一种果蝇抗菌肽伏蝇素的制备方法

摘要

本发明涉及一种果蝇抗菌肽伏蝇素Diptericin的制备方法。该方法的具体步骤为：果蝇伏蝇素Diptericin基因的获得，重组质粒pGEX－4T－1－diptericin的构建以及融合蛋白的表达纯化和伏蝇素Diptericin的获得。本发明方法采用基因工程方法生产果蝇伏蝇素Diptericin，比化学合成法成本低。以大肠杆菌为表达宿主，表达量较高，达到了315.4mg/L。以pGEX－4T－1为表达载体，易于融合蛋白的纯化，只需经一次亲和层析便可得到纯度较高的融合蛋白。只需经一次酶切便可得到纯的伏蝇素Diptericin，纯化简便。

说明书

技术领域

本发明涉及一种果蝇抗菌肽伏蝇素Diptericin的制备方法，特别是一种采用基因工程法制备果蝇抗菌肽伏蝇素Diptericin的方法。

发明背景

20世纪30年代，随着Fleming发现青霉素之后，各种天然、合成、半合成的抗生素开始被应用于抵抗各种微生物的感染，广泛使用在药物、动物饲料等领域。此后的几十年，抗生素对保护人类健康做出了巨大贡献。但是，随着它的长期大量应用，人们发现了多种产生耐药性的菌株，导致一些过去可以被抗生素有效控制的传染性疾病死灰复燃。抗感染治疗再度陷入危机，使得寻找抗生素替代品成了亟需解决的问题。

抗菌肽(Antibacterial Peptide)作为一种具有抗感染活性的多肽类物质，具有以下特性：性能稳定，抗菌谱广泛，不易产生耐药性和生理抵制作用。因此，抗菌肽越来越多地受到人们的关注，有望成为替代抗生素的药物。

果蝇缺乏哺乳动物所具有的获得性免疫系统，即体内没有T细胞和B细胞，也没有抗体和补体系统。但是成虫果蝇却能成为酵母、细菌和真菌的传播载体，使有机体腐烂或变坏，这主要是因为果蝇具有天然的免疫系统，可以抵制各种病原微生物的侵染。果蝇免疫反应的一个重要特点就是在受到病原微生物侵染或损伤时，脂肪体细胞能快速合成一些抗菌肽，这些分子分泌到血淋巴后能杀死入侵的病原微生物。伏蝇素Diptericin就是其中的一个重要成员，它对革兰氏阴性菌具有较强杀菌作用，推测其杀菌机制可能是增加了革兰氏阴性菌细胞质内β-半乳糖苷酶的释放，从而增加内膜和外膜的通透性，阻碍了细菌的生长。

目前抗菌肽的生产主要有以下渠道：直接提取纯化、化学合成以及通过基因工程合成的方法合成，但是，从生物体内直接提取的难度大，对技术和成本的要求高，难以实现规模化生产，化学合成法费用昂贵，限制了应用。因此，基因重组技术成为大量表达有活性抗菌肽的一条有效途径。

大肠杆菌的原核表达系统是迄今在基因工程领域中应用最多、也最完善的系统，但是，运用该系统表达抗菌肽则遇到了很多困难，主要表现在：1)抗菌肽对宿主细胞的毒性。阳性抗菌肽的抑菌作用会对宿主细胞产生抑制，从而影响抗菌肽的进一步表达。2)容易被降解。由于抗菌肽分子量小，本身带有大量正电荷，因而对蛋白酶非常敏感，在表达细胞中容易被降解，难以实现大量表达。因此，本发明选用融合表达载体pGEX-4T-1，该载体本身含有编码GST蛋白的序列，使表达出的抗菌肽N端融合一段GST序列，起到以下三个作用：1)增加外源蛋白的稳定性；2)提高外源基因在宿主中的表达水平；3)有利于目的蛋白的分离纯化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种果蝇抗菌肽伏蝇素的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种果蝇抗菌肽伏蝇素的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.获得果蝇伏蝇素Diptericin基因：提取果蝇总RNA，然后以果蝇总RNA为模板，根据果蝇diptericin基因序列设计特异性引物：

上游引物D1：5′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3’；

下游引物D2：5′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3’；

然后进行PCR扩增得到280bp的diptericin片段；

b.重组质粒pGEX-4T-1-diptericin的构建：将用EcoR I和Xho I双酶切后的diptericin片断插入质粒pGEX-4T-1的EcoR I/Xho I之间，构成重组表达质粒pGEX-4T-1-diptericin；转化大肠杆菌BL21，挑选出抗Ampicillin的阳性克隆；抽提质粒，用EcoR I和Xho I双酶切，得到280bp左右的片段，即为重组质粒pGEX-4T-1-diptericin；

c.融合蛋白的表达纯化和伏蝇素Diptericin的获得：将上述的重组表达质粒pGEX-4T-1-diptericin在含100μg/mlAmpicillin的2×YT液体培养基中培养至OD600值达到0.6，加入100mM IPTG储液至终浓度为1.0mM；继续培养4小时后离心，收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集果蝇伏蝇素Diptericin的融合蛋白组分，用凝血酶酶切融合蛋白，4℃下反应16小时，终止反应，再次进行亲和层析，收集流出组分，冷冻干燥，得到果蝇抗菌肽伏蝇素Diptericin。

与现有技术相比，本发明具有如下显而易见的特点和显著优点：

1.采用基因工程方法生产果蝇伏蝇素Diptericin，比化学合成法成本低。

2.以大肠杆菌为表达宿主，表达量较高，达到了315.4mg/L。

3.以pGEX-4T-1为表达载体，易于融合蛋白的纯化，只需经一次亲和层析便可得到纯度较高的融合蛋白。

4.只需经一次酶切便可得到纯的伏蝇素Diptericin，纯化简便。

附图说明：

图1重组质粒pGEX-4T-1-diptericin的构建流程图。

图2Diptericin-GST蛋白的纯化，1-纯化得到的Diptericin-GST蛋白，2-marker。

图3Diptericin-GST蛋白的酶切，1-marker；2，3-酶切后的Diptericin-GST；4-酶切前的Diptericin-GST。

图4Diptericin对大肠杆菌的抑菌活性，0-加入PBS对照；1-加入20μl1mg/ml Diptericin溶液；2-加入20μl 0.5mg/ml Diptericin溶液；3-加入20μl 0.25mg/ml Diptericin溶液。

具体实施方式：

参见图1、2、3、4，本发明具体方案叙述如下：

1.获得果蝇伏蝇素Diptericin基因

先提取果蝇总RNA，然后以果蝇总RNA为模板，根据果蝇diptericin基因序列设计特异性引物：

上游引物D1：5′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3’；

下游引物D2：5′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3’；

30℃10min，47℃30min，5℃5min进行反转录，然后85℃1min，55℃1min，72℃1min，循环25次进行PCR扩增得到280bp左右大小的diptericin片段(包括编码82个氨基酸残基的Diptericin成熟肽基因序列246bp、终止密码子3bp、引物设计增加24bp)，DNA序列测定表明扩增片段序列与果蝇diptericin序列相符。

2.重组质粒pGEX-4T-1-diptericin的构建

将用EcoR I和Xho I双酶切后的diptericin片断插入质粒pGEX-4T-1的EcoR I/XhoI之间，构成重组表达质粒pGEX-4T-1-diptericin。转化大肠杆菌BL21，挑选出抗Ampicillin的阳性克隆。抽提质粒，用EcoR I和Xho I双酶切，得到280bp左右的片段，与预期结果相符。

3.融合蛋白的表达纯化和伏蝇素Diptericin的获得

将构建好的重组表达质粒pGEX-4T-1-diptericin在含100μg/mlAmpicillin的2×YT液体培养基中培养至OD600值达到0.6，加入100mM IPTG储液至终浓度为1.0mM。继续培养4小时后离心，收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集果蝇伏蝇素Diptericin的融合蛋白组分，经考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，表达量达到315.4mg/L。用凝血酶酶切融合蛋白，4℃下反应16小时，终止反应，再次进行亲和层析，收集流出组分，冷冻干燥，得到果蝇伏蝇素Diptericin。

4.伏蝇素Diptericin的初步抑菌活性

将得到的Diptericin冻干粉用500μl无菌水溶解，配成母液。考马斯亮蓝法测得蛋白浓度为8mg/ml。取100μl母液稀释成1mg/ml、0.5mg/ml以及0.25mg/ml的Diptericin溶液。

采用琼脂扩散法，以大肠杆菌为受试菌，经LB液体培养基37℃培养16～18h活化增菌，取0.1ml菌液置于LB琼脂平板上，用灭菌的L形曲玻棒均匀涂布，略干后用灭菌打孔器，在涂有细菌的平板培养基表面打孔，孔径直径为5mm，孔间中心距离≥24mm。孔内分别加入20μl 1mg/ml、0.5mg/ml以及0.25mg/ml的Diptericin溶液，及对照PBS，37℃培养过夜，用卡尺测量抑菌环直径。实验结果显示，参见图4，Diptericin对大肠杆菌有良好的抑杀作用，1mg/ml浓度时，抑菌圈直径达20.00mm。

                           序列表

<110>上海大学

<120>一种果蝇抗菌肽伏蝇素Diptericin的制备方法

<160>1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

5′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3’；

5′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3’；