使用低温下结晶纯化APO－2配体/TRAIL的方法

摘要

本发明涉及包括结晶的Apo2L/TRAIL的纯化。

说明书

发明领域

本发明涉及结晶参与的Apo2L/TRAIL的纯化。

发明背景

已经有多种分子鉴定为肿瘤坏死因子(“TNF”)细胞因子家族的成员，诸 如肿瘤坏死因子-α(“TNF-α”)、肿瘤坏死因子-β(“TNF-β”或“淋巴毒素-α”)、 淋巴毒素-β(“LT-β”)、CD30配体、CD27配体、CD40配体、OX-40配体、 4-1BB配体、Apo-1配体(也称作Fas配体或CD95配体)、Apo-2配体(也 称作Apo2L或TRAIL)、Apo-3配体(也称作TWEAK)、APRIL、OPG 配体(也称作RANK配体、ODF或TRANCE)和TALL-1(也称作BlyS、 BAFF或THANK)[参见例如Gruss and Dower，Blood，85：3378-3404(1995)； Schmid et al.Proc.Natl.Acad.Sci.83：1881(1986)；Dealtry et al.Eur.J. Immunol.17：689(1987)；Pitti et al.J.Biol.Chem.271：12687-12690(1996)； Wiley et al.Immunity，3：673-682(1995)；Browning et al.Cell，72：847-856 (1993)；Armitage et al.Nature，357：80-82(1992)，WO 97/01633，公开于1997 年1月16日；WO 97/25428，公开于1997年7月17日；Marsters et al.Curr. Biol.8：525-528(1998)；Chicheportiche et al.Biol.Chem.272：32401-32410 (1997)；Hahne et al.J.Exp.Med.188：1185-1190(1998)；WO 98/28426，公开 于1998年7月2日；WO 98/46751，公开于1998年10月22日；WO 98/18921， 公开于1998年5月7日；Moore et al.Science，285：260-263(1999)；Shu et al.J. Leukocyte Biol.65：680(1999)；Schneider et al.J.Exp.Med.189：1747-1756 (1999)；Mukhopadhyay et al.J.Biol.Chem.274：15978-15981(1999)]。在这些 分子中，TNF-α、TNF-β、CD30配体、4-1BB配体、Apo-1配体、Apo-2配 体(Apo2L/TRAIL)和Apo-3配体(TWEAK)有报道说涉及凋亡性细胞死亡。

数年前将Apo2L/TRAIL鉴定为TNF细胞因子家族的成员[参见例如 Wiley et al.Immunity，3：673-682(1995)；Pitti et al.J.Biol.Chem. 271：12687-12690(1996)]。全长人Apo2L/TRAIL多肽是长281个氨基酸的II 型跨膜蛋白质。有些细胞能通过酶促切割多肽的胞外区而生成该多肽的天 然可溶形式[Mariani et al.J.Cell.Biol.137：221-229(1997)]。对可溶形式 Apo2L/TRAIL的晶体学研究揭示了与TNF及其它相关蛋白质的结构类似的 同三聚体结构[Hymowitz et al.Molec.Cell，4：563-571(1999)；Hymowitz et al. Biochemistry，39：633-644(2000)]。然而，与其它TNF家族成员不同，发现 Apo2L/TRAIL具有独特的结构特征，即三个半胱氨酸残基(同三聚体中各 个亚基的第230位)一起与锌原子配位，而且锌结合对于三聚体的稳定性 和生物学活性来说是重要的[Hymowitz et al.同上；Bodmer et al.J.Biol. Chem.275：20632-20637(2000)]。

文献中已有报道，Apo2L/TRAIL可能在免疫系统的调节中起作用，包 括自身免疫病，诸如类风湿性关节炎和HIV治疗中[参见例如Thomas et al.J. Immunol.161：2195-2200(1998)；Johnsen et al.Cytokine，11：664-672(1999)； Griffith et al.J.Exp.Med.189：1343-1353(1999)；Song et al.J.Exp.Med. 191：1095-1103(2000)]。

还有报道，在体外可溶形式的Apo2L/TRAIL在多种癌细胞中诱导凋亡， 包括结肠、肺、乳房、前列腺、膀胱、肾、卵巢和脑肿瘤，以及黑素瘤、 白血病和多发性骨髓瘤[参见例如Wiley et al.同上；Pitti et al.同上；Rieger et al.FEBS Letters，427：124-128(1998)；Ashkenazi et al.J.Clin.Invest. 104：155-162(1999)；Walczak et al.Nature Med.5：157-163(1999)；Keane et al.Cancer Research，59：734-741(1999)；Mizutani et al.Clin.Cancer Res. 5：2605-2612(1999)；Gazitt，Leukemia，13：1817-1824(1999)；Yu et al.Cancer Res.60：2384-2389(2000)；Chinnaiyan et al.Proc.Natl.Acad.Sci. 97：1754-1759(2000)]。在鼠肿瘤模型中进行的体内研究进一步表明，单独使 用的或者联合化疗或放疗的Apo2L/TRAIL能发挥实质性的抗肿瘤作用[参 见例如Ashkenazi et al.同上；Walzcak et al.同上；Gliniak et al.Cancer Res. 59：6153-6158(1999)；Chinnaiyan et al.同上；Roth et al.Biochem.Biophys. Res.Comm.265：1999(1999)]。与许多类型的癌细胞相反，大多数正常人细 胞类型表现出对某些重组形式Apo2L/TRAIL的凋亡诱导有抗性[Ashkenazi et al.同上；Walzcak et al.同上]。Jo等人报道，附加多组氨酸标签的可溶 形式Apo2L/TRAIL在体外在正常的分离的人肝细胞中诱导凋亡，在非人源 的肝细胞中则不然[Jo et al.Nature Med.6：564-567(2000)；Nagata，Nature Med.6：502-503(2000)]。有人认为，某些重组Apo2L/TRAIL制备物在生物 化学特性和生物学活性方面对患病细胞和正常细胞可有所不同，这取决于 例如标签分子的存在与否、锌含量和三聚体含量百分比[参见Lawrence et al. Nature Med.Letter to the Editor，7：383-385(2001)；Qin et al.Nature Med. Letter to the Editor，7：385-386(2001)]。

人们认为此类TNF家族细胞因子介导的各种细胞应答是由它们对特定 细胞受体的结合所引发的。先前，鉴定了约55kDa(TNFR1)和75kDa (TNFR2)的两种不同TNF受体[Hohman et al.J.Biol.Chem.264： 14927-14934(1989)；Brockhaus et al.Proc.Natl.Acad.Sci.87：3127-3131 (1990)；EP 417,563，公开于1991年3月20日；Loetscher et al.Cell，61：351 (1990)；Schall et al.Cell，61：361(1990)；Smith et al.Science，248：1019-1023 (1990)；Lewis et al.Proc.Natl.Acad.Sci.88：2830-2834(1991)；Goodwin et al.Mol.Cell.Biol.11：3020-3026(1991)]。发现这些TNFR共有细胞表面受 体的典型结构，包括胞外区、跨膜区和胞内区。发现两种受体的胞外部分 在天然条件下也作为可溶的TNF结合性蛋白存在[Nophar，Y.et al.EMBO J. 9：3269(1990)；及Kohno，T.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：8331 (1990)；Hale et al.J.Cell.Biochem.Supplement 15F，1991，p.113(P424))]。

1型和2型TNFR(TNFR1和TNFR2)的胞外部分含有4个富半胱氨 酸结构域(CRD)的重复氨基酸序列模式，从NH₂末端起以1到4指称。 [Schall et al.同上；Loetscher et al.同上；Smith et al.同上；Nophar et al. 同上；Kohno et al.同上；Banner et al.Cell，73：431-435(1993)]。类似的CRD 重复模式存在于数种其它的细胞表面蛋白中，包括p75神经生长因子(NGFR) [Johnson et al.Cell，47：545(1986)；Radeke et al.Nature，325：593(1987)]、B 细胞抗原CD40[Stamenkovic et al.EMBO J.8：1403(1989)]、T细胞抗原 OX40[Mallet et al.EMBO J.9：1063(1990)]和Fas抗原[Yonehara et al.同上 and Itoh et al.Cell，66：233-243(1991)]。CRD还在Shope和粘液瘤痘病毒的 可溶性TNFR(sTNFR)样T2蛋白质中有发现[Upton et al.Virology，160：20-29 (1987)；Smith et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.176：335(1991)；Upton et al.Virology，184：370(1991)]。这些序列的最优比对结果暗示半胱氨酸残 基的位置非常保守。有时将这些受体统称为TNF/NGF受体超家族成员。

除了淋巴毒素-β以外，迄今为止鉴定的TNF家族配体都是典型II型跨 膜蛋白质，其C-末端在细胞外。与之相反，迄今为止鉴定的TNF受体(TNFR) 家族的大多数受体是典型的I型跨膜蛋白质。然而，在TNF配体和受体两 个家族中，发现在家族成员间鉴定的同源性主要位于胞外域(″ECD″)。数种 TNF家族细胞因子，包括TNF-α、Apo-1配体和CD40配体，在细胞表面受 到蛋白水解切割；在每种情况中所得蛋白质通常形成同三聚体分子，其发 挥可溶性细胞因子的功能。TNF受体家族蛋白质常常还受到蛋白水解切割 而释放可溶性受体ECD，其能发挥相关细胞因子抑制剂的功能。

Pan等人披露了称为“DR4”的另外的TNF受体家族成员[Pan et al. Science，276：111-113(1997)]。DR4有报道说包含能够与细胞自杀机制联动 的胞质死亡域。据Pan等人披露，有人认为DR4是称为“Apo-2配体”或 “TRAIL”的配体的受体。

在Sheridan et al.Science，277：818-821(1997)和Pan et al.Science， 277：815-818(1997)中记载了另一种据说是Apo2L/TRAIL的受体的分子(还 可参见WO 98/51793，公开于1998年11月19日；WO 98/41629，公开于1998 年9月24日)。该分子称为DR5或称作Apo-2、TRAIL-R、TR6、Tango-63、 hAPO8、TRICK2或KILLER)(Screaton et al.Curr.Biol.7：693-696(1997)； Walczak et al.EMBO J.16：5386-5387(1997)；Wu et al.Nature Genetics， 17：141-143(1997)；WO 98/35986，公开于1998年8月20日；EP 870,827，公 开于1998年10月14日；WO 98/46643，公开于1998年10月22日；WO 99/02653，公开于1999年1月21日；WO 99/09165，公开于1999年2月25 日；WO 99/11791，公开于1999年3月11日)。像DR4一样，DR5有报道 说包含胞质死亡域且能够发出凋亡信号。Apo-2L/TRAIL和DR5间形成的 复合物的晶体结构记载于Hymowitz et al.Molecular Cell，4：563-571(1999)。

最近鉴定的另一类TNFR家族成员称为“诱饵受体”(decoy receptor)，它 们被认为发挥信号传导抑制物而非转换器的功能。该组包括DCR1(也称作 TRID、LIT或TRAIL-R3)[Pan et al.Science，276：111-113(1997)；Sheridan et al.Science，277：818-821(1997)；McFarlane et al.J.Biol.Chem. 272：25417-25420(1997)；Schneider et al.FEBS Letters，416：329-334(1997)； Degli-Esposti et al.J.Exp.Med.186：1165-1170(1997)；Mongkolsapaya et al. J.Immunol.160：3-6(1998)]和DCR2(也称作TRUNDD或TRAIL-R4) [Marsters et al.Curr.Biol.7：1003-1006(1997)；Pan et al.FEBS Letters， 424：41-45(1998)；Degli-Esposti et al.Immunity，7：813-820(1997)]，这两种细 胞表面分子，以及OPG[Simonet et al.同上]和DCR3[Pitti et al.Nature， 396：699-703(1998)]，它们都是分泌型可溶性蛋白质。Apo2L/TRAIL有报道 说结合那些称为DcR1、DcR2和OPG的受体。

Apo2L/TRAIL被认为经由细胞表面“死亡受体”DR4和DR5起作用而活 化胱天蛋白酶或执行胞内细胞死亡程序的酶(参见例如Salvesen et al.Cell， 91：443-446(1997))。配体结合后，DR4和DR5都能经由称作FADD/Mort1 的含死亡域的连接物(adaptor)分子通过募集和活化凋亡起始物胱天蛋白酶 -8而独立触发凋亡[Kischkel et al.Immunity，12：611-620(2000)；Sprick et al. Immunity，12：599-609(2000)；Bodmer et al.Nature Cell Biol.2：241-243 (2000)]。与DR4和DR5相反，DcR1和DcR2受体不转导凋亡信号。

关于TNF细胞因子家族及其受体的综述参见Ashkenazi and Dixit， Science，281：1305-1308(1998)；Ashkenazi and Dixit，Curr.Opin.Cell Biol. 11：255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.7：750-753(1997)；Gruss and Dower， 同上；Nagata，Cell，88：355-365(1997)；Locksley et al.Cell，104：487-501 (2001)。

发明概述

某些蛋白质，诸如Apo2L/TRAIL和TNF细胞因子家族的其它成员，在 该蛋白质呈三聚体(trimer或trimeric)形式时表现生物学活性。因此，为了治 疗乃至诊断用途的目的，需要此类蛋白质的配制剂，其中蛋白质是稳定的 并保持生物学活性，尤其是以三聚体形式稳定地存在。

申请人令人意外地发现，Apo2L/TRAIL的独特分子结构在特定的条件 下使它能够自发结晶。这种性质使得利用结晶作为纯化步骤的高效、可计 量的(scaleable)Apo2L/TRAIL回收/纯化方法的开发成为可能。另外，从 Apo2L/TRAIL获得的经验，在通常意义上，为开发能通用于可结晶蛋白质 的牵涉结晶的回收和纯化方法提供了可能。

在一个方面中，本发明涉及一种从混合物中回收Apo2L/TRAIL的方法， 包括：

(a)将混合物加载到阳离子交换柱上；

(b)用平衡缓冲液冲洗阳离子交换柱，去除混合物中未结合的组分；

(c)用洗脱缓冲液洗脱结合于阳离子交换柱的Apo2L/TRAIL；

(d)将洗脱物逐渐冷却到约2～4℃，使Apo2L/TRAIL以晶体形式自发 沉淀，形成母液和Apo2L/TRAIL晶体的混合物；及

(e)从步骤(d)所得的混合物回收纯度为至少约99％的Apo2L/TRAIL。

在一个具体实施方案中，加载到阳离子交换柱上的混合物是产 Apo2L/TRAIL细胞的培养基或细胞溶解物。

在另一个实施方案中，所述混合物是产Apo2L/TRAIL的大肠杆菌(E. coli)宿主细胞的细胞溶解物。

在又一个实施方案中，在加载到阳离子交换柱上之前将所述溶解物澄 清。

在再一个实施方案中，对步骤(c)所得的洗脱物不作进一步纯化而进行 结晶步骤(d)。

阳离子交换柱可以是例如SP-Sepharose柱。

在进一步的一个实施方案中，加载到阳离子交换柱(例如SP-Sepharose) 上的混合物的pH是大约7.5或者被调整为大约7.5。Apo2L/TRAIL的洗脱 可以例如在如下的洗脱缓冲液中进行：所述洗脱缓冲液在调整pH到7.5-7.8 的缓冲剂中含有100-200mM NaCl或100-150mM Na₂SO₄。

在其它实施方案中，在步骤(d)中，将洗脱物从约15℃到30℃的温度经 过大约1到60个小时冷却到约2℃到8℃的温度，或者经过约1到8个小 时冷却到约2℃到8℃的温度，或者经过约1个小时冷却到约2℃到8℃的 温度，或者经过约1个小时冷却到约4℃的温度。

在另一个实施方案中，在结晶之前所述洗脱物的pH是约pH 7.0-8.0或 被调整为约pH 7.0-8.0，诸如pH 7.3。

在另一个实施方案中，在结晶之后所述洗脱物的pH是约pH 7.5-8.0或 被调整为约pH 7.5-8.0。

在另一个实施方案中，步骤(d)中保持约2℃到4℃的温度直至达到或近 似达到Apo2L/TRAIL的平衡溶解度。

在进行本发明方法的过程中，步骤(d)中可添加抗溶剂(anti-solvent)例如 聚乙二醇(PEG)、MPD、乙醇、异丙醇和/或二氧杂环己烷(dioxane)来降 低Apo2L/TRAIL的溶解度。

因此，例如，使用PEG分子量为大约400到大约10,000道尔顿之间的 PEG作为抗溶剂。在其它代表性的实施方案中，PEG分子量为400、3,350 或10,000道尔顿。

在另一个实施方案中，步骤(e)中Apo2L/TRAIL以晶体的形式回收，所 述晶体是通过过滤、或离心、或其组合从母液分离的。过滤之前可将母液 的pH调整到大约8.0以降低溶解度。

在另一个方面中，本发明的回收/纯化方法还包括下述步骤：将上述方 法步骤(d)中所获的Apo2L/TRAIL晶体溶解，并对所得溶液进行第二色谱纯 化步骤。

在一个实施方案中，第二色谱纯化步骤是疏水相互作用色谱，它可在 例如Phenyl-Sepharose柱上进行。

在另一个实施方案中，第二色谱纯化步骤是阳离子交换色谱，它在例 如CM-Sepharose或SP-Sepharose柱上进行。

在另一个实施方案中，在第二色谱纯化步骤之后通过超滤-渗滤对 Apo2L/TRAIL进行回收和配制。

在其它实施方案中，纯化后蛋白的纯度至少为大约99.5％，或至少约 99.9％。

附图简要说明

图1所示为人Apo2L/TRAIL cDNA(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列和它 的衍生氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。第447位核苷酸处的“N”(SEQ ID NO：2中)用来表示该核苷酸碱基可以是“T”或“G”。

图2所示为显示所述Apo2L/TRAIL制备物纯度的SDS-PAGE银染色凝 胶。

图3显示各种盐类对Apo2L/TRAIL结晶的影响。

图4显示与22℃和2℃之间经1、4、8和24小时冷却的线性温度变化 相对应的平衡晶体粒度分布(equilibrium crystal size distribution)。

图5显示添加PEG对APO2L/TRAIL溶解度的影响：2-8℃搅拌5天。

发明详述

A.定义

“TNF家族成员”广义地指在结构或功能方面与肿瘤坏死因子(TNF) 具有某些类似性的各种多肽。与TNF家族多肽相关的特定结构和功能特征 是本领域已知的，且在例如上文“发明背景”中有说明。此类多肽包括但 不限于本领域中称为TNF-α、TNF-β、CD40配体、CD30配体、CD27配体、 OX-40配体、4-1BB配体、Apo-1配体(也称Fas配体或CD95配体)、 Apo2L/TRAIL(也称TRAIL)、Apo-3配体(也称TWEAK)、APRIL、OPG 配体(也称为RANK配体、ODF或TRANCE)、和TALL-1(也称Blys、 BAFF或THANK)的那些多肽(参见例如Gruss and Dower，Blood， 85：3378-3404(1995)；Pitti et al.J.Biol.Chem.271：12687-12690(1996)； Wiley et al.Immunity，3：673-682(1995)；Browning et al.Cell，72：847-856 (1993)；Armitage et al.Nature，357：80-82(1992)，PCT申请WO 97/01633和 WO 97/25428；Marsters et al.Curr.Biol.8：525-528(1998)；Chicheportiche et al.Biol.Chem.272：32401-32410(1997)；Hahne et al.J.Exp.Med. 188：1185-1190(1998)；PCT申请WO 98/28426，WO 98/46751和WO 98/18921； Moore et al.Science，285：260-263(1999)；Shu et al.J.Leukocyte Biol.65：680 (1999)；Schneider et al.J.Exp.Med.189：1747-1756(1999)；Mukhopadhyay et al.J.Biol.Chem.274：15978-15981(1999))。

本文的术语“Apo2L/TRAIL”、“Apo-2L”和“TRAIL”是用来指包 括图1(SEQ ID NO：1)所示的氨基酸序列中氨基酸残基114-281(含端点)， 95-281(含端点)，残基92-281(含端点)，残基91-281(含端点)，残 基41-281(含端点)，残基15-281(含端点)，或残基1-281(含端点)， 及上述序列的生物活性片段，缺失、插入或替代变体。在一个实施方案中， 所述多肽序列包括图1(SEQ ID NO：1)的残基114-281，及任选地，由图 1(SEQ ID NO：1)的残基114-281组成。任选地，所述多肽序列包括图1 (SEQ ID NO：1)的残基92-281或残基91-281。Apo-2L多肽可以由图1(SEQ ID NO：2)所示的天然核苷酸序列编码。任选地，编码图1(图1，SEQ ID NO：2) 中Pro119残基的密码子可以是“CCT”或“CCG”。在其它的实施方案中， 所述片段或变体是生物学活性的，且与上述的任一Apo2L/TRAIL序列具有 至少约80％的氨基酸序列同一性，更优选至少约90％的同一性，更优选具 有至少95％，96％，97％，98％，或99％的序列同一性。任选地，所述 Apo2L/TRAIL多肽由在严格条件下与图1(SEQ ID NO：2)提供的编码核苷 酸序列杂交的核苷酸序列所编码。该定义涵盖Apo2L/TRAIL的替代变体， 其中它的至少一个天然氨基酸被替代为丙氨酸残基。具体的Apo2L/TRAIL 的替代变体包括至少一个氨基酸被替代为丙氨酸残基的变体。这些替代变 体包括标识为，例如，“D203A”、“D218A”和“D269A”的那些变体。 用该命名法标识第203、218和/或269位(使用图1(SEQ ID NO：1)所示 的编号)的天冬氨酸被替代为丙氨酸残基的Apo2L/TRAIL变体。可选地， 所述Apo2L/TRAIL变体可包含已公布的PCT申请WO 01/00832的表I中记 载的一种或多种丙氨酸替代。替代性变体包括2001年1月4日公开的WO 01/00832的表I指明的一个或多个残基的替代。该定义还涵盖从 Apo2L/TRAIL来源分离的、或通过重组或合成方法制备的天然序列 Apo2L/TRAIL。本发明的Apo2L/TRAIL包括PCT申请WO97/01633和 WO97/25428中公开的、称为Apo2L/TRAIL或TRAIL的多肽。术语 “Apo2L/TRAIL”或“Apo2L”用来泛指Apo2L/TRAIL的多种形式，包括 该多肽的单体、二聚体或三聚体形式。Apo2L序列中提到的所有氨基酸残 基的编号都使用根据图1(SEQ ID NO：1)的编号，除非另有特别说明。例 如，“D203”或“Asp203”指图1(SEQ ID NO：1)中提供的序列的第203 位的天冬氨酸残基。

术语“Apo2L/TRAIL胞外域”或“Apo2L/TRAIL ECD”是指 Apo2L/TRAIL的基本上没有跨膜和胞质域的形式。通常，ECD具有少于1％ 的所述跨膜和胞质域，且优选具有少于0.5％的所述域。应当理解，为本发 明多肽鉴定的任何跨膜域都是根据本领域中鉴定那种疏水域的常规标准鉴 定的。跨膜域的确切边界可以是变化的，但最有可能是在最初鉴定的域的 任一末端处不多于约5个氨基酸的变化。在优选的实施方案中，ECD由所 述多肽的可溶性胞外域序列组成，基本上没有跨膜和胞质或胞内域(而且 不是膜结合的)。具体的Apo-2L/TRAIL胞外域序列在PCT申请WO97/01633 和WO97/25428中有描述。

术语“Apo2L/TRAIL单体”或“Apo2L单体”指Apo2L的胞外域序列 的共价链。

术语“Apo2L/TRAIL二聚体”或“Apo2L二聚体”指通过二硫键共价 键连接的2个Apo-2L单体。用于本文的该术语包括独立存在的(free standing) Apo2L二聚体和三聚体形式的Apo2L中的Apo2L二聚体(即，与另一第三 Apo2L单体联合)。

术语“Apo2L/TRAIL三聚体”或“Apo2L三聚体”是指非共价缔合的 三个Apo2L单体。

术语“Apo2L/TRAIL聚集体(aggregate)”用于指自我缔合 (self-associated)的Apo2L/TRAIL高级寡聚形式，例如Apo2L/TRAIL三聚 体，其形成例如Apo2L/TRAIL六聚体和九聚体形式。

Apo2L/TRAIL单体、二聚体或三聚体(及其它聚集体)的存在和数量 可使用本领域已知的方法和测定法(及使用可商购的材料)来确定，例如 非变性(native)大小排阻HPLC(“SEC”)、使用十二烷基硫酸钠的变 性大小排阻色谱(“SDS-SEC”)，反相HPLC和毛细管电泳，包括后文 实施例中进一步详述的那些方法。

术语“附加标签的”(tagged)用于本文时是指一种嵌合多肽，其包含 与“标签多肽”融合的Apo2L/TRAIL或其部分。标签多肽具有足够的残基， 用来提供可针对其制造抗体的表位，或提供其它某些功能，诸如金属例子 螯合；但又足够短，使其一般不干扰TNF家族细胞因子的活性。标签多肽 优选还是相当独特的，使得标签特异性抗体基本上不与其它表位发生交叉 反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常在约8个和约 50个氨基酸残基之间(优选在约10个和约20个氨基酸残基之间)。

术语“二价金属离子”是指具有两个正电荷的金属离子。二价金属离 子的例子包括但不限于锌、钴、镍、镉、镁和锰。可利用的此类金属的具 体形式包括盐形式(例如药用盐形式)，诸如上述二价金属离子的氯化物、 乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐形式。任选地，用于本发明的二价金 属离子是锌，优选盐形式，硫酸锌或氯化锌。

“分离的”，在用于描述本文中所公开的各种蛋白质时，意指已经从 其天然环境的某种成分中被识别并分离和/或回收的蛋白质。其天然环境的 污染性成分指通常会干扰该蛋白质的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、 激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中， 将蛋白质纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N- 末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝或优选银染色的 非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE，达到均质，或(3)通过质谱和肽作 图技术达到均质。分离的蛋白质包括重组细胞内的原位蛋白质，因为至少 有一种Apo2L/TRAIL天然环境的成分将不会存在。然而，分离的蛋白质通 常通过至少一个纯化步骤来制备。

“分离的”Apo2L/TRAIL核酸分子是这样的核酸分子，它已经从 Apo2L/TRAIL核酸的天然来源中通常与它相伴随的至少一种污染性核酸分 子中被识别并与之分离开来。分离的Apo2L/TRAIL核酸分子不同于它存在 于自然界中时的形式或背景。因此，分离的Apo2L/TRAIL核酸分子与存在 于天然细胞中时的Apo2L/TRAIL核酸分子有区别。然而，分离的 Apo2L/TRAIL核酸分子包括通常表达Apo2L/TRAIL的细胞中所包含的 Apo2L/TRAIL核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位 不同于它在天然细胞中的染色体定位时。

关于本文所提到的多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为 对齐序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任 何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定Apo2L/TRAIL 多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为确定百分比氨基 酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的能确定对比的适当参数 的多种方式进行，包括使用为获得所比较的全长序列最大对比所需的算法。 为了本发明的目的，百分比氨基酸序列同一性值可使用序列比较计算机程 序ALIGN-2获得，该程序由Genentech公司编写，下文表1所示源代码已 经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，Washington D.C.20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech 公司(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序。所有序列比较参数 由ALIGN-2程序设定且不变。

杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易地确定，而且 通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探 针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常 依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能 力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也 越高。结果是可推知较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低 温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel 等人，《Current Protocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers (1995)。

“高严格性条件”，如本文中所定义的，通常体现为下列条件：(1)采 用低离子强度和高温进行清洗；0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％ 十二烷基硫酸钠，于50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂；50％(v/v)甲酰 胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficol1/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸 钠缓冲液pH 6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，于42℃；或(3)采用 50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)， 0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)， 0.1％SDS，和10％硫酸右旋糖苷，于42℃，及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/ 柠檬酸钠)和50％甲酰胺中，于55℃清洗，接着于55℃在含EDTA的0.1x SSC 中进行高严格性清洗。

“中等严格条件”可体现为Sambrook等人，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，New York，Cold Spring Harbor Press，1989中的叙述， 包括于37℃在含20％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、 50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x Denhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖苷和20mg/ml 变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于约37-50℃在1x SSC中 清洗滤膜。技术人员将认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应 诸如探针长度等因素。

术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列 所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列例如包括启动子，任 选还包括操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、 多腺苷酸化信号和增强子。

若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操 作连接”的。例如，若前序列(presequence)或分泌前导序列(secretory leader) 的DNA表达成参与所述多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与多肽的 DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子 或增强子与所述编码序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促 进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接”意味着被连 接的多个DNA序列是毗邻的，而且在分泌前导序列的情况下意味着相邻且 在阅读上是同相的(in reading phase)。然而，增强子不一定是相邻的。连 接可以通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点， 那么依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

术语“贮存稳定的”用于描述配制剂具有对商业销售过程中的产品而 言可接受的保存期，例如在给定温度条件下至少12个月，优选在给定温度 条件下至少24个月。任选地，此类贮存稳定的配制剂含有不超过5％的聚 集物，不超过10％的二聚体，并且/或者电荷异质性或生物学活性变化最小。 蛋白质的降解途径可涉及化学不稳定性(即，涉及通过成键或生成新化学 实体的切割而修饰蛋白质的任何过程)或物理不稳定性(即，蛋白质高级 结构的变化)。化学不稳定性可以是，例如，脱酰胺作用、消旋作用、水 解作用、氧化作用、β-消除作用或二硫键交换作用的结果。物理不稳定性可 以是，例如，变性作用、聚集作用、沉淀作用或吸附作用的结果。最常见 的三种蛋白质降解途径是蛋白质聚集、脱酰胺和氧化。Cleland et al.Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4)：307-377(1993)。

如本文使用的，“可溶的”是指多肽在水溶液中完全溶解，产生肉眼 观察为澄清到轻微乳白色、无可见颗粒的溶液。可进一步通过测量340nm 到360nm的UV吸光度(用1cm长的比浊杯)来测定溶液的浊度(或蛋白溶 液的溶解度)，20mg/ml的浊度吸光度单位少于0.05。

“渗压剂(osmolyte)”是指赋予溶液重量摩尔渗透压浓度的张力调节 剂(tonicity modifier)或渗透压调节剂(osmotic adjuster)。重量摩尔渗透 压浓度是指离子和非离子化分子对溶液贡献的总渗透压活度。实例包括本 领域已知一般认为安全(GRAS)的无机盐诸如氯化钠、聚乙二醇、聚丙二 醇、糖诸如蔗糖或海藻糖、甘油、氨基酸、和糖醇诸如甘露糖醇。

“防腐剂”可起到防止配制剂中细菌、病毒和真菌扩增；抗氧化剂或其 它化合物可通过多种途径发挥作用来保持配制剂的稳定性。例子包括氯化 十八烷基二甲基苄基铵、氯化己烷双胺；苯扎氯铵(氯化烷基苄基二甲基 铵的混合物，其中烷基是长链化合物)和苯索氯铵。其它类型的化合物包 括芳香醇诸如苯酚和苯甲醇、对羟苯甲酸烷基酯诸如对羟苯甲酸甲酯或丙 酯、以及间苯甲酚。任选地，此类化合物是苯酚或苯甲醇。所述防腐剂或 其它化合物将任选地包含在液体或含水形式的Apo2L/TRAIL配制剂中，但 通常不包含在冻干形式的配制剂中。在后一种情况下，所述防腐剂或其它 化合物通常将存在于供重建用的注射用水(WFI)或注射用抑菌水(BWFI) 中。

“表面活性剂”可起到减少配制剂中蛋白质的浊度或变性的作用。表 面活性剂的例子包括非离子型表面活性剂诸如聚山梨醇酯，例如聚山梨醇 酯20、60或80；泊洛沙姆(poloxamer)，例如泊洛沙姆184或188；Pluronic 多元醇；乙烯/丙烯嵌段聚合物或者本领域已知为GRAS的任何其它表面活 性剂。任选地，表面活性剂是聚山梨醇酯或泊洛沙姆。

本文所用的“缓冲剂”是指GPAS的任何合适的缓冲剂，通常赋予大 约6到大约9的pH，任选大约6.5到大约8.5，任选大约7到大约7.5，如 果多肽是Apo2L/TRAIL的话。实例包括Tris、Hepes、三乙醇胺、组氨酸或 本领域已知具有所需效果的任何其它缓冲剂。

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一 细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统 的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人 生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松 驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH) 和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催 乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺 激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生 成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子；转化生长 因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成 素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和 -γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；及其它多肽因子，包括LIF 和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重 组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。

术语“细胞毒剂”如本文所用，指抑制或阻止细胞的功能或导致细胞 破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰和Re¹⁸⁶)， 化疗剂，和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活毒素，或其片段。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类 (alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺 (cyclophosphamide)(CYTOXAN^TM)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白 消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类 (aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派 (meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类 (methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺 (triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代 磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)； 番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮 (bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康 (topotecan)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新 (adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻 素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)； duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素 (eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类 (nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、 胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺 (ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾 醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶 氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯 脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫 司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类(enediyne) 抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γlI和加利车 霉素phiI1，参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994)；蒽环 类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸 如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素 (neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素 (aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨 酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、 洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、 放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、 6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(Adriamycin^TM)(包括吗啉 代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、 表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗 霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸 (mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛 霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素 (quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星 (streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁 (zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate) 和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤 (methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物， 诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤 (thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、 阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷 (cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺 他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮 (calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇 (epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸 如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶 酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖 苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧 啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲 沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌 (diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素 (epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖 (lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如 美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托 蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他 丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌 (losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙 卡巴肼(procarbazine)；；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃 (sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三 亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤 其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素 (anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)； 甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇 (mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside) (“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类 (taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(，Bristol-Myers Squibb Oncology， Princeton，NJ)和多西他塞(doxetaxel)(，-Poulenc Rorer， Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine) (Gemzar^TM)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤 (methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱 (vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺 (ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨 (vinorelbine)(Navelbine^TM)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达 曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；xeloda； 伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基 鸟氨酸(difluoromethylornithine)(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸 (retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；以及任何上述物质的药剂学可接受 的盐、酸或衍生物。该定义还包括担负调节或抑制作用于肿瘤的激素的抗 激素制剂例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，包括例如他莫 昔芬(tamoxifen)(包括Nolvadex^TM)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬 (droloxifene)、4-羟基他莫昔芬(hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、那 洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)、和托瑞米芬 (toremifene)(Fareston^TM)；抑制芳香化酶的芳香化酶抑制剂，其调节肾上腺 中雌激素的生产，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地 孕酮(megestrol acetate)(Megace^TM)、依西美坦(exemestane)、福美坦 (formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)(Rivisor^TM)、来曲唑 (letrozole)(Femara^TM)、和阿那曲唑(anastrozole)(Arimidex^TM)；以及抗雄激素 例如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、 亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任何一种的药学上 可接受的盐、酸或衍生物。

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是过 表达本文提及的任何基因的癌细胞之生长的化合物或组合物。如此，生长 抑制剂可以是显著降低处于S期的过表达此类基因的细胞百分比的药剂。 生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂， 诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类 (vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、泰素(taxol)、和拓扑 异构酶II抑制剂诸如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉 素。那些阻滞G1的药剂也延及S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔 芬、泼尼松、达卡巴嗪、双氯乙基甲胺、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和 ara-C。更多信息可参见《The Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel 编，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”， Murakami等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。

为本文的目的，“生物学活性的”或“生物学活性”的意思是：(a)作 为单独的药剂单用或者与化疗剂组合，在至少一类哺乳动物癌细胞或感染 病毒的细胞中具有体内或离体(ex vivo)诱导或刺激凋亡的能力；(b)能够激 发产生抗体，即具有免疫原性；(c)能够结合和/或刺激Apo2L/TRAIL的受 体(此类受体可包括DR4受体、DR5受体、OPG、DcR1受体和DcR2受体)； 或(d)保持天然或天然存在的Apo2L/TRAIL多肽的活性。用于确定生物学 活性Apo2L/TRAIL的测定可以使用本领域已知的方法来进行，诸如DNA 片段化(参见例如Marsters et al.Curr.Biology，6：1669(1996))；胱天蛋白 酶失活、DR4结合、DR5结合(参见例如WO98/51793，公布于1998年11 月19日)，DcR1结合(参见例如WO98/58062，公布于1998年12月23 日)，DcR2结合(参见例如WO99/10484，公布于1999年3月4日)，以 及PCT申请WO97/01633、WO97/25428、WO01/00832和WO01/22987中 描述的测定法。

术语“凋亡”和“凋亡活性”以广义使用，指哺乳动物中有序或受控 形式的细胞死亡，通常伴随着一种或多种特征性细胞变化，包括细胞质浓 缩、质膜微绒毛丧失、细胞核节段化、染色体DNA降解或线粒体功能丧失。 此活性可使用本领域众所周知的方法来测定和测量，例如通过细胞生存力 测定法(例如Alamar蓝分析或MTT分析)、FACS分析、胱天蛋白酶活化、 DNA片段化(参见例如Nicoletti等人，J.Immunol.Methods，139：271-279 (1991))，以及多聚ADP核糖聚合酶、“PARP”、切割分析来测定和 测量这种活性。

本文所用的术语“病症”(disorder)泛指可通过本文所述组合物的治疗而 受益的任何状态，包括可以用有效量的Apo2L/TRAIL等多肽治疗的任何疾 病或病症。这包括慢性和急性病症，以及那些使哺乳动物倾向于患有所述 病症的病理状态。本文要治疗的病症的非限制性例子有良性和恶性癌症； 炎性病症、血管发生性病症和免疫病症；自身免疫性病症、关节炎(包括 类风湿性关节炎)、多发性硬化和HIV/AIDS。

术语“癌症”、“癌性”(cancerous)和“恶性”(malignant)指向或描述哺乳 动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限 于癌、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤和肉瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞 状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤、胃肠癌、肾癌、 卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫 内膜癌、肾的癌(kidney cancer)、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰 腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞癌(hepatoma)、 乳腺癌、结肠癌和头颈癌。任选地，癌细胞表达DR4和/或DR5受体。

本文中的术语“治疗”或“处理”(treating、treatment或therapy)指 根治性治疗(curative therapy)、预防性治疗(prophylactic therapy)和防止 性治疗(preventative therapy)。连续治疗或施用是指至少以天计算，不间 断地治疗一日或多日。间歇治疗或施用，或者说间歇地治疗或施用，是指 治疗不是连续性，而是周期性的。

术语“哺乳动物”在用于本文时指归入哺乳类的任何哺乳动物，包括 人、牛、马、犬和猫。在本发明的一个优选实施方案中，哺乳动物是人。

术语“多元醇”在用于本文时泛指多羟基醇化合物。多元醇可以是例 如任何水溶性聚(亚烷基氧化物)聚合物，而且可具有线性链或分支链。优选 的多元醇包括那些在一个或多个羟基位置用化学基团诸如具有1至4个碳 的烷基取代的多元醇。典型的是，多元醇是聚(亚烷基二醇)，优选聚(乙二 醇)(PEG)。然而，本领域技术人员认识到，其它多元醇诸如聚(丙二醇)和聚 乙烯-聚丙二醇共聚物可用于偶联蛋白质和其它生物分子。本发明的多元醇 包括本领域众所周知的那些类型以及可公开获得，诸如从商业来源获得的 那些类型。

B.用于实施本发明的示例性方法和材料

本发明提供用于回收和纯化Apo2L/TRAIL的方法。具体地，本发明提 供牵涉结晶的方法，用于从Apo2L/TRAIL伴随其它污染物质的诸如污染蛋 白质和其它杂质混合物中回收和纯化Apo2L/TRAIL。在一个具体的实施方 案中，本发明提供从重组宿主培养物或细胞溶解物，诸如产Apo2L/TRAIL 的大肠杆菌重组宿主细胞的细胞溶解物中回收和纯化Apo2L/TRAIL的方 法。

这些纯化方法是基于一个出人意料的发现，即Apo2L/TRAIL在某些缓 冲系统中容易自发结晶。这个发现使得在Apo2L/TRAIL纯化方案中使用结 晶作为高效的纯化步骤成为可能。具体地，本发明的基础实验工作已经表 明，在Apo2L/TRAIL和表现类似自发结晶倾向的其它蛋白质的纯化过程中， 可以将结晶作为一个步骤加以执行。与使用多个色谱纯化步骤而不进行结 晶的传统纯化方案相比，纯化方案中引入结晶步骤，可以在减少纯化过程 的步骤的同时保持相似的收率。由此，在纯化过程中引入结晶可明显节约 时间和成本而无损于效率、产品产率或产品质量。

B.1 Apo2L/TRAIL的产生

下面的说明涉及通过培养用含有编码Apo2L/TRAIL的核酸的载体转化 或转染过的宿主细胞，并从细胞培养物回收多肽来产生Apo2L/TRAIL的方 法。

编码Apo2L/TRAIL的DNA可从任何cDNA文库获得，所述cDNA文 库是从认为具有Apo2L/TRAIL mRNA且以可检测水平表达它的组织制备 的。因此，人Apo2L/TRAIL DNA可方便地从以人组织制备的cDNA文库 获得，诸如WO 97/25428中所述的人胎盘cDNA的噬菌体文库。 Apo2L/TRAIL编码基因还可从基因组文库或通过寡核苷酸合成获得。

可用为鉴定目的基因或其编码的蛋白质而设计的探针(诸如针对 Apo2L/TRAIL的抗体或至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库。可使 用标准流程用选定探针对cDNA或基因组文库进行筛选，诸如Sambrook等 人，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，New York，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中所述。另一种可选的分离编码Apo2L/TRAIL 的基因的方法是采用PCR方法学(Sambrook et al.见上文；Dieffenbach et al. PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1995)。

Apo2L/TRAIL的氨基酸序列片段或变体可通过在Apo2L/TRAIL DNA 中引入适宜的核苷酸变异或者通过合成期望的Apo2L/TRAIL多肽来制备。 此类片段或变体代表了图1(SEQ ID NO：1)为全长Apo2L/TRAIL所示胞内 区、跨膜区或胞外区氨基酸序列内、或者一端或两端的残基插入、替代和/ 或删除。可进行任意组合的插入、替代和/或删除以获得最终的构建物，只 要最终的构建物具有，例如，期望的生物学活性或本文所定义的凋亡活性。 在一个优选的实施方案中，所述片段或变体与本文Apo2L/TRAIL的胞内域、 跨膜域或胞外域或者Apo2L/TRAIL的全长序列具有至少约80％的氨基酸序 列同一性、更优选至少约90％的序列同一性、甚至更优选至少95％、96％、 97％、98％或99％的序列同一性。氨基酸变化还可能改变Apo2L/TRAIL的 翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特性。

如上所述Apo2L/TRAIL序列中的变异可利用美国专利5,364,934中关 于保守和非保守突变所列任何技术和指导方针来产生。这些包括寡核苷酸 介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。

可采用扫描氨基酸分析沿着连续的序列鉴定一个或多个氨基酸。优选 的扫描氨基酸中是相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨 酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这一类中的优选扫描氨基酸，因为 它消除了β-碳的侧链且不大可能改变变体的主链构象(Cunningham et al. Science，244：1081(1989))。丙氨酸通常还因为它是最常见的氨基酸而成为 优选的。此外，在隐藏的和暴露的位置都经常可以找到它(Creighton，《The Proteins》，W.H.Freeman&Co.NY；Chothia，J.Mol.Biol.150：1(1976))。

本发明的具体Apo2L/TRAIL变体包括这样的Apo2L/TRAIL多肽，它 们包含已公布的PCT申请WO 01/00832的表I提供的一种或多种丙氨酸替 代。此类Apo2L/TRAIL变体通常会包含非天然存在的氨基酸序列，该序列 与天然Apo2L/TRAIL序列(如图1SEQ ID NO：1所示的全长或成熟形式的 Apo2L/TRAIL或其胞外域序列)至少有一个或多个氨基酸不同。任选地， 所述在Apo2L/TRAIL变体中与天然Apo2L/TRAIL中比较有所不同的一个 或多个氨基酸将包括WO 01/00832的表I中所示的氨基酸替代。本发明的 Apo2L/TRAIL变体包括可溶性Apo2L/TRAIL变体，其包含图1(SEQ ID NO：1)的残基91-281、92-281、95-281或114-281且具有一个或多个氨基 酸替代。优选的Apo2L/TRAIL变体将包括这样的变体：它们包含图1(SEQ ID NO：1)的残基91-281、92-281、95-281或114-281，并具有一个或多个 增强生物学活性(诸如受体结合)的氨基酸替代。一个特别优选的变体包 含图1(SEQ ID NO：1)的残基114-281。在一个具体的实施方案中， Apo2L/TRAIL由图1(SEQ ID NO：1)的残基114-281组成。

如2001年1月4日公布的WO 01/00832所述，鉴定了Apo2L/TRAIL 胞外域的x射线晶体结构，并进行了丙氨酸扫描诱变以提供其受体接触区 域的定位。所获得的Apo2L/TRAIL结构揭示了一种同源三聚体蛋白，它含 有新的二价金属离子(锌)结合位点，该位点协调Apo2L/TRAIL三聚体分 子中三个亚基的相互作用。和TNF家族的其它成员类似，Apo2L/TRAIL表 现为包含由三个薄卷饼型单体形成的紧密的三聚体，这些单体包埋大约 5100平方埃(每个单体1700平方埃)而形成球状三聚体。核心β折叠链的 位置与TNF家族其它结构已表征的成员--TNF-α、TNF-β和CD40L相比 具有良好的保守性(与TNF-α或TNF-β的核心折叠链相比时)。

也包含在本发明的范围的Apo2L/TRAIL序列的变化涉及氨基末端衍生 物或修饰的形式。这样的Apo2L/TRAIL序列可包括如本文所述的、在多肽 序列N末端具有甲硫氨酸或修饰的甲硫氨酸(诸如甲酰甲硫氨酰或其它各 种嵌段甲硫氨酰物质)的Apo2L/TRAIL多肽。

可将编码天然或变异Apo2L/TRAIL的核酸(例如cDNA或基因组DNA) 插入可复制载体以便进一步克隆(DNA扩增)或表达。有多种载体是可公 开获得的。载体构件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制 起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列，它 们在下文中都有描述。可采用的任选的信号序列、复制起点、标志基因、 增强子元件和转录终止子序列是本领域已知的且更为详细的描述于WO 97/25428。

表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别且与Apo2L/TRAIL核酸 序列可操作连接的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5′侧) (通常在大约100至1000bp内)且控制与其可操作连接的特定核酸序列诸 如Apo2L/TRAIL核酸序列的转录和翻译的非翻译调控序列。此类启动子通 常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的某些 变化(如营养物的存在与否或温度变化)而使其控制下的DNA的转录水平 升高的启动子。现在，众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。 通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入载体， 由此将这些启动子与Apo2L/TRAIL编码DNA可操作连接。天然 Apo2L/TRAIL启动子序列和许多异源启动子都可用于指导 Apo2L/TRAILDNA的扩增和/或表达。

适用于原核和真核宿主的启动子是本领域已知的，而且更为详细的描 述于WO 97/25428。

用于在大肠杆菌中生成可溶性Apo2L/TRAIL的优选方法采用诱导型启 动子来调节产物表达。使用可控的诱导型启动子，可在诱导产物表达并大 量积聚宿主可能不太耐受的产物之前将培养物培养至期望细胞密度。

为了表达Apo2L/TRAIL(氨基酸114-281)，申请人评估了多种诱导型 启动子系统(包括T7聚合酶、trp和碱性磷酸酶(AP))。使用T7聚合酶、 trp和碱性磷酸酶启动子这三种启动子之一导致从收获的细胞团中回收到大 量可溶性、生物学活性的Apo2L/TRAIL三聚体。另一种可选的启动子是磷 酸甘油启动子系统。

包含一种或多种上述构件的合适载体的构建采用标准连接技术。将分 离的质粒或DNA片段切割、剪裁、并以期望方式重新连接以产生所需质粒。

为了分析证实所构建质粒中的序列正确，可用连接混合物转化大肠杆 菌K12菌株294(ATCC 31，446)并在通过氨苄青霉素或四环素抗性(视情 况而定)选择成功的转化子。从转化子制备质粒，通过限制性内切核酸酶 消化进行分析，和/或使用本领域已知的标准技术进行测序(参见例如 Messing et al.Nucleic Acids Res.1981，9：309；Maxam et al.Methods in Enzymology，1980，65：499)。

可采用有助于在哺乳动物细胞中编码Apo2L/TRAIL配体的DNA的瞬 时表达的表达载体。通常，瞬时表达涉及使用能够在宿主细胞中高效复制 的表达载体，使得宿主细胞积聚许多拷贝的表达载体并继而高水平的合成 由该表达载体编码的期望多肽(Sambrook et al.见上文)。包含合适表达 载体和宿主细胞的瞬时表达系统可供方便地正向鉴定(positive identification) 由所克隆的DNA编码的多肽，以及对所述多肽快速筛选期望生物学或生理 学特性。因此，瞬时表达系统在本发明中特别可以用来鉴定是生物学活性 Apo2L/TRAIL的Apo2L/TRAIL类似物和变体。

可适用于在重组脊椎动物细胞培养物中合成Apo2L/TRAIL的其它方 法、载体和宿主细胞描述于Gething et al.Nature，293：620-625(1981)；Mantei et al.Nature，281：40-46(1979)；EP 117,060；EP 117,058。

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母或 高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括但不限于真细菌(Eubacteria)， 诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)， 诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属 (Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变 形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacillus)诸如 枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989 年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属 (Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属 (Streptomyces)。优选的是，宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶。

大肠杆菌是用于本发明的优选宿主细胞。大肠杆菌尤其适于表达 Apo2L/TRAIL(包括图1的氨基酸114-281)这种大小在20kd以下、无需 糖基化的多肽。作为生产宿主，大肠杆菌可以培养至较高的细胞密度，而 且可以产生较高水平的异源蛋白。

除了原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适于 Apo2L/TRAIL编码载体的克隆或表达的宿主。适用于表达糖基化 Apo2L/TRAIL的宿主细胞衍生自多细胞生物体。所有此类宿主细胞的例子， 包括CHO细胞，进一步描述于PCT申请WO 97/25428。

用上文为Apo2L/TRAIL生产而描述的表达或克隆载体转染，优选转化 宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因 而适当改动的营养培养基中培养。

转染是指宿主细胞对表达载体的摄取，无论任何编码序列事实上是否 被表达。普通技术人员知道许多转染方法，例如CaPO₄和电穿孔。当宿主 细胞内出现此载体运行的任何迹象时，通常认为转染是成功的。

转化是指将DNA导入生物体，使得该DNA可复制，或是作为染色体 外元件或是通过染色体整合体(integrant)。根据所用宿主细胞，使用适于此 类细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理，如Sambrook等，见上 文中所述，或者电穿孔，通常用于具有坚固细胞壁屏障的原核生物或其它 细胞。使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行的感染用于转 化某些植物细胞，如(Shaw et al.Gene，23：315(1983)和PCT申请WO 89/05859)所述。此外，可使用超声处理转染的植物，1991年1月10日公 开的PCT申请WO 91/00358对此有描述。

对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可采用磷酸钙沉淀法(Graham and van der Eb，Virology，52：456-457(1978))。美国专利4,399,216描述了哺 乳动物细胞宿主系统转化的一般情况。对酵母的转化通常依照Van Solingen et al.J.Bact.1977，130：946和Hsiao et al.1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 76：3829的方法进行。然而，还可使用将DNA导入细胞的其它方法，诸如 通过核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞融合、或聚阳离子例 如polybrene、聚鸟氨酸。关于转化哺乳动物细胞的各种技术参见Keown et al. Methods in Enzymology，1990，185：527-537和Mansour et al.Nature，1988， 336：348-352。

用于生产Apo2L/TRAIL的原核细胞可在合适的培养基中培养，通常如 Sambrook et al.见上文中所述。可用于培养大肠杆菌的培养基的具体形式 进一步描述于PCT申请WO01/00832。在一种特别优选的方法中，使用锌 源和磷酸甘油发酵制备产生Apo2L/TRAIL的大肠杆菌(包含图1的氨基酸 114-281)。发酵效价优选在大约4到约6g/l的范围。

用于产生Apo2L/TRAIL的哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培 养。

商品化培养基的例子包括Ham’s F10(Sigma)、Minimal Essential Medium (“MEM”，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (“DMEM”，Sigma)。任何此类培养基都可根据需要补充激素和/或其它生长因 子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁 和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷(诸如腺苷和胸苷)、抗生素 (诸如Gentamycin^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓 度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以本领域技术人员知 道的适宜浓度包括任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等就是先 前为了表达而选择用于宿主细胞的那些培养条件，而且对于普通技术人员 是显而易见的。

一般而言，用于哺乳动物细胞培养物生产力最大化的原理、方案和实 用技术可参阅《Mammalian Cell Biotechnology：A Practical Approach》， M.Butler编，IRL出版社，1991。

Apo2L/TRAIL的表达可以在样品中直接测量，例如以本文提供的序列 为基础，使用适当标记的探针，通过常规的Southern印迹、定量mRNA转 录的Northern印迹(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1980，77： 5201-5205)、斑点印迹(DNA分析)或原位杂交。可采用多种标记物，最 常用的是放射性同位素，特别是³²P。然而，也可采用其它技术，诸如使用 供导入多核苷酸的生物素修饰的核苷酸。然后该生物素充当结合亲合素或 抗体的位点，所述亲合素或抗体可用很多种标记物进行标记，诸如放射性 核苷酸、荧光剂或酶。或者，可采用能识别特定双链体的抗体，所述双链 体包括DNA双链体、RNA双链体、和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白 质双链体。抗体继而可进行标记，并可进行这样的测定法，其中使双链体 结合到某一表面上，使得在该表面上形成双链体后，可检测与双链体结合 的抗体的存在。

或者，可通过免疫学方法来测量基因表达，诸如细胞或组织切片的免 疫组织化学染色和细胞培养物或体液的测定法，以对基因产物的表达进行 直接定量。关于免疫组织化学染色技术，通常通过脱水和固定来制备细胞 样品，随后与对所偶联基因产物特异的经标记抗体进行反应，其中标记物 通常是可直观检测的，诸如酶标记物、荧光标记物、发光标记物等。

可用于免疫组织化学染色和/或体液样品测定法的抗体可以是单克隆的 或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可针对天然 Apo2L/TRAIL多肽或针对基于本文所提供的DNA序列的合成肽或针对与 Apo2L/TRAILDNA融合且编码特异抗体表位的外源序列制备抗体。

Apo-2L多肽可共价连接(以下称为“偶联”)有一种或多种化学基团。 适用于本发明Apo-2L偶联物的化学基团优选没有显著毒性或免疫原性。可 与多肽偶联的多种例示性化学基团是本领域已知的，包括例如碳水化合物， 诸如天然存在于糖蛋白上的碳水化合物、多谷氨酸(酯/盐)、和非蛋白质聚 合物诸如多元醇(参阅例如美国专利6,245,901)。

例如，可将多元醇与多肽诸如Apo-2L在一种或多种氨基酸残基(包括 赖氨酸残基)处偶联，正如WO 93/00109，见上文中所公开的。所采用的多 元醇可以是任何水溶性聚(亚烷基氧化物)聚合物，而且可具有线性链或分支 链。合适的多元醇包括那些在一个或多个羟基位置被化学基团(诸如具有1 至4个碳的烷基)取代的多元醇。典型的是，多元醇是聚(亚烷基二醇)，诸 如聚(乙二醇)(PEG)，因此，为了便于描述，余下讨论涉及例示性实施方案， 其中所采用的多元醇是PEG且将多元醇与多肽偶联的过程称为“PEG化” (pegylation)。然而，本发明技术人员认识到，其它多元醇诸如例如聚(丙二 醇)和聚乙烯-聚丙二醇共聚物可利用本文中关于PEG描述的偶联技术得以 采用。

Apo-2L PEG化中所采用的PEG的平均分子量可有所变化，通常范围可 以是约500至约30,000道尔顿(D)。优选的是，PEG的平均分子量是约1,000 至约25,000D，更优选约1,000至约5,000D。在一个实施方案中，使用平 均分子量约1,000D的PEG进行PEG化。任选的是，PEG同聚物是未取代 的，但它也可以在一端被烷基取代。优选的是，所述烷基是C1-C4烷基， 最优选甲基。PEG制品可商购，通常适用于本发明的那些PEG制品是依照 平均分子量出售的非同质制品。任选的是，Apo-2L三聚体是以这样的方式 PEG化的，使得PEG分子与构成三聚体Apo-2L的三个单体中的一个、两 个或每个连接或偶联。在这样的一个实施方案中，优选所采用的PEG的平 均分子量为约1,000至大约5,000D。还设想了Apo-2L三聚体可以是“部分” PEG化的，即其中构成三聚体的三个单体中只有一个或两个与PEG连接或 偶联。

本领域知道用于蛋白质PEG化的多种方法。生成与PEG偶联的蛋白质 的具体方法包括美国专利4,179,337、美国专利4,935,465和美国专利 5,849,535中记载的方法。通常，蛋白质经由该蛋白质的一个或多个氨基酸 残基与聚合物的末端反应性基团共价键合，主要取决于反应条件、聚合物 的分子量、等等。具有反应性基团的聚合物在本文中称作活化的聚合物。 反应性基团选择性地与蛋白质上的游离氨基或其它反应性基团起反应。PEG 聚合物可与蛋白质上的氨基或其它反应性基团以随机或位点特异的方式偶 联。

B.2 Apo2L/TRAIL的结晶

结晶广泛地应用于小分子的纯化。但是一般来说，结晶技术尚未广泛 地应用于蛋白质，因为多种参数可能影响蛋白质结晶，包括例如溶解度、 成核作用(nucleation)和生长速度、以及晶体粒度分布(每一种均为诸如溶解 度、温度、pH、缓冲剂、杂质等其它参数的函数)。由于蛋白质一般比小 分子更难结晶，目前治疗用蛋白质的回收和纯化很少涉及结晶步骤。

申请人出人意料地发现，在5℃、中等到低离子强度条件下， Apo2L/TRAIL蛋白的固体状态是晶态的，这与本领域已知的其它多种蛋白 质在类似条件下为可溶性或形成无定形沉淀不同。另外发现，Apo2L/TRAIL 晶体的固态在变为环境温度(即室温)时可逆地溶解，而并不损失蛋白质 的生物学活性或对蛋白质的生化特性产生不利影响。该观察结果与本领域 中其它蛋白质观察到的变性或不可逆沉淀完全不同。

任选地，将Apo2L/TRAIL蛋白的过饱和溶液从大约20℃到大约30℃ 冷却到大约15℃以下，优选约2～8℃，更优选大约2-8℃以下，甚至更优 选大约4℃以下，最优选到大约2～4℃，来制备Apo2L/TRAIL晶体。任选 地，为了引发自发结晶，Apo2L/TRAIL浓度可以为3g/L以上。在较低的蛋 白浓度，可以使用抗溶剂(antisolvent)来引发自发结晶。结晶可以按分批或 半分批模式，以从几个毫升到数百升溶液的宽范围的规模进行。结晶速度 可以通过程序化的冷却和搅拌来控制。设备可以包括，但不限于，具有表 面和/或内部温控装置的搅拌槽或静态槽。在搅拌槽中，可以使用内部挡板 和引流管来促进混合。还可以通过加晶种来控制晶核生成[Moore，AIChE Practical Engineering Perspecitives，Distillation and Other Industrial Separations， pp 239-245]。过饱和的程度、盐组成、冷却速率、搅拌速率和晶种添加，以 及其它参数，可以影响结晶形成效率、晶体粒度分布和晶体产率。

任选的是，为了制备晶体，Apo2L/TRAIL蛋白质溶液含有硫酸钠或氯 化钠。任选的是，盐浓度为大约100mM到大约200mM，且任选pH为大 约6到大约9(优选地，pH为大约6.5到大约8.5)。

B.3结晶在Apo2L/TRAIL回收和纯化中的使用

在本发明的方法中，结晶是Apo2L/TRAIL回收和纯化中的步骤，任选 地也是用于Apo2L/TRAIL回收和纯化的单柱或双柱流程中的步骤。

在一个具体的实施方案中，使用包含结晶步骤的纯化方法，从重组宿 主培养物或细胞溶解物，或从澄清过的细胞溶解物纯化Apo2L/TRAIL。如 果Apo2L/TRAIL在大肠杆菌中产生，则通常收获全细胞培养液，再将其匀 浆以破裂大肠杆菌细胞并释放出细胞质中的可溶性Apo2L/TRAIL。去除固 体碎片(例如通过离心)后，将混合物加载到阳离子交换色谱树脂例如 SP-Sepharose Fast Flow或CM-Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia， Sweden)上。实施例2和3中提供了从大肠杆菌发酵所得细胞培养液中纯 化Apo2L/TRAIL的典型规程。

在一个典型的规程中，将通过大肠杆菌发酵获得的全细胞培养液的pH 调整到大约7.5，例如通过添加HEPES钠或任何其它合适的缓冲剂。优选 的是，添加还原剂，诸如1，4-二硫代-苏糖醇或β-巯基乙醇，以防止非共价 结合的Apo2L/TRAIL单体之间形成二硫键。使细胞通过可商购的高压匀浆 机匀浆一次或多次以将其破裂，去除细胞碎片，再澄清细胞溶解物。具体 的处理参数，诸如试剂的选择和浓度，取决于起始的全细胞培养液的组成， 例如细胞密度。

然后将含Apo2L/TRAIL的混合物，诸如澄清后的细胞溶解物，加载到 使用第一阳离子交换树脂的第一色谱柱上。阳离子交换色谱通过树脂表面 上本质为酸性的带电基团与组氨酸、赖氨酸和精氨酸之间的相互作用保留 生物分子。阳离子交换树脂可以从多个制造商，例如Sigma Aldrich的产品 线商购。阳离子交换介质包括携带例如羧甲基官能团的树脂(弱阳离子交 换介质，诸如CM cellulose/Sephadex)或携带磺酸官能团的树脂(强阳离子 交换介质，诸如SP Sephadex)。在本发明的方法的第一纯化步骤中，优选 强阳离子交换柱，例如SP-Sepharose、Spectra/Gel强阳离子交换介质等， TSKgel强阳离子交换介质等等。在SP-Sepharose柱的情况下，具有带负电 官能团的交联琼脂糖基质与Apo2L/TRAIL结合，同时允许大部分杂质和 Apo2L/TRAIL变体通过柱子。洗脱可以使用盐梯度洗脱或分步洗脱来进行， 优选的是分步洗脱，因为它为后续结晶步骤提供更好的条件，而不损害产 率。洗脱缓冲液通常含有氯化钠或硫酸钠，且选择盐浓度以满足阳离子交 换柱和后续结晶步骤的需要。SP-Sepharose柱需要相当高的盐浓度以去除 结合的Apo2L/TRAIL蛋白，而对于后续的结晶步骤而言，优选相对较低的 盐浓度以降低蛋白质的溶解度。典型的是使用大约100-150mM Na₂SO₄或 100-200mM NaCl的浓度。一种典型的洗脱缓冲液由200mM NaCl、50mM HEPES、0.05％Triton X-100、1mM DTT，pH 7.5组成。

在阳离子交换例如SP-Sepharose洗脱总产物(elution pool)中， Apo2L/TRAIL的浓度影响着后面结晶步骤的理论产率。浓度必须足够高以 使得较低温时的溶解度差异最大化，但不能太高而在室温或接近室温引起 自发结晶。

在一个代表性的实施方案中，在加载和洗脱Apo2L/TRAIL蛋白之间使 用两个冲洗步骤。第一次冲洗使用平衡缓冲液，第二次冲洗是盐冲洗，所 用的缓冲液除了使用较低的盐浓度以外(例如100mM NaCl而不是200mM NaCl)，与后续的洗脱缓冲液相同。

SP洗脱步骤，包括两个冲洗步骤，通常产生约3-6g/L的Apo2L/TRAIL 浓度，诸如大约5g/L，产率大约为80-90％。盐冲洗步骤导致活性蛋白质的 损失，因此，若去掉该步骤，产率可提高到超过95％。但是，去掉该步骤 也会降低柱子去除内毒素和胞外蛋白的能力，从而降低纯度。

对离开离子交换柱的洗脱总产物(elution pool)直接进行结晶，而不进行 任何进一步的纯化步骤，但任选包括无菌过滤。结晶通常是通过将温度从 大约15-30℃经过一段时间逐渐降低到大约2至8℃，这段时间可长达60个 小时，但通常较短些，例如大约1到8个小时。

在一个典型的结晶方法中，将离开离子交换柱的洗脱总产物转移到充 分搅拌的温控槽中。重要的是保证容器和蛋白质溶液在结晶前不含任何颗 粒，以避免发生基于这些固体颗粒的成核作用，该作用可影响结晶动力学。 对于小规模的应用，例如，可以使用1升或2升的Applikon反应容器。在 1升反应容器中，通过浸入容器的冷却蛇管来控制温度。2升反应容器含有 热交换夹套。在两种容器中都可以使用可编程热交换浴(例如Polyscience Programmable Temperature Circulator Model 1157)产生线性温度变化。所述 容器通常装有搅拌器，用来充分混合溶液并且一旦晶体生成即将其悬浮。 搅拌速率对于0.4升规模通常大约为250rpm，对于更大的总产物，通过保 持恒定功率/体积比(constant power to volume ratio)，与N³/V成正比来放大 (恒定直径的搅拌器)。

已经发现，Apo2L/TRAIL的溶解度随着盐浓度增加而增加，并且 Apo2L/TRAIL在硫酸钠和氯化钠中可溶性大致相等。与硫酸钠中形成的外 观较平的晶体相比，氯化钠中形成的晶体具有更大的厚度。结果，氯化钠 中产生的晶体更容易通过过滤分离，因此氯化钠是优选的盐。作为背景缓 冲液，通常HEPES和TRIS提供的效果类似。

在大约pH7.0到8.0的范围内，Apo2L/TRAIL的溶解度随pH上升而降 低。较高的pH倾向于提高收率，但使晶体外观无定形程度更高。另外，pH 越高，晶体越大，也越脆。考虑到这些因素，产生期望的晶体形态的优选 pH是7.3±0.1。

结晶过程中使用的温度变化(通常为从大约环境温度到大约2℃)对大 约1到24小时之间的平均晶体粒度或粒度分布(size distribution)没有显著影 响。温度变化可以是线性的，但也可以使用非线性冷却速率，通过随着结 晶的进程维持恒定的过饱和水平来进一步改善晶体粒度分布(crystal size profile)。由于在本发明的缓冲系统中Apo2L/TRAIL直到温度低于大约8℃、 优选低于大约5℃时才自发结晶，因此有可能快速降温到10℃左右，再将 总产物缓慢冷却以供结晶。

晶体粒度受搅拌速率的影响。通过测试三种不同搅拌速率(100rpm、 175rpm和250rpm)，发现在最大搅拌速率下结晶最快，但对于175rpm和 250rpm的搅拌速率而言晶体粒度分布和晶体外观是相似的。在较低的速率 下，晶体悬浮不完全，可发生晶体聚集。在较高的搅拌速率下，应注意不 要让可溶性蛋白因暴露于气/液界面上的剪切作用而遭到破坏。

通过降低Apo2L/TRAIL的溶解度可改善结晶效率。因此，从第一阳离 子交换色谱柱收集的冷却的总产物(pool)中Apo2L/TRAIL的溶解度部分地 控制着结晶步骤的总体产率。影响产率的两个因素为：从第一阳离子交换 色谱柱(例如SP柱)收集的洗脱总产物中Apo2L/TRAIL的初始浓度，和 晶体浆中可溶性Apo2L/TRAIL的浓度(即不结晶的Apo2L/TRAIL的量)。 结晶之后仍在溶液中的Apo2L/TRAIL将在过滤中丧失掉。添加抗溶剂可以 改变溶液化学从而降低平衡溶解度：

百分比理论产率＝[Apo2L]_22C-[Apo2L]_4C/[Apo2L]_22C×100％，

其中下标数字表示温度值。

通过减少溶液中的Apo2L/TRAIL，当滤去母液时被除去的蛋白质较少。 抗溶剂，又称沉淀剂，在本领域是公知的，可以通过多种方式起作用。某 些抗溶剂通过吸收水分使溶液脱水。这样就显著降低了可供溶解蛋白质的 水活度(参见，例如，McPherson，A.1998，Crystallization of Biological Macromolecules.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Plainview NY)。

一种广泛应用的抗溶剂是聚乙二醇(PEG)，它是一种以很多种可用分 子量存在的聚合物。如实施例中所示，在本发明的方法中较高分子量的PEG (3350和10000)提供了较好的结果。其它可用作抗溶剂的聚合物包括， 例如，Eudragit RS、乙基纤维素、异丙醇、乙醇、二氧杂环己烷和2-甲基-2，4- 戊二醇(MPD)。

当结晶完成时移出Apo2L/TRAIL晶体，例如通过过滤。可以使用内置 搅拌器在整个过滤通过中保持晶体悬浮，或者可以使其沉积在填充床中。 重要的是避免形成压缩性晶体饼(compressed crystal cake)，其可能使期望的 流速难以达到。因此，必须使跨越填充床的压差最小。流速可以变化，典 型地是大约200cm/hr和大约100cm/hr之间。流速可能取决于所用的设备， 以及过滤中施加的压差。过滤可以分批或连续进行。可以通过，例如，用 不会明显溶解Apo2L/TRAIL晶体的溶液洗涤沉积的晶体床来进行进一步的 纯化，其中所述溶液例如冷却过的(2-8℃)低摩尔浓度TRIS溶液，pH为 大约7.5。

结晶和分离后，可以将Apo2L/TRAIL晶体溶解和贮存或转化为适合期 望用途的配制剂。

或者，可以添加另一个色谱纯化步骤，通过去除抗溶剂(PEG)残余和 缓冲剂组分来进一步改善纯度，并降低残余胞外蛋白、内毒素、二聚体和 聚集物的水平。结晶之后使用的第二色谱柱可以是阳离子交换柱或疏水相 互作用柱。由于结晶总产物是非常纯的，通常不需要使用结合-洗脱 (bind-and-elute)的分离模式(例如SP-Sepharose或CM-Sepharose通常所 使用的)；穿过(flow-through)柱，诸如Phenyl Sepharose HIC树脂，通常 会表现良好的性能。在实施例中测试了使用这两类树脂，即结合-洗脱模式 的阳离子交换和穿过模式的HIC，并对结果进行了讨论。结果发现，结合- 分步洗脱色谱步骤是初始纯化的非常有力的工具，而在第二色谱纯化步骤 中，Phenyl-Sepharose上的疏水相互作用色谱足以提供期望的纯度和产率。 因为它是穿过步骤，与结合-洗脱色谱相比，它可提供优良的产率并减少完 成操作所需溶液的数目。

B4.Apo2L/TRAIL的用途

本发明的方法为例如需要多次柱纯化的纯化规程提供了一种有效、高 效、节约成本的替代方法。如上面讨论的，在一个实施方案中，本发明的 纯化流程涉及使用单个阳离子交换色谱柱，然后进行结晶。可以将通过本 发明的方法得到的Apo2L/TRAIL晶体干燥以便贮存。对晶状物料加以干燥， 还可以显著地减少贮存体积，并提供了一种有效的大批量贮存方法，可避 免将纯化物料在配制溶液中以低浓度冷冻。极高蛋白浓度的晶体浆可以在 较小容积的容器中冷冻。

在另一个实施方案中，收集Apo2L/TRAIL晶体，并用缓冲液(或水) (优选温度为大约2℃到8℃的冷缓冲液)洗涤。可以将洗涤过的晶体在环 境温度下重悬浮或重溶解。对于重溶解的Apo2L/TRAIL，可以通过疏水相 互作用色谱或第二个如上所述的阳离子交换色谱步骤加以纯化，重结晶， 洗涤，并作为湿的晶体总物料(wet crystal bulk material)贮存。或者，可以省 略疏水相互作用或其它色谱步骤而直接进行重结晶。

湿的晶体总物料可以在-20℃贮存，或者在环境温度(室温)下或2-8 ℃干燥以供贮存。优选的是，将经过干燥的晶体物料在含有精氨酸柠檬酸 盐(arginine succinate)的配制剂中重溶解。任选地，可以将这样的配制剂 无菌过滤和/或装到单独的剂量小瓶中，并冻干供以后重建(reconstitution)或 悬浮。任选地，可以将干燥后的晶状配制剂作为粉末装入小瓶中，并制成 溶液或悬浮液。干燥后的Apo2L/TRAIL晶体中的含水量以达到大约5％到 大约10％为宜。

Apo2L/TRAIL配制剂可应用于多种治疗和非治疗用途中。这些用途包 括治疗病症，诸如癌症、免疫相关病症或病毒病症的方法。此类治疗和非 治疗用途在例如WO97/25428、WO97/01633和WO01/22987中有进一步描 述。

在本发明使用本文公开的配制剂治疗病症的方法中，Apo2L/TRAIL的 配制剂可以通过包括输注或注射在内的任何适当技术直接施用于哺乳动 物。具体的施用途径将取决于例如患者的医疗史，包括使用Apo2L/TRAIL 时觉察到或预料到的任何副作用，以及要治疗的具体病症。胃肠外施用的 例子包括组合物的皮下、肌肉内、静脉内、动脉内和腹膜内施用。配制剂 优选作为多次使用的静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、肌肉内(i.m.)注射剂 或输注剂，颅内输注剂，或作为适于鼻内或肺内投递的气溶胶配制剂来施 用(肺内投递参见例如EP 257,956)。

应当指出在皮下和肌肉内注射中，注射剂的渗透压可能是重要的。注 射用溶液无论是低渗还是高渗在输注时均可能给患者造成疼痛。通常，对 于本文中的治疗性注射用配制剂，优选注射用溶液的相对重量克分子渗透 浓度(osmolarity)为大约300mosm到大约600mosm。

Apo2L/TRAIL也可以以持续释放制剂的形式施用。持续释放制剂的合 适例子包括包含该蛋白质的固态疏水聚合物半透性基质，这些基质的形式 为成形制品例如薄膜，或微胶囊。持续释放基质的例子包括纤维素衍生物 (例如羧甲基纤维素)、非水性介质中的乙酸异丁酸蔗糖酯(SABER^TM)、 聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯))(Langer et al.J.Biomed. Mater.Res.1981，15：167-277；Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982)或聚(乙 烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L- 谷氨酸酯的共聚物(Sidman et al.Biopolymers，1983，22：547-556)、不可降 解的乙烯-乙酸乙烯(Langer et al.见上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物 诸如Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微 球体)、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。一种任选的全身作用药物 递送方法涉及通过连续输注(使用例如持续释放设备或微型泵诸如渗透压 泵或皮肤贴)或注射(使用例如静脉内或皮下方法，包括单次推注施用) 来施用。

可以符合优质医疗规范的方式配制、剂量给药和施用本发明的抗体组 合物，同时考虑患者个体的临床状况、投递组合物的部位、施用方法、施 用日程安排及从业人员已知的其它因素。不是必需而是任选将抗体与目前 用于预防或治疗所讨论紊乱的一种或多种药剂一起配制。因此，为本文目 的的各种组分的“有效量”取决于这些考虑因素，是Apo2L/TRAIL或其它 药物对于哺乳动物带来生物利用度的量。

作为一般的建议，Apo2L/TRAIL多肽施用的总药物有效量将在基于患 者公斤体重大约1mg/kg/日到大约20mg/kg/日的范围，但如上文指出的， 这应该根据治疗学的考虑予以裁量。

虽然优选的是注射，输注设备可使用进行连续输注。还可以使用静脉 内用袋装溶液。

预计其它疗法也可以用于所述方法中。所述一种或多种其它疗法可包 括但不限于施行本领域已知且具体在上文章节I中进一步定义的放射疗法、 细胞因子、生长抑制剂、化疗剂、细胞毒剂、酪氨酸激酶抑制剂、ras法呢 基转移酶抑制剂、血管发生抑制剂和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。另 外，基于靶向肿瘤抗原的治疗性抗体诸如Rituxan^TM或Herceptin^TM及抗血管 发生抗体诸如抗-VEGF、或靶向Apo2L受体诸如DR5或DR4的抗体的疗 法。

化疗剂的制备和剂量给药方案可依照制造商的说明书进行，或者由技 术人员凭经验决定。此类化学疗法的制备和剂量给药方案也可参阅 《Chemotherapy Service》，M.C.Perry编，Williams&Wilkins，Baltimore， MD(1992)。

施用针对其它抗原的抗体可能是理想的，诸如结合CD20、CD11a、 CD18、CD40、ErB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、血管内皮生长因子(VEGF) 或其它TNFR家族成员(诸如DR4、DR5、OPG、TNFR1、TNFR2)的抗 体。或者/另外，可将两种或两种以上的抗体共同施用于患者，其中这些抗 体结合相同的本文公开的抗原，或两种或两种以上不同的本文公开的抗原。 有时，还给予患者一种或多种细胞因子也是有益的。在一个实施方案中， 将Apo2L配制剂与生长抑制剂共同施用。

Apo2L/TRAIL配制剂可以与此类其它药剂同时或顺序施用。例如，可 以施用Apo2L/TRAIL配制剂或化疗剂作为预处理(在施用任何此类其它药 剂之前)，诸如对本来对Apo2L/TRAIL的凋亡效应有抗性的癌细胞进行预 处理。

本发明还提供包含本文所述配制剂的试剂盒。典型的试剂盒包括供容 纳一种或多种上述赋形剂中的Apo2L/TRAIL的容器，优选小瓶；以及指示 使用者如何利用Apo2L/TRAIL配制剂的指导，诸如产品插页或标签。它可 优选地提供药用配制剂。优选的是，药用配制剂用于治疗癌症或免疫相关 病症。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器和试管。所述容器可以用 各种材料诸如玻璃或塑料制成。该容器装有有效诊断或治疗病症的 Apo2L/TRAIL配制剂，并且可具有无菌存取口(例如该容器可以是具有皮 下注射针可刺穿的塞子的静脉内使用的溶液袋或小管)。在容器上或与容 器相伴随的标签或包装插页表明该配制剂用于诊断或治疗所选的病症。该 制品还可包括另外的容器，其中包含注射用水、药学可接受的溶液、盐水、 林格氏(Ringer)溶液或右旋糖溶液。该制品还可包括从商业和使用者立场上 看适宜的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和带 有使用指导的包装插页。

本申请中引用所有专利、专利申请、出版物、产品说明和操作规程， 在此完整收入它们的公开作为参考。

实施例

下面的实施例是仅为说明的目的而提供的，并不意图以任何方式限制 本发明的范围。实施例中述及的可商购试剂，除了另有说明外，均按照制 造商的指示使用。下述实施例中以及整个说明书中以ATCC登录号标识的 细胞均来源于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection， Manassas，Virginia)。

实施例1 在大肠杆菌中产生Apo2L/TRAIL并通过多个色谱步骤(无 结晶)加以纯化

A.在大肠杆菌中在AP启动子的控制下表达由氨基酸114-281(见图 1)组成的Apo2L/TRAIL蛋白质(2001年1月4日公布的WO 01/000832 实施例8(A部分)中描述的制备和表达过程)，并通过由阳离子交换、羟 基磷灰石和疏水相互作用色谱组成的三个色谱步骤从大肠杆菌细胞溶解物 中将其纯化出来(WO 01/000832实施例8，C部分)。在所述第三个色谱 分离过程中，在600mM硫酸钠或400mM硫酸铵，50mM Tris，pH7.5中 洗脱Apo2L/TRAIL蛋白。

B.另一种纯化Apo2L/TRAIL的方法由4个色谱步骤和两个超滤/渗滤 (UFDF)步骤组成。将大肠杆菌生产过程获得的全细胞培养液匀浆，以破 裂大肠杆菌细胞并释放出细胞质中所含的可溶性Apo2L/TRAIL。然后通过 离心去除固体细胞碎片。

通过阳离子交换色谱(CEX)柱(SP-Sepharose Fast Flow柱)上的结合 和梯度洗脱来进行初始(primary)分离。然后将洗脱物转移到羟基磷灰石 (HA)色谱柱上，再进行疏水相互作用(Phenyl-Sepharose)色谱。经过一 个超滤/渗滤(UFDF)步骤后，将混合物加载到CM-Sephrose Fast Flow柱 上，通过最后的UFDF步骤浓缩洗脱的蛋白质。

实施例2 Apo2L/TRAIL结晶作为单柱纯化之后的回收和纯化方法

利用Apo2L/TRAIL在硫酸钠溶液中的结晶倾向作为从大肠杆菌提取物 纯化Apo2L/TRAIL蛋白的手段。使用下面的规程回收和纯化了重组 Apo2L/TRAIL，而对蛋白质质量没有产生不良影响。

将收获的衍生自大肠杆菌(实施例1中所述)的全细胞培养液用1.5M Hepes(或1.5M Tris)调节到pH 7.5，然后用匀浆机(Gaulin corporation， Everett，MA)以6,500psi匀浆。用含5mM DTT的纯水将匀浆物一对一稀 释。一旦溶液达到室温，即加入5％聚乙烯亚胺(PEI)至终浓度0.1％，将 溶液絮凝1～2小时。用BTPX205(Alfa Laval Separation AB，Sweden)连续进 料离心机将絮凝物料离心，再通过深层过滤加以澄清。用Triton-X100处理 澄清后的细胞溶解物(提取物)，Triton-X100的终浓度为0.5％。然后将处 理过的澄清细胞溶解物加载到在50mM Hepes(或50mM Tris)/0.05％ Triton-X 100/1mM DTT，pH 7.5中平衡的阳离子交换柱(SP-Sepharose FF 阳离子交换树脂，Amersham Pharmacia，Sweden)上。Apo2L/TRAIL结合 于柱子上，而未结合的蛋白质穿过柱子，用平衡缓冲液冲洗直至280nm吸 光度达到基线而除去。然后用3个柱体积的含0.1M NaCl的平衡缓冲液冲 洗柱子。用含0.1M NaCl(或0.1M Na₂SO₄)，Hepes、Tris和三乙醇胺各50 mM，0.05％Triton-X 100，以及1mM DTT缓冲剂，pH 7.8的溶液分步洗脱 Apo2L/TRAIL。

将从SP柱收集的、环境温度的Apo2L/TRAIL总产物置于带有加热和 冷却用隔热夹套的不锈钢槽中。该槽配有圆锥形底部和冲洗底阀以获得结 晶蛋白质的最大回收率。使用船用型叶轮在温和的混合条件下搅拌总产物。 使用温控托盘(skid)以1个小时的时间将温度从大约25℃线性变化到大约4 ℃。在总产物达到4℃后数分钟之内观察到了自发结晶。在这些条件下超过 12小时后，结晶因大体上达到了平衡溶解度而得以完成。然后将晶体捕获 在包含20μm烧结聚丙烯的过滤组件上。在晶体沉积在滤器表面上以后， 用冷却的20-50mM Tris，pH 7.5洗涤晶体。然后用与Apo2L/TRAIL SP总产 物体积相比等体积的洗涤缓冲液去除沉积晶体中残余的母液(上清液)。 洗涤后，通过在大约30℃使溶解缓冲液经过晶体床回流来将晶体溶解在100 mM硫酸钠/20mM Tris，pH7.5中。在大约4小时内观察到了晶体的溶解。 然后将溶解的纯化的Apo2L/TRAIL无菌过滤到容器中，在-70℃冷冻保存。

利用总大肠杆菌蛋白(ECP)ELISA测定法、鲎变形细胞溶解物(LAL) 试验及银染色SDS-PAGE来测定Apo2L/TRAIL制备物的纯度。ECP ELISA 如下进行：将亲和纯化的山羊抗全ECP抗体固定在微量滴定板的孔上，温 育样品然后温育辣根过氧化物酶偶联的ECP。然后使用邻苯二胺，通过在 微量滴定读板器上读取490nm吸光度对过氧化物酶活性定量。使用鲎凝块 溶解测定法(Limulus Amebocyte clot lysis assay)测定内毒素水平。在10到 20％梯度聚丙烯酰胺凝胶(Daiichi Pure Chemicals)上，用含0.1％SDS的 Tris-甘氨酸缓冲液进行银染色SDS-PAGE。用50mA恒定电流电泳直到染 料前线达到凝胶底部附近为止。用考马斯亮蓝或Merrill银染色法对凝胶进 行固定和染色。

根据实施例1中所述的方法，借助SEC、SDS-SEC、IEX和生物学活性 对蛋白质的质量加以评估。

表1所示是在60L发酵规模条件下，使用上述结晶方法回收的 Apo2L/TRAIL的纯度和质量。为了比较，还显示了经过如实施例1所述的 三步色谱方法纯化的参比标准品。

表1

如表1所示，工业生产规模的Apo2L/TRAIL制备物具有适于治疗用途 的高纯度。这些数据说明“单柱”步骤纯化的Apo2L/TRAIL蛋白是易于结 晶的，其与利用实施例1中描述的三柱纯化方法纯化的Apo2L/TRAIL蛋白 质相比，具有类似或更好的纯度。图3显示盐类型对单柱步骤纯化的 Apo2L/TRAIL的结晶的影响。对于部分纯化的Apo2L/TRAIL观察到了二价 金属所致的结晶“中毒”(poisoning)(图3)。

部分纯化的Apo2L/TRAIL的结晶(见表1)也没有对Apo2L/TRAIL生 化特性造成不良影响。这些数据提示，当重组表达的Apo2L/TRAIL处于部 分纯化的状态时，对它进行结晶是一种有效、高效和经济的纯化手段。任 选地，随后可用这样的晶体制备大批量干燥物料，用于贮存或制备控释制 剂。

实施例3 利用结晶的Apo2L/TRAIL回收和纯化方法，包含结晶后第 二色谱步骤(双柱纯化)

用1.5M Hepes(或1.5M Tris)将收获的衍生自大肠杆菌的全细胞培养 液(实施例1中所述)调整至pH 7.5。加入DTT至5mM以防止非共价结 合的单体之间形成二硫键。以6,500psi用匀浆机匀浆两次，破碎大肠杆菌 细胞。将用含5mM DTT的纯水将溶解物一对一稀释。一旦溶液达到室温， 即加入5％PEI至终浓度0.2％PEI。PEI导致细胞固形物絮凝，将该物料至 少混合30分钟，然后离心以实现彻底絮凝。离心后，用Cuno Maximizer 30/60SP深层过滤器(Cuno Incorporated，Meriden CT)将澄清的溶解物过滤。 在将澄清的溶解物加载到SP Sepharose柱上之前，用1M Na HEPES将pH 调整到7.5，并用含5mM DTT的水将电导率调整到9.5mS/cm以下。

如实施例2中描述的纯化方法，初始的捕获步骤选用SP-Sepharose树 脂这种强阳离子交换树脂。具有带负电荷官能团的交联琼脂糖基质与 Apo2L/TRAIL结合，而允许大多数杂质和Apo2L/TRAIL变体通过柱子。使 用下面所述的缓冲条件：200mM NaCl、50mM HEPES、0.05％Triton X-100、 1mM DTT，pH 7.5。

通过历时4小时从22℃到4℃的受控温度变化实现了SP洗脱总产物(SP elution pool)的结晶。将SP洗脱总产物无菌过滤，然后转移到充分搅拌的温 控槽中。重要的是要保证容器和蛋白质溶液在结晶前不含有任何颗粒。当 SP洗脱总产物冷却时自发产生了晶体，其平均弦长(chord length)以 Lasentec’s Focused Beam Reflectance Measurement(聚焦光束反射测量)技术 测得为44μm。晶体形态为六边形面，深度大约为最大弦长的一半。将总产 物在4℃保持大约1到2小时以使晶体生长速率减慢，然后加入50％ PEG3350使终浓度为5％PEG3350。PEG3350(抗溶剂)的加入降低了 Apo2L/TRAIL的溶解度，并促进了晶体进一步生长。

然后通过过滤移出形成的晶体，所述过滤可以是分批的或连续的。在 两种情况下均去除母液，并洗涤晶体以去除杂质和残余的溶剂。过滤在2-8 ℃条件下进行。利用虹吸或者通过对容纳晶体浆的槽加压，将晶体浆转移 到含5-20μm烧结钢、烧结聚丙烯或钢丝网滤器的布氏漏斗或真空吸滤器 (Nutsche type filter)，然后或者将晶体手工从滤器上刮下，或者将其溶解在 适于下一个纯化步骤的缓冲系统中。

在加载到CM-Sepharose柱上之前，将晶体溶解在0.5M精氨酸琥珀酸 盐/20mM TRIS/pH 7.2中。在加载到Phenyl-Sepharose柱上之前，将晶体溶 解在0.6mM Na₂SO₄/50mM TRIS/pH 7.5中。

结晶后的色谱步骤的作用是从结晶蛋白质总产物中去除PEG和缓冲液 组分，并至少适度地去除ECP、内毒素、二聚体和聚合物。

在一组实验中，该步骤中使用CM-Sepharose结合-洗脱柱。加载柱子前， 将Apo2L/TRAIL晶体溶解在配制缓冲液即0.5M精氨酸-琥珀酸盐/20mM TRIS pH 7.2中，并将溶解的总产物用20mM TRIS稀释5倍。将溶解的晶 体总产物加载到柱子上，用125mM NaCl/50mM TRIS/1mM DTT/pH 7.5 洗脱。多次重复所述柱操作，都显示了一致的收率(85-95％)和纯度。

在另一组实验中，使用穿过柱Phenyl Sepharose HIC。这里，将晶体溶 解到0.6M Na₂SO₄/50mM TRIS/1mM DTT/pH 7.5中。由于盐浓度高， Apo2L/TRAIL在这种溶液中的溶解度很高。三次运行一致地获得了98％的 产率，而色谱图也几乎相同。纯度水平很高，如使用CM-Sepharose结合- 洗脱柱时所见的一样。

实施例4 结晶条件的选择

将来自实施例3所述第一色谱纯化步骤的SP-Sepharose洗脱总产物冷 却以产生晶体，然后加热溶解晶体，进行多次。

在整个结晶过程中，使用实时粒度分析仪(Lasentec Focused Beam Reflectance Measurement-FERM)监测晶体的弦长和分布。在FBRM方法中， 激光沿着圆形路径快速旋转，当激光扫过晶体时，光束被持续反射一定的 时间，将该持续时间乘以旋转激光的速度得到“弦长”。

温度冷却速率的影响

使用FBRM监测作为温度冷却速率函数的晶体生长曲线。冷却速率影 响结晶所需的时间和最终的粒度分布。缓慢的冷却速率使溶液缓慢地过饱 和，且晶体成核和生长变慢。快速冷却则诱发高度的过饱和，形成许多小 的晶体。

对经过不同的时间实现从22℃到2℃的线性温度变化进行了研究。经 过1、4、8和24小时冷却时间的平衡晶体分布结果如图4和表2所示。

  冷却时间(小时)  平均粒度(μm)   颗粒(1-32μm)数目   溶解度(g/L)   1   38±20   810   0.81   4   43±22   560   0.74   8   39±18   550   1.0   24   44±22   500   0.82

4小时的冷却速率提供了可接受的结果。

搅拌对晶体粒度的影响

在3种搅拌速率下对大约0.4L的SP洗脱缓冲液进行结晶。所研究的 三种速率为：悬浮大部分晶体所需的最小速率(100RPM)、吸入气泡之前 的最大搅拌速率(250RPM)及中间速率(175RPM)。发现在最高搅拌速 率(250RPM)下结晶最快。在175RPM和250RPM下进行的实验的晶体 粒度分布非常相似，且显微图像没有明显差异。100RPM提供的搅拌不足 以完全悬浮所有颗粒。另外，观察到一定的晶体聚集。在所有的情况下， 叶轮均接近空气表面，容易吸入空气。在大规模应用中这种配置可能有所 改变，从而可以使用较高的搅拌速率而不会由于暴露于气-液界面而破坏蛋 白质。

抗溶剂研究

结晶过程中使用的抗溶剂通过降低蛋白质的溶解度而提高结晶的效 率。由于任何残余在溶液中的蛋白质均会在过滤过程中丧失，在结晶反应 中尽量降低溶解度是重要的。

抗溶剂的筛选如下进行：将Apo2L/TRAIL晶体或SP洗脱总产物装入5 mL注射器中，然后加入适量抗溶剂。在室温和2-8℃缓慢搅动样品，历时2 周。将1mL样品通过0.22μm滤器过滤以除去所有蛋白质晶体，然后过 HPLC IEX以测定溶液中的Apo2L/TRAIL浓度。

用分子量为400、3500和10000Da的聚乙二醇(PEG)(分别为PEG 400、PEG 3350和PEG 10000)作为抗溶剂进行测试。将Apo2L/TRAIL晶 体溶解在SP洗脱缓冲液中(200mM NaCl、50mM HEPES、0.05％Triton X-100、1mM DTT，pH 7.5)，并加入PEG。在2-8℃的温度将混合物搅拌 5天。图5所示的结果表明，就收率的改善而言，PEG 3350和PEG 10000 均优于PEG 400而且几乎相同。相对于未加PEG或任何其它抗溶剂的结晶 而言，加入5％的PEG 3350将理论产率从大约85％提高到了大约96％。

然后，考察乙醇和异丙醇对Apo2L/TRAIL溶解度的影响。发现这两者 在5％到10％的浓度均提供显著的产率增加。使用这些溶剂的Apo2L/TRAIL 平衡溶解度大约等于使用PEG的平衡溶解度。

还测试了其它常用的有机抗溶剂，即2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)、乙 二醇和二氧杂环己烷，但它们几乎无助于降低Apo2L/TRAIL溶解度。

根据这些研究确定的是，用4个小时的冷却时间，PEG3350作为抗溶 剂，利用22℃到4℃之间的线性温度变化冷却SP洗脱总产物，可以实现良 好的结晶效果和产率。

实施例5 结晶步骤中使用抗溶剂的双柱纯化方法

基本上如实施例3所述纯化Apo2L/TRAIL，但在结晶过程中加入5％ PEG 3350。结晶后，将总产物分成6份。将3份总产物过CM-Sepharose柱， 3份总产物过Phenyl-Sepharose柱。产率和纯度结果如下表4所示。

表4

  步骤   步骤产率   ECP(ppm)   LAL(EU/mg)   匀浆   1.6×10⁶  85.3   SP-Sepharose柱   89％   172.90   1.9   结晶   96％   9.1   1.9   CM-Sepharose柱   (第一选项)   86％   1.3   1.02   Phenyl-Sepharose柱   (第二选项)   98％   ＜0.35   0.23

本发明的范围不应受本文所述的具体实施方案的限制。事实上，除了 本文所述的那些修改形式之外，本领域技术人员根据前文的描述和附图可 以显然想到本发明的各种修改形式。所附权利要求的范围意图涵盖这些修 改形式。

序列表

<110>健泰科生物技术公司(GENENTECH，INC.)

FLORES，HEATHER

LIN，TANYA P.

MATTHEWS，TIMOTHY C.

PAI，ROGER

SHAHROKH，ZAHRA

<120>使用低温下结晶纯化APO-2配体/TRAIL的方法

<130>39766-0174P2 PCT

<140>PCT/US2006/018137

<141>2006-05-10

<150>US 11/136,842

<151>2005-05-24

<160>2

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>281

<212>PRT

<213>人(Homo Sapiens)

<400>1

Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys

 1               5                  10                  15

Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala

            20                  25                  30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys

        35                  40                  45

Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

    50                  55                  60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val

65                  70                  75                  80

Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser

                85                  90                  95

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

            100                 105                 110

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

        115                 120                 125

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

    130                 135                 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly

145                 150                 155                 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

                165                 170                 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

            180                 185                 190

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

        195                 200                 205

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

    210                 215                 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

225                 230                 235                 240

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

                245                 250                 255

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala

            260                 265                 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

        275                 280

<210>2

<211>1042

<212>DNA

<213>人(Homo Sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<222>447

<223>n＝T或G

<400>2

tttcctcact gactataaaa gaatagagaa ggaagggctt cagtgaccgg ctgcctggct   60

gacttacagc agtcagactc tgacaggatc atggctatga tggaggtcca ggggggaccc  120

agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt  180

gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccaac gagctgaagc agatgcagga caagtactcc  240

aaaagtggca ttgcttgttt cttaaaagaa gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa  300

gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc aagtggcaac tccgtcagct cgttagaaag  360

atgattttga gaacctctga ggaaaccatt tctacagttc aagaaaagca acaaaatatt  420

tctcccctag tgagagaaag aggtccncag agagtagcag ctcacataac tgggaccaga  480

ggaagaagca acacattgtc ttctccaaac tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa  540

ataaactcct gggaatcatc aaggagtggg cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg  600

aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg ttttactaca tctattccca aacatacttt  660

cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca aagaacgaca aacaaatggt ccaatatatt  720

tacaaataca caagttatcc tgaccctata ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt  780

tggtctaaag atgcagaata tggactctat tccatctatc aagggggaat atttgagctt  840

aaggaaaatg acagaatttt tgtttctgta acaaatgagc acttgataga catggaccat  900

gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt ggctaactga cctggaaaga aaaagcaata  960

acctcaaagt gactattcag ttttcaggat gatacactat gaagatgttt caaaaaatct 1020

gaccaaaaca aacaaacaga aa                                          1042