酶很多，本发明只选用了两种淀粉酶，许多研究尚待继续。

因此，本发明缩短了猪粪沼气发酵时间，提高沼气产气率和沼气产量，奠定了并开辟了沼气发酵水解酶前处理之基础。

附图说明

图1是本发明采用厌氧发酵装置示意图。

图2是本发明日产气量随时间变化图。

图3是本发明沼气中甲烷的变化图。

图4是本发明累积产气量变化图。

具体实施方式

一、材料

1淀粉酶

α-淀粉酶(即α-1.4糊精酶，俗称液化型淀粉酶)，北京奥博星生物技术责任有限公司生产，其最适pH6.0，温度60-70℃，可适用于最高达90℃，酶活单位4000U/g。能将淀粉分子的α-1，4-葡萄糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精以及少量麦芽糖和葡萄糖，直链淀粉和支链淀粉均以无规则的形式进行分解，从而使淀粉糊的粘度迅速下降，即“液化”作用，故又称液化酶。

γ-淀粉酶(即γ-1.4-葡萄糖苷酶，俗称糖化型淀粉酶)，张家港市金源生物化工有限公司生产，其最适pH4.0-4.5，温度60℃，酶活单位10万U/g。有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始分解1.4-糖苷键生成葡萄糖，也能缓慢水解α-1.6-糖苷键转化成葡萄糖。

2厌氧发酵原料

鲜猪粪，取自昆明市呈贡县石碑村一农户家的猪圈，并储存于低温冰箱(-21℃)之中，经测定该猪粪的总固体含量(Total Solid，TS)为28.45％，挥发性固体含量(Volatile Solid，VS)为22.31％，pH为6.80。

3接种物

接种物取云南师大省农村能源重点试验室生物质能试验室，以猪粪为原料沼气发酵后产生的活性污泥。经测定该活性污泥的TS为13.4％，VS为9.86％，pH为7.19。

二、试验装置及方法

1试验装置

试验装置如图1，发酵瓶500mL，采用排水集气法收集沼气，每天定时观察记录产气情况。

2试验方法

分组：整个试验分为四组，即对照组、试验1、2、3组。试验组与对照组相比，增加了淀粉酶对原料的前处理。发酵结束后，与对照组比较沼气的产气速率和产气量。

配制发酵料液：按TS浓度8％配制发酵料液。各组在500ml烧杯中称取猪粪90g，加入230ml水，此时TS浓度约为8％。

样品处理：将盛有配制好的发酵料液的烧杯放入已恒温至80℃恒温水浴锅中，在试验2组和4组中加入α-淀粉酶0.5g，恒温处理45分钟；然后，使恒温水浴锅水浴温度降至60℃，在试验3组和4组中加入γ-淀粉酶0.25g，恒温处理90分钟。

沼气发酵：将处理后的样品装入500ml发酵瓶中，用100ml的量筒加入100ml接种物，并补充少量水至发酵总体积为450ml，连接好集气瓶，放入恒温水浴装置中。

调节水浴温度：通过控温仪控制水浴温度在35℃左右，采用中温发酵。

各组试验方案见表1。

表1淀粉酶前处理猪粪沼气发酵试验组方案

3测定方法

(1)总固体含量(TS)和挥发性固体含量(VS)的测定

鲜猪粪、接种物、沼气发酵启动和结束时的TS和VS的测定，按照沼气发酵常规分析法进行。取样品放入在105℃的烘箱中烘干至恒重获得的物质的重量为该样品的总固体重量TS；而将上述已测定完TS含量的瓷坩锅和样品放入马弗炉中，设定温度在560℃下灼烧至恒重所获得的灰分重量为挥发性固体含量VS。

(2)pH值测定：pH值采用奥立龙816型pH计直接测量。

(3)产气量和产气速率测定：产气量每天从量筒读出测量，产气速率根据每天的产气量来计算，表示为每天每立方米反应容积的产气量，m³/m.d。

(4)沼气中甲烷含量测定：沼气中的主要成分是二氧化碳和甲烷，用浓KOH(33％)吸收完二氧化碳后，剩余的便是甲烷。因此把33％的KOH溶液装满100ml血清瓶，盖上橡胶塞，并用铝盖封紧。测量时，用10ml的注射器从发酵瓶上部的气体取样口中准确吸取10ml气体，注入血清瓶中，来回抽动注射器活动杆几次，吸收平衡后，根据注射器刻度读出剩余气体的体积，即甲烷体积；或气体减少体积，即二氧化碳体积。

三、结果及分析

1发酵前后发酵料液的TS，VS和pH变化

鲜猪粪、接种物、沼气发酵启动和结束时的TS和VS的测定，取样品2-3g放入已恒重并知准确重量的瓷坩锅中，在分析天平上称重；然后放入在105℃的烘箱中烘干至恒重，此时物质的重量就是该样品的总固体重量，TS按式(1)计算：

式中：W₁-样品放在105℃的烘箱中烘干的重量，即干物质重量(g)；W₀-所取样品重量(g)。

将上述已测定完TS含量的瓷坩锅和样品放入马弗炉中，设定温度在560℃下灼烧至恒重，得灰分重量，VS按式(2)计算：

式中：W₂-灰分重量(g)。

发酵前混合料液的TS和VS，根据发酵原料和接种物计算：

$\mathrm{TS}=\frac{W_1\times {\mathrm{TS}}_1+W_2\times {\mathrm{TS}}_2}{W_0}\times 100\%---\left(3\right)$

$\mathrm{VS}=\frac{W_1\times {\mathrm{VS}}_1+W_2\times {\mathrm{VS}}_2}{W_0}\times 100\%---\left(4\right)$

式中：W₀为发酵料液的总重量(450克)；W₁为猪粪的重量(90克)；W₂为接种物的重量(100克)；TS₁和VS₁分别为猪粪的TS(28.45％)和VS(22.31％)；TS₂和VS₂分别为接种物的TS(13.40％)和VS(9.86％)。

发酵结束后，取样分析TS、TS和pH值。发酵前后发酵料液的TS，VS和pH变化如表2。其中沼气发酵结束后TS降解率表示为α_TS，VS降解率表示为α_VS；试验组对对照组的TS、VS降解率变化表示为δ_TS和δ_VS：

表2发酵前后发酵料液的TS，VS及pH变化

根据表2的结果，未经淀粉酶处理的猪粪的TS和VS降解率分别52.13％和54.14％，而经α-淀粉酶处理后TS和VS降解率分别为57.09％和59.40％，分别比对照组提高了9.51％和9.72％；经γ-淀粉酶处理后TS和VS降解率分别为56.17％和59.10％，分别比对照组提高了7.74％和9.17％；经α-淀粉酶和γ-淀粉酶同时处理后TS和VS降解率分别为57.78％和60.15％，分别比对照组提高了10.84％和11.11％。结果表明猪粪在厌氧发酵前，经淀粉酶处理后，其TS和VS降解率与对照组相比有明显的提高，其中经双酶处理的效果比经α-淀粉酶处理的效果要好，而经α-淀粉酶处理的效果又比经γ-淀粉酶处理的效果稍好。

沼气发酵的最适pH是6.5-7.5，从表2可以看出发酵前后的pH变化不大，整个发酵过程pH值保持在7.0左右。

2发酵过程产气曲线分析

本次试验在恒温35℃下，从启动到产气结束，共进行了35天，每天记录产气量和分析沼气中甲烷含量，并排空气体。日产气量曲线如图2，甲烷含量如图3，累积产气量如图4。

根据图2可以把产气过程分为四个阶段，延迟产气期(0-2天)、产气高峰期(3-8天)、次产气高峰期(12-16天)和产气衰竭期(20天以后)。延迟产气期也就是沼气发酵启动期，产气速率不大，因为在这期间发酵瓶内含有空气，发酵料液上层表现为兼性发酵，中下层为厌氧发酵，当接种物中的兼性微生物耗尽空气中的氧气后，整个发酵瓶内形成厌氧环境，厌氧微生物开始迅速生长繁殖，然后逐渐转入产气高峰期。在产气高峰期，底物浓度较高，微生物生长繁殖迅速、并首先利用小分子糖类及淀粉类容易降解的底物，故产气量较大。各试验组在第3-5天出现最大产气速率：试验3组1580ml/天，试验2组1480ml/天，试验1组1500ml/天，对照组1320ml/天，试验组均高于对照组，其原因是试验组的原料经淀粉酶处理后，发酵料液中含有较多的葡萄糖或是二糖，最容易被微生物利用。在试验组中，经α-淀粉酶和γ-淀粉酶同时处理后的试验3组高于经α-淀粉酶处理的试验1组，又高于经γ-淀粉酶处理的试验2组。产气高峰过后，产气速率降低，然后又出现次产气高峰期，期间最大产气速率出现在第12-14天。这时可能因容易降解的底物大量被消耗后，产气量迅速下降，而后微生物不得不选择较为难降解的纤维素等，故又出现次产气高峰期，在这一期间，各试验组产气速率差别不大。次产气高峰期过后，随着各种底物大量被消耗，从第20开始进入产气衰竭期，直至停止产气，表明利用猪粪厌氧发酵，在恒温35℃下，发酵周期为20天，此时能被降解的原料已基本全部降解。

根据图2和按有效容积450ml计，还可以计算出在20天发酵周期内的平均有效容积产气率和最大有效容积产气率，以及试验组相对于对照组的相对增量，见表3。

图3显示的是发酵过程的甲烷含量的变化，在延迟产气期，甲烷含量较低，从10％到30％。进入产气高峰期后，甲烷含量增至50％-60％，而在次产气高峰期和衰竭期，甲烷含量保持在70％左右。甲烷含量的变化可能与微生物利用不同类底物有关。

图4表明发酵过程累积产气量变化趋势，对照组累积产气量11350ml，试验1组12950ml，比对照组提高了14.08％；试验2组12840ml，比对照组提高了13.13％；试验3组13020ml，比对照组提高了14.70％。根据图4计算出各试验组的原料产气潜力，如表3所示，对照组为565.3ml/gVS，试验1组为644.9ml/gVS，与对照组相比提高了14.08％；验2组为639.5ml/gVS，与对照组相比提高了13.13％；试验3组为648.4ml/gVS，与对照组相比提高了14.70％。

表3不同试验组容积产气率、原料产气潜力比较