利用基因工程生产限制性内切酶的方法

摘要

本发明公开了一种生产限制性内切酶的方法，所述方法包括以下步骤：将与所述限制性内切酶相对的修饰酶基因克隆到载体的上游；在修饰酶的保护下，将限制性内切酶基因克隆至同一载体强启动子下游的多克隆位点中；转化表达宿主菌；筛选稳定、可诱导、高表达的限制性内切酶的菌株。

说明书

                        技术领域

本发明涉及一种利用基因工程生产限制性内切酶的方法。

                        背景技术

限制性内切酶是特异性识别DNA序列并在特定点将其切断的工具酶，它们来源于不同的微生物，是细菌防御外来病毒入侵的武器。在20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制-修饰系统(restriction-modificationsystem，R-M system)。该系统中有作用于同一DNA序列的两种酶，即，消化DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，并且这两种酶作用于同一DNA的相同部位。一般说来，不同的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制-修饰系统。

这些酶自七十年代后期在基因工程、分子生物学上被广泛应用，已有30年历史。目前商品化的酶有230多种，常用酶有50多种。随着基因克隆技术的应用，大大简化了限制性内切酶的生产过程，酶的纯度也更好。与一般基因工程工具酶不同，限制性内切酶可将自身DNA切断而导致菌体不能存活。所以要在大肠杆菌内工程化生产这种酶，必须先将这种酶的修饰酶基因导入菌体并预先表达，或通过这种酶的限制-修饰调控序列来精确调控两种酶的表达顺序。现有的克隆技术以及限制-修饰系统理论研究的限制使得工程菌株很难实现基因可诱导性表达。现有技术中生产限制性内切酶的方法主要是将限制-修饰及调控基因以鸟枪法克隆入质粒，靠质粒的高拷贝数实现目的蛋白高表达。这种生产方法的产量低、纯度差并且生产成本高，所以需要开发一种产量高、纯度好并且生产成本低的生产限制性内切酶的方法。

                     发明内容

本发明提供了一种生产限制性内切酶的方法，利用该方法生产酶的产量高、酶的纯度好并且成本低。

根据本发明的生产限制性内切酶的方法包括以下步骤：将与所述限制性内切酶相对的修饰酶基因克隆到载体的上游；在修饰酶的保护下，将限制性内切酶基因克隆至同一载体强启动子下游的多克隆位点中；转化表达宿主菌；筛选稳定、可诱导、高表达的限制性内切酶的菌株。

本发明上述方法中的修饰酶基因可选自甲基化酶基因，例如BHIM甲基化酶基因。

本发明方法中采用的载体可以是适合原核宿主的任何载体，优选地为pEEB载体。

本发明方法中采用的宿主菌可以是任何原核宿主细胞。优选地为大肠杆菌。

本发明的方法可以应用到生产以下限制性内切酶：AatII、AccI、AciI、AclI、AfeI、AflII、AflIII、AgeI、AluI、AlwI、ApaI、ApaLI、ApeKI、ApoI、AscI、AseI、AsiSI、AvaI、AvaII、BamHI、BanI、BanII、BbvCI、BbvI、BccI、BclI、BfaI、BfuCI、BglI、BglII、BlpI、BmgBI、BmrI、BmtI、Bpu10I、BsaBI、BsaHI、BsaI、BsaJI、BsaWI、BseYI、BsiEI、BsiHKAI、BsiWI、BsmFI、BsmI、BsoBI、Bsp1286I、BspDI、BspEI、BspHI、BspMI、BsrBI、BsrDI、BsrFI、BsrGI、BsrI、BssHII、BssKI、BssSI、BstAPI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、BtgI、BtgZI、BtsCI、BtsI、AvrII、Cac8I、ClaI、CspCI、CviAII、CviKI-1、CviQI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DraIII、DrdI、EaeI、EagI、EarI、EciI、EcoNI、EcoRI、EcoRV、FatI、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HincII、HindIII、HinfI、HinP1I、HpaI、HpaII、HphI、HpyAV、KasI、KpnI、MboI、MboII、MfeI、MluI、MlyI、MmeI、MnlI、MscI、MseI、MslI、MspA1I、MspI、MwoI、NaeI、NarI、NciI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NlaIII、NlaIV、NmeAIII、NotI、NruI、NsiI、NspI、PacI、PaeR7I、PciI、PflFI、PflMI、PhoI、PleI、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI、PsiI、PspGI、PspOMI、PspXI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、RsrII、SacI、SacII、SalI、SapI、Sau3AI、Sau96I、SbfI、ScaI、ScrFI、SexAI、SfaNI、SfcI、StiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SmlI、SnaBI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyD4I、StyI、SwaI、TaqαI、TfiI、TliI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspMI、TspRI、Tth111I、XbaI、XcmI、XhoI、XmaI、XmnI、ZraI，优选地为限制性内切酶BamHI。

根据本发明的示例性实施例，生产限制性内切酶的方法可以用于生产限制性内切酶BamHI，采用的修饰酶是BHIM甲基化酶基因，采用的载体是pEEB载体。

                      附图说明

图1是根据本发明的生产限制性内切酶的方法的流程图；

图2是示出根据本发明实施例的BHIM甲基化酶基因的PCR扩增结果的电泳测试图；

图3是示出根据本发明实施例的BamHI限制酶基因的PCR扩增结果的电泳测试图；

图4是示出根据本发明实施例的克隆BHIM甲基化酶基因的结果的电泳测试图；

图5是示出采用限制性内切酶Bgl II和Sph I对克隆后的BHIM甲基化酶基因进行酶切的结果的电泳测试图；

图6是示出根据本发明实施例的将BHIM甲基化酶基因克隆到pEEB载体上之后，挑取转化子作PCR扩增试验结果的电泳测试图；

图7是示出根据本发明实施例的将BHIM甲基化酶基因克隆到pEEB载体上之后，挑取转化子作Bgl II酶切试验结果的电泳测试图；

图8是示出PCR鉴定BamHI插入片段的结果的电泳测试图；

图9是采用Nde I和Sac I对pEEB-BHIM中的BamHI插入基因进行酶切的结果的电泳测试图；

图10是采用SDS-PAGE检测根据本发明实施例制备的BamHI表达的测试图；

图11是用western-blot检测根据本发明实施例制备的BamHI表达的测试图。

                          具体实施方式

本发明提供了一种生产限制性内切酶的方法，根据本发明实施例的生产限制性内切酶的方法包括以下步骤：将修饰酶基因克隆到载体的上游；在修饰酶的保护下，将内切酶基因克隆到同一载体的强启动子下游的多克隆位点中；转换表达宿主菌；筛选稳定、可诱导和高表达的限制酶的菌株。

在下文中，将以限制性内切酶BamHI和pEEB载体(由金普诺安蛋白质工程技术有限公司生产)为例来描述根据本发明实施例的生产限制性内切酶的方法。

具体地讲，根据本发明示例性实施例的生产限制性内切酶的方法包括以下步骤：从基因数据库中找到编码酶的DNA序列；从菌体或基因组DNA中PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)扩增目的基因；扩增目的基因的纯化、酶切；将基因片断插入pEEB质粒载体；将载体转化导入大肠杆菌(修饰酶先于限制酶)；DNA测序确证基因序列正确；正确质粒转化表达宿主菌并筛选工程菌；蛋白质的诱导表达和检测PAGE及免疫印记；大量发酵培养工程菌；收集工程菌、破菌、分离、纯化蛋白质；酶活性试验；质量控制试验，包括非特异性内切酶、外切酶、核酸酶监测、再连接及蓝白斑试验；冻干或分装成为成品酶。

BHIM基因和BamHI基因的PCR扩增结果

BHIM是与限制性内切酶BamHI相对的修饰酶，称作甲基化酶。

根据设计的两对引物，PCR扩增BHIM基因和BamHI基因。待扩增目的基因大小分别为1654bp和660bp，其中，BHIM基因包含有编码基因自身调控区域。从图2和图3可知，PCR扩增产物与设计引物时预期的片断大小相吻合，且目的片断扩增特异性高，阴性对照正常。

克隆甲基化酶基因(BHIM)

BHIM的PCR产物经纯化后与pGEM-T载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，次日挑取转化子，提取质粒进行PCR和酶切图谱鉴定，如图4和图5所示。

由图4可知，四个转化子中有一个转化子PCR扩增程阳性。利用质粒小提试剂盒对此转化子进行质粒抽提，并用限制性内切酶Bgl II和Sph I分别酶切来进一步验证阳性转化子的正确性，酶切验证结果如图5所示。由图5可知，提取质粒经Bgl II消化后能正确释放出1600bp左右的条带，Sph I单酶切后线性质粒大小为4000bp左右，以上结果均符合预期片断大小。由此可知，筛选的转化子为含有目的基因的阳性克隆子并命名为pGEM-BHIM。

将BHIM克隆到pEEB载体上游

pGEM-BHIM用Bgl II消化后回收甲基化酶BHIM基因，与同样经Bgl II消化并去磷酸化的线性载体pEEB连接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取转化子做菌液PCR扩增和Bgl II酶切验证，如图6和图7所示。由图6和图7可以看出，在1600bp左右出现条带，由此可知甲基化酶BHIM基因正确克隆入pEEB载体中。

BamHI表达质粒的构建

PCR扩增BamHI基因并用酶Nde I和Sac I对其进行消化，回收目的片段与同样经Nde I和Sac I消化的线性质粒载体pEEB-BHIM连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取转化子做菌液PCR扩增和Nde I、Sac I双酶切验证，结果如图8和图9所示。由图8和图9的电泳图可知，转化子PCR扩增和Nde I、Sac I酶切结果均出现一条大小为660bp左右的片断，由此证明该转化子中携带有内切酶BamHI基因。

目的蛋白诱导表达及SDS-PAGE电泳检测和Western Blot分析

经验证正确的表达质粒转化大肠杆菌，挑取新鲜克隆于LB培养基中培养过夜，次日按1％接种量接种于大量液体LB培养基中，200rpm，37℃培养，加入IPTG诱导表达BamHI，进行SDS-PAGE电泳检测和Western Blot分析，结果如图10和图11所示。菌株经IPTG诱导后，其总蛋白中明显呈现一条诱导蛋白，大小为24kD左右，与内切酶BamHI目的蛋白大小吻合。同时，WesternBlot分析也证明菌体中存在目的蛋白。

酶的纯化

对亲和纯化酶蛋白进行纯化，纯度可达90％以上。

酶活性检测

限制性内切酶的一个活性单位是指：在50μl的反应体系里，采用随酶提供的缓冲液，用1个小时的时间，彻底消化1μg底物DNA所需要的酶量。酶切反应应在带盖的Eppendorf管中进行，浓缩的酶稀释成大约1,000单位/ml。根据检测结果可知，根据本发明的示例性方法生产的BamHI活性稳定，识别序列正确，比活性好。

连接DNA片段的再酶切实验

DNA片段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA而获得(20-50倍)。用T4DNA连接酶连接(5′末端浓度为0.1-1.0μM)。连接的片段然后用同一种限制性内切酶重切。仅当3′和5′末端都保留完整，连接反应才会发生；而且只有那些识别位点完全恢复的分子才能被重切。根据再酶切试验结果可知，切割后正常的带型说明3′和5′末端都是完整的，并且根据本发明实施例的方法生产的酶样品中检测不到核酸外切酶和磷酸酶。

核酸酶污染的过夜鉴定

所有的限制性内切酶与1μg底物DNA在50μl反应体系中，采用提供的缓冲液温育过夜。比较酶切1小时的特征带型和过夜酶切的带型。通过比较可知，在两种情况下带型均明显且没有改变，说明测试的酶中不存在非特异性的DNA酶，由此可知根据本发明实施例生产的酶合格。

核酸外切酶污染鉴定

所有的限制性内切酶与1μg单双链混合的、3H标记的E.coli DNA(200,000cpm/μg)在50μl反应体系中，采用随酶提供的缓冲液，在推荐的温度下温育4小时。通过可溶解的TCA着色，可以计算出反应体系中被标记的DAN的百分比，进而可以显示出核酸外切酶的污染。根据本发明实施例生产的限制性内切酶酶未检出外切酶活性。

蓝白斑筛选鉴定

用于克隆的酶还须通过额外的质量鉴定，即，蓝白斑筛选鉴定，以确定经酶过量消化后DNA末端的完整性。该种鉴定方法为：用酶10倍过量消化适当的载体上lacZ基因中单一的酶切位点、连接、转化、并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、连接和表达半乳糖苷酶(b-galactosidase)可以说明克隆后基因是完整的，一个完整的基因产生蓝斑，一个不完整的基因(例如，降解的DNA末端)产生白斑。在进行蓝白斑鉴定中，根据本发明实施例生产的限制性内切酶产生的白斑数量未超过3％，该结果合格。

以上以限制性内切酶BamHI和pEEB载体为例示出了根据本发明实施例的生产限制性内切酶的方法，但是根据本发明实施例的生产内切酶的方法可以应用到生产其它限制性内切酶上。例如，可以应用到生产以下限制性内切酶：AatII、AccI、AciI、AclI、AfeI、AflII、AflIII、AgeI、AluI、AlwI、ApaI、ApaLI、ApeKI、ApoI、AscI、AseI、AsiSI、AvaI、AvaII、BamHI、BanI、BanII、BbvCI、BbvI、BccI、BclI、BfaI、BfuCI、BglI、BglII、BlpI、BmgBI、BmrI、BmtI、Bpu10I、BsaBI、BsaHI、BsaI、BsaJI、BsaWI、BseYI、BsiEI、BsiHKAI、BsiWI、BsmFI、BsmI、BsoBI、Bsp1286I、BspDI、BspEI、BspHI、BspMI、BsrBI、BsrDI、BsrFI、BsrGI、BsrI、BssHII、BssKI、BssSI、BstAPI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、BtgI、BtgZI、BtsCI、BtsI、AvrII、Cac8I、ClaI、CspCI、CviAII、CviKI-1、CviQI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DraIII、DrdI、EaeI、EagI、EarI、EciI、EcoNI、EcoRI、EcoRV、FatI、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HincII、HindIII、HinfI、HinP1I、HpaI、HpaII、HphI、HpyAV、KasI、KpnI、MboI、MboII、MfeI、MluI、MlyI、MmeI、MnlI、MscI、MseI、MslI、MspA1I、MspI、MwoI、NaeI、NarI、NciI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NlaIII、NlaIV、NmeAIII、NotI、NruI、NsiI、NspI、PacI、PaeR7I、PciI、PflFI、PflMI、PhoI、PleI、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI、PsiI、PspGI、PspOMI、PspXI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、RsrII、SacI、SacII、SalI、SapI、Sau3AI、Sau96I、SbfI、ScaI、ScrFI、SexAI、SfaNI、SfcI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SmlI、SnaBI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyD4I、StyI、SwaI、TaqαI、TfiI、TliI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspMI、TspRI、Tth111I、XbaI、XcmI、XhoI、XmaI、XmnI、ZraI。

另外，根据本发明实施例的生产限制性内切酶的方法也可以采用现有技术中的其它载体，而不限于上述的pEEB载体。

从以上描述可知，根据本发明实施例的生产内切酶的方法分别克隆限制酶和甲基化酶及调控基因，顺序插入载体，在甲基化酶保护下，实现限制酶基因的可诱导高表达。

根据本发明实施例的生产限制性内切酶的方法通过利用PCR扩增从原始菌中分别扩增限制修饰系统的甲基化酶基因和内切酶基因，其中，甲基化酶带自身调控序列便于基因自身调控。

因此，根据本发明实施例的生产限制性内切酶的方法可以提高蛋白质表达量，易于纯化和生产，并且能够降低限制性内切酶的生产成本。