永生化大鼠骨髓基质细胞系及其制备方法

摘要

本发明提供了一种永生化大鼠骨髓基质细胞系及其制备方法。用本发明方法能在短时间内获得永生化大鼠骨髓基质细胞。本发明的hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系稳定，可以连续传代并保持二倍体核型和正常大鼠骨髓基质细胞特性，具备极强的增殖能力，真正实现了永生化。应用本发明方法所建立的永生化大鼠骨髓基质细胞系可以方便、快速地获得大量的具有二倍体核型的大鼠骨髓基质细胞。这对于研究骨髓基质细胞的体内外诱导和分化等无疑将具有巨大的促进作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种永生化大鼠骨髓基质细胞系及其制备方法。

背景技术

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，bMSCs)是存在于骨髓中的一类具有多向分化潜能的干细胞群。bMSCs在一定条件下能够在体外或体内分化成为骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞和神经元及神经胶质细胞。骨髓基质细胞具有来源丰富、采集方便、免疫原性弱、细菌污染率低、不涉及伦理问题等优点，这就为帕金森病(PD)等退行性疾病的细胞移植或替代治疗提供了一种新的种子细胞来源途径。正是由于此细胞具有多向分化潜能，而且可以实现自体取材，自体移植，从而避免了免疫排斥反应，所以，bMSCs就成为近年来人们研究的热点。有关体内和体外条件下诱导骨髓基质细胞定向分化为某一特定表型的细胞的研究也越来越多。

尽管bMSCs具有干细胞特性，但其很难实现体外连续传代和大量扩增，这就限制了对其进行体外诱导分化，体内迁移分化潜能及细胞和基因治疗的研究。因此，就需要建立一种永生化的骨髓基质细胞系，以方便地获取大量细胞用于研究骨髓基质细胞的体内外诱导分化及其机制和移植治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种永生化大鼠骨髓基质细胞系及其制备方法。

本发明所提供的制备永生化大鼠骨髓基质细胞系的方法，是将人端粒酶反转录酶催化亚基基因hTERT导入大鼠骨髓基质细胞得到永生化大鼠骨髓基质细胞系。

其中，所述人端粒酶反转录酶催化亚基的氨基酸序列具体如序列表中序列2所示，共1132个氨基酸。

所述人端粒酶反转录酶催化亚基基因hTERT的核苷酸序列具体可如序列表中序列1所示，共3399个碱基。

所述人端粒酶反转录酶催化亚基基因具体可以通过逆转录病毒载体导入大鼠骨髓基质细胞。

所述人端粒酶反转录酶催化亚基基因具体可通过重组逆转录病毒载体pLPCX-Flag-hTERT导入大鼠骨髓基质细胞；所述重组逆转录病毒载体pLPCX-Flag-hTERT是将融合蛋白的编码基因插入逆转录病毒载体pLPCX的多克隆位点得到的重组载体；所述融合蛋白可为在人端粒酶反转录酶催化亚基的N端融合FLAG表位标签得到的融合蛋白。

其中，所述重组逆转录病毒载体pLPCX-FLAG-hTERT具体可按照如下方法导入大鼠骨髓基质细胞：将pLPCX-FLAG-hTERT转染到包装细胞系，被包装成具有侵袭能力而复制缺陷的带有人端粒酶反转录酶催化亚基基因hTERT的病毒后，再转导大鼠骨髓基质细胞。

上述大鼠具体可为Sprague-Dawley封闭群大鼠(SD大鼠)。

按照上述任一所述方法获得的永生化大鼠骨髓基质细胞系也属于本发明的保护范围。

用本发明方法能在短时间内获得hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系。获得的细胞系稳定，可以连续传代，传至第105代还保持二倍体核型和正常大鼠骨髓基质细胞特性，具备极强的增殖能力，真正实现了永生化。应用本发明方法所建立的永生化大鼠骨髓基质细胞系可以方便、快速地获得大量的具有二倍体核型并具有原代骨髓基质细胞表面标志物的大鼠骨髓基质细胞。这对于研究骨髓基质细胞的体内外诱导和分化等无疑将具有巨大的促进作用。

附图说明

图1为原代骨髓基质细胞的形态学观察结果。

图2为原代骨髓基质细胞的细胞表面标志物的流式细胞分析结果。

图3为原代骨髓基质细胞的染色体倍数及细胞周期分析结果。

图4为原代骨髓基质细胞的生长曲线。

图5为hTERT永生化骨髓基质细胞系的形态学观察结果。

图6为hTERT永生化骨髓基质细胞系的细胞表面标志物的流式细胞分析结果。

图7为hTERT永生化骨髓基质细胞系细胞的生长曲线。

图8为hTERT永生化骨髓基质细胞系细胞的染色体倍数及细胞周期分析结果。

图9为hTERT永生化骨髓基质细胞系细胞的裸鼠接种结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

实施例1、大鼠骨髓基质细胞的分离培养及生物学特性检测

一、大鼠骨髓基质细胞的分离、培养和传代

成年SD大鼠(Sprague-Dawley封闭群大鼠)断头处死，常规消毒四肢及胸部皮肤后，迅速取出四肢骨及胸骨，用预冷的D-hank’s液(每升含：NaCl 8.00g，KCl0.40g，Na₂HPO₄ 0.06g，KH₂PO₄ 0.06g，NaHCO₃ 0.35g，酚红0.02g，含10⁵u/L青霉素(华北制药)和0.1g/L链霉素(华北制药))浸泡3-5分钟后，用10号注射针头吸取无血清预冷的α-MEM(Gibco)冲洗骨髓腔以获取骨髓细胞的冲洗液。取细胞冲洗液1份，小心加于3倍体积的淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)之上，以2000-2500rpm的转速室温离心10-20分钟。用吸管吸出液面交界处的云雾状液体，将其移到10mlα-MEM液中，充分混匀，以1000rpm离心5-10分钟，用含10％(体积百分含量)胎牛血清(Hyclone)的α-MEM重新悬浮细胞，接种于用多聚赖氨酸(Sigma)包被过的培养瓶(Corning)内，置CO₂培养箱内，37℃、5％CO₂培养24小时后将细胞上清液去除，加入新鲜培养基(含10％(体积百分含量)胎牛血清的α-MEM)，48小时后换液，去除未贴壁细胞，待贴壁细胞达到85％融合后，用0.25％胰酶(Ameresco)和0.02％EDTA(sigma)消化细胞。含血清培养基终止消化进行传代，即可得到原代大鼠骨髓基质细胞。

该原代大鼠骨髓基质细胞主要呈梭型，见图1。

二、大鼠骨髓基质细胞的生物学特性检测

(一)大鼠骨髓基质细胞的鉴定-流式细胞仪检测其表面标志：

待原代大鼠骨髓基质细胞达80％～90％融合时，消化后，用PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1×10⁶个细胞/ml，取细胞悬液，并向其中加入小鼠抗大鼠CD11b-FITC、CD90-R-PE、CD45-PE(BD Pharmingen)，置于4℃孵育30min，然后离心，收集细胞，用PBS洗涤2次，最后制备成500μl单细胞悬液，上机对细胞表面标志进行流式检测。阴性对照采用抗体同型对照(BD Pharmingen)，孵育方法同实验组。流式分析结果显示，原代培养的骨髓基质细胞(第一代)细胞表面标志主要表现为CD11b阴性，CD45阴性和CD90阳性，少数细胞表现为CD11b阳性和CD45阳性(图2)。

(二)原代大鼠骨髓基质细胞的染色体倍数及细胞周期分析

原代培养的骨髓基质细胞用PBS洗涤2次，胰蛋白酶消化，PBS洗涤3次，去除上清，细胞((1-2)×10⁶个细胞/ml)加入1ml 70％的冰乙醇混匀，置4℃过夜，离心，去上清，细胞沉淀重悬于1ml的PI(Fluka)染液中，于4℃避光孵育30分钟，上流式细胞仪分析。实验设三次重复，取其平均数，流式分析结果显示，原代培养的骨髓基质细胞为2倍体核型，大部分细胞处于G₀-G₁(静止)期(97.69％)，处于G₂-M(有丝分裂)期细胞比例为0.94％，处于S(DNA合成)期细胞比例为1.37％(图3)。

(三)原代骨髓基质细胞生长曲线的绘制：

对数生长期的原代骨髓基质细胞经消化，计数后，按1×10⁴个/孔接种于24孔板(Corning)中，37℃，5％CO₂培养，及时换液并计数各孔中的细胞数，每次取3个孔计数，取均数，连续计数至细胞生长脱落为止，以横坐标为培养天数，纵坐标为细胞数，绘制细胞生长曲线。实验设三次重复，取其平均数，生长曲线显示，原代培养的骨髓基质细胞于5天左右达到平台期，达到平台期的细胞数约为40×10⁴个(图4)。

(四)原代骨髓基质细胞的群体倍增时间和群体倍增次数的测定

对数生长期的原代骨髓基质细胞经消化，计数后；按2×10⁵(N₀)/瓶接种于25cm²的培养瓶，37℃，5％CO₂培养，及时换液，当细胞生长至对数生长期时，将培养瓶中的细胞消化计数(N_t)；按下列公式计算细胞的群体倍增时间(T)和群体倍增次数(PD)。

T＝tlg2/lg(N_t/N₀)，PD＝(N_t/N₀)-1。

其中，N₀表示接种时的细胞数；N_t表示测定时的细胞数；t表示从接种开始到测定时所经历的时间。

实验设三次重复，取其平均数。经过计算原代骨髓基质细胞的群体倍增时间为60h，群体倍增次数为11。

(五)原代骨髓基质细胞的裸鼠接种实验

收集原代培养的骨髓基质细胞，按1×10⁷个/0.2ml/只(共接种3只)和1×10⁶个/0.2ml/只(共接种6只)的比例将其皮下接种于Balb/c裸鼠的背部前侧，阴性对照为向Balb/c裸鼠的背部前侧接种0.2ml PBS，观察4-6个月，全部未发现长瘤，小鼠生长状况良好，并于接种后4-6个月后处死。

实施例2、永生化大鼠骨髓基质细胞系的获得及其生物学特性的检测

一、永生化大鼠骨髓基质细胞系的获得

1、人端粒酶反转录酶催化亚基基因(hTERT)的获得

从人Jurkat T淋巴细胞瘤(human Jurkat T-cell lymphoma，ATCC)提取mRNA，通过反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，以5’-ctgctgcgcacgtgggaag-3’为上游引物，5’-cgggtggccatcagtccag-3’为下游引物，通过PCR获得3.4Kb的目的产物，将目的产物纯化回收后直接连接到pTARGET^TM载体(Promega)的3’T末端(overhangs)，得到pTARGET-hTERT，并选择阳性克隆进行测序，获得人端粒酶反转录酶催化亚基基因(hTERT)序列，其序列如序列表中序列1所示，编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2、构建重组逆转录病毒载体pLPCX-Flag-hTERT

(1)构建pTARGET-Flag-hTERT载体

以步骤1获得的人端粒酶反转录酶催化亚基基因(hTERT)为模板；在hTERT起始密码子上游引入编码FLAG表位标签的碱基序列设计上游引物(5’-atggattacaaggatgacgacgataagccgcgcgctccccgct-3’)，以5’-catcagtccaggatggtcttgaagtc-3’为下游引物，利用所设计的上下游引物进行PCR扩增，获得N端融合有Flag表位标签的Flag-hTERT的PCR产物，将该PCR产物纯化回收后直接连接到pTARGET^TM载体的3’T末端(overhangs)，得到含有Flag-hTERT融合基因的重组载体pTARGET-Flag-hTERT。

(2)构建重组逆转录病毒载体pLPCX-Flag-hTERT

用EcoRI和SalI分别酶切pTARGET-Flag-hTERT和pLPCX(Clontech)载体，将回收的融合基因Flag-hTERT亚克隆到pLPCX载体，得到重组逆转录病毒载体pLPCX-Flag-hTERT。

3、带有hTERT基因的逆转录病毒(pLPCX-Flag-hTERT)上清液的获得

将逆转录病毒载体pLPCX-Flag-hTERT用脂质体lipofectin2000(Gibco)转染方法导入包装细胞系PT67(Clontech)，经嘌呤霉素(Gibco)筛选阳性细胞克隆，利用文献(Morgenstern JP，Land H.Advanced mammalian gene transfer：hightitre retroviral vectors with multiple drug selection markers and acomplementary helper-free packaging cell line.Nucleic Acids Res.1990.18：3587-3596.)中所述的方法对重组病毒进行验证，最后获得带有hTERT基因的具有感染能力而复制缺陷的hTERT逆转录病毒上清。

4、永生化大鼠骨髓基质细胞系的获得

将实施例1获得的原代大鼠骨髓基质细胞按2×10⁵个/mL的密度接种于75cm²培养瓶中，用培养基(含10％(体积百分含量)胎牛血清的α-MEM)培养48小时后；弃培养基，加入步骤3获得的hTERT逆转录病毒上清3ml，并加入8μg/mL polybrene(Sigma)转染4-6小时后；换正常培养基(含10％(体积百分含量)胎牛血清的α-MEM)，继续培养48小时后，换正常培养基(含10％(体积百分含量)胎牛血清的α-MEM)，并向其中加入嘌呤霉素50-100μg/mL，筛选培养7-10天。在该筛选培养过程中，每3-4天换一次培养基。经50-100μg/mL嘌呤霉素筛选培养7-10天得到的转基因大鼠骨髓基质细胞即为hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞。

按实施例1中步骤一所述方法，将获得的hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞进行传代，得到hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系(第0代)。hTERT永生化的大鼠骨髓基质细胞系的细胞主要呈梭型(图5)，和原代培养的大鼠骨髓基质细胞的形态相似。

将该hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系(第0代)进行连续传代，并将不同代次细胞冷冻保存，直至传代达100代以上。

二、永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞生物学特性检测

以下均是检测第105代hTERT永生化的大鼠骨髓基质细胞系的细胞生物学特性。

(一)细胞形状：第105代的hTERT永生化的大鼠骨髓基质细胞系的细胞主要呈梭型，与原代大鼠骨髓基质细胞形态相同(图5)。

(二)hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞表面标志的鉴定

按照实施例1步骤二中(一)所述的方法，对hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系的细胞表面标志物进行流式细胞仪检测。流式分析结果表明，hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系的细胞大多数细胞表面标志表现为CD11b阴性，CD45阴性和CD90阳性，极少数细胞表现为CD45阳性，未检测到CD11b阳性细胞(图6)；和原代骨髓基质细胞的表面标志物相似。

(三)hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞的染色体倍数及细胞周期分析

按照实施例1步骤二中(二)所述的方法，对hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞进行染色体倍数及细胞周期分析。结果表明，hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞为2倍体核型，处于G₀-G₁(静止)期细胞比例为35.45％，处于G₂-M(有丝分裂)期细胞比例为55.56％，处于S(DNA合成)期细胞比例为9.00％(图8)；和原代骨髓基质细胞的细胞周期分析结果相比，hTERT永生化骨髓基质细胞系的细胞增殖分裂旺盛，具体表现为：处于G₀-G₁(静止)期的细胞比例显著降低，处于S(DNA合成)期细胞比例明显增加，处于G₂-M(有丝分裂)期细胞比例显著增加。具体结果见表1。

表1原代骨髓基质细胞与hTERT永生化骨髓基质细胞系的细胞周期对比

  不同时期的细胞  原代骨髓基质细胞 hTERT永生化骨髓基质 细胞系  处于G₀-G₁(静止)期  细胞比例  97.69％ 35.45％  处于S(DNA合成)期  细胞比例  1.37％ 9.00％  处于G₂-M(有丝分裂)期  细胞比例  0.94％ 55.56％

(四)hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞生长曲线的绘制

按照实施例1步骤二中(三)所述的方法，对hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞进行生长曲线的绘制。生长曲线显示，hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞于5天左右达到平台期，达到平台期的细胞数约为123×10⁴(图7)；和原代骨髓基质细胞的生长曲线相比，hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞于接种后的第一天生长缓慢，从第二天开始，细胞生长迅速，达到平台期的细胞数要比原代骨髓基质细胞的细胞数要高2倍。

(五)hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞群体倍增时间和群体倍增次数的测定

按照实施例1步骤二中(四)所述的方法，对hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系的细胞进行细胞群体倍增时间和群体倍增次数的测定。经过计算hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞的群体倍增时间为20h，群体倍增次数为120；和原代骨髓基质细胞的细胞群体倍增时间(60h)和群体倍增次数(11)相比，hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系的细胞增殖更快，细胞数更多。

(六)hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞克隆形成率的测定

收集对数生长期的hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系的细胞，计数细胞，将细胞稀释至1000个/ml；取100μl接种于60mm的平皿(Corning)内，及时换液，至平皿内长满细胞克隆时，固定细胞，计数克隆数。实验重复三次，每次接种3个平皿，取均数，按下面公式计算克隆形成率，

克隆形成率(％)＝形成集落的数目/接种细胞数×100％

经过计算hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞的克隆率为60％。这表明hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞具有极强的增殖能力。

(七)hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞的裸鼠接种实验

按照实施例1步骤二中(五)所述的方法，对hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系的细胞进行裸鼠接种实验。按1×10⁷个/0.2ml/只(共接种3只)、1×10⁶个/0.2ml/只(共接种6只)和5×10⁵个/0.2ml/只(共接种6只)的比例将细胞皮下接种于Balb/c裸鼠的背部前侧，阴性对照为接种0.2ml PBS。观察4-6个月，裸鼠全部发现长瘤(图9)，长瘤的增长速度和大小与接种的细胞数呈正相关，进一步表明hTERT永生化骨髓基质细胞系的细胞增殖分裂旺盛。裸鼠生长状况良好，于接种后4-6个月后处死。

(八)hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系细胞的在体接种实验

收集hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系对数生长期的细胞，用脑立体定位仪(KOPF)将其定位移植到SD大鼠的纹状体(平前囟：0mm，旁开：3.0mm，深度：6.0mm，门齿棒下2.4mm)，1×10⁶/10ul/只，共移植10只，同时移植PBS(10ul)和正常大鼠骨髓基质细胞(1×10⁶/10ul/只)各5只作为对照。移植后观察10个月，未在脑内发现肿瘤，这说明本发明hTERT永生化大鼠骨髓基质细胞系具有一定的安全性，可用于骨髓基质细胞体内外的诱导和分化研究。

序列表

<160>2

<210>1

<211>3399

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag     60

gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag    120

cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg    180

gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg    240

gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc    300

ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc    360

agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg    420

ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg    480

ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct    540

gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa    600

cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt    660

gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt    720

ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc    780

aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa    840

gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc    900

cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct    960

tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag   1020

ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc   1080

gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc   1140

cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac   1200

gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc   1260

ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag   1320

gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag   1380

gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc   1440

aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat   1500

gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg   1560

cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc   1620

ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc    1680

ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc    1740

tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag    1800

ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga    1860

ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg    1920

ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca    1980

ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg    2040

ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag    2100

gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gtggatgtga cgggcgcgta cgacaccatc    2160

ccccaggaca ggctcacgga ggtcatcgcc agcatcatca aaccccagaa cacgtactgc    2220

gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag    2280

agccacgtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt ggctcacctg    2340

caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag    2400

gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc    2460

aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg    2520

ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac    2580

gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg    2640

aaaaccttcc tcaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt ggtgaacttg    2700

cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac ggcttttgtt    2760

cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac ccggaccctg    2820

gaggtgcaga gcgactactc cagctatgcc cggacctcca tcagagccag tctcaccttc    2880

aaccgcggct tcaaggctgg gaggaacatg cgtcgcaaac tctttggggt cttgcggctg    2940

aagtgtcaca gcctgtttct ggatttgcag gtgaacagcc tccagacggt gtgcaccaac    3000

atctacaaga tcctcctgct gcaggcgtac aggtttcacg catgtgtgct gcagctccca    3060

tttcatcagc aagtttggaa gaaccccaca tttttcctgc gcgtcatctc tgacacggcc    3120

tccctctgct actccatcct gaaagccaag aacgcaggga tgtcgctggg ggccaagggc    3180

gccgccggcc ctctgccctc cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaagc attcctgctc    3240

aagctgactc gacaccgtgt cacctacgtg ccactcctgg ggtcactcag gacagcccag    3300

acgcagctga gtcggaagct cccggggacg acgctgactg ccctggaggc cgcagccaac    3360

ccggcactgc cctcagactt caagaccatc ctggactga                           3399

<210>2

<211>1132

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser

1               5                   10                  15

His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly

            20                  25                  30

Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg

        35                  40                  45

Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro

    50                  55                  60

Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu

65                  70                  75                  80

Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val

                85                  90                  95

Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro

            100                 105                 110

Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr

        115                 120                 125

Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val

    130                 135                 140

Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val

145                 150                 155                 160

Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr

                165                 170                 175

Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly

            180                 185                 190

Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg

        195                 200                 205

Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg

    210                 215                 220

Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg

225                 230                 235                 240

Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp

                245                 250                 255

Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val

            260                 265                 270

Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala

        275                 280                 285

Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His

    290                 295                 300

Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro

305                 310                 315                 320

Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly

                325                 330                 335

Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro

            340                 345                 350

Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser

        355                 360                 365

Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln

    370                 375                 380

Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His

385                 390                 395                 400

Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg

                405                 410                 415

Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln

            420                 425                 430

Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu

        435                 440                 445

Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe

    450                 455                 460

Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser

465                 470                 475                 480

Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser

                485                 490                 495

Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met

            500                 505                 510

Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys

        515                 520                 525

Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe

    530                 535                 540

Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe

545                 550                 555                 560

Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr

                565                 570                 575

Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His

            580                 585                 590

Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln

        595                 600                 605

His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile

    610                 615                 620

Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val

625                 630                 635                 640

Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser

                645                 650                 655

Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg

            660                 665                 670

Pro Gly Len Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg

        675                 680                 685

Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro

    690                 695                 700

Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile

705                 710                 715                 720

Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln

                725                 730                 735

Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His

            740                 745                 750

Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp

        755                 760                 765

Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser

    770                 775                 780

Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu

785                 790                 795                 800

Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His

                805                 810                 815

Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro

            820                 825                 830

Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp

        835                 840                 845

Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu

    850                 855                 860

Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala

865                 870                 875                 880

Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys

                885                 890                 895

Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu

            900                 905                 910

Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe

        915                 920                 925

Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser

    930                 935                 940

Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe

945                 950                 955                 960

Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly

                965                 970                 975

Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn

            980                 985                 990

Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln

        995                 1000                1005

Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln

    1010                1015                1020

Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp

    1025                1030                1035

Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly

    1040                1045                1050

Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu

    1055                1060                1065

Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr

    1070                1075                1080

Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr

    1085                1090                1095

Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr

    1100                1105                1110

Ala Len Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys

    1115                1120                1125

Thr Ile Leu Asp

    1130