类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌及其菌剂制备方法

摘要

类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌及其菌剂制备方法。该杀虫工程菌是由苏云金芽胞杆菌的crylAc基因与一种外源毒素基因融合构建的双效工程菌，并在苏云金芽胞杆菌中表达融合杀虫晶体蛋白。所述苏云金芽胞杆菌为苏云金芽胞杆菌4.0718菌株。所述外源毒素基因为球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因。经发酵生产制备的类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌菌剂的效价均在6000国际单位/μg以上，对鳞翅目、双翅目与鞘翅目的昆虫杀虫率都达到90％。在相同的浓度下，其杀虫效果要比单价的高3～5倍以上；无残毒，对人、畜安全，有利于保护生态环境。

说明书

技术领域

本发明涉及一种类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌及其菌剂制备方法，特别是涉及一种含有外源类枯草杆菌蛋白酶基因重组的苏云金芽胞杆菌工程菌及其菌剂制备方法。

背景技术

人类长期大量使用高毒和高残留的化学农药，这些化学农药对生态环境、食品安全和人类健康带来了众所周知的负面作用和影响。因此，减少使用高毒和高残留的化学农药势在必行，以生物防治为主的害虫防治策略正受到广泛重视，开发高效稳定的微生物农药已经成为当务之急。微生物农药具有无公害、无残留和害虫不容易产生抗性等特点，且与人类未来的生产生活方式、食品安全、营养健康、生态平衡和生物多样性保护都具有良好的相融性，在病虫害综合治理中发挥了越来越大的作用，并被认为是实现农业可持续发展的重要手段，因而微生物农药的研究开发已经受到广泛的关注。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌，其在形成芽孢的同时能够产生伴胞晶体(parasporalcrystal protein)，其中含有一种或几种杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，简称ICPs)，即δ-内毒素(delta-endotoxin)。伴胞晶体本身无毒，当被敏感昆虫摄入体内后，在中肠碱性环境下分解成原毒素，中肠内的蛋白酶对原毒素进行消化，释放出毒性多肽核心片段(toxincore fragment)，并与昆虫消化道刷状缘膜囊(brush border memberane vesicles，简称BBMV)上的受体高亲合性结合，快速而不可逆地插入细胞质膜，形成孔(pore)或病灶(lesion)，引起细胞膜非极性化，破坏细胞渗透平衡，导致细胞裂解，最后引起昆虫发生肿胀和厌食而死亡。目前普遍认为受体是一种糖蛋白或氨肽酶，关于ICPs与受体间的作用模式，比较流行的是二步模型，即ICPs先与中肠膜上的受体结合，然后ICPs插入膜并形成孔。最新研究证实，ICPs与BBMV的受体结合是特异的，这种宏观杀虫机制已普遍为人们所接受。由于Bt对靶标昆虫有特异性毒杀作用，具有对人畜无害和不危害环境等优点，因此在农业、林业和卫生害虫防治上得到广泛应用。

目前Bt制剂已达100多种，是国内外产量最大和应用范围最广的微生物杀虫剂，它对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和小菜蛾(Pultella xylostella)等40多种农业害虫有良好的防治效果，已经用来防治鳞翅目(Lepidopteran)、双翅目(dipteran)和鞘翅目(coleopteran)的多种害虫。此外Bt还对膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)和食毛目(Mallophaga)的多种害虫及植物病原线虫、螨类和原生动物有控害作用。我国早在20世纪50年代就开始了Bt杀虫剂的研究和应用，到90年代全国Bt产品的产量和质量都得到大幅度提高。目前我国Bt年产量已逾4万吨，产品覆盖所有省市并销往欧美以及新西兰等国家和地区。

Bt杀虫剂在世界范围内得到了广泛应用。但是，由于Bt杀虫剂在长期使用过程中仍存在一些缺点，如杀虫谱较窄，毒力较化学杀虫剂弱，残效期偏短等。并且Bt杀虫剂在长期施用过程中，也给昆虫提供了一个持续选择压力，加快了昆虫抗性的产生。国内外已发现多种对Bt伴孢晶体产生抗性作用的害虫，限制了Bt杀虫剂的进一步推广应用。因此不断分离和鉴定高效广谱的杀虫晶体蛋白，深入研究其功能结构关系，以及试图改变其结构而提高杀虫活性已成为世界各国Bt研究者的一个工作重点。采用基因工程技术构建药效稳定和杀虫谱较广的Bt工程菌制剂，是当前Bt农药发展的新趋势。

发明内容

本发明的目的在于克服现有Bt杀虫剂杀虫谱较窄，毒力较化学杀虫剂弱，残效期偏短等缺陷，提供一种杀虫谱较广，毒力较强，残效期较长的类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌及其菌剂制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

研究表明，昆虫病原真菌分泌的类枯草杆菌蛋白酶对许多蛋白质具有良好的蛋白酶活性，其能降解的蛋白质包括酪蛋白、弹性蛋白、牛血清蛋白、胶原蛋白和昆虫的表皮结构蛋白，且降解能力很强(比蛋白酶K高33倍)，在病原真菌降解寄主体壁的过程中起主要作用，是与杀虫真菌毒力密切相关的重要因子。在昆虫血淋巴中高浓度的类枯草杆菌蛋白酶可以引起昆虫过度表达酚氧化酶，将酚类物质氧化成醌类物质，从而导致昆虫中毒死亡。同时它也能降解寄主的免疫蛋白，引起昆虫免疫系统紊乱，从而降低昆虫的免疫力。因此，其可以作为目的基因用于植物抗虫育种和杀虫微生物的菌株改造。

研究还表明，球孢白僵菌(Beauveria bassiana)类枯草杆菌蛋白酶是球孢白僵菌主要的杀虫毒力因子，组成性表达类枯草杆菌蛋白酶具有明显的杀虫增效作用。

本发明通过Red/ET同源重组技术，将一种外源毒素基因类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因与苏云金芽胞杆菌cry1Ac基因进行融合，构建了一种新的类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌。

本发明之类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌是由苏云金芽胞杆菌的cry1Ac基因与一种外源毒素基因融合构建的双效工程菌，并在苏云金芽胞杆菌中表达融合杀虫晶体蛋白。

所述苏云金芽胞杆菌优选苏云金芽胞杆菌4.0718菌株。

所述的外源毒素基因优选球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因。

所述CDEP2基因是本发明者在球孢白僵菌中发现的一个新的具有自主知识产权的类枯草杆菌蛋白酶基因，其在基因银行(GenBank)上的登录号为EF195164。

本发明之类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌的构建及其菌剂的制备方法，包括类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的克隆、类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌的构建和类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌菌剂的发酵制备方法三部分。

本发明通过引入外源类枯草杆菌蛋白酶基因，解决了现有Bt杀虫剂杀虫谱窄，毒力弱、残效期偏短等问题。

当苏云金芽胞杆菌中表达的融合杀虫晶体蛋白被靶标昆虫吞食后，在昆虫肠道碱性环境下溶解，降解成Cry1Ac蛋白和CDEP2蛋白的活性多肽，其中Cry1Ac蛋白的活性多肽区域与昆虫中肠细胞表皮膜形成离子通道或孔道，破坏细胞渗透压平衡，引起中肠细胞的崩溃，导致昆虫体内失水和厌食；随后CDEP2蛋白通过孔道进入昆虫的淋巴循环，使昆虫过度表达酚氧化酶并将体内的酚类物质氧化成有毒性的醌类物质，由于醌类物质的累积从而导致昆虫中毒，抑制了其生长发育；同时CDEP2蛋白也能降解寄主的免疫蛋白，从而降低昆虫的免疫力，导致昆虫更加容易死亡。两种蛋白共同发挥杀虫作用，增加了本发明之工程菌的杀虫毒力。由于昆虫表皮中蛋白质的含量可高达70％，昆虫幼虫的中肠围食膜中蛋白质的含量可高达40％，而类枯草杆菌蛋白酶对蛋白质有非常强的降解作用，因此，CDEP2一方面通过与昆虫体表、中肠道的接触和累积，对昆虫体壁和中肠围食膜进行降解，干扰其正常的生长发育。另一方面通过被Cry1Ac蛋白穿透形成的中肠孔道进入昆虫血腔，引起体内有毒的酚类物质的积累，破坏其正常的组织结构并使昆虫的免疫系统发生紊乱，从而起到了杀虫增效作用。

该种融合晶体蛋白还具有安全性的特点，因为它在人畜消化道酸性环境中不会溶解，原毒素激活被抑制，活性多肽不能被释放；并且CDEP2多肽包裹在晶体蛋白中，在消化道中不能产生任何作用，即使有游离的CDEP2多肽产生，也将会被消化道蛋白酶降解而失效。

本发明扩大了苏云金芽胞杆菌工程菌的杀虫谱范围，提高了苏云金芽胞杆菌工程菌对靶标昆虫的杀虫毒力，改善了其生物安全性。因此，本发明之类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌及其菌剂具有良好的生产应用前景。

附图说明

图1为本发明之中间载体pUAc的构建流程图；

图2为本发明之表达载体pHAc的构建流程图；

图3为本发明之融合基因表达载体pHT-cry1Ac-CDEP2的构建流程图；

图4为本发明之类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌菌剂发酵制备流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

本实施例类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌，由苏云金芽胞杆菌4.0718菌株的cry1Ac基因与外源毒素基因球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因融合构建的双效工程菌。

所述球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因是本发明者在球孢白僵菌中发现的一个新的具有自主知识产权的类枯草杆菌蛋白酶基因，其在基因银行(GenBank)上的登录号为EF195164。

本实施例利用苏云金芽胞杆菌高毒力杀虫菌株4.0718(中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC No.M200016，参见中国专利ZL01114592.7号)及Bt无晶体突变株Cry-B作为宿主菌，从球孢白僵菌中分离出的类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因，将其与Bt中cry1Ac基因融合，并以合适的载体克隆并转入苏云金芽胞杆菌中实现高表达，构建出高效、广谱、安全的新型生物杀虫剂菌株，并通过发酵生产制备工程菌菌剂。

以下详细介绍本实施例类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌的构建及其菌剂的制备方法，包括球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的克隆、类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌的构建和类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌菌剂的发酵制备方法。

(1)球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的克隆

①RT-PCR引物的设计

根据GenBank上登录号为EF195164的球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因的序列，参考文献[方卫国，张永军，杨星勇，等.球孢白僵菌降解昆虫体壁蛋白酶基因CDEP-1的克隆与序列分析.遗传学报，2002，29(3)：278-282]设计PCR引物，

CDEP2-F：5’GCGCAGATCTATGCGTCTATCAATCATTGC 3’

CDEP2-R：5’ATACAATTGTTAGGTGGCGCCGTTAAATGC 3’

②RT-PCR获得球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的cDNA全序列

提取球孢白僵菌Bb591(购自安徽农业大学)的总RNA，以总RNA为模板，CDEP2-R为特异性引物，使用cDNA第一链合成试剂盒反转录获得CDEP2基因的cDNA第一链，以CDEP2基因的cDNA第一链为模板，CDEP2-F和CDEP2-R为引物，PCR扩增获得CDEP2基因的cDNA双链；

③CDEP2基因的cDNA全序列的测序分析

将CDEP2基因的cDNA双链片段与pMD18-T载体进行TA连接，构建克隆载体pMD-CDEP2；将其转化到大肠杆菌DH5α中，用无菌牙签从含有氨苄青霉素的LB平板上挑取抗性转化子做菌落PCR检测，初步确定阳性转化子，然后小量制备转化子质粒，进一步酶切鉴定并将酶切正确的转化子测序；CDEP2基因的cDNA序列全长1140bp，其在GenBank的登录号为EF195164；

(2)构建含有cry1Ac基因的中间载体pUAc和表达载体pHAc

①PCR引物的设计

扩增含有上游启动子序列的cry1Ac基因的引物

Ac-F：5’ACGCGTCGACTTGCAGGTAAATGGTTCTA 3’，下划线处为SalI位点；

Ac-orf-R：5’GCGCAGATCTCTATTCCTCCATAAGGAGTAGTAATTC 3’，下划线处为BglII位点；

扩增cry1Ac基因下游序列的引物

Ac-Ter-F：5’ACGCAGATCTGCAAACTCAGGTTTAAATATCG 3’，下划线处为BglII位点；

Ac-R：5’ACGCGGATCCCAAAAACACCCTATTAGTG 3’，下划线处为BamHI位点；

②中间载体pUAc的构建

提取Bt4.0718菌株的总DNA，方法参考文献[Diversity of locations forBacillus thuringiensis crystal protein genes.J Bacteriol.1983 Apr154(1)：419-428]；以Bt4.0718菌株的总DNA为模板，Ac-F和Ac-orf-R为引物进行PCR扩增，扩增含有上游启动子序列的3.9kb cry1Ac基因。同样以Bt4.0718菌株的总DNA为模板，Ac-Ter-F和Ac-R为引物进行PCR扩增，扩增288bp cry1Ac基因下游终止子序列；分别将含有上游启动子序列的3.9kb cry1Ac基因用BglII酶切后回收，将288bp cry1Ac基因下游序列用BglII酶切后回收，通过连接得到4.2kb完整的cry1Ac基因片段。以完整的cry1Ac基因片段为模板，Ac-F，Ac-R为引物，扩增4.2kb的完整cry1Ac基因；

用SalI/BamHI双酶切cry1Ac基因，同样用Sal I/BamHI双酶切载体pUC19，用T₄ DNA连接酶将两者连接起来，形成中间载体pUAc(参见图1)；然后将其转化大肠杆菌(E.coli)DH5α中扩增。挑选多个转化子，并提取质粒进行酶切鉴定；

③表达载体pHAc的构建

用Sal I/BamHI双酶切中间载体pUAc，回收4.2kb的cry1Ac基因，同样用Sal I/BamHI双酶切穿梭载体pHT315，并回收载体片段，将两者进行连接，获得表达载体pHAc(参见图2)；将其转化E.coli DH5α中扩增；

(3)Red/ET同源重组构建融合基因表达载体pHT-cry1Ac-CDEP2

①PCR引物设计

Cry1Ac-CDEP2-F：

5’CGGAAGGAACATTTATCGTGGACAGCGTGGAATTACTCCTTATGGAGGAACGTCTATCAATCATTGCTG 3’，下划线代表上游同源臂序列；

Cry1Ac-CDEP2-R：

5’TGGACAATTGATTTGAAAACGATATTTAAACCTGAGTTTGCATGAGACTAGGTGGCGCCGTTAAATGCCAG 3’，下划线代表下游同源臂序列；

②构建融合基因表达载体pHT-cry1Ac-CDEP2

利用Red/ET同源重组技术(参见文献Zhang Y，Buchhol z F，and MuyrersJ P P，et al.A new logic for DNA engineering using recombination inEscherichia coli[J].Nat Genet.1998，20：123-128；Zhang Y，Muyrers JP P，and Testa G，et al.DNA cloning by homologous recombination inEscherichia coli[J].Nat Biotech.2000，18：1314-1317)，以pMD-CDEP2为模板，Cry1Ac-CDEP2-F和Cry1Ac-CDEP2-R为引物PCR扩增带有同源臂序列的CDEP2基因，并回收；提取质粒pHAc，用BglII单酶切后回收；将带同源臂的CDEP2片段和用Bgl II单酶切后的pHAc质粒电转化进大肠杆菌YZ2005中，进行Red/ET同源重组，条件为2.3kV，25uF，200Ω(参见图3)；电击后的产物加入1mlLB培养基，37℃复苏75min后将菌液涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜；用无菌牙签从LB平板上挑取转化子做菌落PCR检测，初步确定阳性转化子，然后小量制备转化子质粒，进一步酶切鉴定并将酶切正确的转化子测序，重组质粒命名为pHT-cry1Ac-CDEP2；

(4)基因重组杀虫工程菌菌株Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2的构建

将重组质粒pHT-cry1Ac-CDEP2电转化Bt无晶体突变株Cry-B中；电转化感受态的制备和电转化条件参照文献[胡宏源，夏立秋，史红娟等.(2004)苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kb DNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究.生物工程学报，20(5)：656-661]，电转化条件：1.8KV、25μF、200Ω；通过红霉素抗性平板初步筛选转化子，然后通过菌落PCR和SDS-PAGE进一步鉴定和检测；将正确的转化子命名为Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2；

(5)类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌菌剂的发酵制备

参照图4，本实施例类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌菌剂发酵工艺流程主要包括菌种活化、一级种子罐发酵培养、二级种子罐发酵培养和生产发酵罐培养。

①菌种活化

将保藏在-80℃冰箱中的本发明之类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌菌株在无菌台上划线接种于灭菌的固体种子培养基斜面上，接种后在28～30℃条件下培养30～48h，加入无菌水配成孢子悬液，以5％的接种量接种到种子罐；

②种子罐发酵

先将一级种子罐在121℃下灭菌30min，装入种子培养基后再灭菌，冷却至30℃，将孢子悬液以5％的接种量接种到种子罐中，30℃培养8小时，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃下灭菌30min，装入种子培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按5％～8％接种量接入二级种子罐，30℃培养8小时，可得二级种子罐发酵菌液；

③生产发酵罐培养

先将生产发酵罐灭菌，装入发酵培养基后再灭菌，保压降温至25℃～30℃，按5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养；

④浓缩

发酵过程结束后，将菌液通过超滤进行浓缩、补加增效添加剂、随后装瓶；

所述灭菌的方法及培养条件为：灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3-0.5kg/cm²条件下灭菌30min。生产发酵罐接种后，在28～35℃条件下培养36～48小时，通气量1～2Vols/vol/min，氧气含量30～40％。种子罐培养液配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl 0.1～0.6％，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.06％，K₂HPO₄0.01％～0.06％，MnSO₄ 0.02％～0.08％，pH值灭菌前7.0～7.8，灭菌后pH6.8～7.8。生产发酵罐培养液配方：黄豆粉2～8％，玉米淀粉0.3～1.5％，NaOH 0.2～0.8％，在121℃水解20min后，过滤去除杂质，按体积补加葡萄糖1.3～2.0％，KH₂PO₄0.08～0.22％，K₂HPO₄0.10～2.2％，CaCO₃ 0.1～2.20％，FeSO4·7H₂O 0.001～0.005％，搅拌均匀，pH值灭菌前8.5～11.0，灭菌后6.5～9.5；发酵液含活芽胞数每毫升达80亿以上，菌体量不足5％时放罐，pH值7.0-8.0，无杂菌污染。

(6)杀虫功能验证

①Westren-blotting检测融合基因的表达产物

将已纯化的CDEP2蛋白免疫新西兰公兔，获得CDEP2蛋白的多克隆抗体。将工程菌用超声波处理后的总蛋白进行SDS-PAGE，将总蛋白转膜后用多克隆抗体进行杂交、显色，确定工程菌表达了Cry1Ac-CDEP2融合蛋白。

②验证表达的正确性

通过HPLC纯化融合蛋白，C端测序确定表达是否正确。

③室内杀虫试验确定工程菌株的杀虫效价。

本实施例之类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌菌剂具有以下优点：(1)杀虫效果好本实施例之类枯草杆菌蛋白酶基因重组杀虫工程菌菌剂，是一种产生Bt杀虫蛋白和经基因克隆后产生类枯草杆菌蛋白酶的双效苏云金芽胞杆菌制剂。由于工程菌株分别带有多种杀虫毒素Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ac、Cry2Aa与类枯草杆菌蛋白酶，除了自身的杀虫能力外还具有显著的正协同作用，能对害虫产生胃毒及触杀双重效果；其活性芽孢含量在80亿/ml以上，制剂的效价在6000国际单位/μg以上，对鳞翅目、双翅目和鞘翅目害虫幼虫杀虫率均达90％以上；在相同的浓度下，双效工程菌的杀虫效果要比单效的高3-5倍以上；(2)杀虫谱广本发明之杀虫工程菌自身带有多种杀虫毒素，同时由于类枯草杆菌蛋白酶基因与改造后的杀虫晶体蛋白的domain II区域以融合蛋白形式表达，使杀虫晶体蛋白可识别的范围增大，同时能对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多类害虫有毒杀效果，因此在生物防治上，应用面较广，成本相对较低；(3)安全性更高由于本发明之杀虫工程菌所携带的昆虫毒素均为天然毒蛋白，容易为自然界中的微生物所降解和易受阳光紫外线破坏，不形成残留；同时，各种杀虫毒蛋白均对人畜无害，因此，在保护生态环境、促进绿色农业发展和增加出口创汇等方面有极大的优势。