骨瓜提取物注射剂及其制备方法

摘要

本发明提供了一种骨瓜提取物注射用药物，其通过对哺乳类动物骨多肽的提取以及甜瓜籽多肽的提取，将获得的提取物按一定的比例配比，制成可供注射用的药物。本发明采用特定的提取工艺增加了有效成分，提取效率高，同时高分子量物质被降到了最低。本发明药物具有调节骨代谢，刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成，调节钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防止骨质疏松等作用，能够用于风湿、类风湿关节炎、骨关节炎、腰腿疼痛、骨折创伤修复等疾病的预防和治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽药物组合物，具体地说是骨瓜提取物注射用药物，本发明还涉及该药物的制备方法。

背景技术

骨瓜提取物含有多种活性多肽和游离氨基酸，具有调节骨代谢，刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成，调节钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防止骨质疏松等作用。

骨诱导多肽类生物因子的作用：骨诱导多肽类生物因子可有效促进机体内影响骨形成和吸收和骨源性生长因子的合成，包括骨形态发生蛋白(BMPs)，β-转化生长因子(TGF-β)，成纤维细胞生长因子(FGF)等，从而具有多种生物活性。其主要药理作用有：促进细胞有丝分裂、分化作用、趋化作用和溶骨活性。其中BMPs是一组酸性低分子量糖蛋白，作为一种高效骨诱导物质，BMPs是间充质细胞向骨系细胞分化的最初信号因子，能诱导血管周围游动的间充质细胞转化为不可逆性的骨系细胞，即软骨细胞和成骨细胞，从而促进骨痂形成，诱导新骨形成，促进骨折修复；此外，BMPs还可调节细胞外基质成份的改变，并通过与TGF-β和FGF相互之间的协调作用更好地诱导新骨形成，使骨组织更成熟。TGF-β是一组具有多种功能的蛋白多肽，对成骨细胞及成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重调节作用，与多种因子如细胞外基质和其他分化调节生长因子一起协同参与对细胞分化的调节；TGF-β可促进细胞外基质合成，可以直接刺激成纤维细胞外基质的合成，并对其新合成的基质降解有显著抑制作用；对于成骨细胞，TGF-β可促进其合成I型胶原、骨粘连素和骨桥蛋白；同时，TGF-β对淋巴细胞和巨噬细胞的作用表明，它即能缓解炎性反应的破坏性，又能协助巨噬细胞来源的某些细胞因子在细胞组织修复中发挥作用。FGF是一组肝素黏合多肽，可刺激细胞的趋向移动、增值和分化，增加合成胶原细胞的数量，促进骨胶原蛋白及非胶原蛋白的合成，增加骨钙素的合成。

甜瓜籽提取物的作用：甜瓜籽提取物是从葫芦科植物甜瓜(Cucumis melo L.)的成熟干燥种子经特殊工艺提取而成，能降低骨折局部毛细血管通透性，减少炎性渗出，促进局部血运障碍的恢复；同时还能降低全血黏度及红细胞聚集程度，改善骨痂局部的血液循环，为骨细胞提供一个良好的供血环境；另外还能抑制前列腺素的释放，达到止痛效果；在促进骨折早期愈合中，甜瓜籽提取物与补充的骨诱导多肽生物因子具有协同作用，促进骨原性生长因子的作用。

其它成份的作用：富含的多种游离氨基酸，为骨细胞合成BMPs、TGF-β、FGF等骨源性生物因子提供原料，促进骨源性生物因子的合成，有机钙、磷离子可参与钙磷代谢，维持骨容量。

CN 1742778A公开了一种鹿瓜多肽药物组合物，该组合物含有鹿骨提取物、甜瓜籽提取物和一种或多种赋形剂组成，其中鹿骨多肽与甜瓜籽的重量比为2∶1至6∶1。其是通过如下方法制备：A)鹿骨提取物溶液的制备：(1)鹿骨预处理：(2)将预处理后的净鹿骨粉碎；(3)在碎鹿骨中加2倍重量以上的注射用水，121℃热压提取滤出获得一次鹿骨提取液；(4)在一次提取后的鹿骨渣中加入2倍以上重量注射用水，继续在121℃-123℃热压提取，滤出获得二次鹿骨提取液，与步骤(3)获得的一次鹿骨提取20液合并制成鹿骨提取液：(5)将鹿骨提取液离心，收集上清离心液；(6)将离心液分别进行100KD、10KD、6KO超滤，收集滤出液，减压浓缩至总体积的10％，收取浓缩液，制得鹿骨提取物溶液：B)甜瓜子提取物溶液的制备：(1)将干燥成熟甜瓜子漂洗干净：(2)在净甜瓜子中加入2倍以上重量的注射用水，用胶体磨研磨成甜瓜子匀浆；(3)将甜瓜子匀浆在121℃热压提取，滤出一次甜瓜子提取液：(4)在一次提取后的甜瓜子渣中加入2倍以上重量注射用水，继续在121℃-123℃热压提取，滤出二次甜瓜子提取液，与步骤(3)获得的一次甜瓜子提取液合并制成甜瓜子提取液1(5)将甜瓜子提取液离心，收集上清离心液(6)将离心液分别进行100KD、10KD、6KD超滤，收集滤出液，减压浓缩至原体积的10％，收取浓缩液，制得甜瓜子提取物溶液：C)注射用鹿瓜多肽药物组合物的制备：混合步骤A)制备的鹿骨提取物溶液和步骤B)制备的甜瓜子提取物溶液和一种或多种赋形剂制备药物组合物，通过冷冻干燥技术制成冻干粉针，其中鹿骨多肽与甜瓜子多肽的重量比为2∶1至6∶1。

上述制备方法的提取率低，制成的骨瓜提取物注射液有效成分较低。为此，人们迫切寻求一种更有效的解决方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种骨瓜提取物注射用药物，及其制备方法。

本发明的骨瓜提取物注射用药物通过如下方法制备获得：

A)骨提取物的制备

1)将哺乳动物骨头预处理后得净骨；

2)取净骨，加2～5倍重量的纯化水，于120℃～123℃，0.11～0.13Mpa条件下热压提取1～3h，过滤，得滤液；

3)将滤液于0～10℃条件下静止8～16小时，去掉上层油脂；

4)调节PH为8.5～9.0，加热至44℃～46℃，按骨重量的0.1～0.3％加入胰酶，恒温连续水解1～3小时；

5)调节pH为3.5～4.0，煮沸，保温15～45分钟后过滤，滤液调节pH为6.5～7.0；

6)加入适量活性炭，加热至沸腾，保温10～20分钟后过滤，滤液于-20℃深冻36～50小时后室温融化；

7)10KD分子截留下超滤，滤液经适当浓缩后，再在6KD分子截留下超滤，即得；

B)甜瓜籽提取物的制备：

1)将甜瓜籽预处理后得净甜瓜籽；

2)取净甜瓜籽，加入1～3倍重量的水，于120℃～123℃，0.11～0.13MPa热压提取1～3h，过滤得滤液

3)重复步骤2)1～3次；

4)合并滤液，降温至25～35℃，调节pH至3.5～4.0，静置8～16个小时，去沉淀；

5)煮沸，保温15～45分钟，过滤；

6)调节pH为8.5～9.0，于-20℃深冻36～50小时后室温融化；

7)煮沸，保温15～45分钟，过滤，调节pH至6.0～7.0；

8)10KD分子截留下超滤，滤液经适当浓缩后，再在6KD分子截留下超滤，即得；

C)将步骤A)制备的骨提取物和步骤B)制备的甜瓜籽提取物混合，添加适量赋形剂，制备成注射液或冻干粉，其中注射液可以是小容量骨瓜提取物注射液、骨瓜氯化钠注射液或骨瓜葡萄糖注射液，其中骨多肽与甜瓜籽多肽的重量比为1∶10～10∶1，优选为1～5∶1，更优选为3∶1。

优选地，本发明注射剂通过如下制备方法获得：

A)骨提取物的制备

1)将哺乳动物骨头预处理后得净骨；

2)取净骨，加4倍重量的纯化水，于121℃，0.12Mpa条件下热压提取2h，过滤，得滤液；

3)将滤液于0～10℃条件下静止12小时，去掉上层油脂；

4)调节pH为8.5～9.0，加热至45℃，按骨重量的0.2％加入胰酶，恒温连续水解2小时；

5)调节pH为3.5～4.0，煮沸，保温30分钟后过滤，滤液调节pH为6.5～7.0；

6)加入适量活性炭，加热至沸腾，保温15分钟后过滤，滤液于-20℃深冻48小时后室温融化；

7)10KD分子截留下超滤，-0.1MPA，60℃条件下减压浓缩至原体积的1/3，再在6KD分子截留下超滤，即得；

B)甜瓜籽提取物的制备：

1)将甜瓜籽预处理后得净甜瓜籽；

2)取净甜瓜籽，加入2倍重量的水，于121℃，0.12MPa热压提取2h，过滤得滤液

3)重复步骤2)2次；

4)合并滤液，降温至25～35℃，调节pH至3.5～4.0，静置12个小时，去沉淀；

5)煮沸，保温30分钟，过滤；

6)调节pH为8.5～9.0，于-20℃深冻48小时后室温融化；

7)煮沸，保温15～45分钟，过滤，调节pH至6.0～7.0；

8)10KD分子截留下超滤，-0.1MPA，60℃条件下减压浓缩至原体积的1/3，再在6KD分子截留下超滤，即得；

C)将步骤A)制备的骨提取物和步骤B)制备的甜瓜籽提取物混合，添加适量的赋形剂制备成注射液或冻干粉。其中所用赋形剂可以为甘露醇和/或右旋糖酐，优选为甘露醇，赋形剂与总多肽按重量比为1∶1～5，优选为1∶2。

本发明中所述的哺乳动物骨头优选为哺乳动物四肢骨，更优选为鹿骨或猪骨。

所述的甜瓜籽为葫芦科植物瓜籽，优选为甜瓜籽；提取所用的水为纯化水或注射用水。

本发明骨瓜提取物注射剂，其有效成分含量高，对风湿、类风湿关节炎、骨关节炎、腰腿疼痛、骨折创伤修复等疾病具有显著的疗效，且高分子物质含量小，通过此法制得的注射剂较为稳定，成品收率高，且可以制得多种供临床使用的剂型。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1猪骨提取物的制备

剥离：取新鲜或冷冻的猪四肢骨，除肉及筋膜，断开，去除骨髓，得净骨15kg。

提取：取净骨，加4倍重量的纯化水，于121℃，0.12Mpa条件下热压提取2h，过滤，得滤液，滤液于5℃条件下静止12小时后，去掉提取液的上层油脂，用8％氢氧化钠溶液调节pH为8.5，加热至45℃左右，按骨重量的0.2％加入胰酶，恒温连续水解2小时后，用12％盐酸调节pH为3.5，煮沸，保温30分钟后过滤，滤液用8％氢氧化钠溶液调节pH为6.5。按滤液体积的0.1％加入活性炭，加热至沸腾，保温15分钟后过滤，滤液于-20℃深冻48小时后室温融化。

超滤、浓缩：用1万道尔顿分子量的超滤器将上述溶液超滤，滤液于-0.1MPA，60℃条件下减压浓缩至原体积的1/3。浓缩液再经过6000道尔顿分子量的超滤器超滤，得滤液20L，超滤液搅拌均匀后盛于无菌容器中，于-20℃条件下保存。

经检测提取液中的猪骨多肽的含量为10.1mg/ml，游离氨基酸含量为6.1mg/ml。

实施例2鹿骨提取物的制备

剥离：取新鲜或冷冻的梅花鹿四肢骨，除肉及筋膜，断开，去除骨髓，得净骨15kg。

提取：取净骨，加3倍重量的纯化水，于121℃，0.12Mpa条件下热压提取2h，过滤，得滤液，滤液于4℃条件下静止12小时后，去掉提取液的上层油脂，用8％氢氧化钠溶液调节pH为9.0，加热至45℃左右，按骨重量的0.2％加入胰酶，恒温连续水解2小时后，用12％盐酸调节pH为4.0，煮沸，保温30分钟后过滤，滤液用8％氢氧化钠溶液调节pH为7.0。按滤液体积的0.1％加入活性炭，加热至沸腾，保温15分钟后过滤，滤液于-20℃深冻48小时后室温融化。

超滤、浓缩：用1万道尔顿分子量的超滤器将上述溶液超滤，滤液于-0.1MPA，60℃条件下减压浓缩至原体积的1/3。浓缩液再经过6000道尔顿分子量的超滤器超滤，得滤液15L，超滤液搅拌均匀后盛于无菌容器中，于-20℃条件下保存。

经检测提取液中的鹿骨多肽的含量为10.2mg/ml，游离氨基酸含量为7.2mg/ml。

实施例3甜瓜籽提取物的制备

洗涤：取成熟干燥得甜瓜籽，加纯化水漂洗4次，空干水分，挑出杂物，得净甜瓜籽15kg。

提取：取净甜瓜籽，加入2倍重量的纯化水，于121℃，0.12MPA热压提取2h，过滤，得滤液，再加入2倍重量的纯化水，重复上次提取，如此反复提取三次，合并三次滤液，降温至30℃，用12％盐酸将上述滤液的pH调节为3.5，静止12小时。

去除杂蛋白，将上述水解液煮沸，保温30分钟后过滤，滤液用8％氢氧化钠溶液将上述滤液pH调节为8.5，于-20℃深冻48小时后室温融化，煮沸，保温30分钟后过滤，滤液用12％盐酸调节PH为6.0。

超滤、浓缩：用1万道尔顿分子量的超滤器将上述溶液超滤，滤液于-0.1MPA，60℃条件下减压浓缩至原体积的1/3。浓缩液再经过6000道尔顿分子量的超滤器超滤，得滤液30kg，超滤液搅拌均匀后盛于无菌容器中，于-20℃条件下保存。

经检测提取液中的甜瓜籽多肽的含量为4.3mg/ml，游离氨基酸含量为3.8mg/ml。

肽测定法按照福林酚测定法测定。

游离氨基酸测定利用高效液相色谱先进行鉴别再用适宜的氨基酸测定仪或高效液相色谱法进行测定。

实施例4甜瓜籽提取物的制备

洗涤：取成熟干燥得甜瓜籽，加纯化水漂洗3次，空干水分，挑出杂物，得净甜瓜籽15kg。

提取：取净甜瓜籽，加入2倍重量的纯化水，于121℃，0.12MPA热压提取2h，过滤，得滤液，再加入2倍重量的纯化水，重复上次提取，如此反复提取三次，合并三次滤液，降温至30℃，用12％盐酸将上述滤液的pH调节为4.0，静止12小时。

去除杂蛋白，将上述水解液煮沸，保温30分钟后过滤，滤液用8％氢氧化钠溶液将上述滤液pH调节为9.0，于-20℃深冻48小时后室温融化，煮沸，保温30分钟后过滤，滤液用12％盐酸调节PH为6.0。

超滤、浓缩：用1万道尔顿分子量的超滤器将上述溶液超滤，滤液于-0.1MPA，60℃条件下减压浓缩至原体积的1/3。浓缩液再经过6000道尔顿分子量的超滤器超滤，得滤液30kg，超滤液搅拌均匀后盛于无菌容器中，于-20℃条件下保存。

经检测提取液中的甜瓜籽多肽的含量为4.2mg/ml，游离氨基酸含量为3.8mg/ml。

多肽测定法按照福林酚测定法测定。

游离氨基酸测定利用高效液相色谱先进行鉴别再用适宜的氨基酸测定仪或高效液相色谱法进行测定。

实施例5骨瓜多肽注射剂的配制1

实施例1的提取物    7.5g(按猪骨多肽计)

实施例3的提取物    2.5g(按甜瓜籽多肽计)

注射用水           加至2000ml

将实施例1制备的猪骨提取物溶液和实施例1制备的猪骨提取物溶液按猪骨多肽与甜瓜籽多肽重量比3∶1混合，用8％的氢氧化钠溶液或12％的盐酸溶液调节pH值6.8，再加注射用水至全量，用0.22μm的微孔滤膜过滤后灌装于2ml曲颈安瓶中，拉丝封口。121℃灭菌12分钟。经灯检、贴签、包装、入库即得。

实施例6骨瓜多肽注射剂的配制2

实施例1的提取物     6.25(按猪骨多肽计)

实施例3的提取物     6.25g(按甜瓜籽多肽计)

注射用水            加至2500ml

将实施例1制备的猪骨提取物溶液和实施例1制备的猪骨提取物溶液按猪骨多肽与甜瓜籽多肽重量比1∶1混合，用5％的氢氧化钠溶液或5％的盐酸溶液调节pH值至6.5，再加注射用水至全量，用0.22μm的微孔滤膜过滤后灌装于5ml曲颈安瓶中，拉丝封口。121℃灭菌12分钟。经灯检、贴签、包装、入库即得。

实施例7骨瓜多肽注射剂的配制3

实施例1的提取物      25g(按猪骨多肽计)

实施例3的提取物      5g(按甜瓜籽多肽计)

注射用水             加至6000ml

将实施例1制备的猪骨提取物溶液和实施例1制备的猪骨提取物溶液按猪骨多肽与甜瓜籽多肽重量比5∶1混合，用稀稀氢氧化钠溶液或稀盐酸溶液调节pH值6.7，再加注射用水至全量，用0.22μm的微孔滤膜过滤后灌装于10ml曲颈安瓶中，拉丝封口。121℃灭菌12分钟。经灯检、贴签、包装、入库即得。

实施例8骨瓜多肽注射剂的配制4

实施例1的提取物     37.5g(按猪骨多肽计)

实施例3的提取物     12.5g(按甜瓜籽多肽计)

氯化钠              900g

注射用水            加至100000ml

将实施例1制备的猪骨提取物溶液和实施例1制备的猪骨提取物溶液按猪骨多肽与甜瓜籽多肽重量比3∶1混合，加入氯化钠900g溶解，用稀稀氢氧化钠溶液或稀盐酸溶液调节pH值，再加注射用水至全量，用0.22μm的微孔滤膜过滤后灌封于100ml输液瓶中。121℃灭菌15分钟。经灯检、贴签、包装、入库即得。

实施例9骨瓜多肽注射剂的配制5

实施例1的提取物       37.5g(按猪骨多肽计)

实施例3的提取物       12.5g(按甜瓜籽多肽计)

葡萄糖                5000g

注射用水              加至100000ml

将实施例1制备的猪骨提取物溶液和实施例1制备的猪骨提取物溶液按猪骨多肽与甜瓜籽多肽重量比3∶1混合，加入葡萄糖5000g溶解，用稀稀氢氧化钠溶液或稀盐酸溶液调节pH值，再加注射用水至全量，用0.22μm的微孔滤膜过滤后灌封于100ml输液瓶中。121℃灭菌15分钟。经灯检、贴签、包装、入库即得。

实施例10骨瓜多肽注射剂的配制6

实施例1的提取物      18.75g(按猪骨多肽计)

实施例3的提取物      6.25g(按甜瓜籽多肽计)

甘露醇               50g

注射用水             加至5000ml

将实施例1制备的猪骨提取物溶液和实施例1制备的猪骨提取物溶液按猪骨多肽与甜瓜籽多肽重量比3∶1混合，加入甘露醇溶解，用稀稀氢氧化钠溶液或稀盐酸溶液调节pH值6.4，再加注射用水至全量，用0.22μm的微孔滤膜过滤后灌装，冻干，轧盖，经贴签、包装、入库即得。

实施例11骨瓜多肽注射剂的配制7

实施例1的提取物     25g(按猪骨多肽计)

实施例3的提取物     2.5g(按甜瓜籽多肽计)

注射用水            加至5000ml

将实施例1制备的猪骨提取物溶液和实施例1制备的猪骨提取物溶液按猪骨多肽与甜瓜籽多肽重量比10∶1混合，用8％的氢氧化钠溶液或12％的盐酸溶液调节pH值至6.3，再加注射用水至全量，用0.22μm的微孔滤膜过滤后灌装于5ml曲颈安瓶中，拉丝封口。121℃灭菌12分钟。经灯检、贴签、包装、入库即得。

实施例12骨瓜多肽注射剂的配制8

实施例1的提取物      2.5g(按猪骨多肽计)

实施例3的提取物      25g(按甜瓜籽多肽计)

注射用水             加至2000ml

将实施例1制备的猪骨提取物溶液和实施例1制备的猪骨提取物溶液按猪骨多肽与甜瓜籽多肽重量比1∶10混合，用8％的氢氧化钠溶液或12％的盐酸溶液调节pH值6.8，再加注射用水至全量，用0.22μm的微孔滤膜过滤后灌装于5ml曲颈安瓶中，拉丝封口。121℃灭菌12分钟。经灯检、贴签、包装、入库即得。

实验例1高分子量物质含量测定

按照《中国药典2005年版二部附录VD》中规定的高效液相色谱法测定。

对照品为胰岛素(分子量5800)，加流动相(三氟醋酸-乙腈-水0.05∶10∶90)制成每1ml含1mg的溶液。

测试品为实施例5中的制剂，加流动相制成1ml中含多肽1mg的溶液。

测定方法：取对照品溶液和测试溶液个20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，经检测，测试溶液的高分子物质含量低于1.5％。

说明本品稳定，不会引起变态反应。

实验例2本发明制剂治疗骨性关节炎的效果

方法：60例OA患者(符合美国ACR修订的OA诊断标准)随机分为2组，观察组每例患者应用骨瓜提取物注射液连续10d治疗，每天12mg静脉滴注。对照组仅用钙剂和活性α-D3及止痛治疗，疗程10d，

疗效评价标准：

1.疼痛观察指标用视觉比量表(VAS)表示。

2.压痛、肿胀、功能障碍观察，每天评价1次。具体计分方法按表1内容计分。

3.疗效判定显效：肿胀及压痛明显减轻，关节活动改善明显，治疗后总计分下降≥2/3；有效：肿胀及压痛减轻，关节活动有明显，治疗后总计分下降≥1/3；无效：

症状无改善，治疗后总计分下降＜1/3。

统计学处理计量资料采用t检验，计数资料采用方差分析，等级资料用Ridit检验，所有资料用SPSS8.0软件包处理。

表1压痛、肿胀、功能障碍计分标准

  程度  压痛  肿胀  功能障碍  结果  无  无  无  无  0  轻度  按压后疼痛  轻度、皮纹变浅  轻度、正常活动  1  中度  按压后表情痛苦  中度、皮纹变少  中度、活动时疼痛  2

  重度  拒按  严重、皮肤薄、亮  重度、关节功能受限  3

结果①观察组在治疗前后疼痛分数分别为(5.7±1.5)分与(4.2±1.4)分，二者比较差异有显著性(P＜0.05)。对照组在治疗前后疼痛分数分别为(4.9±1.1)分与(4.3±1.0)分，二者比较差异有显著性(P＜0.05)。②2组疗效比较：观察组显效总有效率为80.00％，对照组总有效率为53.34％，观察组疗效较对照组好，差异有显著性(P＜0.05)。结论骨瓜提取物注射液有较好的消肿，止痛作用，并有一定的调节骨代谢的作用，安全性好，可作为OA的一种辅助治疗措施。