EGLN2变体及其在预防或治疗血栓栓塞病和冠心病中的用途

摘要

本发明涉及在氨基酸序列的58位具有丝氨酸或亮氨酸的人EGLN2变体及其在预防或治疗血栓栓塞病或冠心病中的用途，其中所述疾病尤其是中风、长期的可逆性局部缺血性神经功能缺损(PRIND)、短暂性局部缺血发作(TIA)、心肌梗塞和/或早发性心肌梗塞。

说明书

技术领域

本发明涉及在氨基酸序列的58位具有丝氨酸或亮氨酸的人EGLN2变 体及其在预防或治疗血栓栓塞病或冠心病中的用途，其中所述疾病尤其是 中风、长期的可逆性局部缺血性神经功能缺损(prolonged reversible ischaemic neurological deficit；PRIND)、短暂性局部缺血发作(transient ischemic attack；TIA)、心肌梗塞和/或早发性心肌梗塞(premature myocardial infarct)。

背景技术

EGLN2，由于其的HIF脯氨酰羟化酶活性，也称作含有脯氨酰羟化酶 结构域的蛋白质1(PHD1)，其属于具有由5个编码外显子组成的保守基 因组结构的Egl-Nine基因家族的一组密切相关蛋白质。HIF (hypoxia-inducible factor，缺氧诱导因子)是在氧稳态的许多方面发挥关 键作用的转录调节因子，但EGLN同种型EGLN1(PHD1)、EGLN2(PHD2) 和EGLN3(PHD3)在HIF的生理调节上所起的作用仍然不明确(Appelhoff， R.J.等人(2004)J.Biol.Chem.，279，38458-38465，No.37)。已报道，所有 EGLN同种型都表现出不同的细胞特异性和可诱导性行为，这使得可以灵 活地调节HIF对缺氧的反应。这意味着，对特定EGLN同种型的特异药 理学抑制作用可能可以选择性地调节HIF反应，这在治疗应用中将是有用 的(Appelhoff，R.J.等人(2004)，见上文)。例如，对EGLN2的抑制作用 广泛地在一系列处于静息状态的细胞类型中激活HIF反应。相反，对 EGLN3的特异抑制作用选择性地在高水平表达该酶的一些组织中增强对 缺氧的反应(Appelhoff，R.J.等人(2004)，见上文)。这开启了治疗局部缺 血性/缺氧性疾病的可能性。与EGLN2和EGLN3相反地，对EGLN1的 生理作用知道得不多。

发明内容

为了更好地理解EGLN2在冠心病发生和发展中的潜在作用，就 EGLN2基因在根据本发明以索引号NM_053046.2发表的EGLN2参考序 列的470位的变异，对一组详细表征的患者进行了基因型-表型相关性分 析，其中所述变异为。已经已知SNP(单核苷酸多态性)形式的EGLN2基 因的不同遗传变体，并发表在 http://www.nchi.nlm.nih.gov/SNP/snp ref.cgi？locusId＝112398)。

令人惊讶地发现，编码人EGLN2蛋白质的核酸在470位核苷酸的变 异、尤其是从胞嘧啶变为胸腺嘧啶、或者人EGLN2蛋白质在58位氨基酸 的变异、尤其是从丝氨酸变为亮氨酸，与血栓栓塞病和/或冠心病的发生相 关。

因此，本发明的一个主题涉及含有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列 的EGLN2蛋白质和编码该EGLN2蛋白质的核酸，尤其是根据SEQ ID NO： 4的核酸序列。优选地，根据本发明的核酸为DNA或RNA，优选DNA， 尤其是双链DNA。该核酸的序列可以进一步表征为其具有至少一个内含子 和/或一个polyA序列。

在本发明再一实施方案中，核酸可以用来制备载体，优选穿梭载体、 噬菌粒、粘粒、表达载体或具有基因治疗活性的载体形式。此外，基因敲 除构建体或表达盒可以用上述核酸制备。表达载体可以为原核或真核表达 载体。原核表达载体的实例为例如用于在大肠杆菌(E.coli)中表达的载体， 例如载体pGEM或pUC衍生物，真核表达载体的实例为用于在酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)中表达的载体，例如载体p426Met25或 p426GAL1(Mumberg等人(1994)Nucl.Acids Res.，22，5767-5768)，用于 在昆虫细胞中表达的载体，例如EP-B1-0 127 839或EP-B1-0 549 721中公 开的杆状病毒(Baculovirus)载体，以及用于在哺乳动物中表达的载体，例 如载体Rc/CMV和Rc/RSV或SV40载体，其中所述载体都为通常能获得 的。一般而言，表达载体也含有适于相应宿主细胞的启动子，例如在大肠 杆菌中表达的trp启动子(见，例如EP-B1-0 154 133)，在酵母中表达的 Met25、GAL1或ADH2启动子(Russel等人(1983)，J.Biol.Chem.258， 2674-2682；Mumberg，见上文)，在昆虫细胞中表达的杆状病毒多角体蛋白 启动子(见，例如EP-B1-0 127 839)。对于在哺乳动物细胞中的表达，例如， 适宜的启动子为那些允许在真核细胞中组成性、可调节性、组织特异性或 代谢特异性表达的启动子。根据本发明的可调节元件为启动子、激活物序 列、增强子、沉默子和/或阻抑物序列。使得可以在真核生物中组成性表达 的合适可调节元件的实例为RNA聚合酶III识别的启动子或病毒启动子、 CMV增强子、CMV启动子(也见实施例13)、SV40启动子或例如来自 MMTV(小鼠乳腺瘤病毒；Lee等人(1981)Nature 214，228-232)的LTR启 动子，以及衍生自例如HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV或HIV 的其它病毒启动子和激活物序列。使得可以在真核生物中诱导性表达的可 调节元件的实例为与相应阻抑物联合的四环素操纵基因(Gossen M.等人 (1994)Curr. Opin.Biotechnol.5，516-20)。使得可以在真核生物中代谢特异 性表达的可调节元件的实例为优选受缺氧调节的启动子。

为了能够引入根据本发明使用的核酸、并且由此能通过转染、转化或 感染而在真核细胞或原核细胞中表达多肽，核酸可以以质粒形式或者作为 病毒或非病毒载体的一部分出现。本文适宜的病毒载体尤其为：杆状病毒、 痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒(adeno-associated viruse)和疱疹病毒。 本文适宜的非病毒载体尤其为：病毒体、脂质体、阳离子脂质或多聚赖氨 酸缀合的DNA。

具基因治疗活性的载体的实例为病毒载体，例如腺病毒载体或逆转录 病毒载体(Lindemann等人，1997，Mol.Med.3：466-76；Springer等人，1998， Mol.Cell.2：549-58)。分离形式的真核表达载体对基因治疗用途是合适的， 因为裸露的DNA在局部应用时能够渗透进入皮肤细胞(Hengge等人，1996， J.Clin.Invest.97：2911-6；Yu等人，1999，J.Invest.Dermatol.112：370-5)。 具基因治疗活性的载体也可以通过将根据本发明所用的核酸和脂质体复合 来获得，因为这样能实现非常高的转染效率，尤其是对皮肤细胞(Alexander 和Akhurst，1995，Hum.Mol.Genet.4：2279-85)。在脂质转染的情况中，可 以通过超声波处理脂质体悬浮液，从阳离子脂质制备单层小脂泡。DNA以 离子方式结合至脂质体表面，其中结合比率使得可以保持正净电荷、并且 质粒DNA100％地复合至脂质体。除了Felgner等人(1987，见上文)采用的 脂质混合物DOTMA(1，2-二油基氧基丙基-3-三甲基-铵溴化物)和DPOE (二油酰基磷脂酰乙醇胺)，还合成了许多新型脂质制剂，并检测了它们转 染多种细胞系的效率(Behr，J.P.等人(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86， 6982-6986；Felgner，J.H.等人(1994)J.Biol.Chem.269，2550-2561；Gao，X. &Huang，L.(1991)，Biochim.Biophys.Acta 1189，195-203)。脂质制剂的实 例为DOTAP N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-铵乙基-硫酸盐 或DOGS(TRANSFECTAM；二-十八烷基酰胺基甘氨酰亚精胺)。增加核 酸转移进入细胞的助剂可以是例如使核酸能转运进入细胞核的合成的肽 -DNA分子或者结合DNA的蛋白质或肽(Schwartz等人(1999)Gene Therapy 6，282；Brandén等人(1999)Nature Biotech.17，784)。助剂也包括 能使核酸释放进入细胞质的分子(Planck等人(1994)J.Biol.Chem.269， 12918；Kichler等人(1997)Bioconj.Chem.8，213)或例如脂质体(Uhlmann 和Peymann(1990)见上文)。另一尤其适宜的基因治疗载体形式可以如下 获得，即通过将根据本发明所用的核酸施用至金颗粒，并在所谓的基因枪 辅助下将这些射入组织、优选皮肤或细胞(实施例13；Wang等人，1999，J. Invest.Dermatol.，112：775-81，Tuting等人，1998，J.Invest.Dermatol.111： 183-8)。

对于上述核酸的基因治疗应用，如果编码多肽的核酸部分含有一个或 多个非编码序列，包括，优选位于启动子和多肽起始密码子之间的内含子 序列、和/或尤其位于基因3’末端的polyA序列、尤其是天然存在的polyA 序列或SV40病毒polyA序列，那么由于因此可以实现mRNA的稳定化， 所以其也是有利的(Jackson，R.J.(1993)Cell 74，9-14和Palmiter，R.D.等 人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，478-482)。

基因敲除构建体为本领域技术人员已知，例如可以从美国专利 5,625,122、US 5,698,765、US 5,583,278和US 5,750,825获知。

本发明进一步涉及用根据本发明的载体或基因敲除构建体转化的宿主 细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞，原核宿主细胞的实例为大肠杆菌， 并且真核细胞的实例为酿酒酵母或昆虫细胞。尤其优选的转化了的宿主细 胞为转基因的非人胚胎干细胞，其特征为其包含根据本发明的基因敲除构 建体或根据本发明的表达盒。转化宿主细胞和/或干细胞的方法为本领域技 术人员熟知，并且包括例如电穿孔法或显微注射法。

本发明的另一主题涉及含有根据本发明的核酸或载体的转基因动物。

制备转基因动物尤其是小鼠的方法同样也为本领域技术人员已知的 (可以从DE 196 25 049和US 4,736,866、US 5,625,122、US 5,698,765、 US 5,583,278和US 5,750,825获知)，并且包括可以例如通过直接将表达载 体(见上文)注射进入胚胎或精母细胞或者通过将表达载体转染进入胚胎 干细胞(Polites和Pinkert：DNA Microinjection and Transgenic Animal Production，15-68页in Pinkert，1994：转基因动物技术：实验室手册， Academic Press，London，UK；Houdebine，1997，Harwood Academic Publishers，Amsterdam，The Netherlands；Doetschman：Gene Transfer in Embryonic Stem Cells，115-146页in Pinkert，1994，见上文；Wood： Retrovirus-Mediated Gene Transfer，147-176页in Pinkert，1994，见上文； Monastersky：Gene Transfer Technology；Alternative Techniques and Applications，177-220页in Pinkert，1994，见上文)而产生的转基因动物。 如果将根据本发明所用的核酸整合进入所谓的靶向载体中(Pinkert，1994， 见上文)，那么可以例如在转染胚胎干细胞和同源重组后产生敲除小鼠，一 般地，所述小鼠为杂合小鼠，其显示出所述核酸降低的表达，而纯合小鼠 则不再显示出所述核酸的表达。以这种方式产生的转基因的和敲除的细胞 或动物也可以用于筛选和鉴定具有基因治疗活性的药物活性物质载体。

本发明的另一主题涉及特异地结合含有根据SEQ ID NO：3的氨基酸 序列的EGLN2蛋白质的抗体。

根据本发明，术语“特异地”表示抗体结合含有根据SEQ ID NO：3的 氨基酸序列的EGLN2蛋白质，但基本不结合含有根据SEQ ID NO：2的氨 基酸序列的EGLN2蛋白质，即，抗体适宜于区分在58位具有丝氨酸的 EGLN2蛋白质和在58位具有亮氨酸的EGLN2蛋白质。

抗体为多克隆或单克隆的，优选地其为单克隆抗体。根据本发明，术 语抗体应理解为也指通过基因工程技术制备的以及任选修饰的抗体或其抗 原结合部分，例如嵌合抗体、人源化的抗体、多功能抗体、双或寡特异性 抗体、单链抗体、F(ab)或F(ab)₂片段(见，例如EP-B1-0 368 684、US 4,816,567、US 4,816,397、WO 88/01649、WO 93/06213、WO 98/24884)。

生产抗体的方法根据本领域技术人员通常已知的方法进行，例如根据 需要在存在例如弗氏佐剂和/或氢氧化铝凝胶下、用上述多肽或其所述部分 免疫哺乳动物例如兔(见，例如Diamond，B.A.等人(1981)The New England Journal of Medicine，1344-1349)。然后，可以根据通常已知的方 法容易地从血液中分离作为免疫反应结果而在动物中形成的多克隆抗体， 并例如通过柱层析进行纯化。单克隆抗体可以例如根据Winter&Milstein 的已知方法(Winter，G.&Milstein，C.(1991)Nature，349，293-299)产生。 重组抗体可以按照如上文具体指出的专利出版物中所公开的方法产生。

本发明的另一主题涉及产生含有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的 EGLN2蛋白质的方法，其中在适宜的培养基中培养上文详述的细胞，并 任选地从细胞或培养基中分离该EGLN2蛋白质。

EGLN2蛋白质可以例如根据本领域技术人员通常已知的方法通过在 上文已说明的适宜表达系统中表达上述核酸来制备。适宜的宿主细胞为例 如大肠杆菌菌株DHS、HB101或BL21，酵母菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，鳞翅目(Lepidoptera)昆虫细胞系、例如来自草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)的细胞系或动物细胞COS、Vero、293、HaCaT 和HeLa，所有这些宿主细胞都是通常可获得的。EGLN2蛋白质也可以为 融合蛋白质的一部分。在此，含有上述多肽的融合蛋白质可以如上文所述 制备，融合蛋白质自身已具有上述多肽的功能或者该特定功能只有在切去 融合部分后才是功能活性的。本文特别包括具有大约1-300、优选大约 1-200、尤其是大约1-100、特别是大约1-50个外源氨基酸的部分的融合蛋 白质。此类肽序列的实例为原核肽序列，所述原核肽序列可以衍生自例如 大肠杆菌的半乳糖苷酶。此外，也可以使用病毒肽序列例如噬菌体M13 的病毒肽序列来产生融合蛋白质用于本领域技术人员已知的噬菌体展示方 法。用于融合蛋白质的肽序列的其它优选实例为利于更容易地检测出融合 蛋白质的肽，这些肽为例如“绿色荧光蛋白”或其变体。

为了分离和/或纯化上述蛋白质，可以连接(一个或多个)其它多肽(标 签)。适宜的蛋白质标签允许例如高亲和力吸收至基质、用适当缓冲液严紧 洗涤而不显著洗脱复合体、以及随后定向洗脱所吸附的复合体。本领域技 术人员已知的蛋白质标签的实例为(His)₆标签、Myc标签、FLAG标签、 血细胞凝集素标签、谷胱甘肽转移酶(GST)标签、具有几丁质结合亲和 标签的内含肽或麦芽糖结合蛋白质(MBP)标签。这些蛋白质标签可以位 于N或C末端和/或内部。

本发明的再一主题涉及筛选EGLN2蛋白质的调节剂的方法，其中所 述方法包括下列步骤：

(a)提供EGLN2蛋白质或编码EGLN2蛋白质的核酸，

(b)提供测试化合物，和

(c)测定或检测测试化合物对EGLN2蛋白质或EGLN2基因的影 响。

一般地，例如在测试系统中提供EGLN2蛋白质或编码EGLN2蛋白 质的核酸，并使其直接或间接地与测试化合物、尤其是生物化学或化学的 测试化合物(例如化学化合物文库的形式)接触。然后测定或检测测试化 合物对EGLN2蛋白质或编码EGLN2蛋白质的核酸的影响。此后，可以 分析和/或分离适宜的调节剂，例如激活剂或抑制剂。对于筛选化学化合物 文库，优选使用本领域技术人员已知的或商业可得的高通量测定法。

根据本发明，术语“化学化合物文库”指的是从多个来源中的任何来源 集合在一起的多个化学化合物，包括化学合成的分子和天然产物的化学化 合物，或是通过组合化学技术产生的多个化学化合物。

一般地，在多相或均相试验中测定或检测测试化合物对EGLN2或 EGLN2基因的影响。如本文所用，多相试验为包括一个或多个洗涤步骤 的试验，而在均相试验中不需要该洗涤步骤。仅混合试剂和化合物并进行 测定。

适宜的功能测试试验可以基于EGLN2的基因表达，EGLN2的直接激 活或抑制来进行。在存在作为EGLN2基因表达调节剂的待测试物的生物 化学或化学化合物时，可以通过技术人员通常已知的手段或如Appelhoff， R.J.等人(2004)，见上文和/或Jaakkola，P.等人(2001)Science，292，468-472， No.5516.中所述的方法，测定直接的激活作用或抑制作用或与其它蛋白质 例如细胞蛋白质形成的复合体。

例如，脯氨酰羟化酶活性可以通过质谱分析来测定，其中可以检测脯 氨酸，例如该脯氨酰羟化酶或HIF-1α底物的Pro⁵⁶⁴的氧化；或者通过本 领域技术人员已知的酶测定法，例如在体外测试试验中和/或在用人细胞、 动物细胞、细菌细胞或酵母细胞的体外全细胞测试试验中测定。

固相结合的多肽也可以构成阵列的一部分。例如在US 5,744,305中公 开了用固相化学作用和光不稳定的保护基团制备该阵列的方法。也可以使 这些阵列与测试化合物或化合物文库接触，并测试相互作用，例如结合或 构象改变。

在本发明的另一实施方案中，该方法用全细胞进行。通常，将生长在 多孔板底部的细胞进行固定并透化处理、之后封闭并与抗目的底物的一级 (P)-特异性抗体孵育。然后，例如用铕标记的或HRP缀合的二级抗体 与特定化学发光的或显色的物质(例如上述的)来产生信号。联合使用显 微镜，不仅可以在单细胞水平上定量(P)-特异性抗体的数量，也可以确定 磷酸化诱导的底物移位或细胞的形态变化。

方便地，本发明的方法可以在机器人系统中进行，所述机器人系统例 如包括机器人种板(plating)和机器人液体转移系统，例如使用微流体学 (microfluidics)，即，在通道结构中。

在本发明的另一实施方案中，该方法以高通量筛选系统的形式进行。 方便地，在该系统中筛选方法是自动化和小型化的，尤其是其使用小型化 的孔和受机器人控制的微流体技术。

本发明的另一主题涉及含有根据SEQ ID NO：2或3的氨基酸序列的 EGLN2蛋白质或编码该EGLN2蛋白质的核酸在生产预防或治疗血栓栓 塞病和/或冠心病的药物中的用途。所述血栓栓塞病尤其是中风、长期的可 逆性局部缺血性神经功能缺损(PRIND)和/或短暂性局部缺血发作(TIA)。 此外，冠心病尤其是心肌梗塞。特别地，含有根据SEQ ID NO：3的氨基 酸序列的EGLN2蛋白质或编码该EGLN2蛋白质的核酸用来生产预防或 治疗中风、PRIND和/或TIA的药物，并且含有根据SEQ ID NO：2的氨 基酸序列的EGLN2蛋白质或编码该EGLN2蛋白质的核酸用来生产预防 或治疗心肌梗塞、尤其是早发性心肌梗塞的药物。

具体而言，如果470位的核苷酸在染色体DNA中为胸腺嘧啶或在 mRNA中为尿嘧啶或者58位的氨基酸为亮氨酸，那么存在更高的发生中 风、PRIND和/或TIA的风险。然而，如果470位的核苷酸为胞嘧啶或58 位的氨基酸为丝氨酸，那么存在更高的发生心肌梗塞、尤其是早发性心肌 梗塞的风险。

根据本发明，术语“EGLN2-C470C”指的是一组在编码EGLN2的基因 的两个等位基因上在参考序列NM_053046.2的470位具有胞嘧啶(导致相 应蛋白质58位的氨基酸为丝氨酸)的人。这些人就该EGLN2变体而言是 纯合的。相应地，术语“EGLN2-C470T”指的是一组在编码EGLN2的基因 的一个等位基因上具有导致相应蛋白质58位为丝氨酸的胞嘧啶、并在编码 EGLN2的基因的另一等位基因上具有导致相应蛋白质58位为亮氨酸的胸 腺嘧啶的人。这些人就该EGLN2变体而言是杂合的。

编码人EGLN2蛋白质的参考序列的核酸序列优选具有SEQ ID NO：1 的核酸序列，并且人EGLN2蛋白质的氨基酸序列优选具有SEQ ID NO：2 的氨基酸序列。然而，本发明也包括人EGLN2的其它变体和其非人同系 物，例如其它哺乳动物EGLN2同系物、或来自秀丽隐杆线虫 (Caenorhabdidis elegans)、小鼠或大鼠的EGLN2同系物，条件是在对应 于所述参考序列的470位的位置存在自胞嘧啶向胸腺嘧啶的核苷酸交换、 和/或在对应于所述参考序列58位的位置存在自丝氨酸到亮氨酸的氨基酸 交换、并且进一步地该相应蛋白质具有脯氨酰羟化酶活性、尤其是HIF脯 氨酰羟化酶活性。所述酶活性例如可以通过如上文所述的质谱分析测定。

一般地，470位的特定核苷酸可以通过核酸测序法、核酸质谱分析、 杂交法和/或扩增法确定。核酸测序法的实例为焦磷酸测序(pyrosequencing) 和/或借助放射性和/或荧光标记的核苷酸的测序。杂交方法的实例为 Southern印迹分析、Northern印迹分析和/或在DNA-微阵列上的杂交法。 扩增法的实例为TaqMan分析、RNA差别展示分析和/或代表性的差异分 析(Shi M.M.(2002)Am J Pharmacogenomics.，2(3)，197-205；Kozian& Kirschbaum(1999)Trends Biotechnol.，17(2)，73-8.)

此外，58位的氨基酸序列可以通过测定特定蛋白质的量的方法和/或 测定特定蛋白质的活性的方法确定。测定特定蛋白质的量的方法的实例为 Western印迹分析和/或ELISA。测定特定蛋白质的活性的实例为体外测试 试验和/或用人细胞、动物细胞、细菌细胞或酵母细胞进行的体外全细胞测 试试验，所有这些都为本领域技术人员已知。

用于检测相应变体的样品的实例为细胞、组织或体液、尤其是血液的 细胞组分、内皮细胞或平滑肌细胞。优选地，样品用本领域技术人员已知 的常规方法预处理以便分离和/或纯化样品中的核酸或染色体DNA或蛋白 质用于进行进一步的分析。

鉴定根据本发明的变体的一个优选方法包括下列步骤：

(a)从样品、特别是从来自例如待研究的人或患者的细胞、组织、 体液、血液的细胞组分、内皮细胞或平滑肌细胞，分离核酸 探针，尤其是DNA探针；

(b)借助引物，尤其是实施例中详述的引物，扩增包含EGLN2 基因470位的特定区域；

(c)测序扩增的区域；和

(d)分析经测序的区域。

确定根据本发明的变体的一个备选方法包括下列步骤：

(a)从样品、尤其是从例如来自待研究的人或患者的细胞、组织、 体液、血液的细胞组分、内皮细胞或平滑肌细胞，分离ENGL2 蛋白质；和

(b)测定EGLN2蛋白质58位的氨基酸。

实施例中以逐一单独的方式或以集合的方式详述了更加优选的步骤， 所述步骤在此处引入作为每个步骤的参考。

最后，本发明的主题涉及生产治疗血栓栓塞病和/或冠心病的药物的方 法，其中所述方法包括下列步骤：

(a)实施如上文所述的筛选方法，

(b)分离经测定或检测适宜于治疗血栓栓塞病和/或冠心病的测试化 合物，和

(c)将经测定或检测的测试化合物用一种或多种可药用载体或辅助 物质进行配制。

根据上述方法的步骤(c)，经检测的测试化合物通常根据施用类型用一 种或多种可药用添加剂或辅助物质进行配制，其中所述添加剂或辅助物质 为例如生理缓冲溶液、例如氯化钠溶液、软化水、稳定剂、ε-氨基己酸或 抑胃酶肽A、或螯合剂、例如EDTA、凝胶形成剂例如白凡士林、低粘性 石蜡和/或黄蜡等。

适宜的其它添加剂为例如去污剂，例如Triton X-100或脱氧胆酸钠， 以及多元醇类、例如聚乙二醇或丙三醇，糖类、例如蔗糖或葡萄糖，两性 离子化合物、例如氨基酸、例如甘氨酸或者尤其是牛磺酸或甜菜碱，和/ 或蛋白质、例如牛或人血清白蛋白。优选去污剂、多元醇类和/或两性离子 化合物。

生理缓冲溶液优选具有大约6.0-8.0的pH、尤其是大约6.8-7.8的pH、 特别是大约7.4的pH、和/或大约200-400毫渗透压摩尔/升、优选大约 290-310毫渗透压摩尔/升的渗透性。通常，药物的pH用适当的有机或无 机缓冲液调节，例如优选使用磷酸盐缓冲液、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基 甲烷)、HEPES缓冲液([4-(2-羟基乙基)哌嗪]-乙磺酸)或MOPS缓冲液 (3-吗啉-1-丙磺酸)。相应缓冲液的选择通常取决于期望的缓冲液重量摩尔 浓度。例如，磷酸盐缓冲液适用于注射和输注溶液。

药物可以以常规方式施用，例如通过口服剂量形式例如片剂或胶囊、 通过粘膜例如鼻腔或口腔、以植入皮下的栓剂形式、通过注射、输注或含 有根据本发明药物的凝胶来施用。，还可以局部(topically and locally)施用 药物来治疗上文所述的特定关节疾病，如果适当的话以脂质体复合物的形 式。此外，治疗可以通过经皮治疗系统(TTS)来进行，这使得可以实现 药物在时间上的控制性释放。TTS例如可以从EP 0 944 398 A1、EP 0 916 336 A1、EP 0 889 723 A1或EP 0 852 493 A1中已知。

如果仅向身体施用相对小量例如大约1毫升至大约20毫升的溶液或悬 浮液，那么通常使用注射溶液。如果施用较大量溶液或悬浮液例如一升或 更多升，那么通常使用输注溶液。因为，不同于输注溶液，在注射溶液的 情况中仅施用几毫升，所以在注射剂中与血液或组织液在pH和渗透压上 的小差别本身不值得注意、或者仅就疼痛感觉而言值得轻微程度的注意。 因此，通常不需要在使用前稀释根据本发明的制剂。然而，在施用相对大 量的情况中，应当在临施用前将根据本发明的制剂稀释到可以获得至少大 约等渗的溶液的程度。等渗溶液的实例为0.9％浓度的氯化钠溶液。在输注 剂的情况中，可以用例如无菌水进行稀释，而施用可以通过例如所谓的通 路(bypass)进行。

下列图、表、序列和实施例将解释本发明，但不限制本发明的范围。

附图简述

图1显示具NCBI号NM_053046的人EGLN2基因的核酸序列。下划 线为用来扩增在470位(粗体)具遗传变异C→T的遗传部分的引物。

图2显示衍生自具NCBI号NM_053046的核酸序列的人EGLN2的氨 基酸序列。该EGLN2蛋白质中58位的氨基酸以粗体显示。

图3显示在58位含有亮氨酸的人EGLN2变体的氨基酸序列。该 EGLN2蛋白质中58位的氨基酸以粗体显示。

图4显示在470位含有苏氨酸的人EGLN2变体基因的核酸序列。

图5显示在患者组中EGLN2在参考序列NM_053042.2的470位的基 因型对冠心病的发生年龄的影响，其中所述基因型导致EGLN2蛋白质58 位氨基酸的改变。低于0.05的P值为统计学上相关的。

序列描述

SEQ ID NO：1显示具NCBI号NM_053046的人EGLN2蛋白质的核 酸序列。

SEQ ID NO：2显示衍生自具NCBI号NM_053046的核酸序列的人 EGLN2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3显示在58位含有亮氨酸的人EGLN2变体的氨基酸序 列。

SEQ IN NO：4显示在470位含有苏氨酸的人EGLN2变体的核酸序列。

SEQ ID NO 5：显示具有参考序列NM_053046.2.的444-463位核苷酸的 第一引物序列。

SEQ ID NO 6：显示具有参考序列NM_053046.2.的504-521位碱基的互 补序列的第二引物序列。

实施例

通过测序检测和分析SNP

扩增用的寡核苷酸(引物)：

下列引物用来检测具索引号NM_053046.2的EGLN2序列在470位从 C到T的核苷酸交换：

引物1：5′-CTGTCCAGGAGTGCCTAGTG-3′(参考序列 NM_053046.2的核苷酸444-463；SEQ ID NO：5)；

引物2：5′-GGGCTGGCAGTGGTAGAG-3′(参考序列NM_053046.2 的504-521碱基的互补序列；SEQ ID NO：6)。

用于扩增的PCR实验程序：

所用试剂购自Applied Biosystems(Foster City，USA)：20ng基因组 DNA；1单位TaqGold DNA聚合酶；1×Taq聚合酶缓冲液；500μM dNTP； 2.5mM MgCl₂；上述扩增引物对每个引物各200nM；H₂O加至5μl。

鉴定基因型的PCR扩增程序：

95℃10分钟×1个循环

95℃30秒

70℃30秒×2个循环；

95℃30秒

65℃30秒×2个循环；

95℃30秒

60℃30秒×2个循环；

95℃30秒

56℃30秒

72℃30秒×40个循环；

72℃10分钟

4℃30秒×1个循环；

用于微测序和检测SNP的实验程序

所用试剂购自Applied Biosystems(Foster City，USA)。2μl纯化的PCR 产物，1.5μl BigDye-Terminator试剂盒，200nM上述测序引物；H₂O加 至10μl。

用于测序的扩增程序：

96℃2分钟×1个循环；

96℃10秒

55℃10秒

65℃4分钟×30个循环；

72℃7分钟

4℃30秒×1个循环；

测序产物的分析：

首先用Sequenz分析软件(Applied Biosystems，Foster City，USA)分析 序列来获得初步数据，然后用软件Phred，Phrap，Polyphred und Consed 处理。Phred，Phrap，Polyphred und Consed由华盛顿大学的Phil Green 编写(http://www.genome.washington.edu)。

结果

该组个体的特征

表1显示所研究的该组个体的特征

表1

  n   ％  总数   2074  性别   女性   603   29.07   男性   1471   70.93  年龄   61.8(+/-10.5)  BMI(体重指数)   29.1(+/-4.4)  血压   1214   58.7  吸烟者   1372   66.41  II型糖尿病   361   17.46  心肌梗塞   830   40.59  中风   145   7.01

EGLN2基因变体的频率和分布

表2显示EGLN2基因在参考序列NM_053046.2的470位的遗传变体 在所研究的该组患者中的频率和分布。

表2

  频率   百分数   EGNL2-C470C   (EGNL2Ser58Ser)   1253   96.31   EGNL2-C470T   (EGNL2Ser58Leu)   47   3.61   EGNL2-T470T   (EGNL2Leu58Leu)   1   0.08   缺失值   773

在下文中，仅考虑具EGLN2-C470C(EGLN2Ser58Ser)和 EGLN2-C470T(EGLN2Ser58Leu)的个体。

EGLN2变体对早发性心肌梗塞的发生的影响

表3显示在研究的患者组中EGLN2在参考序列NM_053046.2的470 位的基因型对早发性心肌梗塞(男性低于55岁，并且女性低于60岁)和 中风/PRIND(长期的可逆性局部缺血性神经功能缺损)/TIA(短暂性局部 缺血发作)的发生的影响。P值小于0.05为统计学上相关的。

表3

结果：

1.相比具EGLN2-C470T的患者，具EGLN2-C470C的患者显示统 计学上更高的早发性心肌梗塞发病率。

2.相比具EGLN2-C470C的患者，具EGLN2-C470T的患者显示显 著增加的遭受中风、PRIND和/或TIA的风险。

EGLN2变体对冠心病患者年龄的影响

图5显示在患者组中EGLN2在参考序列NM_053042.2的470位的基 因型对冠心病的发生年龄的影响。

结果：

发现，相比具EGLN2-C470T(EGLN2 Ser58Leu)的患者年龄，具 EGLN2-C470C(EGLN2 Ser58Ser)的患者年龄与冠心病的早发显著相关。

结论：

编码EGLN2的基因的遗传变体和/或上述蛋白质EGLN2之间在统计 学上的显著相关性清楚地指明，在血栓栓塞病和/或冠心病的发生中涉及所 述遗传变体。因此，所述遗传变体是用于预后血栓栓塞病和/或冠心病、尤 其是预后早发性心肌梗塞和/或中风、PRIND和/或TIA的生物标记。

序列表

SEQ ID NO：1

   1 gctttcccct gcctgcctgt ctctagtttc tctcacatcc cttttttttt ttcctttctc

  61 tagccaccct gaagggtccc ttcccaagcc cttagggacc gcagaggact tggggaccag

 121 caagcaaccc ccagggcacg agaagagctc ttgctgtctg ccctgcctca ccctgcccca

 181 cgccaggccc ggtggccccc agctgcatca agtggaggcg gaggaggagg cggaggaggg

 241 tggcaccatg ggcccgggcg gtgccctcca tgcccggggg atgaagacac tgctgccatg

 301 gacagcccgt gccagccgca gcccctaagt caggctctcc ctcagttacc agggtcttcg

 361 tcagagccct tggagcctga gcctggccgg gccaggatgg gagtggagag ttacctgccc

 421 tgtcccctgc tcccctccta ccactgtcca ggagtgccta gtgaggcctc ggcagggagt

 481 gggaccccca gagccacagc cacctctacc actgccagcc ctcttcggga cggttttggc

 541 gggcaggatg gtggtgagct gcggccgctg cagagtgaag gcgctgcagc gctggtcacc

 601 aaggggtgcc agcgattggc agcccagggc gcacggcctg aggcccccaa acggaaatgg

 661 gccgaggatg gtggggatgc cccttcaccc agcaaacggc cctgggccag gcaagagaac

 721 caggaggcag agcgggaggg tggcatgagc tgcagctgca gcagtggcag tggtgaggcc

 781 agtgctgggc tgatggagga ggcgctgccc tctgcgcccg agcgcctggc cctggactat

 841 atcgtgccct gcatgcggta ctacggcatc tgcgtcaagg acagcttcct gggggcagca

 901 ctgggcggtc gcgtgctggc cgaggtggag gccctcaaac ggggtgggcg cctgcgagac

 961 gggcagctag tgagccagag ggcgatcccg ccgcgcagca tccgtgggga ccagattgcc

1021 tgggtggaag gccatgaacc aggctgtcga agcattggtg ccctcatggc ccatgtggac

1081 gccgtcatcc gccactgcgc agggcggctg ggcagctatg tcatcaacgg gcgcaccaag

1141 gccatggtgg cgtgttaccc aggcaacggg ctcgggtacg taaggcacgt tgacaatccc

1201 cacggcgatg ggcgctgcat cacctgtatc tattacctga atcagaactg ggacgttaag

1261 gtgcatggcg gcctgctgca gatcttccct gagggccggc ccgtggtagc caacatcgag

1321 ccactctttg accggttgct cattttctgg tctgaccggc ggaaccccca cgaggtgaag

1381 ccagcctatg ccaccaggta cgccatcact gtctggtatt ttgatgccaa ggagcgggca

1441 gcagccaaag acaagtatca gctagcatca ggacagaaag gtgtccaagt acctgtatca

1501 cagccgccta cgcccaccta gtggccagtc ccagagccgc atggcagaca gcttaaatga

1561 cttcaggaga gccctgggcc tgtgctggct gctccttccc tgccaccgct gctgcttctg

1621 actttgcctc tgtcctgcct ggtgtggagg gctctgtctg ttgctgagga ccaaggagga

1681 gaagagacct ttgctgcccc atcatggggg ctggggttgt cacctggaca gggggcagcc

1741 gtggaggcca ccgttaccaa ctgaagctgg gggcctgggt cctaccctgt ctggtcatga

1801 ccccattagg tatggagagc tgggaggagg cattgtcact tcccaccagg atgcaggact

1861 tggggttgag gtgagtcatg gcctcttgct ggcaatgggg tgggaggagt acccccaagt

1921 cctctcactc ctccagcctg gaatgtgaag tgactcccca acccctttgg ccatggcagg

1981 caccttttgg actgggctgc cactgcttgg gcagagtaaa aggtgccagg aggagcatgg

2041 gtgtggaagt cctgtcagcc aagaaataaa agtttacctc agagctgcaa aaaaaaaaaa

2101 aaaaaaaaaa a

SEQ ID NO：2

MDSPCQPQPLSQALPQLPGSSSEPLEPEPGRARMGVESYLPCPLLPSYHCPGVPSEASAGSGTPRA

TATSTTASPLRDGFGGQDGGELRPLQSEGAAALVTKGCQRLAAQGARPEAPKRKWAEDGGDAPSPS

KRPWARQENQEAEREGGMSCSCSSGSGEASAGLMEEALPSAPERLALDYIVPCMRYYGICVKDSFL

GAALGGRVLAEVEALKRGGRLRDGQLVSQRAIPPRSIRGDQIAWVEGHEPGCRSIGALMAHVDAVI

RHCAGRLGSYVINGRTKAMVACYPGNGLGYVRHVDNPHGDGRCITCIYYLNQNWDVKVHGGLLQIF

PEGRPVVANIEPLFDRLLIFWSDRRNPHEVKPAYATRYAITVWYFDAKERAAAKDKYQLASGQKGV

QVPVSQPPTPT

SEQ ID NO：3

MDSPCQPQPLSQALPQLPGSSSEPLEPEPGRARMGVESYLPCPLLPSYHCPGVPSEALAGSGTPRA

TATSTTASPLRDGFGGQDGGELRPLQSEGAAALVTKGCQRLAAQGARPEAPKRKWAEDGGDAPSPS

KRPWARQENQEAEREGGMSCSCSSGSGEASAGLMEEALPSAPERLALDYIVPCMRYYGICVKDSFL

GAALGGRVLAEVEALKRGGRLRDGQLVSQRAIPPRSIRGDQIAWVEGHEPGCRSIGALMAHVDAVI

RHCAGRLGSYVINGRTKAMVACYPGNGLGYVRHVDNPHGDGRCITCIYYLNQNWDVKVHGGLLQIF

PEGRPVVANIEPLFDRLLIFWSDRRNPHEVKPAYATRYAITVWYFDAKERAAAKDKYQLASGQKGV

QVPVSQPPTPT

SEQ ID NO：4

  1 gctttcccct gcctgcctgt ctctagtttc tctcacatcc cttttttttt ttcctttctc

 61 tagccaccct gaagggtccc ttcccaagcc cttagggacc gcagaggact tggggaccag

121 caagcaaccc ccagggcacg agaagagctc ttgctgtctg ccctgcctca ccctgcccca

181 cgccaggccc ggtggccccc agctgcatca agtggaggcg gaggaggagg cggaggaggg

241 tggcaccatg ggcccgggcg gtgccctcca tgcccggggg atgaagacac tgctgccatg

301 gacagcccgt gccagccgca gcccctaagt caggctctcc ctcagttacc agggtcttcg

361 tcagagccct tggagcctga gcctggccgg gccaggatgg gagtggagag ttacctgccc

421 tgtcccctgc tcccctccta ccactgtcca ggagtgccta gtgaggcctt ggcagggagt

481 gggaccccca gagccacagc cacctctacc actgccagcc ctcttcggga cggttttggc

541 gggcaggatg gtggtgagct gcggccgctg cagagtgaag gcgctgcagc gctggtcacc

601 aaggggtgcc agcgattggc agcccagggc gcacggcctg aggcccccaa acggaaatgg

661 gccgaggatg gtggggatgc cccttcaccc agcaaacggc cctgggccag gcaagagaac

721 caggaggcag agcgggaggg tggcatgagc tgcagctgca gcagtggcag tggtgaggcc

781 agtgctgggc tgatggagga ggcgctgccc tctgcgcccg agcgcctggc cctggactat

 841 atcgtgccct gcatgcggta ctacggcatc tgcgtcaagg acagcttcct gggggcagca

 901 ctgggcggtc gcgtgctggc cgaggtggag gccctcaaac ggggtgggcg cctgcgagac

 961 gggcagctag tgagccagag ggcgatcccg ccgcgcagca tccgtgggga ccagattgcc

1021 tgggtggaag gccatgaacc aggctgtcga agcattggtg ccctcatggc ccatgtggac

1081 gccgtcatcc gccactgcgc agggcggctg ggcagctatg tcatcaacgg gcgcaccaag

1141 gccatggtgg cgtgttaccc aggcaacggg ctcgggtacg taaggcacgt tgacaatccc

1201 cacggcgatg ggcgctgcat cacctgtatc tattacctga atcagaactg ggacgttaag

1261 gtgcatggcg gcctgctgca gatcttccct gagggccggc ccgtggtagc caacatcgag

1321 ccactctttg accggttgct cattttctgg tctgaccggc ggaaccccca cgaggtgaag

1381 ccagcctatg ccaccaggta cgccatcact gtctggtatt ttgatgccaa ggagcgggca

1441 gcagccaaag acaagtatca gctagcatca ggacagaaag gtgtccaagt acctgtatca

1501 cagccgccta cgcccaccta gtggccagtc ccagagccgc atggcagaca gcttaaatga

1561 cttcaggaga gccctgggcc tgtgctggct gctccttccc tgccaccgct gctgcttctg

1621 actttgcctc tgtcctgcct ggtgtggagg gctctgtctg ttgctgagga ccaaggagga

1681 gaagagacct ttgctgcccc atcatggggg ctggggttgt cacctggaca gggggcagcc

1741 gtggaggcca ccgttaccaa ctgaagctgg gggcctgggt cctaccctgt ctggtcatga

1801 ccccattagg tatggagagc tgggaggagg cattgtcact tcccaccagg atgcaggact

1861 tggggttgag gtgagtcatg gcctcttgct ggcaatgggg tgggaggagt acccccaagt

1921 cctctcactc ctccagcctg gaatgtgaag tgactcccca acccctttgg ccatggcagg

1981 caccttttgg actgggctgc cactgcttgg gcagagtaaa aggtgccagg aggagcatgg

2041 gtgtggaagt cctgtcagcc aagaaataaa agtttacctc agagctgcaa aaaaaaaaaa

2101 aaaaaaaaaa a

SEQ ID NO：5

1CTGTCCAGGA GTGCCTAGTG

SEQ ID NO：6

1GGGCTGGCAG TGGTAGAG