一种苏云金芽孢杆菌伴孢晶体反浮选分离纯化生产工艺

摘要

本发明提供了一种苏云金芽孢杆菌伴孢晶体反浮选分离纯化生产工艺，具体生产工艺为：按重量百分比称取牛肉膏0.2～0.4％，蛋白胨0.6～1.5％，氯化钠0.3～0.6％，琼脂1.3～2.5％，水95～98％，用NaOH调pH＝7.4～7.6，100～130℃灭菌20～40分钟，倒入培养皿中，自然冷却至室温，液体凝固形成琼脂固体培养基；在培养基表面上按“之”字形接种，之后在生化培养箱中26～36℃培养36～48小时，得到无菌水菌苔悬浊液，注入高效微泡浮选柱中浮选，离心液浆10～20min，得到伴孢晶体半成品；用生理盐水和无菌纯净水洗涤伴孢晶体半成品，以7000～9000转/分钟的转速离心，得到含水的伴孢晶体，经真空干燥得到伴孢晶体纯品，于－20～－80℃环境中保存。该方法工艺简单、易于操作、产品纯度在99.99％以上、生产成本低、适合于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，特别提供了一种苏云金芽孢杆菌伴孢晶体反浮选分离纯化生产工艺，适用于工业化生产。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰阳性芽孢杆菌。Bt的菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。当菌体的营养体生长到一定的阶段后，在菌体的一端形成芽孢，另一端形成一种被称为伴孢晶体的近菱形的蛋白质晶体，菌体破裂后可释放出芽孢和伴孢晶体。

在Bt的基因工程、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等科学研究方面都对Bt伴孢晶体纯品提出了极大的需求。因此，萃取法(中国专利99122189.3)、梯度密度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等Bt伴孢晶体的分离纯化方法逐步得到了发展(左雅慧，苏云金芽孢杆菌培养条件及晶体蛋白提纯方法初探，植物保护，1999，25(4)：32-34；郭艾英，苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的制备方法，食品与发酵工业，2005，31(8)：8-10；朱仕房，双水相体系分离苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究，世界农药，2000，22(5)：39-42)。但是，萃取法使用了高毒性的有机溶剂CCl₄，不利于环境保护；梯度密度离心法提取蛋白量少，而且超离心时间很长，约14h，成本高，操作复杂；液体双相法体系复杂，影响因素多，难于实现工业化；等电点法容易破坏了伴孢晶体的形态；碱裂解法很容易出现伴孢晶体被自身产生的碱性蛋白水解酶降解的现象；高速离心法提取的产品纯度较低；生物物理法需要特种试剂，条件苛刻，成本过高。因此，Bt伴孢晶体仍处于实验室自制自用阶段，尚无商品出现。

发明内容

本发明提供一种Bt伴孢晶体反浮选分离纯化生产工艺，采用增加一种Bt伴孢晶体反浮选分离纯化方法，该方法的特点是工艺简单、易于操作、产品纯度在99.99％以上、生产成本低、适合于工业化生产。

本发明采用浮选分离方法将Bt伴孢晶体与孢子、营养体碎片等杂质分离，获得Bt伴孢晶体纯品，生产工艺(流程参见附图)如下：

按重量百分比称取牛肉膏0.2～0.4％，蛋白胨0.6～1.5％，氯化钠0.3～0.6％，琼脂1.3～2.5％，水95～98％，用NaOH调pH＝7.4～7.6，100～130℃灭菌20～40分钟，在洁净工作台中将灭菌后的液体倒入已灭过菌的大培养皿中，自然冷却至室温，液体凝固形成琼脂固体培养基；用接种环沾取Bt菌种，在琼脂固体培养基表面接种，之后在生化培养箱中26～36℃培养36～48小时，此时，在琼脂固体培养基表面上形成一层菌苔；用无菌纯净水将菌苔冲洗到容器中，得到无菌水菌苔悬浊液；用超声波细胞粉碎机处理菌苔悬浊液10～30分钟后，将此菌苔悬浊液注入微泡浮选柱中浮选；在此反浮选过程中，芽孢和营养体碎片进入泡沫层而脱离体系，伴孢晶体则留在液浆中，之后以7000～9000转/分钟的转速离心液浆10～20min，弃去上清液，得到伴孢晶体半成品；洗涤伴孢晶体半成品，以7000～9000转/分钟的转速离心，得到含水的伴孢晶体，在-20～-80℃，0.1～1.0Pa真空度条件下干燥3～4小时，得到伴孢晶体纯品。

所述在琼脂固体培养基表面接种，是按“之”字形接种。

所述的浮选是将菌苔悬浊液逐步注入30～100L微泡浮选柱中，浮选的进气量为2～8L/min，浮选10～30分钟。

所述的洗涤伴孢晶体半成品是用0.5～1.5M NaCl生理盐水洗涤伴孢晶体半成品3～5次，每次10～15L，再用无菌纯净水洗涤伴孢晶体半成品3～5次。

得到的伴孢晶体纯品于-20～-80℃环境中保存。

本发明的特点在于：

(1)本工艺的核心步骤是反浮选分离伴孢晶体及杂质。伴孢晶体是一种蛋白质，分子量在65～130KD左右，在水中的溶解度很小，以粒状形态存在。伴孢晶体由氨基酸组成，其表面存在大量的羧基和氨基，因此，伴孢晶体的润湿性良好，在反浮选过程中留在浆液中；

(2)芽孢和营养体碎片的表面润湿性差，在反浮选过程中与气泡、水形成三相体系，上升到泡沫层，能够很好地与体系分离；

(3)在超声波处理发酵物悬浊液的过程中，营养体被击碎，伴孢晶体从其中脱离出来，同时，营养体中的营养液进入浆液中。这些营养液含有小分子量的蛋白质和糖类物质，是浮选过程中的发泡剂。因此，浮选过程中不需要外加发泡剂，这样既降低了成本，又避免了杂质的引入；

(4)本工艺使用琼脂固体培养基培养Bt菌苔。Bt菌种在琼脂固体培养基的表面生长，培养完成后形成菌苔，用无菌纯净水冲洗培养基的表面，菌苔则与培养基脱离，形成无菌水菌苔悬浊液，而琼脂固体培养基的成分则不会进入悬浊液，减少了杂质的引入，减轻了后续步骤的负担(如果从Bt液体发酵物中分离伴孢晶体，由于液体培养基中的牛肉膏、蛋白胨等主要成分不可避免地与Bt孢子、伴孢晶体混合在一起，后继的伴孢晶体分离纯化步骤将变得十分复杂)；

(5)本工艺中由于使用了生理盐水洗涤伴孢晶体，可以消除发酵过程中产生的内生蛋白酶吸附在伴孢晶体表面而对伴孢晶体产生的降解。

本发明在琼脂固体培养基上培养Bt菌种，用超声波使伴孢晶体与母体脱离，采用反浮选方法将伴孢晶体与孢子、营养体碎片等杂质分离，经洗涤、冷冻干燥后获得Bt伴孢晶体纯品。本发明的优点在于：工艺简单、易于操作、产品纯度在99.99％以上、生产成本低、适合于工业化生产。

附图说明

图1为苏云金芽孢杆菌伴孢晶体反浮选分离纯化生产工艺流程图

具体实施方式

实施例1：

称取牛肉膏2kg，蛋白胨6kg，氯化钠3kg，琼脂13kg，水950kg，用NaOH调pH＝7.4，100℃灭菌20分钟，在洁净工作台中将灭菌后的液体倒入20个已灭过菌的大培养皿中(直径0.5m)，自然冷却至室温，液体凝固形成琼脂固体培养基。用接种环沾取少量Bt菌种，在琼脂固体培养基表面上“之”字形接种，之后在生化培养箱中26℃培养36小时。此时，在琼脂固体培养基表面上形成一层菌苔，用500L无菌纯净水将菌苔冲洗到1000L的容器中，得到无菌水菌苔悬浊液。

用超声波细胞粉碎机处理菌苔悬浊液10分钟后，将此菌苔悬浊液逐步注入30L高效微泡浮选柱中浮选，进气量为2L/min，浮选10分钟。在此反浮选过程中，芽孢和营养体碎片进入泡沫层而脱离体系，伴孢晶体则留在液浆中，之后以7000转/分钟的转速离心液浆10min，弃去上清液，得到伴孢晶体半成品。

用0.5M NaCl生理盐水洗涤伴孢晶体半成品3次，每次10L，再用无菌纯净水伴孢晶体半成品3次，以7000转/分钟的转速离心，得到含水的伴孢晶体，-20℃，0.1Pa的真空度干燥3小时，得到伴孢晶体纯品1.0kg，于-20℃环境中保存。

实施例2：

称取牛肉膏4kg，蛋白胨15kg，氯化钠6kg，琼脂25kg，水980kg，用NaOH调pH＝7.6，130℃灭菌40分钟，在洁净工作台中将灭菌后的液体倒入20个已灭过菌的大培养皿中(直径0.5m)，自然冷却至室温，液体凝固形成琼脂固体培养基。用接种环沾取少量Bt菌种，在琼脂固体培养基表面上“之”字形接种，之后在生化培养箱中36℃培养48小时。此时，在琼脂固体培养基表面上形成一层菌苔，用600L无菌纯净水将菌苔冲洗到2000L的容器中，得到无菌水菌苔悬浊液。

用超声波细胞粉碎机处理菌苔悬浊液30分钟后，将此菌苔悬浊液逐步注入100L高效微泡浮选柱中浮选，进气量为8L/min，浮选30分钟。在此反浮选过程中，芽孢和营养体碎片进入泡沫层而脱离体系，伴孢晶体则留在液浆中，之后以9000转/分钟的转速离心液浆20min，弃去上清液，得到伴孢晶体半成品。

用1.5M NaCl生理盐水洗涤伴孢晶体半成品5次，每次15L，再用无菌纯净水伴孢晶体半成品5次，以9000转/分钟的转速离心，得到含水的伴孢晶体，-80℃，1.0Pa的真空度干燥4小时，得到伴孢晶体纯品1.2kg，于-80℃环境中保存。

实施例3：

称取牛肉膏3kg，蛋白胨10kg，氯化钠4.5kg，琼脂19kg，水970kg，用NaOH调pH＝7.5，120℃灭菌30分钟，在洁净工作台中将灭菌后的液体倒入20个已灭过菌的大培养皿中(直径0.5m)，自然冷却至室温，液体凝固形成琼脂固体培养基。用接种环沾取少量Bt菌种，在琼脂固体培养基表面上“之”字形接种，之后在生化培养箱中31℃培养42小时。此时，在琼脂固体培养基表面上形成一层菌苔，用550L无菌纯净水将菌苔冲洗到1500L的容器中，得到无菌水菌苔悬浊液。

用超声波细胞粉碎机处理菌苔悬浊液20分钟后，将此菌苔悬浊液逐步注入70L高效微泡浮选柱中浮选，进气量为5L/min，浮选20分钟。在此反浮选过程中，芽孢和营养体碎片进入泡沫层而脱离体系，伴孢晶体则留在液浆中，之后以8000转/分钟的转速离心液浆15min，弃去上清液，得到伴孢晶体半成品。

用1.0M NaCl生理盐水洗涤伴孢晶体半成品4次，每次13L，再用无菌纯净水伴孢晶体半成品4次，以8000转/分钟的转速离心，得到含水的伴孢晶体，-50℃，0.5Pa的真空度干燥3.5小时，得到伴孢晶体纯品1.1kg，于-50℃环境中保存。

实施例4：

称取牛肉膏2kg，蛋白胨7kg，氯化钠4kg，琼脂15kg，水970kg，用NaOH调pH＝7.5，120℃灭菌25分钟，在洁净工作台中将灭菌后的液体倒入20个已灭过菌的大培养皿中(直径0.5m)，自然冷却至室温，液体凝固形成琼脂固体培养基。用接种环沾取少量Bt菌种，在琼脂固体培养基表面上“之”字形接种，之后在生化培养箱中28℃培养38小时。此时，在琼脂固体培养基表面上形成一层菌苔，用500L无菌纯净水将菌苔冲洗到1000L的容器中，得到无菌水菌苔悬浊液。

用超声波细胞粉碎机处理菌苔悬浊液30分钟后，将此菌苔悬浊液逐步注入100L高效微泡浮选柱中浮选，进气量为8L/min，浮选30分钟。在此反浮选过程中，芽孢和营养体碎片进入泡沫层而脱离体系，伴孢晶体则留在液浆中，之后以9000转/分钟的转速离心液浆20min，弃去上清液，得到伴孢晶体半成品。

用1.0M NaCl生理盐水洗涤伴孢晶体半成品4次，每次13L，再用无菌纯净水伴孢晶体半成品4次，以8000转/分钟的转速离心，得到含水的伴孢晶体，-50℃，0.5Pa的真空度干燥3.5小时，得到伴孢晶体纯品1.1kg，于-50℃环境中保存。

实施例5：

称取牛肉膏4kg，蛋白胨6kg，氯化钠3kg，琼脂25kg，水980kg，用NaOH调pH＝7.6，130℃灭菌40分钟，在洁净工作台中将灭菌后的液体倒入20个已灭过菌的大培养皿中(直径0.5m)，自然冷却至室温，液体凝固形成琼脂固体培养基。用接种环沾取少量Bt菌种，在琼脂固体培养基表面上“之”字形接种，之后在生化培养箱中36℃培养48小时。此时，在琼脂固体培养基表面上形成一层菌苔，用600L无菌纯净水将菌苔冲洗到2000L的容器中，得到无菌水菌苔悬浊液。

用超声波细胞粉碎机处理菌苔悬浊液20分钟后，将此菌苔悬浊液逐步注入70L高效微泡浮选柱中浮选，进气量为5L/min，浮选20分钟。在此反浮选过程中，芽孢和营养体碎片进入泡沫层而脱离体系，伴孢晶体则留在液浆中，之后以8000转/分钟的转速离心液浆15min，弃去上清液，得到伴孢晶体半成品。

用0.5M NaCl生理盐水洗涤伴孢晶体半成品3次，每次10L，再用无菌纯净水伴孢晶体半成品3次，以7000转/分钟的转速离心，得到含水的伴孢晶体，-20℃，0.1Pa的真空度干燥3小时，得到伴孢晶体纯品1.2kg，于-20℃环境中保存。

实施例6：

称取牛肉膏3.1kg，蛋白胨12kg，氯化钠5.5kg，琼脂21kg，水970kg，用NaOH调pH＝7.5，120℃灭菌30分钟，在洁净工作台中将灭菌后的液体倒入20个已灭过菌的大培养皿中(直径0.5m)，自然冷却至室温，液体凝固形成琼脂固体培养基。用接种环沾取少量Bt菌种，在琼脂固体培养基表面上“之”字形接种，之后在生化培养箱中31℃培养42小时。此时，在琼脂固体培养基表面上形成一层菌苔，用550L无菌纯净水将菌苔冲洗到1500L的容器中，得到无菌水菌苔悬浊液。

用超声波细胞粉碎机处理菌苔悬浊液10分钟后，将此菌苔悬浊液逐步注入30L高效微泡浮选柱中浮选，进气量为2L/min，浮选10分钟。在此反浮选过程中，芽孢和营养体碎片进入泡沫层而脱离体系，伴孢晶体则留在液浆中，之后以7000转/分钟的转速离心液浆10min，弃去上清液，得到伴孢晶体半成品。

用1.5M NaCl生理盐水洗涤伴孢晶体半成品5次，每次15L，再用无菌纯净水伴孢晶体半成品5次，以9000转/分钟的转速离心，得到含水的伴孢晶体，-80℃，1.0Pa的真空度干燥4小时，得到伴孢晶体纯品1.2kg，于-80℃环境中保存。

实施例7：

称取牛肉膏2.5kg，蛋白胨6kg，氯化钠5.5kg，琼脂14kg，水960kg，用NaOH调pH＝7.5，110℃灭菌22分钟，在洁净工作台中将灭菌后的液体倒入20个已灭过菌的大培养皿中(直径0.5m)，自然冷却至室温，液体凝固形成琼脂固体培养基。用接种环沾取少量Bt菌种，在琼脂固体培养基表面上“之”字形接种，之后在生化培养箱中31℃培养40小时。此时，在琼脂固体培养基表面上形成一层菌苔，用580L无菌纯净水将菌苔冲洗到1200L的容器中，得到无菌水菌苔悬浊液。

用超声波细胞粉碎机处理菌苔悬浊液15分钟后，将此菌苔悬浊液逐步注入50L高效微泡浮选柱中浮选，进气量为4L/min，浮选18分钟。在此反浮选过程中，芽孢和营养体碎片进入泡沫层而脱离体系，伴孢晶体则留在液浆中，之后以7800转/分钟的转速离心液浆13min，弃去上清液，得到伴孢晶体半成品。

用0.8M NaCl生理盐水洗涤伴孢晶体半成品4次，每次11L，再用无菌纯净水伴孢晶体半成品5次，以8200转/分钟的转速离心，得到含水的伴孢晶体，-40℃，0.3Pa的真空度干燥3.3小时，得到伴孢晶体纯品1.1kg，于-60℃环境中保存。

实施例8：

称取牛肉膏3.6kg，蛋白胨9kg，氯化钠6kg，琼脂20kg，水980kg，用NaOH调pH＝7.6，130℃灭菌30分钟，在洁净工作台中将灭菌后的液体倒入20个已灭过菌的大培养皿中(直径0.5m)，自然冷却至室温，液体凝固形成琼脂固体培养基。用接种环沾取少量Bt菌种，在琼脂固体培养基表面上“之”字形接种，之后在生化培养箱中29℃培养30小时。此时，在琼脂固体培养基表面上形成一层菌苔，用520L无菌纯净水将菌苔冲洗到1600L的容器中，得到无菌水菌苔悬浊液。

用超声波细胞粉碎机处理菌苔悬浊液28分钟后，将此菌苔悬浊液逐步注入90L高效微泡浮选柱中浮选，进气量为8L/min，浮选10分钟。在此反浮选过程中，芽孢和营养体碎片进入泡沫层而脱离体系，伴孢晶体则留在液浆中，之后以7200转/分钟的转速离心液浆18min，弃去上清液，得到伴孢晶体半成品。

用1.2M NaCl生理盐水洗涤伴孢晶体半成品5次，每次14L，再用无菌纯净水伴孢晶体半成品3次，以8800转/分钟的转速离心，得到含水的伴孢晶体，-80℃，0.8Pa的真空度干燥3.5小时，得到伴孢晶体纯品1.1kg，于-50℃环境中保存。