真菌Xylaria sp.FDYS－1及其制备的生物制剂与在防治松材线虫中的应用

摘要

本发明公开一株真菌Xylaria sp.FDYS－1及其制备的生物制剂与在防治松材线虫中的应用。真菌Xylaria sp.FDYS－1，于2008年2月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M208025。本发明将Xylaria sp.FDYS－1接种至马铃薯葡萄糖液体培养基或马铃薯蔗糖液体培养基中，培养基的pH为5～8，培养温度为26℃～29℃，无光照条件下培养3～5天后，将培养液离心过滤，收集滤液即得生物制剂，该生物制剂对于松材线虫具有高致死活性，且热稳定性好，来源环保无毒性，选择性强，对生态环境影响小。本发明的菌株Xylaria sp.FDYS－1的培养条件要求低，产生活性物质的能力基本保持遗传稳定，具有很好的开发应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物农药领域，具体涉及一株真菌Xylaria sp.FDYS-1及其制备的生物制剂与在防治松材线虫中的应用。

背景技术

松材线虫病是松树的一种毁灭性病害。该病通常来势凶猛，染病松树死亡率极高，被称为“森林的癌症”和“无烟的森林火灾”。我国自1982年在南京中山陵首次发现该病，现已蔓延至江苏、浙江、安徽、山东、湖北、广东、江西、重庆、贵州等12个省份的113个县(区)，发生面积超过73hm²，死亡松树200万株，造成林业经济、森林生态的巨大损失和自然景观的严重破坏，并对我国广大适生区的松林构成严重威胁。

目前对松材线虫病的防治主要针对其传媒昆虫和松材线虫本身，而当前研究的松材线虫控制因子主要包括产毒真菌、抗生素和杀虫植物等。在产毒真菌方面，孙建华报道总状共头霉(Syncephalastrumracemosurn)对松材线虫有极强的杀线虫活性。向红琼等发现用乙酸乙酯从粗皮侧耳麦粒培养物中提取的粗毒素，对松材线虫有较强的毒性。李国红等发现一种侧耳属(Pleurotus sp.)真菌，12h内对松材线虫的致病率可达90％以上，且其活性组分存在于发酵液中，不需诱导能稳定生成，水溶性，对热不敏感。张克勤等发现Pseudohalonectriaadversaria ZD1菌株通过液体和麦粒固体培养后，可从代谢产物中提取有效的水溶和脂溶性物质制备成杀线虫生物毒素；Caryosporacallicarpa ZD2菌株通过液体和固体发酵后，可制备成对松材线虫具毒杀活性的生物制剂。董锦艳等发现粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)Gr87菌株采用常规固体发酵及提取分离的方法，可以获得6种对松材线虫有毒杀活性的化合物，这些化合物可单独或组合制备杀线虫生物农药。可见，寻找对松材线虫有毒性作用的真菌已经逐渐成为研究的热点。

使君子是传统的杀虫药用植物，自身能产生杀虫成分，基于植物内生真菌能产生与其宿主相同或相似的活性成分这一观点，如果以使君子植物内生真菌为筛选对象，应该可以获得对松材线虫有毒杀活性的菌株，从而为线虫的生物防治奠定基础，目前尚未有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具杀线虫活性的真菌Xylaria sp.FDYS-1。

本发明的另一个目的在于提供由上述真菌Xylaria sp.FDYS-1的代谢产物制备而得的生物制剂，该生物制剂具有较高的松材线虫致死活性。

本发明的另一个目的在于提供上述生物制剂的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供上述真菌Xylaria sp.FDYS-1及其代谢产物在松材线虫防治中的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

真菌Xylaria sp.FDYS-1分离自广州华南植物园栽培的使君子(Quisqualis indica L.)健康叶片，该菌为子囊菌中炭角菌属(Xylariasp.)的菌株FDYS-1，在PDA培养基上菌落为纯白色，辐射状，表面稍有褶叠，未见产孢结构，菌株的ITS序列与GenBank中登陆号为EF423534.1的Xylaria sp.同源性达99％，菌株Xylaria sp.FDYS-1已于2008年1月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 208025。

一种生物制剂，是由杀线虫活性菌株Xylaria sp.FDYS-1经液体发酵后提取制备而得，其制备方法为：将Xylaria sp.FDYS-1接种至pH为5～8的液体培养基，于26℃～29℃无光照条件下120r/min振荡培养3～5天，将含菌丝的发酵液放入离心管中，离心过滤除去菌丝，收集滤液即得。

上述液体培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)或马铃薯蔗糖液体培养基(PS)。

实验证明：上述生物制剂对松材线虫有毒杀活性，对线虫的致死率可达99％，且经121℃处理20min也不失活；真菌Xylaria sp.FDYS-1产生毒杀松材线虫的活性物质的能力基本保持遗传稳定，连续继代6代后对线虫的致死率仍达90.43％。

因此，本发明的真菌Xylaria sp.FDYS-1及其代谢产物(如上述的由发酵培养液制备的生物制剂)可用于松材线虫的防治。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的生物制剂对松材线虫具有高致死活性，热稳定性好，经121℃处理20min也不失活，而且该生物制剂来源环保无毒性，选择性强，对人畜安全，对生态环境影响小；2.本发明采用的Xylaria sp.FDYS-1菌株，其培养条件要求低，且产生活性物质的能力基本保持遗传稳定，连续继代6代后对线虫的致死率仍高达90.43％，具有很好的开发应用前景。

附图说明

图1为Xylaria sp.FDYS-1在PDA培养基上的菌落正面图；

图2为Xylaria sp.FDYS-1在PDA培养基上的菌落背面图；

图3为Xylaria sp.FDYS-1经不同培养液培养后滤液的杀线虫活性；

图4为Xylaria sp.FDYS-1在不同培养温度下培养后滤液的杀线虫活性；

图5为Xylaria sp.FDYS-1在不同初始pH值下培养后滤液的杀线虫活性；

图6为Xylaria sp.FDYS-1在不同培养代数后滤液的杀线虫活性。

具体实施方式

各种培养基配方：

PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和17～20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，121℃灭菌20分钟后，冷却后贮存备用。

PD培养液：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml。

PS培养液：马铃薯200g，蔗糖20g，水1000ml。

PC培养液：马铃薯200g，胡萝卜100克，水1000ml。

马丁氏培养液：蛋白胨5g，葡萄糖10g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 1g，水1000ml。

Czapek培养液：蔗糖30g，NaNO₃ 2g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄ 0.01g，水1000ml。

改良Fries 3号培养液：蔗糖20g，酒石酸铵5g，NH₄NO₃ 1g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.13g，玉米浆1g，水1000ml。

实施例1Xyalria sp.FDYS-1的分离及其对松材线虫的活性

采集广州华南植物园使君子植物的健康叶片，自来水冲洗干净，晾干水分后剪成约1.5×1.5cm的小块，进行表面消毒，其具体步骤如下：先用70％酒精漂洗30s，再用0.1％升汞漂洗1min，接着再用70％酒精漂洗30s后，无菌水冲洗4次，在无菌滤纸上吸干水分即可。

采用漂洗液检验法和组织印迹法检验表面消毒效果：漂洗液检验法即吸取最后一次无菌水冲洗的冲洗液0.2mL，涂布于PDA平板上；组织印迹法即用灭过菌的镊子将经上述表面消毒的材料移植至PDA平板上，接触5min后取出。处理后的PDA平板于于26±1℃无光照条件下培养7d后，若发现皿中无菌落出现，证明材料表面消毒彻底；否则，需重新分离。

将上述表面消毒处理过的材料在无菌状态下剪切成0.5×0.5cm的小块(剪去0.5cm的边缘)，并移植于含链霉素(0.05mg/ml)的PDA培养基上，于26±1℃无光照条件下培养，待组织块边缘有菌丝长出后，及时挑取菌丝尖端转入PDA平板上获得纯培养。

经多次分离，得到多株纯菌，纯菌经过接种至PD培养液中，于25℃无光照条件下120r/min振荡培养5d，过滤除去菌丝，获得培养滤液。

采用触杀法检测滤液对松材线虫的致死活性：取2mL滤液加入小培养皿(d＝3cm)中，然后用胶头滴管加入供试松材线虫30～50条，置25℃培养箱中培养，分别于24h和48h后，用连续变倍体视显微镜检查线虫死亡情况，并将处理后僵直不动的虫体转入清水中，如4h后线虫不能恢复活动，则记为死亡。经比较筛选，最后得到一株对松材线虫具有高致死活性的菌株FDYS-1，该菌在PDA培养基上的菌落为纯白色(如图1、2所示)，辐射状，表面稍有褶叠，未见产孢结构，其培养滤液对松材线虫的致死活性可达99％，该菌经ITS序列分析鉴定，其ITS序列与GenBank中登陆号为EF423534.1的Xylariasp.同源性达99％。

因此，本实施例分离得到的一株对松材线虫具有高致死活性的菌株FDYS-1属于炭角菌属(Xyalria sp.)，命名为Xylaria sp.FDYS-1，并于2008年1月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 208025。

实施例2培养条件对Xylaria sp.FDYS-1活性物质产生的影响

1、培养液的选择

将Xylaria sp.FDYS-1分别接种至马铃薯葡萄糖培养液(PD)、马铃薯胡萝卜培养液(PC)、马铃薯蔗糖培养液(PS)、马丁氏培养液、Czapek培养液、含20％马铃薯汁的Czapek培养液和改良Fries 3号培养液等7种液体培养基中，于25℃黑暗条件下120r/min振荡培养5d，制备培养滤液并以触杀法检测滤液对松材线虫的致死活性。

结论：如图3所示，Xylaria sp.FDYS-1在7种液体培养基中均能生长和产生杀线活性物质，但不同培养基得到的培养滤液，其杀线虫活性强弱差异明显，PD和PS的培养滤液的杀线虫活性最强，分别达95.67％和95.29％；菌株在PD和PS中生长也最好，培养5d后菌丝干重分别达7.556g/L和7.533g/L。

2、培养温度的选择

以PD培养液为供试培养基，接种Xylaria sp.FDYS-1后分别于20℃、23℃、26℃、29℃、32℃黑暗条件下120r/min振荡培养5d，制备培养滤液并以触杀法检测滤液对松材线虫的致死活性。

结论：如图4所示，Xylaria sp.FDYS-1在20℃～32℃条件下可以产生杀线虫活性物质，但产毒的最适温度为26℃～29℃，在此温度范围内培养，菌株培养滤液的杀线虫活性可达93.35％～96.41％。

3、培养基pH的选择

以PD培养液为供试培养基，用1mol/L HCL和1mol/L NaOH将其初始pH值分别调为3、4、5、6、7、8、9、10、11，以培养基自然pH值(6.4)为对照，接种后于26℃黑暗条件下120r/min振荡培养5d，制备培养滤液并以触杀法检测滤液对松材线虫的致死活性。

结论：如图5所示，初始pH值为5～8时有利于Xylaria sp.FDYS-1菌株产生杀线虫活性物质，初始pH值过高或过低均不利于活性物质的产生，当pH为11时，菌株不能生长。

根据本实施例可得出由Xylaria sp.FDYS-1菌株制备毒杀松材线虫生物制剂的方法为：将Xylaria sp.FDYS-1接种至马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)或马铃薯蔗糖液体培养基(PS)中，培养基的pH为5～8，于26℃～29℃无光照条件下120r/min振荡培养5d，将含菌丝的发酵液放入离心管中，离心过滤除去菌丝，收集滤液即为毒杀松材线虫的生物制剂。

实施例3Xylaria sp.FDYS-1产杀线虫活性物质的遗传稳定性及活性物质的热稳定性

将Xylaria sp.FDYS-1连续继代培养6代，再制备培养滤液及检测其对松材线虫的致死活性。

结论：由图6所示，Xylaria sp.FDYS-1连续继代培养6代后，其培养滤液的杀线虫活性基本保持不变，对松材线虫的致死率仍高达90.43％。

将Xylaria sp.FDYS-1培养滤液分别于60、70、80、90、100℃水浴中处理20、30、40、50、60min以及121℃高压灭菌处理20min，用无菌蒸馏水补足损失水分后，检测杀线活性。测定结果表明，菌株Xylaria sp.FDYS-1培养滤液杀线虫活性的热稳定性较好，经121℃处理20min也不失活。

综上所述可以看出，Xylaria sp.FDYS-1菌株产生活性物质的能力基本保持遗传稳定，且培养滤液经121℃处理20min也不失活，热稳定性好，Xylaria sp.FDYS-1是一株具有较好开发应用前景的杀线虫活性菌株。