应用紫外线诱变甘蓝型油菜离体小孢子和突变体筛选方法

摘要

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜离体小孢子紫外线诱变和突变体的筛选。特征是，用蔗糖水溶液分离甘蓝型油菜小孢子，将小孢子悬浮在添加秋水仙碱改良的NLN培养基上进行紫外线照射和染色体加倍，将加倍后的小孢子转入改良的NLN培养基上诱导出胚状体。再将胚状体转入B5培养基上诱导成双单倍体植株。将所述的植株移栽至田间进行鉴定，筛选出突变体。形态性状突变株率为10.53－21.57％，种子中硫甙、含油量及芥酸含量的变异株率分别是25.53－78.7％，22.22－59.09％和38.89－46.97％。本发明的方法具有操作程序简便，省时和费用低等优点。适用于十字花科作物小孢子离体诱变和突变体筛选。

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种应用紫外线诱变甘蓝型油菜离体小孢子和突变体的筛选方法

背景技术

用物理射线或化学诱变剂诱变油菜种子或者油菜的组织器官和单细胞是创造新种质和改良品种以及建立突变体库的重要方法之一。但是通过诱变种子、组织器官和多细胞愈伤组织产生的突变体是突变和没突变基因的嵌合体，隐性基因突变于当代不表现，不能识别。因此，发现和选择稳定的突变体必须通过自交，尤其是隐性基因和多基因控制的性状需要多代自交才能获得基因纯合、遗传稳定的突变体。获得突变体的周期长、费用高。用射线和化学诱变剂直接诱变单细胞小孢子，并用秋水仙碱等染色体加倍剂处理小孢子，使其染色体二倍化。由此小孢子产生的双单倍体植株(DH)的突变基因是纯合的，突变性状可稳定遗传，不存在嵌合体和显性基因掩盖隐性基因的杂合体，不需要自交程序。加拿大的Swanson等(Swanson等，Microspore mutagenesis and selection：Canola plants with field tolerance to theimidazolinones，Theor Appl Genet，1989(78)：525-53)用r-射线和乙基亚硝基脲和我国的和江明等(和江明等，用EMS诱变和小孢子培养快速获得甘监型油菜高油酸种质材料的研究，西南农业学报，2003，16(2)：34-36)用甲基磺酸乙脂诱变甘蓝型油菜小孢子，分别获得抗除草剂和高油酸的突变体。西班牙的Barro等(Barro等，Doubled haploid lines of Brassica carinata with modified erucic acid contentthrough mutagenesis by EMS treatment of isolated microspores，Plant Breeding，2001，120：262-264)用甲基磺酸乙脂诱变埃塞俄比亚芥小孢子，使芥酸含量发生了广泛变异。

由此可见，化学诱变剂用于油菜小孢子诱变取得了好的效果。但是用化学诱变剂诱变离体小孢子的实验操作程序过于繁琐。小孢子被化学诱变剂处理后必须通过离心把诱变剂清除掉，再进行培养，诱导胚状体。操作步骤多，小孢子易污染，诱变成功率低。而且诱变剂为致癌物，在操作过程中可能污染环境，甚至对实验人员有毒害。其次药品价格贵，费用高。

用物理射线诱变离体小孢子操作程序简便，尤其是采用安装在超净台上的紫外灯辐照小孢子既简便又安全。英国的Ahmad等从紫外线照射甘蓝型菜离体小孢子的再生植株中获得了抗除草剂和抗黑斑病的突变体(Ahmad等，Haploid Culture and UV Mutagenesis in Rapid-cycling Brassica napus for the Generationof Resistance to Chlorsulfuron and Alternaria brassicicola.Annals of Botany，1991，67：521-525)。日本的Zhang等用紫外线处理大白菜的离体小孢子，其再生植株中出现了抗软腐病的突变体(Z hangFeng-lan等，Microspore Mutagenesis and In vitro Selection for Resistance to Soft Disease inChinese Cabbage(Brassica campestris L.ssp.Pekinensis).Breeding Science，1999，49：161-166)。西班牙的Barro等用紫外线辐照埃塞俄比亚芥的离体小孢子，从诱变小孢子的再生植株中获得了低硫甙和高硫甙以及高芥酸突变体(Barro等，Modification of Glucosinolate and Erucic Acid Contents inDoubled Haploid lines of Brassicn carinata by UV Treatment of Isolated Microspores.Euphytica，2003，129：1-6)。

上述结果表明，紫外线对油菜小孢子具有诱变效应，可作为油菜小孢子的诱变工具。同时上述报道为紫外线诱变油菜离体小孢子技术的深入研究奠定了基础。但是诸研究者所使用的紫外灯功率和照射剂量率不同，离体小孢子离紫外灯的距离和辐照时间不同，测定的小孢子半致死剂量(LD₅₀)的照射时间差异很大。而且均没有研究照射时间和剂量率与变异的相关性，不明确采用多大的剂量率和多长的照射时间能获得更多的变异，至今没有对紫外线诱变离体小孢子的理论和方法进行系统的研究，该技术还未成熟，更未程序化。我们采用安装在超净台上的紫外灯对甘蓝型油菜离体小孢子进行了系统地诱变研究。根据小孢子被紫外线诱变后的产胚量(以没被诱变的小孢子的产胚量为对照)和其再生植株的突变率和突变谱确定有效的照射剂量、照射时间和照射方法，建立了油菜离体小孢子紫外线诱变方法。同时建立了诱变小孢子单倍体二倍化的双单倍体植株(DH)再生技术，为油菜品种遗传改良和油菜建立突变体库创造了新种质。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种油菜小孢子离体紫外线(UV)诱变、创造突变体和突变体的筛选方法。

本发明的技术方案和步骤如下：

1、分离纯化小孢子  在花期于田间取甘监型油菜植株的主茎或分枝上小孢子发育到单核晚期的花蕾，用70％乙醇溶液和0.1％升汞水溶液浸泡花蕾灭菌(以下操作均在超净台进行)，然后用无菌水冲洗3次。灭了菌的花蕾放入无菌的试管(注：以下所有器皿均无菌)中，用玻棒捣碎，并加入13％蔗糖的小孢子提取液。将捣碎的花蕾和提取液倒入装有孔径44μm的网筛的漏斗中过滤，除掉萼片、花瓣等体细胞组织，将含小孢子的滤液接入离心管。将离心管放入离心机离心3次，去掉体细胞组织，获得纯化的小孢子。

小孢子提取液的配制：蔗糖130g加蒸馏水溶解，定溶至1000ml，pH5.8-6.0，分装在三角瓶中，于121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

2、小孢子诱变和染色体加倍  将步骤1纯化了的小孢子悬浮在添加70mg/L秋水仙碱的改良的NLN培养基(见：Lichter，R.Anther Culture of Brassica napus in a Liquid Medium.Z.Pflanzenphysiol，1981，103：229-237)，并分装入培养皿中。含小孢子的培养皿(不盖盖)置于距离紫外灯15cm位置处，照射95-100秒，然后盖上盖，并用石腊封膜将皿封住，放入32℃的培养箱暗培养2天，进行小孢子染色体加倍。之后将培养皿中含小孢子的培养液用吸管移入离心管离心1次，弃去秋水仙碱的培养基，再将无秋水仙碱的改良的NLN培养基加入离心管，悬浮小孢子，并倒入培养皿，用石腊封膜封好盖。

本发明的改良NLN培养基配方如下：

KNO₃ 125mg/L，MgSO₄·7H₂O 125mg/L，KH₂PO₄ 125mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 750mg/L(原配方是500mg/L)，*Na₂EDTA 37.3mg/L，*FeSO₄.7H₂O 27.8mg/L(*原配方是Fe·EDTA 40mg/L)，MnSO₄·4H₂O 25mg/L(原配方是MnsO₄·H₂O17.37mg/L)。

KI 0.83mg/L(原配方中没有KI)，H₃BO₃ 10mg/L，2nSO₄·4H₂O 10mg/L，Na₂M₀O₄·2H₂O 0.25mg/L，CoCl₂·6H₂O0.025mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，维生素B₁0.5mg/L，维生素B₆0.5mg/L，叶酸0.5mg/L，生物素0.05mg/L，甘氨酸5.0mg/L(原配方是2.0mg/L)，谷胱甘肽30mg/L，谷氨酰胺800mg/L，丝氨酸100mg/L；蔗糖130g/L，pH5.8-6.0，用孔径0.22μM的微孔滤膜抽滤灭菌。

紫外灯照射小包子的剂量和参数：悬挂在超净工作台上的直管型(ZSZ30D)紫外线灯功率是30W，波长253.7nm，被照射的油菜小孢子距离紫外灯15cm。

3、小孢子培养和胚状体诱导  将步骤2悬浮在无秋水仙碱培养基中的油菜小孢子置于约25℃的培养室进行静止暗培养。当肉眼可见的胚状体出现后，把培养皿放入震荡器，进行震荡培养(50转/分)。当胚状体发育到鱼雷后期到子叶初期时停止震荡培养。

4、诱导小植株  将步骤3得到的鱼雷后期至子叶初期的胚状体接种在附加2％蔗糖的B5固体培养基(Gambory L等，Nutrients Requirements of Suspension Cultures of Soybeen Root Cells.Exp.CellRes.1968，50：151-158)，于培养室(约25℃，光照强度3000LUX，12小时/天光照)，诱导胚状体发芽，得到完整小植株或畸形小植株；

5.诱导壮苗  将步骤4的小植株或畸形小植株切除根，转入B5壮苗培养基，诱导生根，培育壮苗。

B5壮苗培养基的配制：原B5培养基组分，另加0.12mg/L多效唑，原要求分析级蔗糖改用廉价食用蔗糖，蔗糖浓度2％，9g/L琼脂，用自来水补足至1升，pH5.8-6.0，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

6.油菜小孢子再生植株移栽到田间  培育的油菜小孢子再生植株于5月或6月从试管中直接移栽到夏繁基地的田间，或者于10月下旬移栽到田间(湖北省武汉市)。

7.突变体的选择  从苗期至结角期于田间目测确认形态变异植株，并于花期对所有诱变的油菜小孢子产生的植株套袋，迫使其自花传粉产生自交种子。采用近红外反射光谱仪(型号：Bruker，Vector 22/N)检测自交种子中的含油量、芥酸和硫代葡萄糖甙的含量，用高效液相色谱仪(型号：Waters 2487-717-600)复查硫代葡萄糖甙含量，筛选品质性状突变体。

8.突变体的遗传稳定性鉴定  将形态变异体和品质变异体的种子于油菜的正常种植季节播种到田间，采用步骤7的方法进一步鉴定其遗传稳定性。

本发明的效果：

1.本发明的实施结果表明，紫外线对油菜离体小孢子具有较强的诱变效应。在诱变的5个品系油菜小孢子再生植株群体中，出现了雄性不育(图2)，无花瓣(图3)、植株的心叶紫黄色(图4)、花瓣白色，种皮深棕色等22种变异性状，变异率10.53-21.57％。没有诱变(对照)的油菜小孢子再生植株出现早开花多分枝、淡黄色花、叶片淡绿、光叶、种皮深棕色等6种变异性状，变异率为5.08-7.69％。表明本发明明显提高了油菜突变谱和突变率(见表1)。诱变小孢子再生植株的种子品质性状发生了广泛变异。诱变再生的4个DH群体中低于和高于小孢子供体硫代葡萄糖甙含量的最低和最高值植株比率是25.53-78.70％，对照是13.56-23.68％。诱变再生的5个DH群体中低于和高于小孢子供体含油量的最低值和最高值的株率是22.22-59.09％，对照是9.21-19.23％。诱变再生的2个DH群体中，低于和高于小孢子供体芥酸含量的最低值和最高值的株率是38.89-46.97％，对照是18.42-20.34％(见表2-1和表2-2)。

2.利用紫外灯用于油菜小孢子离体诱变具有射线源利用方便，比使用化学诱变剂对操作人员安全和简便、省时及费用低等优点。例如，纯化了的小孢子于培养皿中被照射95-100秒后，用石腊封膜封好培养皿，放入培养箱培养，诱导胚状体，3分钟可完成诱变流程，污染机率低。

3.本发明建立的小孢子离体诱变和植株再生体系使TILLING技术(targeting induced local lesionsin genomes)能在大规模的突变基因筛选中发挥应有的作用。

4.本发明建立的油菜小孢子离体诱变和植株再生方法与离体抗逆境(抗冷、抗病、抗除草剂等)筛选技术结合，可以快速获得有益种质资源。

5.本发明建立的小孢子离体诱变和植株再生系统可在胚状体阶段用子叶测定筛选品质性状突变体，从子叶提取DNA进行遗传研究。

6.本发明建立的小孢子离体诱变和植株再生技术也适用于十字花科其它作物的小孢子离体诱变和突变体筛选。

附图说明

图1：本发明技术路线图；

图2：本发明获得的甘蓝型油菜雄性不育突变株；

图3：本发明获得的甘蓝型油菜无花瓣突变株；

图4：本发明获得的甘蓝型油菜心叶紫黄色突变株。

具体实施方式

实施例1

甘蓝型油菜小孢子的分离和离体诱变

在油菜的花期，于试验田取甘蓝型油菜品种中油821、华双5号、华双2号、华黄1号、华油8号(上述品种为中国公开推广的甘蓝型油菜品种)植株的主茎或分枝花序，带到实验室，选择小孢子发育到单核晚期的花蕾，然后将花蕾放在70％乙醇水溶液中浸泡0.5-1分钟，再于0.1％升汞水溶液中浸泡8-10分钟(以下操作均在超净台进行)，随后用无菌水冲洗3次。表面灭了菌的花蕾放入无菌的试管(以下所用器皿均经过灭菌)中，用玻棒碾碎，然后加含13％蔗糖的小孢子提取液到试管中(依花蕾的数量确定加入量)。将碾碎的花蕾和提取液倒入装有孔径44μm的网筛的漏斗(下接离心管)中过滤，除掉萼片和花瓣等大体细胞组织，将含小孢子的滤液接入离心管。将离心管放入离心机离心，1000转/pm，5分钟。随后用吸管吸出离心管中含体细胞组织的悬浮液，再加小孢子提取液悬浮沉淀在离心管底部的小孢子，按第一次离心的转数和时间进行第二次离心。第三次离心，800转/pm，3分钟，分离出纯化的小孢子。

将分离纯化的油菜小孢子悬浮在附加70mg/L秋水仙碱改良的NLN培养基中，按120000/ml小孢子密度分装在7.5ml的培养皿中，每皿6ml。然后把培养皿(不盖盖)放在距离紫外灯15cm处，照射95秒(在另外的实施例为100秒)，盖上盖，并用石腊封膜将皿封住，放入32℃的培养箱暗培养。

小孢子提取液配制：130g蔗糖加蒸馏水溶解，并加蒸馏水定溶至1000ml，pH 5.8-6.0，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

改良的NLN培养基配方：

KNO₃ 125mg/L，MgSO₄·7H₂O 125mg/L，KH₂PO₄ 125mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 750mg/L(原配方是500mg/L)，*Na₂EDTA 37.3mg/L，*FeSO₄.7H₂O 27.8mg/L(*原配方是Fe·EDTA 40mg/L)，MnSO₄·4H₂O 25mg/L(原配方是MnsO₄·H₂O17.37mg/L)，KI 0.83mg/L(原配方中没有KI)，H₃BO₃ 10mg/L，2nSO₄·4H₂O 10mg/L，Na₂M₀O₄·2H₂O0.25mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，维生素B₁ 0.5mg/L，维生素B₆0.5mg/L，叶酸0.5mg/L，生物素0.05mg/L，甘氨酸5.0mg/L(原配方是2.0mg/L)，谷胱甘肽30mg/L，谷氨酰胺800mg/L，丝氨酸100mg/L；蔗糖130g/L，pH5.8-6.0，用孔径0.22μM的微孔滤膜抽滤灭菌。

实施例2

甘蓝型油菜小孢子染色体加倍和胚状体诱导

将悬浮在秋水仙碱NLN培养基经过紫外线照射的油菜小孢子在32℃的培养箱暗培养2天进行染色体加倍。之后，于超净工作台将培养皿中含小孢子的秋水仙碱培养基用吸管移入离心管中离心(500转/分，3分钟)，沉淀小孢子。再用吸管吸掉秋水仙碱培养基，把无秋水仙碱的改良的NLN培养基6ml加入离心管，悬浮小孢子，然后倒入直径7.5ml培养皿，用石腊封膜封住盖，放于约25℃的培养室静止暗培养，诱导胚状体。

实施例3

甘蓝型油菜再生植株的诱导

当于约25℃下暗培养的小孢子产生肉眼可见的小胚状体时(一般在小孢子分离10天后)，把培养皿放入震荡器，进行震荡培养(50转/分)。在胚状体发育到鱼雷后期到子叶初期时停止震荡培养，将其转接到附加2％蔗糖的B5固体培养基，并于25℃左右的培养室培养(每天光照12小时，光照强度3000LUX)，诱导胚状体发芽。当胚状体产生带叶和茎的小植株或畸形小植株时，切除这些小植株的根，然后转入附加0.12mg/L多效唑的B5壮苗培养基，培育健壮的再生植株。

上述B5壮苗培养基的配制：采用原B5培养基组分，附加0.12mg/L多效唑，将原B5培养基要求的分析级蔗糖改用廉价食用蔗糖，浓度2％，用9g/L琼脂固化，蒸馏水由自来水代替，定溶至1升，pH5.8-6.0，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，备用。

实施例4

甘蓝型油菜小孢子再生的突变植株的鉴定和选择

于10月底，用镊子将试管中的再生植株取出，洗净根部的培养基后立即移栽到湖北省武汉市华中农业大学试验田。在再生植株生长期间，观察其农艺性状与小孢子供体植株的差异，并于花期将变异植株和所有再生植株套袋自交。于成熟期收自交种子，种子晒干后用近红外反射光谱仪(Bruker，Vector 22/N)检测自交种子中的含油量、芥酸和硫代葡萄糖甙等成分的含量。用高效液相色谱仪(Waters 2487-717-600)复测硫代葡萄糖甙含量，筛选品质性状变异体。筛选的农艺性状和品质性状发生变异的植株的种子于9月底播种到华中农业大学试验田，进一步观察其变异性状是否为稳定遗传，同时于花期对所有再生植株套袋自交，收获的种子再次进行品质分析，鉴定其遗传稳定性。

经过两个季节的重复鉴定，从5个诱变的品种中获得了稳定遗传的甘蓝型油菜雄性不育植株(图2)、无花瓣植株(图3)和心叶紫黄色植株(图4)，花瓣白色植株，种皮深棕色植株等22种形态性状突变体，变异株率达10.53-21.57％。未诱变处理的小孢子(对照)产生了早花多分枝，花瓣淡黄色，叶片淡绿色等6种突变体，变异率5.08-7.69％，同时种在田间的小孢子供体植株没有产生变异(见表1)。诱变再生的5个双单倍体群体中低于和高于小孢子供体含油量的最低值和最高值的株率是22.22-59.09％，对照是9.21-19.23％。诱变再生的4个双单倍体双群体中，低于和高于小孢子供体硫代葡萄糖甙含量的最低和最高值株率是25.53-78.70％，对照是13.56-23.68％。2个群体中低于和高于小孢子供体芥酸含量的最低和最高值的株率是38.89-46.97％，对照是18.42-20.34％(见表2-1，2-2)。

说明：在本说明书中出现的“小孢子”、“油菜小孢子”术语就是“甘蓝型油菜小孢子”，它们是指同一个试验材料。