大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球及其制备方法

摘要

本发明公开了大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球及其制备方法，制备方法为：(1)配制海藻酸钠/卵白蛋白复合物溶液；(2)将羟乙基纤维素去离子水溶液与步骤(1)的溶液混合；(3)加液体石蜡和乳化剂混合液，搅拌得乳液；(4)将乳液分散在含有分散剂的有机油相中，加聚乙烯基吡咯烷酮水溶液，加氯化钙水溶液交联成微球，冲洗，将微球放在戊二醛水溶液交联；用乙醇溶液、乙醚浸泡，用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液洗脱微球中卵白蛋白制得。本发明的微球除具有普通大分子印迹和乳液印迹凝胶聚合物微球的印迹效率，还可随环境或自身结构发生变化，并在变化过程中具有重结合特异点，体现了双印迹水凝胶聚合物微球体系重结合规律的特殊性。

说明书

技术领域

本发明涉及分子印迹聚合物微球及其制备方法，特别是涉及一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球及其制备方法。

背景技术

大分子印迹区别于小分子印迹的特征并不是仅仅在于大分子的体积效应，自然界中大分子间的识别现象多决定于局部区域结构的组装或配合。因此，大分子印迹材料与技术的研究中，分子印迹效应的明确判定便成为一个基本的学术问题。

天然生命体系中大分子之间的特异性作用可以划分为两个方面：一是非特异性胶体作用(general colloidal interactions)，通常是受体通过静电作用介入的锁-匙特异性作用阶段，比如带正电的受体蛋白通过选择性结合带负电的DNA螺旋固化特异性基因；二是特异性识别过程，即通过识别位点之间形成氢键结合模板分子与基材，比如蛋白与螺旋连上的官能团的特异性匹配[Adam Baszkin.基材及空气/水界面铺展的蛋白质单层膜上的分子印迹。胶体与表面科学进展128-130(2006)1111-120]许多蛋白分子中的大部分区域都具有重要功能，使得蛋白可以与大量的配体发生作用[Amrita Mohan，Christopher J.Oldfield，Predrag Radivojac.分子识别性质分析。分子生物学期刊。(2006)362，1043-1059]以软湿水凝胶聚合物体系作为基材，印迹蛋白等生物大分子的尝试已有报道[庞兴收，成国祥，陆书来，唐二军。牛血清白蛋白分子印迹带有静电官能团的聚丙烯酰胺凝胶微球的制备。分析化学和生物分析化学。(2006)384：225-230][庞兴收，成国祥，李仁胜，陆书来，张怡华。反相种子悬浮聚合法制备牛血清白蛋白印迹聚丙烯酰胺凝胶微球。分析化学学报550(2005)]此类应用的印迹基材多为多孔网状水凝胶聚合物体系，模板分子则是构象复杂的生物分子，制备成的分子印迹水凝胶聚合物已经具有较好的识别效率。然而，此类模板分子在水凝胶体系中的印迹和识别行为不同于刚性基材上、印迹刚性小分子的经典规律，而是涉及凝胶基材-蛋白模板之间特殊的作用方式、凝胶基材的微观结构(孔隙度和凝胶网络交联度等)以及环境因素的改变等。研究由此产生的对印迹-识别过程的影响，对大分子印迹天然高分子水凝胶体系特有的印迹行为和控制途径的研究变得十分重要。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球。

本发明的第二个目的是提供一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球，用下述方法制成：

(1)按质量比为1～3∶100的比例，将海藻酸钠溶解于浓度为5～20μmol/L的缓冲体系pH为4.87的卵白蛋白水溶液中，得到海藻酸钠/卵白蛋白复合物溶液；

(2)按体积比为0.1～3∶40的比例，将质量浓度为1％～5％的羟乙基纤维素去离子水溶液与步骤(1)制备的溶液混合，静置脱泡18～22小时；

(3)加入液体石蜡和乳化剂混合液，所述液体石蜡的质量占步骤(2)制备的溶液质量的1％～5％，所述乳化剂与液体石蜡的质量比为20～200∶100，在300～500r/min速度下搅拌30～60分钟，得到外观均一的乳液；

(4)按体积比为1∶2～3的比例，将乳液在300～500r/min速度搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，所述分散剂的克数与所述有机油相的毫升数的比为1.5～4.5∶100，加入质量百分浓度为1％～10％的聚乙烯基吡咯烷酮水溶液，所述聚乙烯基吡咯烷酮水溶液的体积与所述乳液体积比为3.5～6.5∶20，加入质量百分浓度为2％～3％的pH为7.5～8.5的氯化钙水溶液交联成微球，所述氯化钙水溶液占所述有机油相的体积百分比浓度为25％～35％；用去离子水冲洗微球，将所述微球放在质量百分浓度为2％～15％的戊二醛水溶液中进一步交联；然后依次用体积百分浓度为30％、60％、90％的乙醇水溶液、无水乙醇和乙醚浸泡，直至浸出液不能检测出石蜡成分，脱除微球之中的水和石蜡，最后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液洗脱微球中的模板分子卵白蛋白，制得一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球。

所述乳化剂为质量比0.5～2∶1的司盘85和吐温80或司盘80和吐温80复配而成。

所述分散剂为质量比为0.3～3∶1的司盘80和司盘85或司盘80和吐温60复配而成。

所述有机油相为由体积比为0.5～4∶3的三氯甲烷和正己烷或二氯甲烷和正己烷或三氯甲烷和环己烷或二氯甲烷和甲苯组成。

所述戊二醛水溶液的质量百分浓度为5％～10％。

一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球的制备方法，包括如下步骤：

(1)按质量比为1～3∶100的比例，将海藻酸钠溶解于浓度为5～20μmol/L的缓冲体系pH为4.87的卵白蛋白水溶液中，得到海藻酸钠/卵白蛋白复合物溶液；

(2)按体积比为0.1～3∶40的比例，将质量浓度为1％～5％的羟乙基纤维素去离子水溶液与步骤(1)制备的溶液混合，静置脱泡18～22小时；

(3)加入液体石蜡和乳化剂混合液，所述液体石蜡的质量占步骤(2)制备的溶液质量的1％～5％，所述乳化剂与液体石蜡的质量比为20～200∶100，在300～500r/min速度下搅拌30～60分钟，得到外观均一的乳液；

(4)按体积比为1∶2～3的比例，将乳液在300～500r/min速度搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，所述分散剂的克数与所述有机油相的毫升数的比为1.5～4.5∶100，加入质量百分浓度为1％～10％的聚乙烯基吡咯烷酮水溶液，所述聚乙烯基吡咯烷酮水溶液的体积与所述乳液体积比为3.5～6.5∶20，加入质量百分浓度为2％～3％的pH为7.5～8.5的氯化钙水溶液交联成微球，所述氯化钙水溶液占所述有机油相的体积百分比浓度为25％～35％；用去离子水冲洗微球，将所述微球放在质量百分浓度为2％～15％的戊二醛水溶液中进一步交联；然后依次用体积百分浓度为30％、60％、90％的乙醇水溶液、无水乙醇和乙醚浸泡，直至浸出液不能检测出石蜡成分，脱除微球之中的水和石蜡，最后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液洗脱微球中的模板分子卵白蛋白，制得一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球。

所述乳化剂为质量比0.5～2∶1的司盘85和吐温80或司盘80和吐温80复配而成。

所述分散剂为质量比为0.3～3∶1的司盘80和司盘85或司盘80和吐温60复配而成。

所述有机油相为由体积比为0.5～4∶3的三氯甲烷和正己烷或二氯甲烷和正己烷或三氯甲烷和环己烷或二氯甲烷和甲苯组成。

所述戊二醛水溶液的质量百分浓度为5％～10％。

本发明的一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球含有卵白蛋白(EA)大分子印迹，其孔径为1-10um。除了具有普通大分子印迹和乳液印迹凝胶聚合物微球的印迹效率，还可以随环境条件(如离子强度、温度和pH值等)或自身结构(如孔径大小和交联组分含量等)发生变化，并且在变化过程中具有重结合特异点，体现了双印迹水凝胶聚合物微球体系重结合规律的特殊性。

附图说明

图1为大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球；

图2为非印迹海藻酸盐聚合物微球；

图3为乳液、分子和大分子及乳液双印迹微球的印迹效率随离子强度改变的溶胀比变化曲线，其中●为乳液印迹效率曲线，■为分子印迹效率曲线，▲为大分子及乳液双印迹效率曲线；

图4为乳液、分子和大分子及乳液双印迹微球的印迹效率随温度改变的溶胀比变化曲线，其中■为乳液印迹效率曲线，●为分子印迹效率曲线，▲为大分子及乳液双印迹效率曲线；

图5为非印迹海藻酸盐聚合物微球；

图6为大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球，乳液孔径d＝4.96±0.33μm；

图7为大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球，乳液孔径d＝6.15±1.53μm；

图8为不同乳液孔径的大分子及乳液双印迹效率随微球溶胀比变化规律，其中■为孔径d＝4.96±0.33μm的微球，●为d＝3.21±0.56μm的微球，▲为d＝2.17±0.12μm的微球。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球的制备：

(1)配制酸性缓冲溶液(pH＝4.87)，将模板蛋白质分子卵白蛋白(EA)溶解于250ml的缓冲液中，配制浓度为20μmol/l的溶液；将海藻酸钠溶于EA缓冲溶液中，常温下充分混合溶解，使其浓度达到3％(w/w％)，得到海藻酸钠/卵白蛋白复合物溶液；

(2)按体积比为1∶40的比例，将质量浓度为3％的羟乙基纤维素去离子水溶液与步骤(1)制备的溶液混合，静置脱泡20小时；

(3)在20ml以上配制的溶液中加入液体石蜡0.5g，司盘80 0.1g和吐温80 0.2g，通过磁力搅拌(转速约为470转/分钟)一小时，得到的均一、稳定的乳液；

(4)将20ml乳液在持续磁力搅拌(转速约为300转/分钟)中分散在三氯甲烷16ml、正己烷24ml、司盘80 0.8g、司盘85 0.8g配成的溶液中，约30分钟，待悬浮液滴粒径稳定、均一之后，将助表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的10％水溶液5ml缓慢滴入分散体系，再将质量百分浓度为2％氯化钙(pH＝8.5)的水溶液10ml缓慢滴入，持续搅拌约20分钟，取出微球，用去离子水冲洗微球，将微球放在质量百分浓度为10％的戊二醛水溶液中进一步交联；用去离子水将微球表面黏附的有机溶剂和石蜡液滴等初步冲洗干净，依次用体积百分浓度为30％、60％和90％的乙醇水溶液和无水乙醇进行梯度洗脱，逐步置换出凝胶微球中的水，后将样品转移到无水乙醚溶液中浸泡48h，即可脱除大部分液体石蜡的乳液模板；将完成乳液模板脱除的微球转移到150ml pH＝7.5、浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中(Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，1mol/L Tris-NaCl buffer配法的比例如下：121.1g Tris+70.2g NaCl+800ml水；pH＝7.5是加入70ml的HCl)以脱除蛋白分子模板，每隔一定时间将样品稍作震动以确保交换完全，约经过48h后，对缓冲液进行紫外-可见光度检测(U-1800，HITACHI)不能检测出萃取液中的EA分子时，可以认为分子模板已洗脱完全，制得一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球。

对比例1

乳液印迹微球的制备：

1)将海藻酸钠溶于去离子水中，常温下充分混合溶解，使其浓度达到3％(w/v％)；

2)在20ml以上配制的溶液中加入液体石蜡0.5g，乳化剂span80 0.1g和tw60 0.2g，通过磁力搅拌(转速约为470转/分钟)一小时，得到的均一、稳定的乳液；

4)将20ml乳液在持续磁力搅拌(转速约为300转/分钟)中分散在含有三氯甲烷16ml、正己烷24ml、span80 0.8g、span85 0.8g的油相溶液中，约30分钟，待悬浮液滴粒径稳定、均一之后，将助表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的10％水溶液5ml缓慢滴入分散体系，再将2％CaCl2(pH＝8.5)30ml水溶液缓慢滴入，持续搅拌约20分钟，取出微球

5)乳液模板的洗脱：用去离子水将微球表面黏附的有机溶剂和石蜡液滴等初步冲洗干净，依次用浓度为30％、70％和100％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，逐步置换出凝胶微球中的水，后将样品转移到无水乙醚溶液中浸泡48h，即可脱除大部分液体石蜡的乳液模板；

6)将乳液印迹微球放在Tris-HCl缓冲液中进行相同处理。

对比例2

分子印迹微球的制备

1)配制酸性缓冲溶液，pH＝4.87，将模板蛋白质分子EA溶解于250ml的缓冲液中，配制浓度为20μmol/l的溶液；将海藻酸钠溶于EA缓冲溶液中，常温下充分混合溶解，使其浓度达到3％(w/v％)。

2)将20ml海藻酸钠-EA水溶液在持续磁力搅拌(转速约为300转/分钟)中分散在含有三氯甲烷16ml、正己烷24ml、span80 0.8g、span85 0.8g的油相溶液中，约30分钟，待悬浮液滴粒径稳定、均一之后，将助表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的10％水溶液5ml缓慢滴入分散体系，再将2％CaCl2(pH＝8.5)30ml水溶液缓慢滴入，持续搅拌约20分钟，取出微球；

3)将分子印迹微球放在乙醇及乙醚溶液中进行相同处理；

4)分子模板的洗脱：将微球转移到150ml pH＝7.5、浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中以脱除蛋白分子模板，每隔一定时间将样品稍作震动以确保交换完全，约经过48h后，对缓冲液进行紫外-可见光度检测(U-1800，HITACHI)不能检测出萃取液中的EA分子时，可以认为分子模板已洗脱完全

对比例3

非印迹微球的制备

1)将海藻酸钠溶于去离子水中，常温下充分混合溶解，使其浓度达到3％(w/v％)；

2)将20ml溶液在持续磁力搅拌(转速约为300转/分钟)中分散在含有三氯甲烷16ml、正己烷24ml、span80 0.8g、span85 0.8g的油相溶液中，约30分钟，待悬浮液滴粒径稳定、均一之后，将助表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的10％水溶液5ml缓慢滴入分散体系，再将2％CaCl2(pH＝8.5)30ml水溶液缓慢滴入，持续搅拌约20分钟，取出微球；

3)使用乙醇及乙醚溶液对微球进行相同处理；

4)使用Tris-HCl缓冲液对微球进行相同处理。

将实施例1中制备的大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球放在连有数码相机的光学显微镜下(型号Axiovert 25C Microscope.厂家：Carl Zeiss Co.Ltd.Germany)拍摄得到附图1，将对比例3制备的非印迹微球拍摄得到附图2及图5。

将实施例1制备的大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球称取相同质量，置于Na⁺离子强度为0-0.5mol/kg(约为5.9％w/v)和Ca⁺⁺离子强度为0-0.5mol/kg(约为2.8％w/v)的若干组EA蛋白质溶液中，利用HCl调节溶液pH＝4.7。待吸附平衡时测定溶液浓度(紫外可见分光光度计，U-1800，HITACHI)并计算出微球印迹效率，绘制大分子及乳液双印迹、分子印迹以及乳液印迹效率随溶胀度变化曲线如图3所示。

将实施例1制备的大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球称取相同质量，置于20μm/L的EA水溶液中，调节pH值为4.7；使用恒温振荡培养箱(HZQ-F，哈尔滨东联电子技术开发有限公司)于不同温度下恒温，待吸附平衡后，测定吸附液中EA浓度变化并计算出吸附量Q和印迹效率E。依次测得不同温度下微球的印迹效率，绘制大分子及乳液双印迹、分子印迹以及乳液印迹效率随溶胀度变化曲线如图4所示。

将实施例1中制备的不同海藻酸钙/HEC比例的大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球放在pH值在3～11范围变化的EA蛋白溶液中，并且考虑不同阳离子对凝胶性质的影响。采用两种方案配制不同pH值的吸附液：

(a)利用氯化钠-氢氧化钠(NaCl-NaOH)配制碱性溶液，盐酸-氯化钠(HCl-NaCl)配制酸性溶液，溶液所含离子为Na⁺，H⁺和OH^-；

(b)利用氯化钙-氢氧化钙(CaCl₂-Ca(OH)₂)配制碱性溶液，盐酸-氯化钙(HCl-CaCl₂)配制酸性溶液，溶液所含离子为Ca²⁺，H⁺和OH^-；

两种方案中的Ca²⁺和Na⁺的离子强度在各个pH范围内保持恒定，即I(Na⁺)＝0.1mol/kg，I(Ca²⁺)＝0.05mol/kg。

将实施例1中制备的不同孔径的大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球置于含有不同浓度NaCl和CaCl₂的20μmol/lEA蛋白溶液中(pH＝4.7)，利用Na⁺和Ca²⁺离子强度控制微球的平衡溶胀比达到不同数值；以紫外分光光度计测定不同溶胀比下，不同孔径的大分子及乳液双印迹微球的印迹效率随溶胀度变化规律，如图8所示。

新的体系除了具有普通大分子印迹和乳液印迹凝胶聚合物微球的印迹效率，还可以随环境条件(如离子强度、温度和pH值等)或自身结构(如孔径大小和交联组分含量等)发生变化，并且在变化过程中具有重结合特异点，体现了双印迹水凝胶聚合物微球体系重结合规律的特殊性。

本发明提供了一种由大分子及乳液双印迹法制取的海藻酸盐聚合物微球，含有EA蛋白质大分子印迹，其孔径为1-10um。

不同离子强度的环境中的重结合实验表明，大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球在EA蛋白质溶液中，随溶胀度变化的的重结合过程不同于单纯大分子印迹或乳液印迹微球，两种印迹的特征吸收峰共同体现在同一体系中，如图3所示。

不同温度下的重结合实验表明，双印迹微球体系既具有因乳液多孔效应而产生的非特异性重结合行为，也具有因分子印迹而产生的特异性重结合行为。这是双印迹水凝胶微球体系特殊的现象。如图4所示。

实施例2

一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球，用下述方法制成：

(1)按质量比为1∶100的比例，将海藻酸钠溶解于浓度为20μmol/L的缓冲体系pH为4.87的卵白蛋白水溶液中，得到海藻酸钠/卵白蛋白复合物溶液；

(2)按体积比为0.1∶40的比例，将质量浓度为5％的羟乙基纤维素去离子水溶液与步骤(1)制备的溶液混合，静置脱泡18小时；

(3)加入液体石蜡和乳化剂混合液，所述液体石蜡的质量占步骤(2)制备的溶液质量的1％，所述乳化剂与液体石蜡的质量比为200∶100，在300r/min速度下搅拌60分钟，得到外观均一的乳液，所述乳化剂为质量比0.5∶1的司盘85和吐温80复配而成；

(4)按体积比为1∶3的比例，将乳液在300r/min速度搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，所述分散剂的克数与所述有机油相的毫升数的比为1.5∶100，所述分散剂为质量比为2∶1的司盘80和司盘85复配而成，所述有机油相为由体积比为2∶3的三氯甲烷和正己烷组成，加入质量百分浓度为5％的聚乙烯基吡咯烷酮水溶液，所述聚乙烯基吡咯烷酮水溶液的体积与所述乳液体积比为5∶20，加入质量百分浓度为2％的pH为8.5的氯化钙水溶液交联成微球，所述氯化钙水溶液占所述有机油相的体积百分比浓度为35％；用去离子水冲洗微球，将所述微球放在质量百分浓度为15％的戊二醛水溶液中进一步交联；得到如图6所示的微球，然后依次用体积百分浓度为30％、60％、90％的乙醇水溶液、无水乙醇和乙醚浸泡，直至浸出液不能检测出石蜡成分，脱除微球之中的水和石蜡，最后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液洗脱微球中的模板分子卵白蛋白，制得一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球。

实施例3

一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球，用下述方法制成：

(1)按质量比为3∶100的比例，将海藻酸钠溶解于浓度为5μmol/l的缓冲体系pH为4.87的卵白蛋白水溶液中，得到海藻酸钠/卵白蛋白复合物溶液；

(2)按体积比为3∶40的比例，将质量浓度为1％的羟乙基纤维素去离子水溶液与步骤(1)制备的溶液混合，静置脱泡20小时；

(3)加入液体石蜡和乳化剂混合液，所述液体石蜡的质量占步骤(2)制备的溶液质量的5％，所述乳化剂与液体石蜡的质量比为20∶100，在500r/min速度下搅拌30分钟，得到外观均一的乳液，所述乳化剂为质量比为2∶1的司盘85和吐温80复配而成；

(4)按体积比为1∶2的比例，将乳液在500r/min速度搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，所述分散剂的克数与所述有机油相的毫升数的比为4.5∶100，所述分散剂为质量比为0.3∶1的司盘80和司盘85复配而成，所述有机油相为由体积比为0.5∶3的二氯甲烷和正己烷组成，加入质量百分浓度为1％的聚乙烯基吡咯烷酮水溶液，所述聚乙烯基吡咯烷酮水溶液的体积与所述乳液体积比为6.5∶20，加入质量百分浓度为3％的pH为7.5的氯化钙水溶液交联成微球，所述氯化钙水溶液占所述有机油相的体积百分比浓度为25％；用去离子水冲洗微球，将所述微球放在质量百分浓度为2％的戊二醛水溶液中进一步交联；然后依次用体积百分浓度为30％、60％、90％的乙醇水溶液、无水乙醇和乙醚浸泡，直至浸出液不能检测出石蜡成分，脱除微球之中的水和石蜡，最后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液洗脱微球中的模板分子卵白蛋白，制得一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球。

实施例4

一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球，用下述方法制成：

(1)按质量比为2∶100的比例，将海藻酸钠溶解于浓度为10μmol/L的缓冲体系pH为4.87的卵白蛋白水溶液中，得到海藻酸钠/卵白蛋白复合物溶液；

(2)按体积比为2∶40的比例，将质量浓度为2％的羟乙基纤维素去离子水溶液与步骤(1)制备的溶液混合，静置脱泡22小时；

(3)加入液体石蜡和乳化剂混合液，所述液体石蜡的质量占步骤(2)制备的溶液质量的3％，所述乳化剂与液体石蜡的质量比为100∶100，在450r/min速度下搅拌50分钟，得到外观均一的乳液，所述乳化剂为质量比为1∶1的司盘80和吐温80复配而成；

(4)按体积比为1∶2.5的比例，将乳液在400r/min速度搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，所述分散剂的克数与所述有机油相的毫升数的比为4.5∶100，所述分散剂为质量比为3∶1的司盘80和司盘85复配而成，所述有机油相为由体积比为4∶3的三氯甲烷和环己烷组成，加入质量百分浓度为10％的聚乙烯基吡咯烷酮水溶液，所述聚乙烯基吡咯烷酮水溶液的体积与所述乳液体积比为3.5∶20，加入质量百分浓度为2％的pH为7.5的氯化钙水溶液交联成微球，所述氯化钙水溶液占所述有机油相的体积百分比浓度为30％；用去离子水冲洗微球，将所述微球放在质量百分浓度为5％的戊二醛水溶液中进一步交联；然后依次用体积百分浓度为30％、60％、90％的乙醇水溶液、无水乙醇和乙醚浸泡，直至浸出液不能检测出石蜡成分，脱除微球之中的水和石蜡，最后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液洗脱微球中的模板分子卵白蛋白，制得一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球。

实施例5

一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球，用下述方法制成：

(1)按质量比为2∶100的比例，将海藻酸钠溶解于浓度为10μmol/L的缓冲体系pH为4.87的卵白蛋白水溶液中，得到海藻酸钠/卵白蛋白复合物溶液；

(2)按体积比为2∶40的比例，将质量浓度为2％的羟乙基纤维素去离子水溶液与步骤(1)制备的溶液混合，静置脱泡22小时；

(3)加入液体石蜡和乳化剂混合液，所述液体石蜡的质量占步骤(2)制备的溶液质量的3％，所述乳化剂与液体石蜡的质量比为50∶100，在300r/min速度下搅拌60分钟，得到外观均一的乳液，所述乳化剂为质量比为1∶1的司盘85和吐温80复配而成；

(4)按体积比为1∶2.5的比例，将乳液在450r/min速度搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，所述分散剂的克数与所述有机油相的毫升数的比为3∶100，所述分散剂为质量比为2∶1的司盘80和吐温60复配而成，所述有机油相为由体积比为4∶3的二氯甲烷和甲苯组成，加入质量百分浓度为8％的聚乙烯基吡咯烷酮水溶液，所述聚乙烯基吡咯烷酮水溶液的体积与所述乳液体积比为4∶20，加入质量百分浓度为3％的pH为8的氯化钙水溶液交联成微球，所述氯化钙水溶液占所述有机油相的体积百分比浓度为30％；用去离子水冲洗微球，将所述微球放在质量百分浓度为8％的戊二醛水溶液中进一步交联；然后依次用体积百分浓度为30％、60％、90％的乙醇水溶液、无水乙醇和乙醚浸泡，直至浸出液不能检测出石蜡成分，脱除微球之中的水和石蜡，最后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液洗脱微球中的模板分子卵白蛋白，制得一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球。

实施例6

一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球，用下述方法制成：

(1)按质量比为3∶100的比例，将海藻酸钠溶解于浓度为5μmol/L的缓冲体系pH为4.87的卵白蛋白水溶液中，得到海藻酸钠/卵白蛋白复合物溶液；

(2)按体积比为3∶40的比例，将质量浓度为1％的羟乙基纤维素去离子水溶液与步骤(1)制备的溶液混合，静置脱泡20小时；

(3)加入液体石蜡和乳化剂混合液，所述液体石蜡的质量占步骤(2)制备的溶液质量的5％，所述乳化剂与液体石蜡的质量比为80∶100，在500r/min速度下搅拌30分钟，得到外观均一的乳液；所述乳化剂为质量比为2∶1的司盘80和吐温80复配而成；

(4)按体积比为1∶2.5的比例，将乳液在400r/min速度搅拌下分散在含有分散剂的有机油相中，所述分散剂的克数与所述有机油相的毫升数的比为2.5∶100，所述分散剂为质量比为3∶1的司盘80和吐温60复配而成，所述有机油相为由体积比为2.5∶3的三氯甲烷和正己烷组成，加入质量百分浓度为5％的聚乙烯基吡咯烷酮水溶液，所述聚乙烯基吡咯烷酮水溶液的体积与所述乳液体积比为5∶20，加入质量百分浓度为2％的pH为8.5的氯化钙水溶液交联成微球，所述氯化钙水溶液占所述有机油相的体积百分比浓度为32％；用去离子水冲洗微球，将所述微球放在质量百分浓度为8％的戊二醛水溶液中进一步交联；得到如图7所示微球，然后依次用体积百分浓度为30％、60％、90％的乙醇水溶液、无水乙醇和乙醚浸泡，直至浸出液不能检测出石蜡成分，脱除微球之中的水和石蜡，最后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液洗脱微球中的模板分子卵白蛋白，制得一种大分子及乳液双印迹海藻酸盐聚合物微球。

本发明采用如表1所示配方制备不同HEC含量的双印迹海藻酸盐聚合物微球。

                 表1.不同配比的SA/HEC混合溶液

       Tab.1 different batch formula of SA/HEC solution

  样品号 HEC溶液体积(ml)  SA体积(ml)  HEC占SA质量比(w/w％)  HEC0  HEC1  HEC2  HEC3  HEC5 0 0.3 0.6 0.9 1.5  20  20  20  20  20  0％  1％  2％  3％  5％

HEC：羟乙基纤维素；SA：海藻酸钠；w：质量

本发明采用如表2所示的配方制备不同孔径的双印迹海藻酸盐聚合物微球。当乳液成分变化时，微球的外观也将产生显著的差异，如图5至图7所示。同时在不同离子环境下，不同孔径的双印迹微球的印迹效率随溶胀度的变化规律也有不同，如图8所示。

                       表2.不同粒径的乳液配制方法

     Tab.2 the batch formula for preparing emulsions of varies diameter

  样品编号  SA溶胶体积(ml) 液体石蜡质量(g)  表面活性剂组成  1  2  3  4  5  6  20  20  20  20  20  20 0.5 1.0 1.2 1.5 2.0 3.0  0.05  Span85+0.1g Tw60  0.05g Span85+0.2g Tw60  0.1g  Span85+0.2g Tw60  0.15g Span85+0.2g Tw60  0.15g Span85+0.4g Tw60  0.2g  Span85+0.4g Tw60

SA：海藻酸钠；Span85：司盘85；Tw60：吐温60