调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物在精子染色或分选方法中的用途

摘要

本发明公开了染色混合物，包括活精子、调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物，以及DNA选择性染料。此类悬浮物中所含的细胞更能耐受多个与分选精子细胞为性别富集细胞群通常相关的步骤，从而使得分选后组合物中活精子或可运动精子的数目增加。本发明也公开了对精子细胞染色的方法，其包括形成染料混合物。

说明书

发明领域

本发明一般地涉及分选染色精子细胞的方法。更具体而言，本发明涉及分选精子细胞的方法，其中形成含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物的精子细胞悬浮液。

发明背景

通过人工授精(AI)使动物受精以及体外受精后的胚胎移植已经是一项成熟的技术。在家畜产业中，能够对繁殖结果施加影响而使其后代具有一种或多种期望特征，有明显的优势。例如，乳制品产业中如能预先选择后代有利于雌性而保证奶牛的产量，则会带来经济效益。将精子分离为富集的带有X和Y染色体的细胞群，即所谓的性别富集精液或性别富集精子，便是达到后代预选目的的方法之一。

为得到性别富集精液，必须将精子细胞以染料染色，然后分选为带有X和Y染色体的细胞。染色和分选过程的每一步对于精子细胞而言都是应激，会导致精子细胞的存活力或运动性，特别是前向性运动性降低。对精子细胞尤其具有压力的是对之染色的过程，该过程中需要将细胞与染料接触一定时间，而且通常是在典型精子细胞环境所不常有的温度和pH条件下。

发明概述

本发明的多方面之一涉及精子悬浮液，所述精子悬浮液可用于如将精子分选为带X或Y染色体的富集精子群的方法。

因此，简言之，本发明涉及这样的染色混合物，其含有活精子、调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物、以及DNA选择性染料，所述染色混合物中组合物若为丙酮酸盐，则其浓度大于50μM。

本发明还涉及染色精子细胞的方法，所述方法包括形成这样的染色混合物，其含有完整活精子细胞、调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物、以及DNA选择性染料，所述染色混合物中组合物若为丙酮酸盐，则其浓度大于50μM。

附图简述

图1以图表显示了实施例1中进行研究的结果，其中测量了于41℃TCA缓冲液或含有10mM丙酮酸盐的TCA缓冲液中，用400μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图2以图表显示了实施例2中进行研究的结果，其中测量了于41℃TCA缓冲液或含有10μM维生素K的TCA缓冲液中，用400μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图3以图表显示了实施例3中进行研究的结果，其中测量了于41℃TCA缓冲液或含有100μM维生素K的TCA缓冲液中，用400μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图4以图表显示了实施例4中进行研究的结果，其中测量了于41℃TCA缓冲液或含有1mM硫辛酸的TCA缓冲液中，用400μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图5以图表显示了实施例5中进行研究的结果，其中测量了于28℃TCA缓冲液或含有10mM丙酮酸盐的TCA缓冲液中，用600μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图6以图表显示了实施例6中进行研究的结果，其中测量了于28℃TCA缓冲液或含有100μM维生素K的TCA缓冲液中，用600μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图7以图表显示了实施例7中进行研究的结果，其中测量了于28℃TCA缓冲液或含有1mM硫辛酸的TCA缓冲液中，用600μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图8以图表显示了实施例8中进行研究的结果，其中测量了于28℃TCA缓冲液、含有2.5mM丙酮酸盐的TCA缓冲液、含有10mM丙酮酸盐的TCA缓冲液、含有25mM丙酮酸盐的TCA缓冲液以及含有50mM丙酮酸盐的TCA缓冲液中，用600μM Hoechst 33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图9以图表显示了实施例9中进行研究的结果，其中测量了于28℃TCA缓冲液或含有10mM丙酮酸盐的TCA缓冲液中，用20μM SYBR-14染料染色的精子的前向性运动百分比。

图10以图表显示了实施例10中进行研究的结果，其中测量了于28℃TCA缓冲液或含有10mM丙酮酸盐的TCA缓冲液中，用100μM BBC染料染色的精子的前向性运动百分比。

图11以图表显示了实施例11中进行研究的结果，其中测量了于28℃TCA缓冲液或含有10mM丙酮酸盐的TCA缓冲液中，用200μM BBC染料染色的精子的前向性运动百分比。

图12以图表显示了实施例12中进行研究的结果，其中测量了于28℃含有10mM丙酮酸盐的TCA或含有10mM丙酮酸盐的二氧化碳气层包裹的TCA中，用600μM Hoechst 33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图13以图表显示了实施例12中进行研究的结果，其中测量了于28℃含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH 7.3基于碳酸盐的抑制性缓冲液中，用600μM Hoechst 33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图14以图表显示了实施例12中进行研究的结果，其中测量了于28℃含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH 6.2基于碳酸盐的抑制剂缓冲液中，用600μM Hoechst 33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图15以图表显示了实施例13中进行研究的结果，其中测量了于28℃含有10mM丙酮酸盐的TCA且随后用含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH 6.2基于碳酸盐的抑制剂1比3稀释的情况下，用1000μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图16以图表显示了实施例13中进行研究的结果，其中测量了于28℃(1)含有10mM丙酮酸盐的TCA且用相同溶液1比3稀释的情况下或(2)pH 7.3基于碳酸盐的缓冲液且用pH 6.2基于碳酸盐的抑制剂1比3稀释的情况下，用1000μM Hoechst 33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图17以图表显示了实施例13中进行研究的结果，其中测量了于28℃含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH 6.2基于碳酸盐的抑制剂中，用1000μM Hoechst 33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图18以图表显示了实施例14中进行研究的结果，其中测量了于41℃含有10mM丙酮酸盐的TCA且随后用含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH 6.2基于碳酸盐的抑制剂1比3稀释的情况下，用300μM Hoechst 33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图19以图表显示了实施例14中进行研究的结果，其中测量了于41℃(1)含有10mM丙酮酸盐的TCA且用相同溶液1比3稀释的情况下或(2)pH 7.3基于碳酸盐的缓冲液且用pH 6.2基于碳酸盐的抑制剂1比3稀释的情况下，用300μM Hoechst 33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

图20以图表显示了实施例14中进行研究的结果，其中测量了于41℃含有10mM丙酮酸盐的TCA或pH 6.2基于碳酸盐的抑制剂中，用300μMHoechst 33342染料染色的精子的前向性运动百分比。

发明详述

令人惊讶的是，与调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物接触的精子往往更能耐受多个与分选精子细胞为带有X或Y染色体的精子富集群通常相关的步骤。因此在优选实施方案中，可以制备性别富集精子群用于人工授精，所述精子群在染色后或分选后的组合物中，活细胞或可运动精子(特别是前向性运动精子)的数目增多。

一般而言，调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物中含有可以将电子从一种底物传递到另一种底物的组分。此类组合物可包含获取或提取电子的组分(氧化剂或电子受体)，或提供电子的组分(还原剂或电子供体)。对于生物系统而言，将调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物视为可以对化合物添加或移去氧或氢的组合物更易理解。

因此，一般而言，此类组合物可含有如丙酮酸盐、维生素K、硫辛酸、谷胱甘肽、黄素、醌类、超氧化物歧化酶(SOD)以及SOD模拟物。精子悬浮液中可含有此类组合物，其浓度足以实现保护性作用而不会对精子健康产生有害作用。根据诸如所用的具体组合物或悬浮液中的精子浓度等因素，例示性的浓度范围包括从约10μM至约50mM。例如，若组合物中含有丙酮酸盐，则其在精子悬浮液中的浓度为约0.5μM至约50mM，优选为约1mM至约40mM，更优选为约2.5mM至约25mM，还更优选为约10mM至约20mM，甚至还更优选为约15mM，最优选为约10mM。若组合物中含有维生素K，则其在精子悬浮液中的浓度为约1μM至约100μM，优选为约10μM至约100μM，更优选为约50μM至约100μM，最优选为约100μM。若组合物中含有硫辛酸，则其在精子悬浮液中的浓度为约0.1mM至约1mM，优选为约0.5mM至约1mM，更优选为约0.5mM，最优选为约1mM。精子悬浮液中可含有任一种上述所列的组合物实施方案，或上述所列浓度的任意组合。例如，精子悬浮液中可含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物，所述组合物中包含浓度为约10mM的丙酮酸盐以及浓度为约100μM的维生素K。或者，精子悬浮液中还可含有包含浓度为约10mM的丙酮酸盐及浓度为约1mM的硫辛酸的组合物。又一精子悬浮液的实例中含有包含浓度为约10mM的丙酮酸盐、浓度为约100μM的维生素K以及浓度为约1mM的硫辛酸的组合物。

一般而言，调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物可以提供保护性作用，例如在含有该组合物的精子悬浮液中增加活细胞的数目或增加可运动细胞的数目，特别是增加前向性运动细胞的数目。此类组合物对精子细胞分选方法中形成的任何悬浮液都具有保护性作用的同时，在染色步骤中其益处具有特别的价值，其中此类组合物可有助于在染色温度升高、染料浓度增加、染色时间增长或其任意组合的情况下保持精子存活力。

一般而言，细胞分选方法包括一系列分离步骤，即细胞样本的收集、细胞染色、细胞分选、分选细胞的收集、任选地和分选细胞的冷冻伸展(cryoextension)。形成的精子悬浮液中最好含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物，或在一个或多个这些步骤中采用所述组合物。

细胞样品的收集

可以收集牛、猪、马或其它哺乳动物完整的活精子细胞并将之与运动抑制剂接触。已知多种收集活精子的方法，例如，包括如手握法、使用人工阴道以及电刺激射精。例如，可以将一般每毫升含有5亿至100亿精子细胞的牛精子样品，直接由来源哺乳动物收集于含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物的容器中，以形成精子悬浮液。或者，也可以将精子样品收集于空容器中，随后在收集的数小时内将之与此类组合物接触以形成精子悬浮液。

精子样品也可混合于缓冲物(以固体或溶液形式)中，以形成缓冲精子悬浮液。其中缓冲物通过缓冲pH或渗透压的显著变化，可以增强精子存活力。一般而言，缓冲物对细胞无毒，且与用于细胞染色的染料相容。例示性的缓冲物包括如磷酸盐、二磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、乳酸盐以及它们的组合。目前优选的缓冲物包括TCA、TEST、柠檬酸钠、HEPES、TL、TES、柠檬酸一水合物、HEPEST(Gradipore，St.Louis，MO)、PBS(Johnson等人，Gamete Research，17：203-212(1987))、以及Dulbecco’s PBS(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。

可以混合一种或多种缓冲物或者与下文讨论的添加剂一同组成缓冲溶液，并将缓冲溶液与精子样品一同混合成缓冲精子悬浮液。缓冲液中也可含有如下文更详细论及的一种或多种添加剂，或调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。缓冲溶液的实例见表I。优选的缓冲溶液包括含有3％TRIS碱、2％柠檬酸一水合物，以及1％果糖(w/v)的pH为约7.0的水溶液；表I中命名为TCA#1的溶液；以及表I中命名为TCA#2的溶液。

表I.缓冲溶液

  成分  TCA#1  TCA#2  TEST  柠檬酸钠  HEPES  TL  氯化钠(NaCl)  7.6g  5.84g  氯化钾(KCl)  0.3g  0.23g  碳酸氢钠  (NaHCO₃)  2.1g  磷酸二氢钠  (NaH₂PO₄·H₂O)  0.04g  (+)-2-羟基丙酸  (乳酸钠)  3.68ml  氯化镁(MgCl₂)  0.1g  0.08g  N-(2-羟乙基)哌嗪  -N’-(2-乙磺酸)  (HEPES)  2.38g  2.38g  三(羟甲基)氨基甲  烷  (TRIS碱)  30.3g  32.02g  10.28g  柠檬酸一水合物  15.75g  18.68g  柠檬酸钠二水合物  29g  2-[(2-羟基-1，1-二羟  甲基乙基)氨基乙磺  酸(TES)  43.25g  果糖  12.5g  2.67g  10g  2.52g  D-葡萄糖  2g  链霉素  0.25g

  青霉素-G  0.15g  水  1升  1升  1升  1升  1升  1升  目标pH  7.35  7.35  7.35  7.35  7.35  7.35  目标渗透压  (毫摩尔渗透压/千克  水)  ～314  ～300  ～302  ～316  ～298  ～296

所用缓冲物的量一般取决于几点考虑，例如具体的缓冲物和缓冲精子悬浮液中且的精子浓度(精子数/ml)。因此，将使用足量缓冲物从而达到期望浓度的精子数/ml。可以加入缓冲物以实现精子悬浮液中含有约1×10³精子/ml至约5×10¹⁰精子/ml。例如，在一个实施方案中，可加入缓冲物以获得“相对低”浓度精子的精子悬浮液，即加入缓冲物以实现精子悬浮液中含有少于约1×10⁷精子/ml，优选少于约1×10⁶精子/ml，更优选约1×10³精子/ml至约5×10⁶精子/ml，还更优选约1×10³精子/ml至约1×10⁶精子/ml，甚至更优选1×10⁴精子/ml至约1×10⁵精子/ml，最优选约1×10⁵精子/ml。在可选的实施方案中，可加入缓冲物以获得“中间”浓度精子的精子悬浮液，即加入缓冲物以实现精子悬浮液中含有约1×10⁷至约1×10⁸精子/ml。又在另一实施方案中，可加入缓冲物以获得“相对高”浓度精子的精子悬浮液，即加入缓冲物以实现精于悬浮液中含有多于约1×10⁸精子/ml，优选约1×10⁸精子/ml至约5×10¹⁰精子/ml，更优选约1.5×10⁸精子/ml至约2×10¹⁰精子/ml，甚至更优选1.5×10⁸精子/ml至约2×10⁸精子/ml，还更加优选约1.5×10⁸精子/ml。

确定所用缓冲物量(即该缓冲精子悬浮液是否将具有“相对低”、“中间”或“相对高”浓度的精子)的另一点考虑，包括随后分选或富集精子细胞所用的方法。例如，可以利用如下文更为详述的流式细胞术分选精子细胞。在这种情况下，缓冲精子悬浮液一般为“中间”或“相对高”浓度的精子/ml。其它分选或富集技术可能在精子细胞浓度较低时更利于使用，例如标有标记(如此处所述的染料和标记)的“相对低”浓度的精子细胞。

可选地，也可以将精子与抑制性缓冲物混合，以形成受抑的精子悬浮液。抑制性缓冲物通过模拟哺乳动物附睾或附睾管内的液体环境，使精子细胞仿效哺乳动物(如公牛)附睾中的精子细胞。此类缓冲液会降低或抑制精子的运动或代谢活性。例示性的该类缓冲物包括基于碳酸盐的缓冲物，如Salisbury & Graves，J.Reprod.Fertil.，6：351-359(1963)中公开的那些。此类中的优选缓冲物为每25ml纯水中含有0.204g NaHCO₃、0.433g KHCO₃和0.473g C₆H₈O₇·H₂O(NaHCO₃0.097mol/L、KHCO₃0.173mol/L、C₆H₈O₇·H₂O 0.090mol/L的水溶液)。此外，受抑精子悬浮液中还可含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。

除了缓冲物之外，精子悬浮液中也可含有一系列添加剂以增强精子存活力或运动性，或提供其它益处。例示性的添加剂包括能源、蛋白质源以及抗生素。可以在缓冲精子悬浮液形成前，向缓冲物或缓冲溶液中加入一种或多种此类添加剂；或者也可分别将其加入精子悬浮液中。

可以加入一种或多种能源，以最大程度降低或抑制精子细胞中胞内磷脂及其它细胞组分的氧化。能源的实例包括单糖(如果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖)和双糖(如蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖)，以及其它多糖。例如，产生的精子悬浮液中可含有约1％(w/v)至约4％(w/v)的能源。若含有能源，则能源优选果糖，且精子悬浮液中含有量约2.5％(w/v)。

缓冲物、缓冲溶液、精子悬浮液或缓冲精子悬浮液中也可含有蛋白质源，以最大程度减小稀释震荡、为细胞提供支持或在整个悬浮液中分散细胞。例示性的蛋白质源包括卵黄、卵黄提取物、乳(包括热匀浆和脱脂乳乳)、乳提取物、大豆蛋白、大豆蛋白提取物、血清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清替代物增补剂以及它们的组合。白蛋白特别是牛血清白蛋白(BSA)，是优选的蛋白质源。例如，若含有BSA，则精子悬浮液中的BSA含量可少于约5.0％(w/v)，优选少于约2％(w/v)，更优选少于约1％(w/v)，而最优选其量为约0.1％(w/v)。

单独使用蛋白质源(如BSA)，可能会起始悬浮液中百分之一精子细胞的获能过程。该过程优选发生于雌性生殖道内。因此，为了抑制稀释过程以及随后的染色和分选期间获能的起始，精子悬浮液中可含有备选蛋白质源或蛋白质替代物。所述的备选蛋白质源或蛋白质替代物除了能够抑制精子悬浮液中更大百分比的细胞起始获能，还具有典型蛋白质源(如BSA)的优点。备选蛋白质源的实例包括人血清替代物增补剂(SSS)(IrvineScientific，Santa Ana，CA)以及胆固醇强化的BSA，而蛋白质替代物的实例包括聚乙烯醇，例如一般分子量为约30,000至约60,000的低至中粘度聚乙烯醇。一般而言，若含有这些组合物，其含量与上述BSA的量相同；缓冲物或缓冲溶液中总白蛋白含量一般不超过约5.0％(w/v)。

可以向精子悬浮液或缓冲精子悬浮液中加入抗生素，以抑制细菌的生长。例示性的抗生素包括如，泰乐菌素、庆大霉素、林可霉素、壮观霉素、利高霉素(林可霉素羟氯化物-壮观霉素)、青霉素、链霉素、替卡西林(ticarcillin)或其任意组合物。抗生素的浓度可为每ml精子中约50μg至约800μg(不论精子是否为纯净的、缓冲性的或含有其它物质，例如此处提及的任一种添加剂)。Certified Semen Services(CSS)和美国国家动物育种协会(NAAB)已经颁布了有关抗生素在精子收集和使用中应用的纲要。

细胞染色

调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物可用于细胞染色方法。一般而言，精子细胞染色方法中可包括形成染色混合物(有时称为标记混合物)，其中含有完整的活精子细胞、调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物，以及染料(有时称为标记)。在本发明的这一方面，可以将组合物与精子细胞接触以形成精子悬浮液，然后将精子悬浮液与DNA选择性染料相接触。在该实施方案中，精子来源可为纯精子，或者为通过离心或使用其它手段分离精子级分而得到的含有精子的精子衍生物。

一经获得，则可以以纯精子的形式、或者以由之获得的悬浮液形式(例如上文“细胞样品收集”中讨论的精子悬浮液或缓冲精子悬浮液)将精子细胞引入染色混合物中。

染料可以为纯固体或液体组合物的形式。也可将染料溶解或分散于非缓冲液体中以形成染料溶液。或者，染料还可以为染料悬浮液的形式，其中含有染料以及与精子细胞生物相容的缓冲物或缓冲溶液。上文“样品收集”中业已讨论了多种缓冲物和缓冲溶液的实例。例如，可用的缓冲物包括含有3％TRIS碱、2％柠檬酸一水合物和1％果糖(w/v)的pH为约7.0的水溶液；或者每25ml纯水中含有0.204g NaHCO₃、0.433g KHCO₃和0.473g C₆H₈O₇·H₂O(NaHCO₃ 0.097mol/L、KHCO₃ 0.173mol/L、C₆H₈O₇·H₂O0.090mol/L的水溶液)基于碳酸盐的缓冲溶液。因此，例如，可以通过将纯精子与染料和调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物混合，形成染色混合物。或者，也可以通过将纯精子与缓冲物或缓冲溶液、染料以及调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物混合，形成染色混合物。此外，还可将精子悬浮液与染料混合形成染色混合物。

如以前在美国专利号5,135,759和WO 02/41906中所述，可使用一种或多种可经UV或可见光激发的选择性DNA染料可以形成染色混合物。经紫外光(UV)激发的选择性染料实例包括Hoechst 33342和Hoechst33258，二者均可由Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)购得。经可见光激发的例示性染料包括可购于Molecμlar Probe，Inc.(Eugene，OR)的SYBR-14，以及WO02/41906中所描述的双苯甲亚胺缀合物6-{[3-((2Z)-2-{[1-(二氟硼烷基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2H-吡咯-5-基)丙酰基]氨基}-N-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，3’H-2，5’-双苯并咪唑-2’-基]苯氧基}乙酰基)氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺(“BBC”)。这些染料中的每一种都可以单独使用或者联合使用；或者，也可以将其它具有细胞渗透性的UV和可见光激发的染料单独或与前述染料联合使用，只要所述染料在可进行别处所述分选的浓度下不会对精子细胞的存活力产生不可接受的不良影响。

或者，还可利用荧光聚酰胺形成染色混合物，更具体而言是利用缀合有荧光标记或报告子的聚酰胺。此类标记在结合于核酸时会发出荧光。连接有荧光标记或报告子的聚酰胺实例包括，如Best等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100(21)：12063-12068(2003)；Gygi等人，Nucleic Acids Res.，30(13)：2790-2799(2002)；美国专利号5,998,140；美国专利号6,143,901以及美国专利号6,090,947中所公开的那些，其中每一篇内容均在此处引用作为参考。

荧光核苷酸序列也可用于标记精子细胞。此类核苷酸序列在与含有靶序列或互补序列的核酸杂交时会发出荧光，但在非杂交状态时则不会发出荧光。此类核苷酸公开见于如美国专利申请公开号2003/0113765(此处引用作为参考)。

性别特异性抗体也可用于标记染色混合物中的精子细胞。例如在该实施方案中，性别特异性抗体可缀合于荧光部分(或等价报告分子)。由于抗体结合的抗原只存在于带有X染色体或Y染色体的细胞上，根据其荧光(相对于无荧光的未标记细胞)能够选择性地鉴定此类细胞。此外，可以同时使用分别与不同荧光部分相连的一种以上的性别特异性抗体。从而能根据带有X染色体或Y染色体的细胞间的不同荧光，对之进行区分。

也可使用发光的色彩选择性纳米晶体标记染色混合物中的精子细胞。这些颗粒也称为量子点，正如美国专利号6,322,901和美国专利号6,576,291所述为本领域所公知(均在此处引用作为参考)。这些纳米晶体已被缀合于多种生物学材料，包括如肽、抗体、核酸、链霉亲和素及多糖(见如美国专利号6,207,3926,423,551、5,990,479和6,326,144，均在此处引用作为参考)，且已用于检测生物学靶标(见如美国专利号6,207,392和6,247,323，两者均在此处引用作为参考)。

染色混合物中DNA选择性染料的浓度优选为一系列变量的函数，所述变量包括细胞对于所选染料的渗透性、染色混合物的温度、完成染色所需要的时间量、以及随后的分选步骤中所期望的富集程度。一般而言，优选的染料浓度足以在适度短的时间内达到所期望的染色程度，而不会对精子存活力产生实质的不良影响。例如，Hoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14或BBC在染色混合物中的浓度一般在约0.1μM至约1.0M之间，优选为约0.1μM至约700μM，更优选为约100μM至约200μM。在特别优选的实施方案中，Hoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14或BBC在染色混合物中的浓度一般在约400μM至约500μM，最优选为约450μM。因此，在一种染色条件设置下，Hoechst 33342的浓度优选为约100μM。在另一种染色条件设置下Hoechst 33342的浓度为约150μM。又在另一种染色条件设置下，浓度优选为约200μM。而在另一种染色条件设置下，Hoechst 33342的浓度最优选为约450μM。

又例如，荧光聚酰胺的浓度(例如美国申请公开号2001/0002314中所述的那些)，一般为约0.1μM至约1mM，优选约1μM至约1mM，更优选约5μM至约100μM，甚至更优选约10μM。

染色混合物中除含有缓冲物外，还可包含其它添加剂以增强精子的存活力或运动性；这些添加剂可以作为精子来源、染料来源的一部分，或单独提供给染色混合物。此类添加剂包括能源、抗生素以及精浆，其中前两者在上文“细胞样品的收集”中已经讨论，后者将于下文“分选细胞的收集”中讨论。此类添加剂可根据染色技术于染色期间添加。

可以在一系列温度范围中的任意温度下保存染色混合物；一般而言，温度范围为约4℃至约50℃。例如，可以将染色混合物保存于“相对低”的温度下，即温度为约4℃至约30℃；在本实施方案中，温度优选为约20℃至约30℃，更优选为约25℃至约30℃，最优选为约28℃。或者，也可将染色混合物保存于“中间”温度范围内，即温度为约30℃至约39℃；在本实施方案中，温度优选为约34℃至约39℃，更优选为约37℃。此外，还可将染色混合物保存于“相对高”的温度范围内，即温度为约40℃至约50℃；在本实施方案中，温度优选为约40℃至约45℃，更优选为约40℃至约43℃，最优选为约41℃。对于优选温度的选择一般取决于一系列变量，包括如细胞对所用染料的渗透性、染色混合物中染料的浓度、细胞在染色混合物中留存的时间、以及在分选步骤中所期望的富集程度。

精子细胞摄取染色混合物中的染料可以持续足够长的一段时间，以达到所期望程度的DNA染色。所述时间一般足以使染料结合于精子细胞的DNA，从而能根据带有X和Y染色体的精子细胞间不同的且可测量的荧光强度，将两者分选开来。一般而言，这一时间不会超过约160分钟，优选不超过约90分钟，还更优选不超过约60分钟，而最优选为约5分钟至约40分钟。

因此，在一个实施方案中，形成含有精子细胞、浓度为约100μM至约200μM的染料和调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物的染色混合物，且将该染色混合物于约41℃的温度保持一段时间。在另一个实施方案中，调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物包括浓度为约10mM的丙酮酸盐、浓度为约100μM的维生素K或浓度为约1mM的硫辛酸。

又在另一个实施方案中，形成的染色混合物中含有精子细胞、浓度为约100μM至约200μM的染料和调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物，且将该染色混合物在于28℃的温度保持一段时间。在另一个实施方案中，调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物包括浓度为约10mM的丙酮酸盐、浓度为约100μM的维生素K或浓度为约1mM的硫辛酸。

而在另一个实施方案中，形成的染色混合物中含有精子细胞、每25ml纯水中含有0.204g NaHCO₃、0.433g KHCO₃和0.473g C₆H₈O₇·H₂O(NaHCO₃0.097mol/L、KHCO₃ 0.173mol/L、C₆H₈O₇·H₂O 0.090mol/L的水溶液)的缓冲物、浓度为约100μM至约200μM的染料和调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物，且将该染色混合物在于28℃的温度保持一段时间。在另一个实施方案中，将该染色混合物在于41℃的温度保持一段时间。而在另一个实施方案中，调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物包括浓度为约10mM的丙酮酸盐、浓度为约100μM的维生素K或浓度为约1mM的硫辛酸。

分选

调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物也可在分选精子细胞期间使用。一般而言，一旦根据本发明将精子染色，可以根据任何已知的可依据荧光分离的方法分选之。常用且公知的方法包括流式细胞术体系，如美国专利号5,135,759、5,985,216、6,071,689、6,149,867及6,263,745；国际专利公开号WO99/33956和WO01/37655；美国专利申请系列号10/812,351及其相应的国际专利公开号WO 2004/088283中所例示和描述的那些。

根据上述流式细胞术方法，如Exhibit A(附件A)所述将染色细胞作为样品液引入流式细胞仪的管口中。因此在一个实施方案中，样品液可包含有染色精子细胞和调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。

样品液一般由鞘液所包裹。鞘液使得样品液中的精子细胞能被吸出形成单列细胞。鞘液与精子细胞一起被流式细胞仪的收集系统所收集，从而构成了精子细胞分选后环境的一部分。因此，期望细胞与鞘液相接触时鞘液可为细胞提供保护性作用。

因此，鞘液中一般含有缓冲物或缓冲溶液，以及调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。缓冲物或缓冲溶液的实例及其可用于鞘液中的例示性浓度如上文“样品收集和稀释”中所公开。在具体实施方案中，鞘液为含有0.96％Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水(w/v)、0.1％BSA(w/v)的pH为约7.0的水溶液。

鞘液中也可任选地含有一系列对精子存活力或运动性有益的添加剂。此类添加剂的实例包括如能源、蛋白质源、抗生素以及聚乙烯醇。这些添加剂中的每一种及其实例，都已经在上文“细胞样品的收集”中讨论过。可据此将向鞘液中加入此类添加剂。

可任选地在分选步骤前过滤鞘液。鞘液中可能含有的杂质(如不可溶的颗粒)可能会干扰分选。因此，可在将鞘液引入流式细胞仪前进行过滤。此类滤器及其使用方法为本领域所公知。一般而言，滤器为约0.1微米至约0.5微米的膜，优选约0.2微米至约0.3微米，更优选约0.2微米。

可以在染色后的任一时间将染色细胞引入鞘液中。一般而言，将样品液中的染色细胞流注射到流式细胞仪管口内的鞘液流中。起初，由于液体层流的缘故(下文将详细讨论)，样品液与鞘液之间基本上没有接触。期望保持样品液和鞘液基本为分离液流，直至样品液中的颗粒(如染色精子细胞)得以分析。然而在有些点，鞘液和样品液中的细胞彼此间会发生接触。例如在液滴分选流式细胞仪(见下文)中，鞘液和样品液随着探询点下游形成液滴而开始相互接触。

在引入染色细胞和鞘液时，染色细胞和鞘液均可处于约4℃至约50℃的温度。鞘液和染色细胞可为相同或不同的温度，其中任一方的温度高于另一方。因此在一个实施方案中，引入染色细胞和鞘液时染色细胞和鞘液温度相同；例如都为“相对低”的温度(例如约5℃至约8℃)；都为“中间”温度(例如约25℃至约30℃)；或都为“相对高”的温度(例如约40℃至约43℃)。在另一个实施方案中，染色细胞的温度比鞘液温度高，例如细胞温度为约40℃至约43℃，而鞘液的温度约为室温或为约5℃。又在另一个实施方案中，染色细胞的温度比鞘液温度低。

分选细胞的收集

一旦完成分选，将分选细胞收集于含有收集液的容器内。一般而言，(采用)收集液的目的在于缓冲收集容器对精子细胞的影响，或为细胞提供液体支持。因此，收集液中可含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物、缓冲物或缓冲溶液，以及蛋白质源。

若含有缓冲物或缓冲溶液，其可用于收集液的实例如上文“样品细胞收集”中所公开。一般而言，这些缓冲物或缓冲溶液的浓度为约0.001M至约1.0M，且其pH为约4.5至约8.5，优选为约5.0至约8.0，更优选为约5.5至约7.5，还更优选为约6.0至约7.0，甚至更优选为约6.5至约7.0，而最优选为约6.5。在一个实施方案中，收集液中含有包含0.96％Dulbecco′s PBS(w/v)的pH为约7.0的缓冲物。在另一个实施方案中，收集液中含有包含0.96％Dulbecco′s PBS(w/v)的pH为约6.5的缓冲物。在另一个实施方案中，收集液中含有每25ml纯水含0.204g NaHCO₃、0.433g KHCO₃和0.473g C₆H₈O₇·H₂O(NaHCO₃ 0.097mol/L、KHCO₃ 0.173mol/L、C₆H₈O₇·H₂O 0.090mol/L的水溶液)的缓冲物。

若含有蛋白质源，则其可为任何不会干扰精子细胞存活力并与具体所用的缓冲物或缓冲溶液相容的蛋白质源。常用蛋白质源的实例包括乳(包括热匀浆和脱脂乳乳)、乳提取物、卵黄、卵黄提取物、大豆蛋白和大豆蛋白提取物。此类蛋白质的使用浓度可为约1％(v/v)至约30％(v/v)，优选约10％(v/v)至约20％(v/v)，更优选约10％(v/v)。尽管乳可以与缓冲物或缓冲溶液联合使用，一般而言乳是单独用于不存在上述物质时，因其本身即为溶液，可以起到与缓冲物或缓冲溶液相同的作用。在此种情况下，收集液中可含有约80％(v/v)至约90％(v/v)的乳。

除蛋白质源外或作为蛋白质源的替代，收集液中还可含有精浆。精浆可起到增强精子存活力和运动性以及稳定精子膜(从而防止精子在收集和贮存过程中获能)的双重功效。Maxwell等人，Reprod.Fert.Dev.(1998)10：433-440。精浆可来自获取精子样品的同一哺乳动物、来自同一种系的不同哺乳动物、或来自不同种系的哺乳动物。若收集液中含有精浆，一般其百分比在约0.5％(v/v)至约10％(v/v)的范围内。若与蛋白质源联合使用(例如卵黄或乳)，则精浆与蛋白质源的总百分比在约1％(v/v)至约30％(v/v)的范围内。在此种情况下，精浆的百分比与蛋白质源的百分比成反比。因此，在一个实施方案中，收集液中含有精浆。在另一个实施方案中，收集液含有精浆量为约0.5％(v/v)至约10％(v/v)，优选其量为约4％(v/v)至约6％(v/v)，更优选量为约5％(v/v)。在另一个实施方案中，收集液中含有蛋白质源和精浆。而在另一个实施方案中，收集液中含有精浆和卵黄，两者的百分比共计为约1％(v/v)至约30％(v/v)。

收集液中也可任选地含有一系列有益于精子存活力或运动性的添加剂。此类添加剂的实例包括能源和抗生素，两者均在上文“细胞样品的收集”中讨论过。可据此向收集液中添加此类添加剂。

因此在某一实施方案中，收集液为含有调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物、0.96％Dulbecco′s PBS(w/v)、1％(v/v)果糖、10％(v/v)卵黄的pH为约7.0的水溶液。而在另一个实施方案中，调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物包含10mM丙酮酸盐、100μM维生素K、1mM硫辛酸或其任意组合。

或者，可将分选细胞收集至含有或包被有随后冰冻伸展步骤中所用的冰冻伸展剂(cyroextender)(将于下文进一步阐述)的容器中，以代替收集液的使用。因此，在具体的实施方案中，分选细胞收集于冰冻伸展剂中。例如冰冻伸展剂可含有水、(Minitube，Verona，WI，含有甘油、tris、柠檬酸、果糖、泰乐菌素5mg/100ml、庆大霉素25mg/100ml、壮观霉素30mg/100ml及林可霉素15mg/100ml)、卵黄，以及调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。而在另一个实施方案中，冰冻伸展剂于每75ml水中含有25g和25g卵黄，以及调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。

应当认识到此处公开的收集液中的蛋白质百分比浓度是在加入流式分选细胞之前的浓度。加入流式分选细胞可能会将收集液的终浓度稀释至加入流式分选细胞前浓度的约1/20。因此，如收集液中可能开始含有约10％(v/v)卵黄。当含有收集液的收集容器中收集了流式分选细胞后，卵黄的终浓度将会降至约0.5％(v/v)。加入流式分选细胞也可能会将收集液的终浓度稀释至加入流式分选细胞前浓度的约1/15。因此，如收集液中可能开始含有约20％(v/v)卵黄。当含有收集液的收集容器中收集了流式分选细胞后，卵黄的终浓度将会降至约1.3％(v/v)。

分选细胞的冰冻伸展

一旦完成精子的分选并收集其至收集容器内，这些精子即可用于对雌性哺乳动物授精。这几乎不需要对精子进行其它处理就可以立即进行。同样，也可以将精子冷却或冰冻以备后用。在这种情况下，额外处理以最大程度地降低冷却或冰冻对存活力或解冻后运动性的影响，对精子大有益处。

一般而言，冰冻伸展剂含有缓冲物或缓冲溶液、调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物、蛋白质源和冰冻保护剂。可用于冰冻伸展剂的缓冲物或缓冲溶液的实例如上文样品收集和伸展中所公开。一般而言，这些缓冲物的浓度为约0.001M至约1.0M，且其pH为约4.5至约8.5，优选为约7.0。

若含有蛋白质源，也可将其加入，例如以提供细胞支持。蛋白质源可为任何不会干扰精子细胞存活力并与具体所用的缓冲物或缓冲溶液相容的蛋白质源。常用蛋白质源的实例包括乳(包括热匀浆和脱脂乳)、乳提取物、卵黄、卵黄提取物、大豆蛋白和大豆蛋白提取物。此类蛋白质的使用浓度可为约10％(v/v)至约30％(v/v)，优选约10％(v/v)至约20％(v/v)，更优选约20％(v/v)。尽管乳可以与缓冲物或缓冲溶液联合使用，一般而言乳是单独用于不存在上述物质时，因其本身即为溶液，可以起到与缓冲物或缓冲溶液相同的作用。在此种情况下，冰冻伸展液中可含有约80％(v/v)至约90％(v/v)的乳。

冰冻伸展剂中优选含有冰冻保护剂，以减轻或避免冷冻休克或以保持精子的生育力。本领域已知众多冰冻保护剂。适于与给定伸展剂共同使用的冰冻保护剂可有多种选择，取决于待冰冻精子来源于哪一种系。适宜冰冻保护剂的实例包括如，甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、海藻糖、以及它们的组合。若含有冰冻保护剂，则其在冰冻伸展剂中的量一般为约1％(v/v)至约15％(v/v)，优选其量为约5％(v/v)至约10％(v/v)，更优选其量为约7％(v/v)，而最优选量为约6％(v/v)。

在具体实施方案中，冰冻伸展剂包含水、卵黄和调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。又在另一个实施方案中，冰冻伸展剂于每75ml水中含有25g和25g卵黄，以及调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。

冰冻伸展剂中也可任选地含有一系列有益于精子存活力或运动性、且能避免或减轻冰冻保存的不良影响的添加剂。此类添加剂的实例可包括例如能源或抗生素，两者均在上文样品收集和稀释中讨论过。可据此向冰冻伸展剂中添加此类添加剂。

上文已经详细描述了本发明，显而易见的是，在不脱离所附权利要求定义的本发明范围时可以对之进行修饰和改变。

实施例

提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。

实施例1

利用人工阴道从性成熟公牛中收集公牛精液，并将样品以2份的碳酸盐缓冲液稀释、于25℃温控容器内转运至染色设施。精液一经接收，便根据标准和公知的方法(Farrell等人，Theriogenology，49(4)：871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn运动性分析仪(IVOS)分析其浓度、运动性和前向运动性。根据精液浓度，移取小份碳酸盐精子悬浮液、将其在500Xg离心5分钟、除去上清液并将沉淀重悬于41℃pH 7.3的TCA缓冲液中，制备1mL 150×10⁶精子/ml的悬浮液。再通过将小份精液悬浮于41℃含10mM丙酮酸盐、pH 7.3的TCA缓冲液内，制备另外1mL 150×10⁶精子/ml悬浮液。向精子悬浮液中加入等份10mM Hoechst水溶液以使染料浓度为400μM Hoechst。染色期间将精子悬浮液留置于41℃水浴中。从染色精子悬浮液中移取50μl小份，加入200μl相同温度的相同缓冲物，通过IVOS分析测量前向性运动百分比(前向性运动％)进行分析。IVOS分析的结果总结于图1。

实施例2

除以下不同外，按照实施例1的相同方法获取和制备精子样品：用于悬浮精子以进行染色和IVOS分析的缓冲物为TCA和含10μM维生素K的TCA。IVOS分析的结果总结于图2。

实施例3

除以下不同外，按照实施例1的相同方法获取和制备精子样品：用于悬浮精子以进行染色和IVOS分析的缓冲物为TCA和含100μM维生素K的TCA。IVOS分析的结果总结于图3。

实施例4

除以下不同外，按照实施例1的相同方法获取和制备精子样品：用于悬浮精子以进行染色和IVOS分析的缓冲物为TCA和含1mM硫辛酸的TCA。IVOS分析的结果总结于图4。

实施例5

利用人工阴道从性成熟公牛中收集公牛精液，并将样品以2份的碳酸盐缓冲液稀释、于25℃温控容器内转运至染色设施。精液一经接收，便根据标准和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)：871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn运动性分析仪(IVOS)分析其浓度、运动性和前向运动性。根据精液浓度，将精子悬浮液在500Xg离心5分钟、除去上清液并将沉淀重悬于28℃pH 7.3的TCA缓冲液中，制备1mL 150×10⁶精子/ml的悬浮液。再通过将小份精液悬浮于28℃含10mM丙酮酸盐、pH7.3的TCA缓冲液内，制备另外1mL 150×10⁶精子/ml悬浮液。向精子悬浮液中加入等份10mM Hoechst水溶液以使染料浓度为600μM Hoechst。染色期间将精子悬浮液留置于28℃水浴中。从染色精子悬浮液中移取50μl小份，加入200μl相同温度的相同缓冲物，通过IVOS分析测量前向性运动百分比(前向性运动％)进行分析。IVOS分析的结果总结于图5。

实施例6

除以下不同外，按照实施例5的相同方法获取和制备精子样品：用于悬浮精子以进行染色和IVOS分析的缓冲物为TCA和含100μM维生素K的TCA。IVOS分析的结果总结于图6。

实施例7

除以下不同外，按照实施例5的相同方法获取和制备精子样品：用于悬浮精子以进行染色和IVOS分析的缓冲物为TCA和含1mM硫辛酸的TCA。IVOS分析的结果总结于图7。

实施例8

利用人工阴道从性成熟公牛中收集公牛精液，并将样品以2份的碳酸盐缓冲液稀释、于25℃温控容器内转运至染色设施。精液一经接收，便根据标准和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)：871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn运动性分析仪(IVOS)分析其浓度、运动性和前向运动性。根据精液浓度，移取小份碳酸盐精子悬浮液、将其在500Xg离心5分钟、除去上清液并将沉淀重悬于1ml TCA缓冲液或1ml含2.5mM、10mM、25mM或50mM丙酮酸盐的TCA缓冲液中，制备1mL150×10⁶精子/ml悬浮液。向样品中加入MON33342溶液以使染料终浓度为600μM。于28℃水浴中孵育悬浮液。从染色精子悬浮液中移取50μl小份，加入200μl相同温度的相同缓冲物，通过IVOS分析测量前向性运动百分比(前向性运动％)进行分析。IVOS分析前向性运动％的结果如图8所示。

实施例9

利用人工阴道从性成熟公牛中收集公牛精液，并将样品以2份的碳酸盐缓冲液稀释、于25℃温控容器内转运至染色设施。精液一经接收，便根据标准和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)：871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn运动性分析仪(IVOS)分析其浓度、运动性和前向运动性。根据精液浓度，移取小份碳酸盐精子悬浮液、将其在500Xg离心5分钟、除去上清液并重悬浮沉淀于1ml TCA缓冲液中，制备1mL含150×10⁶精子/ml的TCA缓冲液。移取小份碳酸盐精子悬浮液、将其在500Xg离心5分钟、除去上清液并将沉淀重悬于1ml含10mM丙酮酸盐的TCA缓冲液中，制备1mL含150×10⁶精子/ml的10mM丙酮酸盐TCA缓冲液。向样品中加入SYBR14染料溶液以使染料终浓度为20μM。于28℃水浴中孵育悬浮液。从染色精子悬浮液中移取50μl小份，加入200μl相同温度的相同缓冲物，通过IVOS分析测量前向性运动百分比(前向性运动％)进行分析。IVOS分析前向性运动％的结果如图9所示。

实施例10

利用人工阴道从性成熟公牛中收集公牛精液，并将样品以2份的碳酸盐缓冲液稀释、于25℃温控容器内转运至染色设施。精液一经接收，便根据标准和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)：871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn运动性分析仪(IVOS)分析其浓度、运动性和前向运动性。根据精液浓度，移取小份碳酸盐精子悬浮液、将其在500Xg离心5分钟、除去上清液并将沉淀重悬于1ml TCA缓冲液中，制备1mL含150×10⁶精子/ml的TCA缓冲液。移取小份碳酸盐精子悬浮液、将其在500Xg离心5分钟、除去上清液并重悬浮沉淀于1ml含10mM丙酮酸盐的TCA缓冲液中，制备1mL含150×10⁶精子/ml的10mM丙酮酸盐TCA缓冲液。向样品中加入BBC溶液以使染料终浓度为100μM。于28℃水浴中孵育悬浮液。从染色精子悬浮液中移取50μl小份，加入200μl相同温度的相同缓冲物，通过IVOS分析测量前向性运动百分比(前向性运动％)进行分析。IVOS分析前向性运动％的结果如图10所示。

实施例11

除以下不同外，按照实施例10的相同方法获取和制备精子样品：染料浓度为200μM BBC。IVOS分析的结果总结于图11。

实施例12

利用人工阴道从性成熟公牛中收集公牛精液，并将样品在25℃温控容器内转运至染色设施。精液一经接收，便根据标准和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)：871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn运动性分析仪(IVOS)分析其浓度、运动性和前向运动性。根据精液浓度，将精液悬浮于TCA缓冲物或基于碳酸盐的抑制剂中，制备数管含150×10⁶精子/ml的悬浮液。下表I显示了所用的组合物和染色条件。

表I

  样品名  组成成分  pH 浓度(μM) Hoechst  温度(℃)  10mM pyr  TCA  含10mM丙酮酸盐的  TCA  7.3  600μM  28℃  10mM pyr  CO₂  CO₂气球包裹的含10  mM丙酮酸盐的TCA  7.3  600μM  28℃  碳酸盐6.2  基于碳酸盐的抑制剂，  pH 6.2  6.2  600μM  28℃  碳酸盐7.3  基于碳酸盐的抑制剂，  pH 7.3  7.3  600μM  28℃

向精子悬浮液中加入等份10mM Hoechst水溶液以使浓度为600μMHoechst。染色期间将精子悬浮液留置于28℃水浴中(约1小时)。从染色精子悬浮液中移取50μl小份，加入200μl 25℃含10mM丙酮酸盐的TCA(pH7.3)以起始静止逆转，至少5分钟的平衡时间后，通过IVOS分析测量前向性运动百分比(前向性运动％)进行分析。IVOS前向性运动百分比的比较结果见图12-14。

实施例13

利用人工阴道从性成熟公牛中收集公牛精液，并将样品在25℃温控容器内转运至染色设施。精液一经接收，便根据标准和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)：871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn运动性分析仪(IVOS)分析其浓度、运动性和前向运动性。根据精液浓度，将精液悬浮于TCA缓冲物或基于碳酸盐的抑制剂中，制备数管含450×10⁶精子/ml的悬浮液。下表II显示了所用的组合物和染色条件。

表II

  样品名  组成成分  pH 浓度(μM) Hoechst  温度(℃)  10mM pyr  TCA  含10mM丙酮酸盐的  TCA  7.3  1000μM  28℃  碳酸盐6.2  基于碳酸盐的抑制剂，  pH6.2  6.2  1000μM  28℃  碳酸盐7.3  基于碳酸盐的抑制剂，  pH7.3  7.3  1000μM  28℃

向精子悬浮液中加入等份10mM Hoechst水溶液以使浓度为1000μMHoechst。将精子悬浮液留置于28℃水浴中1小时，然后按照各图中具体的说明，用含10mM丙酮酸盐的TCA或pH6.2基于碳酸盐的抑制剂将之稀释为150×10⁶精子/ml的典型分选浓度。在各图指定的时间内从染色并稀释的精子悬浮液中移取50μl小份，并加入200μl 25℃含10mM丙酮酸盐的TCA(pH7.3)以起始静止逆转，至少5分钟的平衡时间后，通过IVOS分析测量前向性运动百分比进行分析。IVOS前向性运动百分比的比较结果见图15-17。

实施例14

利用人工阴道从性成熟公牛中收集公牛精液，并将样品在25℃温控容器内转运至染色设施。精液一经接收，便根据标准和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)：871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn运动性分析仪(IVOS)分析其浓度、运动性和前向运动性。根据精液浓度，将精液悬浮于TCA缓冲物或基于碳酸盐的抑制剂中，制备数管含450×10⁶精子/ml的悬浮液。下表II显示了所用的组合物和染色条件。

表III

  样品名  组成成分  pH 浓度(μM) Hoechst  温度(℃)  10mM pyr  TCA  含10mM丙酮酸盐的  TCA  7.3  300μM  41℃  碳酸盐6.2  基于碳酸盐的抑制剂，  pH6.2  6.2  300μM  41℃  碳酸盐7.3  基于碳酸盐的抑制剂，  pH7.3  7.3  300μM  41℃

向精子悬浮液中加入等份10mM Hoechst水溶液以使浓度为300μMHoechst。将精子悬浮液留置于41℃水浴中30分钟，然后按照各图中具体的说明，用含10mM丙酮酸盐的TCA或pH6.2基于碳酸盐的抑制剂将之稀释为150×10⁶精子/ml的典型分选浓度。在各图指定的时间内从染色并稀释的精子悬浮液中移取50μl小份，并加入200μl 25℃含10mM丙酮酸盐的TCA(pH7.3)以起始静止逆转，至少5分钟的平衡时间后，通过IVOS分析测量前向性运动百分比进行分析。IVOS前向性运动百分比的比较结果见图18-20。