抗CD86人源化单克隆抗体

摘要

本发明提供一种CD86人源化单克隆抗体，其相关基因序列和表达系统。本发明提供的单克隆抗体大大减少了鼠单克隆抗体的免疫原性，实现了其在工程细胞(如CHO细胞)中的无血清培养基高表达，且表达产物生物活性高，可以应用于自身免疫性疾病和抑制器官移植后宿主排异反应药物的制备上。

说明书

技术领域

本发明属于生物免疫学领域，具体地，本发明涉及单克隆抗体技术、抗体人源化技术以及基因重组技术。

背景技术

人体的免疫系统是人体抵抗外来病毒感染、维持身体健康最重要的防御屏障。针对侵入人体的异物(病毒、被移植的器官等)，人体首先通过抗原递呈细胞(APC)，如树突状细胞，将抗原加工处理，然后通过APC细胞表面的MHC将抗原分别递呈给T细胞和B细胞。T细胞在其表面CD3抗原的帮助下，通过其表面的T细胞受体(TCR)识别并结合递呈的抗原，这是机体免疫反应激活的第一信号；然后，APC细胞表面的CD86结合T细胞表面的CD28，实际这是T细胞激活的第二信号。T细胞被激活后，产生活化的T细胞去破坏和杀死被病毒感染的或异源体细胞，防止病毒的复制和传播，这就是人体的细胞免疫途径。B细胞则分泌特异性抗体结合入侵的病毒颗粒，中和病毒的感染能力并引导体内的巨噬细胞吞噬病毒颗粒，这是人体的体液免疫途径。当体内的病毒被清除后，APC细胞不再递呈经加工的抗原后，抑制性T细胞就通过其表面的CTLA-4抗原结合APC细胞表面的CD86抗原，阻断CD86对T细胞表面的CD28抗原的激活作用，从而将人体的免疫反应降低到正常水平。这就是人体免疫系统的平衡调节(见图1：双信号模型。抗原特异性的淋巴细胞激活需要两种信号，信号I是抗原多肽与主要组织相容性复合物组成的复合物(MHC)和T细胞受体(TCR)之间的相互作用，信号II是表达在抗原递呈细胞表面的共刺激细胞表面分子传递到T细胞的。通过操纵共刺激信号通路可以作为一种治疗手段促进或终止免疫反应)。

如果人体免疫系统平衡的调节发生异常，就会产生疾病。例如，虽然肿瘤细胞可以产生一些特异的抗原，但是肿瘤病人的T细胞并不能识别并杀死肿瘤细胞。许多研究发现，肿瘤病人体内的T细胞表面CTLA-4的表达异常升高，虽然APC细胞可以递呈抗原，但是由于CTLA-4封闭了CD86抗原与CD28抗原的结合，导致T细胞无法活化，使肿瘤细胞逃避了机体的免疫监视。如果用特异性的药物或抗体封闭CTLA-4，使之无法与CD86抗原结合，就能够激活肿瘤病人自身的T细胞，最终达到清除肿瘤细胞的目的。如果人体的免疫反应过强，人体同样会产生疾病。例如，正常情况下，人体的T细胞不会识别自身的抗原，B细胞也不会产生针对自身抗原的抗体，但是在自身免疫性疾病患者体内，具有识别自身抗原功能的T、B细胞攻击自身的组织器官，例如类风湿性关节炎，强直性脊椎炎和系统性红斑狼疮等。如果采用特异的药物或抗体封闭与T、B细胞激活相关的CD3或CD86抗原，就可以减轻自身免疫性疾病患者的症状。

对于器官移植的病人，病人体内的免疫细胞将移植物当作外来异物进行排斥。因此在术后相当长的时间内，病人需要服用免疫抑制剂以延长被移植物的存活时间，如环磷酰胺。由于环磷酰胺是非特异性免疫系统抑制剂，有较强的副作用。如果采用CD3或CD86的抗体直接阻断T细胞的激活，既可抑制机体的免疫排斥反应，又不会带来明显的不良反应。

目前，单克隆抗体在世界医药市场异军突起，已成为世界生物工程制药业的支柱产品之一。随着技术的不断发展，鼠源性单克隆抗体将逐渐被人源化抗体所替代，其主要原因是：鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低，CDC作用相应较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱；它与NK等免疫细胞表面Fc受体亲和力弱，介导的ADCC作用较弱；鼠源抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥ADCC与CDC作用的时间较短；鼠单克隆抗体具有免疫原性，宿主易产生抗抗体引起过敏反应。

本发明者通过不断摸索，最终实现了对鼠抗人CD86单克隆抗体基因的人源化改造，从而完成了本发明。

因此，本发明第一个目的在于提供一种CD86人源化单克隆抗体。

本发明第二个目的在于提供一种编码CD86人源化单克隆抗体重链可变区的DNA分子。

本发明第三个目的在于提供一种编码CD86人源化单克隆抗体轻链可变区的DNA分子。

本发明第四个目的在于提供一种载体，所述载体包含编码CD86人源化单克隆抗体重链可变区的DNA序列和/或编码CD86人源化单克隆抗体轻链可变区的DNA序列。

本发明第五个目的在于提供一种转染方法。

本发明第六个目的在于提供一种宿主细胞。

本发明第七个目的在于提供CD86人源化单克隆抗体在制备预防或治疗自身免疫性疾病或抑制移植物排异反应的药物上的应用。

发明概述

本发明的一个方面提供一种CD86人源化单克隆抗体，所述抗体包括小鼠来源的重链可变区和轻链可变区以及人源的抗体恒定区，其中所述重链可变区是序列表中SEQ ID NO：1所示序列，所述轻链可变区是序列表中SEQ ID NO：2所示序列。

本发明的另一个方面提供一种DNA分子，所述DNA分子是编码序列表中SEQ IDNO：1的核苷酸序列，即SEQ ID NO：3所示序列。

本发明的另一个方面提供一种DNA分子，所述DNA分子是编码序列表中SEQ IDNO：2的核苷酸序列，即SEQ ID NO：4所示序列。

本发明的再一个方面提供一种载体，所述载体包含序列表中SEQ ID NO：3所示序列和/或序列表中SEQ ID NO：4所示序列。

本发明的还有一个方面提供一种转染方法，所述转染方法是将包含抗体重链可变区基因的载体与包含轻链可变区基因的载体和一种带有抗性筛选基因的载体共转染宿主细胞，或将包含抗体重链可变区基因和轻链可变区基因的载体与带有抗性筛选基因的载体共转染宿主细胞。

本发明进一步提供一种宿主细胞，所述宿主细胞为包含序列表中SEQ ID NO：3所示序列和/或序列表中SEQ ID NO：4所示序列的载体所转染的细胞。

本发明更进一步提供CD86人源化单克隆抗体在制备预防或治疗自身免疫性疾病或抑制移植物排异反应的药物上的应用。

发明详述

利用DNA重组技术将鼠单抗的轻链、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体，其人源化程度达到70％左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和活性，降低了免疫原性。

1.CD86基因的克隆

静脉抽取人血，经FICOLL密度离心，取上层有核细胞部分，经PBS清洗后，用Trizol法提取总RNA，然后用Oligo(dT)作为引物在逆转录酶的作用下合成cDNA，随后采用PCR的方法扩增人CD86的全长基因。

2.抗原制备与动物免疫

将所获得的CD86基因分别克隆到真核基因表达载体上，经转化后提取质粒，随后转染工程细胞，混合并经培养后选择阳性细胞。取一部分阳性细胞作为细胞抗原，免疫小鼠，分离脾细胞。

3.细胞融合

混合脾细胞与骨髓瘤细胞，进行融合反应，其间更换数次培养液，每次换液前均观察杂交瘤细胞的生长。待出现杂交瘤细胞后，取上清以检测抗体的分泌。

4.抗体的检测

采用流式细胞术检测分泌抗体的特异性，若杂交瘤细胞有分泌人CD86抗体，则可在检测结果中看到表达目的基因的CHO细胞与空白CHO细胞存在明显的峰移。

5.单克隆抗体的制备与鉴定

将上述筛选出的阳性细胞株进行抗体制备，采用小鼠腹腔接种法。用盐析法对抗体进行粗提，随后用蛋白亲和层析法进一步纯化抗体，并采用流式细胞仪检测抗体与抗原的结合。

6.抗体的蛋白质N-端测序

取纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAGE，分离抗体的重链和轻链，接着进行Western-blot试验，随后使用蛋白质序列测序系统对重链、轻链进行蛋白测序。

7.CD86单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆

根据蛋白测序结果反推抗体重链和轻链可变区5’端序列并合成相应引物，选择重链和轻链恒定区序列作为3’端引物，采用RT-PCR方法分别扩增重链和轻链可变区的基因。将所得基因克隆到载体中，进行DNA序列分析确证。

8.人源化表达载体的构建与表达

构建重链、轻链表达载体，所述载体已分别含有人抗体重链和轻链恒定区序列基因；克隆重链和轻链可变区基因序列；将重链和轻链可变区基因克隆到表达载体中，经转化检测人源化抗体的表达，选择抗体表达浓度高的克隆扩大培养以纯化抗体。

9.抗体的纯化与鉴定

扩大培养抗体表达浓度高的克隆，经浓缩后采用亲和层析进行纯化。采用UV法检测抗体浓度，采用SDS-PAGE法检测抗体纯度。

10.人源化CD86抗体抑制树突状细胞对T细胞的激活

将分离的人树突状细胞在培养基中培养，同时加入不同比率的CD4⁺T细胞。提取细胞基因组DNA，随后检测DNA的合成。采用这一试验方法，以证明经人源化改造后，CD86抗体仍具有抑制T细胞激活的能力。

有益效果：

本发明提供的CD86人源化单克隆抗体大大减少了鼠单克隆抗体的免疫原性，实现了其在工程细胞(如CHO细胞)中的无血清培养基高表达，且表达产物生物活性高，可以应用于自身免疫性疾病和抑制器官移植后宿主排异反应药物的制备上。

附图说明

图1人体T细胞的激活与抑制(双信号模型)。

图2 CD86单抗特异结合成熟DC细胞表面的CD86抗体。

图3人源化CD86抗体的纯化结果。

图4人源化CD86抗体抑制DC细胞对T细胞的激活能力。

图5免疫斑点印迹检测人源化CD86抗体在CHO细胞中的表达。

具体实施方式

下面用实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。

实施例1 CD86基因的克隆

1.FICOLL密度梯度离心：静脉抽取5ml人血，经FICOLL密度梯度离心(用等体积PBS缓冲液稀释血液，在15ml塑料离心管中先加入3ml FICOLL溶液，用移液器将10ml稀释的血液小心地铺在FICOLL溶液的上层，尽量避免液面混合，室温下2000转/分钟离心30分钟，离心结束后，小心弃血浆层，用移液器小心吸取中间白色细胞层并转移到新的离心管中)，取上层有核细胞部分并用10毫升PBS(150mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，6.5mmol/L的Na₂HPO₄，1.5mmol/L的KH₂PO₄，pH7.4)清洗3次。

2.Trizol法提取总RNA：细胞用1毫升Trizol试剂重悬，加200微升氯仿，振荡混匀，室温静置5分钟，于12000×g、4℃离心10分钟，取上层水相，加等体积的异丙醇，于4℃放置30分钟，随后于12000×g、4℃离心30分钟，弃液体，沉淀用1毫升70％的乙醇洗涤一次，室温晾干后，用100微升水溶解总RNA。

3.用Oligo(dT)12-18作为引物在逆转录酶的作用下合成cDNA：

1)在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H₂O使总体积达11μl，在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl，轻轻混匀、离心；

2)70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物：10×PCR缓冲液2μl、25mM MgCl₂ 2μl、10mMdNTPmi×1μl、0.1M DTT 2μl，轻轻混匀，离心，42℃孵育2-5min；

3)加入Superscript II 1μl，在42℃水浴中孵育50min；

4)于70℃加热15min以终止反应；

5)将管插入冰中，加入RNase H 1μl，37℃孵育20min，降解残留的RNA，-20℃保存备用。

4.采用PCR的方法扩增人CD86的全长基因，所用引物分别为：

CD86：5’端引物(SEQ ID NO：5)：5’-gcaggctccaccatggatcc-3’；

CD86：3’端引物(SEQ ID NO：6)：5’-acatgtttttaggacccagc-3’。

5.PCR产物克隆至T-EASY载体(PROMEGA)及质粒的提取：

1)PCR产物和T载体的连接：

a)PCR产物纯化：PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA片段(凝胶中DNA片段的回收使用试剂盒进行操作，例如碧云天的DNA凝胶回收试剂盒D0056，采用试剂盒提供的方法操作)；

b)配制连接混合液：50ng的T-EASY载体、200ng的待插入片段、5μl的快速连接缓冲液(2×)随后加双蒸水或MilliQ水至9.5μl、0.5μl的Rapid T4DNA连接酶，总体积10μl；

c)用移液器轻轻吹打混匀或轻微涡悬混匀上述连接混合液，室温离心数秒，使液体积聚于管底；

d)室温孵育5-10分钟或更长时间，随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。

2)受体菌的培养：

从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期；将该菌悬液以1∶100-1∶50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD₆₀₀＝0.5左右。

3)感受态细胞制备(CaCl₂法)：

a)将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，4℃下3000×g离心10分钟；

b)弃上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl₂溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，4℃下3000×g离心10分钟；

c)弃上清，加入4ml预冷含15％甘油的0.05mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置数分钟，即成感受态细胞悬液；

d)感受态细胞分装成200μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。

4)转化：

a)从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，随后立即置冰上；

b)加入连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30分钟；

c)42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，随后迅速置于冰上冷却3-5分钟；

d)向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)；

e)将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

5)质粒的提取：质粒的提取采用深圳尚能生物科技有限公司的质粒DNA小量提取试剂盒(产品货号NP1011-100)，按照说明书操作，质粒用50微升水溶解，取1微升做序列分析确证，结果显示正确。

实施例2抗原制备与动物免疫

1.将实施例1所得CD86基因克隆到真核基因表达载体上，如pCDNA3等载体上：

1)CD86基因与pCDNA3载体的连接：

a)连接混合液：50ng的EcoRV限制性内切酶消化的pCDNA质粒DNA、200-500ng的平末端CD86或CTLA4DNA片段、5μl的快速连接缓冲液(2×)随后加双蒸水或MilliQ水至9.5μl、0.5μl的Rapid T4DNA连接酶，总体积10μl；

b)用移液器轻轻吹打混匀或轻微涡悬混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底；

c)室温孵育5-10分钟或更长时间，随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。

2)受体菌的培养：

从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期；将该菌悬液以1∶100-1∶50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD₆₀₀＝0.5左右。

3)感受态细胞的制备(CaCl₂法)：

a)将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，4℃下3000×g离心10分钟；

b)弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl₂溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，4℃下3000×g离心10分钟；

c)弃去上清，加入4ml预冷含15％甘油的0.05mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；

d)感受态细胞分装成200μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。

4)转化：

a)从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，随后立即置冰上；

b)加入连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后；

c)42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，随后迅速置于冰上冷却3-5分钟；

d)向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)；

e)将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

5)质粒提取：采用深圳尚能生物科技有限公司的质粒DNA小量提取试剂盒(产品货号NP1011-100)，按照说明书操作，质粒用50微升水溶解。

2.转染CHO细胞：

取3μg上述步骤1中获得的质粒DNA，与CHO培养基混合至50μl，取3μlLipofctamine试剂(Invitrogen)，用CHO细胞培养基稀释到50μl，混合二者并在室温下放置15-30分钟，然后将混合物缓慢加入已培养48小时的CHO细胞中(3×10⁶/ml)，轻轻混匀，于37度、含5％CO₂的培养液中培养过夜，随后加入G418至终浓度400μg/ml，继续培养以选择阳性细胞。

3.制备5×10⁷个CD86的阳性细胞作为细胞抗原：

用500微升PBS溶液悬浮并与等体积弗氏完全佐剂充分混合后，小鼠皮下多点(每点100-200微升)注射免疫。选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，同时免疫3～4只小鼠。免疫间隔2～3周，注射量与初次免疫量相同，共3次，末次免疫为腹腔注射，3～4天后，分离脾细胞。

实施例3细胞融合

在50ml沉淀管中混合10⁸脾细胞和10⁷小鼠骨髓瘤细胞S/P20，并加入50ml 2.5％FCS-1640液。室温400×g离心3min，使细胞沉淀，移去上清液。轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。

将预热至40℃的50％PEG 0.8ml经1ml吸管缓慢滴加入管内，边滴加PEG边摇动沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程持续2min。加1ml1640液，边滴加边摇动沉淀管，持续1min，重复两次。加入RPMI 1640液15ml，室温，400×g离心1min，使细胞沉淀。去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT(次黄嘌呤(hypo×anthine，H)100umol/L，、氨甲蝶呤(aminopterin，A)400nmol/L和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)16umol/L)的完全1640液。将融合的细胞液滴加至40孔塑料培养盘中，该培养盘为已于前一日种有饲养细胞的培养盘，每孔1滴(约0.05ml)，轻摇后，放入含5％CO₂饱和湿度的37℃温箱中培育。

第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。轻轻吸取上清液，根据需要加入适量的饲养细胞。于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，用斑点杂交的方法检查抗体的分泌(具体步骤，同如下实施例8所述)。

所述杂交瘤细胞已进行生物材料的保藏，保藏的具体信息如下：

所述培养物分类命名：中国仓鼠卵巢细胞株CHO-YD-86细胞株；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCultureCollection，简称CCTCC)；

保藏单位地址：中国武汉武汉大学(邮编430072)；

保藏日期：2007年11月23日；

保藏编号：CCTCC-C200743。

实施例4抗体的检测

采用流式细胞术(FACS)检查分泌抗体的特异性。

吸取杂交瘤细胞培养的上清液，用含0.5％BSA的PBS缓冲液(150mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，6.5mmol/L的Na₂HPO₄，1.5mmol/L的KH₂PO₄，pH7.4)经1∶5、1∶10和1∶50稀释，与CHO细胞或表达CD86的CHO细胞室温孵育30分钟，PBS洗涤3次，再加1∶200稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，室温孵育30分钟，PBS洗涤3次，采用流式细胞仪检测抗体的结合情况。

如果杂交瘤细胞有分泌抗人CD86的抗体，在FACS结果图上可以看到表达目的基因的CHO细胞与空白CHO细胞存在明显的峰移。

FACS检测分泌抗体特异性的结果见图2。特异性表达CD80和CD86的CHO细胞用YD-aCD86或CTLA4Ig在冰上结合30分钟，洗涤后用FITC标记的抗人IgG二抗染色30分钟，洗涤后用流式细胞仪检测，可见YD-aCD86特异性结合表达CD86的CHO细胞，不结合表达CD80的CHO细胞。

实施例5单克隆抗体的制备与鉴定

将实施例4筛选出的阳性细胞株进行抗体制备，采用的是小鼠腹腔接种法，选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠。先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去，接种细胞的数量为5×10⁵/鼠。接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水。

采用葡萄球菌A蛋白亲和层析法(GE Healthcare)对抗体进行纯化。首先用盐析法对抗体进行粗提。

1.盐析法：

1)取10ml腹水加等体积生理盐水，于搅拌下逐滴加入两倍体积的饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50％；

2)于4℃、3h以上，使其充分沉淀，离心(3000rpm)20min，弃上清，以等体积生理盐水溶解沉淀，再逐滴加2倍体积的饱和硫酸铵；

3)置4℃3h以上(此时(NH₄)₂SO₄的饱和度为33％)，重复上述第二步过程1～2次；末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.01M PBS(pH7.4)溶解至2ml装入透析袋；

4)对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH₄+为止；

5)取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测蛋白含量。

2.亲和层析：

1)试剂与仪器：

a)SPA-Sepharose L-4B(pharmacia)；

b)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)+0.02％NaN₃；

c)0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH4.0)+0.02％NaN₃。

2)步骤：

a)用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶15min。按1g干胶：200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)；

b)装柱后用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)平衡；先于10000g离心除去抗体硫酸铵粗提物中的杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/L Tris(pH9.0)液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜；

c)加样，一般按25～30mg IgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)充分淋洗，至到淋洗液OD值为＜0.02；

d)用pH4.0的柠檬酸洗脱液洗脱，流速20ml/h；

e)收集洗脱液测OD值。

3.透析：结合的抗体经低pH洗脱后，立即加入0.5倍体积的2M Tris(pH7.2)中和，PBS透析过夜，其间更换3次缓冲液。

取纯化后的抗体，按1∶200的比例用完全RPMI1640培养基稀释后，与10e⁵表达CD86的成熟DC细胞(mDC)(以未成熟的DC细胞作为对照，iDC)室温孵育30分钟，PBS洗涤3次，加荧光标记的二抗(1∶200稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG)，室温孵育30分钟，洗涤3次。用流式细胞仪检测抗体与抗原的结合。

流式细胞仪检测单克隆抗体与抗原结合的结果见图2。从图中可见，YD-CD86单克隆抗体特异性地结合表达CD86的CHO细胞，而不能结合表达CD80的CHO细胞；CTLA4Ig作为阳性对照，CTLA4Ig可以结合CD86和CD80。

实施例6抗体的蛋白质N-端测序

取纯化后的单克隆抗体10μg，与等体积2×SDS-PAGE电泳缓冲液混合，煮沸5分钟，用10％的SDS-PAGE分离抗体的重链和轻链。电泳结束后，用含20％甲醇的免疫印迹转移缓冲液固定20分钟(转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH₂O定容至1000ml)，同时剪同样大小的PVDF膜，甲醇活化后，于去离子水中浸泡5分钟，随后于转膜缓冲液中浸泡10分钟。转膜装置从下至上依次按阳极、2层滤纸、PVDF膜、凝胶、2层滤纸、阴极的顺序放好，滤纸、凝胶和膜精确对齐，每一步去除气泡。接通电源，恒流1mA/cm²，转移1.5小时。转移结束后，断开电源将膜取出，用考马斯蓝G250染色后脱色，用新的手术刀片切下重链和轻链条带，晾干后用保鲜膜包好，-20度保存，用于蛋白N-端测序。蛋白质的N-端序列分析采用ABI公司的LC491型蛋白质序列测序系统进行。

测序结果如下：

CD86抗体重链N-端序列为：SEQ ID NO.7  D I Q M T Q S P A S I S。

CD86抗体轻链N-端序列为：SEQ ID NO.8  V Q L Q Q S G A E L A；

实施例7 CD86单克隆抗体重链与轻链可变区基因的克隆

根据实施例6所得的蛋白测序结果，反推抗体重链和轻链可变区5’-端的序列并合成相应引物，3’-端引物则选择重链和轻链恒定区的序列，采用RT-PCR的方法(见实施例1)从CD86杂交瘤细胞的cDNA中分别扩增重链和轻链可变区的基因并克隆到T-EASY载体中(见实施例2)。

所设计的重链PCR引物序列为：5’-端SEQ ID NO.9：gttcaactgcagcagtctggag

3’-端SEQ ID NO.10：cgaggaaacggtgaccgtg

所设计的轻链PCR引物序列为：5’-端：SEQ ID NO.11：5’-gatatccagatgacacag-3’

3’-端：SEQ ID NO，12：5’-cgtttcagctccagcttggtc-3’

经DNA序列分析确证为鼠IgG2的重链和轻链可变区基因。

重链DNA序列：SEQ ID NO.3

gttcaactgcagcagtctggagctgaactggcgaggcccggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggctt

ctggcttcaccttcactgaccactttataaactgggtgaggcagaggactggtcagggccttgagtggat

tggagagatttatcctggaactggtaatgctttctacagtgagaagttcaagggcaaggccacactgact

gcagacaaatcctccagcacagcctacatgcacctcagcagcctgacatctgaggactctgcagtctttt

tctgtgcaagtcccctgcgctccggtagtcactactggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggt

caccgtttcctcg

重链蛋白质序列：SEQ ID NO.1：

    V Q L Q Q S G A E L A R P G A S V K L S C K A S G F T F T D H F I N

W V R Q R T G Q G L E W I G E I Y P G T G N A F Y S E K F K G K A T L T

A D K S S S T A Y M H L S S L T S E D S A V F F C A S P L R S G S H Y W

Y F D V W G A G T T V T V S S

轻链DNA序列：SEQ ID NO.4：

cgtttcagctccagcttggtcccagcaccgaatgtgagaggagtcccataatgatgttgacagtaataag

tcccaaaatcttcaggctgcaggctgttgatcttcagagaaaactgtgtgcctgatccactgccactgaa

tcttgatggcacaccttcagctaaggtttttgcattatagaccaggaggtgaggagtttttccctctttc

tgctgataccatactagataactgtaaatattctcacttgctcgacatgtgatggtgacagtttctccca

cagaagcagatatggaggctggagactgtgtcatctggatatc

轻链蛋白质可变区序列：SEQ ID NO.2：

    D I Q M T Q S P A S I S A S V G E T V T I T C R A S E N I Y S Y L V

W Y Q Q K E G K T P H L L V Y N A K T L A E G V P S R F S G S G S G T Q

F S L K I N S L Q P E D F G T Y Y CQ H H Y G T P L T F G A G T K L E L K

实施例8人源化表达载体的构建与表达

分别将重链和轻链可变区基因克隆到我们构建的重链和轻链表达载体中。

1.构建重链、轻链表达载体(pBS-HV和pBS-LV)：

pBS-HV：在pBluescript SKII(+)载体中克隆了CMV启动子、重链信号肽基因序列、NheI和MluI酶切位点、重链衡定区基因序列和生长激素基因poly(A)加尾信号；

pBS-LV：在pBluescript SKII(+)载体中克隆了CMV启动子、轻链信号肽基因序列、DraIII和HindIII酶切位点、轻链衡定区基因序列和生长激素基因poly(A)加尾信号。

2.克隆重链和轻链可变区基因序列：

采用PCR的方法分别从CD86抗体重链和轻链基因中克隆重链和轻链可变区基因序列，所采用的引物两端分别添加与表达载体克隆位点相应的限制性内切酶切位点：重链为NheI和MluI，轻链为DraIII和HindIII，引物序列如下：

重链5’-端引物序列(SEQ ID NO：13)：

                      CTACGCGTGTCTTGTCCCAGGTTCAACTGCAGCAGTCTG

重链3’-端引物序列(SEQ ID NO：14)：GTGCTAGCCGAGGAAACGGTGACCGT

轻链5’-端引物序列(SEQ ID NO：15)：

                        TGCACGATGTGATATCCAGATGACACAGTCT

轻链3’-端引物序列(SEQ ID NO：16)：GTAAGCTTGGTCCCAGCACCGAATGTGAG

3.将重、轻链可变区基因序列克隆至已构建的pBS-HV和pBS-LV载体中：

将上述PCR产物经限制性内切酶消化后，分别克隆到已构建的重链和轻链表达载体(pBS-HV和pBS-LV)。

1)纯化：将构建好的重链和轻链表达载体分别用限制性内切酶NotI，SacI线性化并纯化：分别取10μg质粒DNA，分别加50单位的限制性内切酶，50℃消化5小时后，用QIAGEN公司的QIAquick PCR产物纯化试剂盒(货号28104)纯化线性化的DNA(具体步骤按照试剂盒说明书操作)；

2)共转染：取上述线性化的重链和轻链质粒DNA各4.5ug，等量混合后，与20％量(1μg)的含neo基因(neomycin抗性基因)的载体pCDNA共转染CHO细胞(具体步骤见实施例2)；24小时后添加G418至终浓度400μg/ml，继续培养10-15天后，采用有限稀释法将单一细胞转入96孔板中继续培养；

3)检测人源化抗体的表达：待上述培养基变黄，吸取上清采用斑点杂交的方法检测人源化抗体的表达：用多通道移液器从96孔培养板中每孔取100微升上清，在96孔点样器中点样于PVDF膜上，待液体吸干后，取下PVDF膜，用15ml含5％脱脂奶粉和0.5％TWEEN-20的PBS缓冲液(PBST)室温封闭过夜，用PBST轻微洗涤后，用15ml 1∶5000稀释的HRP标记的兔抗人IgG室温孵育1小时，PBST洗涤3×15分钟，每次200ml，取DAB药片一片，用25ml PBS溶解后，加25μl过氧化氢，将PVDF膜浸入此溶液中显色10-30分钟，用PBS(见实施例1)洗涤。检测结果见图5：免疫斑点印迹检测人源化CD86抗体在CHO细胞中的表达。其中，泳道1是克隆1，泳道2是克隆2，泳道3是阳性对照，泳道4是阴性对照。结果显示多个孔有抗体的表达，选择抗体表达浓度高的克隆2扩大培养以纯化抗体。

实施例9抗体的纯化与鉴定

将实施例8获得的待培养细胞转移到1升的转瓶中继续培养7天至培养基变黄，离心弃上清，细胞用1升含200μg/mlG418的新鲜培养基重悬，在转瓶中继续培养7-10天，离心取上清，用0.22um过滤器过滤后，4℃保存。

将获得的培养液浓缩至100ml，采用蛋白G亲和层析柱进行纯化。经0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分平衡亲和层析柱后，用pH2.7的0.1M柠檬酸溶液洗脱抗体，用2倍体积的2M Tris(pH7.2)中和洗脱液，然后用1升PBS缓冲液(见实施例1)透析过夜，中间换液3次。回收透析后的抗体并用紫外分光光度计测定抗体浓度，并经SDS-PAGE检测纯度。

经测定，抗体的浓度为680μg/ml。

SDS-PAGE的结果见图3。其中，泳道1为人IgG对照，泳道2、3为纯化的YD-aCD86抗体，泳道4为蛋白质分子量标准。从图3可以看出，CD86的纯度均很高，达到99％。

实施例10人源化CD86抗体抑制树突状细胞对T细胞的激活

1.细胞培养：

将分离的人树突状细胞培养在200μl含10％FCS的RPMI1640培养基中，与此同时加入1×10⁵CD4⁺T细胞，比率为1∶10和1∶50DC∶T细胞。培养基中同时加入(或不加)10μg/ml的人源化抗CD86抗体，于37℃、含有5％CO₂培养基中培养5天。在最后16小时，加入终浓度为1μCi/孔的[³H]标记的胸腺嘧啶。收集细胞，PBS(见实施例1)洗涤三次。

2.提取细胞基因组DNA：

1)仪器：高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪；

2)试剂：细胞裂解液(100mM Tris-HCl、5mM EDTA、500mM NaCl、1％SDS(pH7.5))；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70％及无水乙醇；3M NaAC(pH5.2)；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液；

3)步骤：取动植物材料10g(鲜组织)或0.5g(干冻组织)于液氮环境中研碎，加入65℃预热的含有1/10体积酚的10ml裂解液、等体积氯仿，于65℃放置30分钟，间隔5-10分钟轻摇一次；离心(12000-15000rpm，15min)取上清，静止后加入0.6体积冷异丙醇、0.1体积3M乙酸钠(pH5.2)，混匀，挑取絮状体，用70％冷乙醇洗涤，随后真空干燥；加入2ml TE(或水)、10μl RNase，于65℃反应10-30分钟去除RNA；加入等体积酚/氯仿进行氯仿抽提：轻轻混匀，于冰浴沉淀5分钟，5000rpm离心5分钟，取上清；加入2体积无水乙醇、1/10体积乙酸钠，于冰浴30分钟，随后于10000rpm离心10分钟；取沉淀，用70％冷乙醇洗涤，随后真空干燥；所得干粉于-20℃保存，或复溶于0.5-1ml TE或水中，分装成小体积，于-20℃或4℃保存。

3.检测DNA合成：采用液体闪烁记数的方法

1)试剂与仪器：闪烁液：5g的PPO、25g的POPOP，溶于1000mL二甲苯中；液体闪烁计数器：FJ-2107G，西安二六二厂；

2)步骤：取10μL纯化的基因组DNA，分别加水稀释成1、2、10、20、100倍，各取30μL，加闪烁液5mL，置于玻璃闪烁瓶中，测量样品的每分钟计数(cpm)。T细胞的增殖以[³H]掺入量来计算，如果细胞有增殖，则DNA合成增加，[³H]掺入量则增加。

3)结果：液体闪烁记数结果见图4。

图4a是YD-aCD86抑制培养的DC细胞对T细胞的激活作用：T细胞与DCs细胞在抗-CD86(YD-aCD86)或抗-CD80(对照)存在的条件下共培养6天，然后用[³H]标记的胸腺嘧啶做[³H]掺入实验检测T细胞的增殖。1∶10和1∶50为T细胞和DC细胞的比率。从图中可以看出，经人源化改造后，CD86抗体仍具有很高的抑制T细胞激活的能力。

图4b1表示YD-aCD86特异性抑制表达CD86的CHO细胞对T细胞增殖的作用；图4b2表示YD-aCD86不能抑制表达CD80的CHO细胞对T细胞增殖的作用。

                                 序列表

<110>卢小兵

     郑勇

     冯冬晓

<120>抗CD86人源化单克隆抗体

<130>CN081023

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>121

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

1              5                   10                  15

Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp His Phe

            20                 25                  30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

        35                 40                  45

Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Ala Phe Tyr Ser Glu Lys Phe Lys

    50                 55                  60

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65                 70                  75                  80

His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Phe Cys Ala

                85                 90                  95

Ser Pro Leu Arg Ser Gly Ser His Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

            100                105                 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>2

<211>107

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Ile Ser Ala Ser Val Gly

1               5                  10                  15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

            20                 25                  30

Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Glu Gly Lys Thr Pro His Leu Leu Val

        35                 40                  45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                 55                   60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65                 70                  75                  80

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu

                85                 90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

            100                 105

<210>3

<211>363

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gttcaactgc agcagtctgg agctgaactg gcgaggcccg gggcttcagt gaagctgtcc     60

tgcaaggctt ctggcttcac cttcactgac cactttataa actgggtgag gcagaggact    120

ggtcagggcc ttgagtggat tggagagatt tatcctggaa ctggtaatgc tttctacagt    180

gagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg    240

cacctcagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctttt tctgtgcaag tcccctgcgc    300

tccggtagtc actactggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtttcc    360

tcg                                                                  363

<210>4

<211>323

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

cgtttcagct ccagcttggt cccagcaccg aatgtgagag gagtcccata atgatgttga     60

cagtaataag tcccaaaatc ttcaggctgc aggctgttga tcttcagaga aaactgtgtg    120

cctgatccac tgccactgaa tcttgatggc acaccttcag ctaaggtttt tgcattatag    180

accaggaggt gaggagtttt tccctctttc tgctgatacc atactagata actgtaaata    240

ttctcacttg ctcgacatgt gatggtgaca gtttctccca cagaagcaga tatggaggct    300

ggagactgtg tcatctggat atc                                            323

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

gcaggctcca ccatggatcc                                                 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

acatgttttt aggacccagc                                                 20

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>人工合成

<400>7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Ile Ser

1               5                      10

<210>8

<211>11

<212>PRT

<213>人工合成

<400>8

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala

1               5                  10

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

gttcaactgc agcagtctgg ag                                              22

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

cgaggaaacg gtgaccgtg                                                  19

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

gatatccaga tgacacag                                                   18

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

cgtttcagct ccagcttggt c                                               21

<210>13

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

ctacgcgtgt cttgtcccag gttcaactgc agcagtctg                            39

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>14

gtgctagccg aggaaacggt gaccgt                                          26

<210>15

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<400>15

tgcacgatgt gatatccaga tgacacagtc t

                            31

<210>16

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>16

gtaagcttgg tcccagcacc gaatgtgag                                       29