一个控制水稻成花转换及抽穗期基因RID1的克隆及应用

摘要

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控植物(水稻)成花转换或/和抽穗期的基因RID1的分离克隆、功能验证和应用。通过基因功能互补实验，证明本发明克隆的RID1基因具有调控植物(水稻)成花转换或/和调控抽穗期的功能。本发明克隆的基因及其编码蛋白可广泛应用于调控植物的开花特性、改良植物品种的生育期和地区适应范围，具有重要的应用价值。

说明书

                                      技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体是一个控制植物(水稻)成花转换或/和抽穗期基因RID1的克隆、功能验证及应用。将该基因转化到水稻植物内，能启动水稻植物的成花转换过程，调控水稻的抽穗期。

                                    背景技术

开花(水稻上表现为抽穗)是植物由营养性生长向生殖性生长转换的一个重要的生长发育过程。植物开花的时间选择很重要，特别是当所希望的产物是花或从其产生的种子时，植物为了进行成功的有性繁殖，它们必须在适宜的环境条件下开花。比如，普通野生稻主要分布在华南及印度东部等热带地区，最北端只能到北纬28°，但经过人工选育抽穗期(开花)受环境影响相对较小的的亚洲栽培稻则分布地区更广泛，最北端可达北纬45°(Izawa等，Adaptation of flowering-time by natural and artificial selection in Arabidopsisand rice，J Exp Bot(2007)：3091-3097)。此外，水稻籼粳亚种间杂种具有强大的杂种优势，但生育期超亲是目前亚种间强优组合的广泛选配和实际利用最主要的制约因素之一。因此，发现和利用水稻早熟基因将有助于克服籼粳亚种间F1超亲迟熟的障碍(邓晓建等，水稻品种生育期的遗传和基因定位，四川农业大学学报(2001)：172-178)。在另外一些作物中，往往植物的营养器官是有经济价值的部分，比如菠菜叶及莴苣茎，红薯或土豆等的地下块茎，松树和杉树等木本植物的茎，延迟或避免这些植物开花可以提高有用的营养器官部分的得率。抑制或降低杨树、法国梧桐等树种的成花，减少上述树种子和花器官对城市的污染具有重要的意义。总之，研究植物开花调控的分子遗传机理对指导植物育种实践、品种改良及品种推广均具有重要的应用意义，对改良物种的开花习性使之更好地服务于人类的生活和环境具有重要价值。

植物的开花时间受许多因素的影响，主要包括光周期、温度及雨水等外界因素和植物的生理状况(如年龄和叶片数)等内部因素(Baurle等，The timing of developmental transitions in plants，Cell(2006)：655-664)。其中，光周期是影响植物开花最重要的环境调控因子之一。由于长日照条件下能促进拟南芥开花而短日照条件下延迟拟南芥开花，所以拟南芥是一种长日照植物。大量的分子遗传学实验已经鉴定了一系列拟南芥开花调控的突变体并克隆了相关的突变基因，并根据相关突变基因的生物学功能这些拟南芥开花突变体参与了四种途径：光周期途径、春化途径、自主开花途径和赤霉素途径。光周期途径和春化途径主要受环境因素影响，而自主开花途径和赤霉素途径主要取决于植物发育年龄及内源赤霉素水平等(Mouradov等，Control of flowering time：interacting pathways as a basis for diversity，Plant Cell(2002)：S111-S130)。

与拟南芥相反，水稻是一种典型的短日照模式植物，因此研究水稻开花的分子遗传学机理将有助于人们理解长日照植物与短日照植物在开花调控分子水平上的异同(Izawa等，Comparative biology comes intobloom：genomic and genetic comparison of flowering pathways in rice and Arabidopsis，Curr Opin Plant Biol，(2003)：113-120)。前人的研究发现，水稻与拟南芥的许多开花调控基因具有保守性，例如水稻的OsGI、Hd1及Hd3a等基因及它们的拟南芥同源基因GI、CO及FT一样在开花调控中起重要作用(Yano等，Hd1，a maior photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice，is closely related to the Arabidopsis flowering timegene CONSTANS，Plant Cell(2000)：2473-2483；Doi等，Ehdl，a B-type response regulator in rice，confersshort-day promotion of flowering and controls FT-like gene expression independently of Hd11，Genes Dev(2004)：926-936；Kojima等，Hd3a，a rice ortholog of the Arabidopsis FT Gene，promotes transition toflowering downstream of Hd1 under short-day conditions.Plant Cell Physiol(2002)：1096-1105)。但是，水稻与拟南芥在开花调控的分子机理上也有一些不同之处，比如在可诱导的光周期条件下，水稻的Hd1基因和其拟南芥同源基因CO均促进开花；但在非诱导的光周期条件下，水稻的Hd1基因延迟开花，而CO基因在拟南芥的开花调控中不起作用(Hayama等，Adaptation ofphotoperiodic control pathways produces short-dayflowering in rice，Nature(2003)：719-722)。此外，有一些开花调控基因仅仅存在于水稻或拟南芥中。比如，水稻中Ehd1和OsMADS51在短日条件下起开花促进作用，但在拟南芥中并不存在它们的同源基因；而拟南芥自主开花途径中关键调节基因FLC在水稻中也没有发现同源基因(Doi等，Ehd1，a B type responseregulator in rice，confers short-day promotion of flowering and controls FT-like gene expression independently ofHd1，Genes Dev(2004)：926-936；Kim等，OsMADS51 is a short-day flowering promoter that functions upstreamof Ehd1，OsMADS14，and Hd3a，Plant Physiol(2007)：145：1484-94；Michaels等，FLOWERING LOCUSC encodes a novel MADS domain protein that acts as a repressor of flowering，Plant Cell(1999)：949-56)。

C2H2-类型锌指蛋白是真核生物中广泛存在的一大类转录因子家族。研究表明植物中许多C2H2-类型锌指蛋白在植物生长发育或或其他防御反应过程中起着重要调节作用(Agarwal等，Genome-wideidentification of C2H2 zinc-finger gene family in rice and their phylogeny and expression analysis，Plant Mol.Biol(2007)：467-485)。例如，玉米中克隆的ID1基因属于一类新的C2H2-类型锌指蛋白(IDD基因家族)，这类IDD锌指蛋白含有一假定的核定位信号及四个不同的锌指模体。研究发现，ID1基因丧失功能突变体表现为开花延迟和花序突变为似幼苗的营养器官(Colasanti等，The maize INDETERMINATElflowering time regulator defines a highly conserved zinc finger protein family in higher plants，BMC Genomics(2006)：158；Colasanti等，The indeterminate gene encodes a zinc finger protein and regulates a leaf-generatedsignal required for the transition to flowering in maize，Cell(1998)：593-603)。本发明采用T-DNA标签的技术首次在水稻中分离获得RID1基因，该基因编码一种IDD锌指蛋白，突变体表型分析、基因表达分析和基因功能验证实验表明RID1基因能调控水稻开花转换和抽穗期。

                                      发明内容

本发明的目的是分离、克隆一个调控植物(水稻)成花转换或/和抽穗期和的新基因RID1及其编码蛋白，通过遗传转化方法将所述的基因RID1转化到水稻植物体内，以调控水稻植物的成花转换或/和开花期。

申请人将本发明克隆的调控植物(水稻)成花转换或/和抽穗期的新基因，将克隆的这个新基因被命名为Rice Indeterminate 1基因(简称RID1基因)，所克隆的基因的核苷酸酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，也可以是如本发明克隆的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有50％以上同源性的核苷酸序列，当然还包括在所述的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中插入、替代或缺失一个或多个碱基而产生突变体的等位基因。依据上述发明思想，本发明也可以是序列表SEQ ID NO：1所示的RID1蛋白的氨基酸序列，以及与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中50％同源性以上的氨基酸序列，包括在上述氨基酸序列中插入、替代或缺失一个或多个氨基酸而产生的功能改变的蛋白或蛋白类似物。

本发明克隆的调控植物(水稻)成花转换或/和抽穗期和的基因RID1是第一例来源于植物的涉及成花转换的基因。为了简约叙述，在本说明书中对该克隆的基因RID1有时也被称之为“成花基因”，它与前面所述的“成花转换或/和抽穗期和的基因”是指同一个基因。本发明已在细胞组织器官上证明该基因在未成熟叶片的微管束中表达；本发明克隆的水稻成花基因RID1的T-DNA插入失活突变体表现为不抽穗的表型，正常的功能基因RID1转化该突变体后植株恢复正常开花抽穗。分子水平上已经证实该水稻成花基因RID1调控了水稻中已经鉴定的开花基因如Hd3a、Ehd1、Hd1和其它的未知基因，这些基因共同调控了水稻的开花过程(见实施例3)。

本发明提供了一种利用RID1基因进行植物遗传转化从而改变植物开花时间的核苷酸序列和蛋白质序列。具体地说，本发明提供了一种含有所示SEQ ID NO：1序列的基因或该基因的部分类似功能片段的载体，如图3所示的pC2300-RID1(其来源参见实施例1所示)。

本发明克隆的水稻成花基因RID1可用于与其它调控元件，如组成型启动子(如CaMV35S启动子)或器官特异性启动子融合构建基因表达载体，通过转基因技术、反义RNA或RNAi等技术调控植物的开花特性(即提早开花、延迟开花或抑制成花等功能)，运用于改变品种的生育期、提高品种的地域适应范围、提高植物的营养器官的生物量等。

实现本发明的具体技术步骤如下：

1、从水稻已有的T-DNA插入突变体库(突变体库的创建方法已经公开发表论文，见Wu等，Developmentof enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome，Plant J(2003)：418-427；Zhang等，Non-randomdistribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13，804T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library，Plant J(2007)：947-959)筛选鉴定出一个不能实现成花转换的突变体，命名为rid1；突变体的筛选鉴定方法见实施例1中详细描述；

2、采用用Tail-PCR方法(Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of thegenome hierarchy as revealed by analyzing 13，804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutantlibrary，Plant J(2007)：947-959)分离rid1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列，序列分析显示T-DNA插入RID1基因(LOC_Os10g28330，www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/index.shtml)的第二个内含子中(图2中A)；

3、通过T-DNA插入与突变性状的共分离验证(按实施例1的第3部分T-DNA插入与突变表型的共分离检测执行)及功能互补实验(见实施例4)证明本发明获得的基因RID1基因为水稻成花转换基因，并调控了水稻的抽穗期；

4、利用RT-PCR及定量RT-PCR技术分析rid1突变体和野生型植株中RID1基因及抽穗期相关调控基因的表达(见实施例2和实施例3)；

5、基因融合报告基因GFP组织细胞定位结果表明RID1基因在未成熟叶片的微管束中表达，定位在细胞核内(见实施例2)；

6、利用生物信息学(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)分析RID1编码的蛋白质RID1，含有典型的C2H2的锌指结构域和IDD结构域(见图2中B)。根据突变体rid1的表型、基因互补转化的结果及RID1调控水稻的已知开花基因提出RID1调控水稻开花的网络(见图7，实施例5)，RID1控制了水稻的成花转换和抽穗期。

更详细的技术发明细节将由下述实施例给出。

                                      附图说明

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。

图1.水稻rid1突变体和功能互补实验转基因植株的表型。图1A的左边是rid1突变体，右边是野生型水稻品种“中花11号”在抽穗时的表型；图1B是发芽后370天的rid1突变体仍然保持营养生长；图1C是rid1突变体和野生型植株产生的叶片数(野生型植株约90天完成一个生长周期)；图1D是功能互补实验中恢复表型的转基因植株。

图2.是本发明克隆的水稻RID1基因的分子鉴定结果。图2A是RID1基因的结构和T-DNA插入位点分析，起始密码(ATG)和终止密码(TGA)均标出，黑色方框表示RID1基因的外显子，方框之间的线条表示内含子，T-DNA插入在第二个内含子内。LB和RB分别代表插入突变体T-DNA的左边界和右边界：图2B中的RID1蛋白和玉米ID1蛋白的氨基酸序列比对。“TRDFLG”模体和四个锌指模体用方框标注，假定的核定位信号(NLS)用粗线标注。图2C根据插入位点设计PCR引物检测共分离示意图。其中P1，P2，P3分别表示用来检测共分离的引物，T-primers为检测T-DNA插入阳性的引物。M代表T-DNA插入位点纯合植株，H代表T-DNA插入位点杂合植株，W代表野生型植株。

图3.是本发明设计的功能互补载体pC2300-RID1结构示意图。该载体的构建说明见实施例1中的4ID1基因的分离克隆部分，即将基因RID1的启动子和全长基因通过KpnI和BamHI酶切后克隆到载体pCAMBIA2300(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)上形成的新质粒。

图4.是利用RT-PCR方法分析RID1，Hd1，Ehd1，Hd3a基因在野生型和rid1突变体植株中的表达谱。水稻Actin基因作为内对照。图中：L，IM分别代表成熟叶片和未成熟叶片。

图5.是本发明克隆的RID1基因的表达部位分析。RID1::RID1:GFP转基因植株中GFP的表达部位检测：图5A：成熟叶片；图5B：叶舌；图5C：明场下的根(上)和暗场下的根(下)；图5D：未成熟叶片(上)和野生型植株为成熟叶片对照(下)；图5E：GUS在rid1突变体植株(上)和GUS野生型植株(下)中未成熟叶片的表达；图5F：激光共聚焦显微镜下观测GFP在RID1::RID1:GFP转基因植株中茎顶端分生组织上部、图5G：为顶端、图5H：为底部横切面上的表达。ΔRID1-GFP蛋白在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位：图5I：为GFP定位在细胞核内；图5J：为同样的细胞被细胞核染料DAPI染色的结果。图5K：为空载体转化后GFP分布在细胞质和细胞膜；图5L：为同样的细胞在明场下的结果。

图6.短日照条件和长日照条件下rid1突变体和野生型植株RID1、Ehd1、Hd1及Hd3a的定量RT-PCR表达分析。UBQ作为内源对照基因。平均值取自两次生物学重复的三次以上的技术重复。空心圆和实心圆分别代表白天和黑夜。

图7.RID1调控水稻成花的模式图。

                                   具体实施方式

实施例1：RID1基因的分离克隆

1、不抽穗突变体的获得

本发明所鉴定的突变体来自水稻T-DNA插入突变体(突变体库的创建方法已经公开发表论文，见Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome，Plant J(2003)：418-427；Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed byanalyzing 13，804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library，Plant J(2007)：947-959)。突变体的筛选鉴定方法是：从上述水稻T-DNA插入突变体库(见http://rmd.ncpgr.cn/)中将T0代转基因水稻种子，经过常规的浸种、催芽程序后种植于大田后得到每个T₁代家系共20棵植株，植株按5寸×8寸的间距种植于武汉华中农业大学的试验田(长日照条件，日照长度12-14小时)，按常规的水稻种植方法进行田间管理。正常水稻品种“中花11号”(为中国农业科学院培育的常用水稻品种)大约70天左右抽穗(发芽后的天数)，不能抽穗开花的突变体表现表现为不能抽穗和开花的突变表型(图1中A)，申请人把这个突变体命名为rice indeterminate 1(简称rid1)，该突变体已经收集在水稻突变体库中，见数据库http://rmd.ncpgr.cn/，该突变体库的所有资源均可被研究人员索取(见Zhang等，RMD：a rice mutant databasefor functional analysis of the rice genome，Nucl Acids Res(2006)：D745-D748)。该不抽穗的开花突变体在不同的生长条件得到进一步证实，将上述突变体rid1的稻兜移植(即带稻兜进行无性繁殖)中国海南岛(该地区属于短日照条件)以调查其再生植株的抽穗情况，结果发现突变体rid1仍然表现为“不能抽穗”。由于突变体rid1表现为不抽穗的表型，申请人统计了水稻主茎上产生的叶片数，在一年中，该突变体rid1不断产生新叶，表现为不能从营养生长向生殖生长转换(图1中B)。而在人工控制的日中性(12小时白天/12小时黑夜)和短日照(8小时白天/16小时黑夜)条件下种植的野生型水稻植株分别在发芽后60天和55天左右抽穗。图1中C显示了生长1年后的本发明的rid1突变体其主茎随着植株生长不断产生的叶片数。

2、分离rid1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列

利用Tail-PCR技术(参照Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of thegenome hierarchy as revealed by analyzing 13，804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutantlibrary，Plant J(2007)：947-959所示方法和步骤)分离了rid1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列。经过序列分析发现，该侧翼序列定位于水稻第10染色体上，其对应TIGR网站(www.tigr.org/tdb/e2k1/osal/index.shtml)中的基因(登录号：LOC_Os10g28330)，该基因为C2H2-类型锌指蛋白转录因子家族的一个成员。本发明将该基因命名为Rice Indeterminate 1(简称RID1)。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，它包括三个外显子和两个内含子，T-DNA插入第二个内含子中(见图2中的A)。利用Clustal X软件对已报道的玉米中ID1基因和本发明克隆的RID1基因进行蛋白质序列比对分析发现，这两个基因都编码IDD锌指蛋白(如图2中的B)。

Tail-PCR技术分离得到的rid1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列如下：

acctgctgtcgtcttattacgtcagtatttcaagccatcttcatcatcatatctgcatttgcaggaggcattgatggaaacacttcatttatagataatttgctgctgcagtaggatcgctttcttgctcccttttcttgccacagttcctgcattagcaattgaaatttaaggaggcagtttcaaggagcagatatagatatatattggcttatagttagctatagctagcagctgggggaccccaagatacacaataattatgtacactaagtttacacatgtaattaattatctatgcaacactaccaaaaatattgatctcaagaagttaattaattaaacagacactaaaaatctctaacatttaccctgcttgtagctctaactagcatgtaaatccatgaacctgaacatccaatgatcacacacgcgcacaaaccttggaaaagaaactaagctaatcatacggcaaggagacctttcttcaccaaagttaaatgcaactttacatgcatgcatgcgttcatcactgatcatgtgcacatcatcactactgttaccctacaaaatttgggaaatcaaacataaataatcactaaaaaactctttcatctgatcaatccacgtcgtccttaacgc

3、T-DNA插入与突变表型的共分离检测

为了检测rid1突变体T-DNA插入与其突变表型是否共分离，本发明从20株T₁代单株中抽提总DNA用作PCR反应模板，该DNA抽提的方法为CTAB法(参照Liu等，A genome-wide analysis of wide compatibility inrice and the precise location of the S5 locus in the molecular map，Theor Appl Genet(1997)：809-814)。根据rid1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列与水稻基因组的匹配情况，确定插入位点，在插入位点的两边设计一对引物：P1(5’-AAGGACGACTGTGGATTGAT-3’)和P2(5’-TCTTCTTCCTGTTCTTGCTCT-3’)，及T-DNA上设计一条引物P3(5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’)，如图2中的C。引物P1、P2和P3用于PCR反应。PCR反应条件是：先94℃变性3分钟，然后94℃1分钟，56℃1分钟，72℃稻兜1.5分钟，总共进行30个循环。在T1分离后代群体中，T-DNA插入位点纯合时只有P2和P3配对可以扩增出目标产物，因为P1与P2在插入的T-DNA区段两侧，导致P1与P2配对的扩增产物太大(大于10kb)无法得到扩增片段；没有T-DNA插入的野生型植株由于没有T-DNA的插入，所以P2和P3配对扩增没有产物，但可以利用引物P1与P2配对得到目标产物；而T-DNA插入位点杂合的植株则P1和P2配对以及P2和P3配对时都可以扩增得到产物。实验结果显示，20株T₁代单株中，7株“不抽穗”的突变体植株为均为RID1位点纯合的T-DNA插入突变体植株，而其他13株表型正常的植株基因型为野生型或杂合型(如图2中的C)。这表明rid1突变体是由于T-DNA插入造成的隐性开花突变体。

4、ID1基因的分离克隆

用KpnI和BamHI(KpnI和BamHI均购自Takara公司)酶切日本晴(一个普遍应用的日本水稻品种)BAC克隆水稻OSJNBa0018A14(美国亚利桑那大学Rod Wing教授惠赠。http://ag.arizona.edu/pls/faculty/wing.htm)后，用透析袋电洗脱法(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年第二版，321-322页)回收包括整个RID1基因的5.7kb大小的目标片段(包含1920bp启动子序列；2849bp基因编码区如序列表SEQ IDNO：1所示；955bp 3’非编码区)，然后与KpnI和BamHI酶切后的载体质粒pCAMBIA2300(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)用T4连接酶连接(T4连接酶购自Promega公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加800μl LB培养基复苏45分钟，取200μl涂于含50mg/L的卡那霉素、20mg/L的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)及20mg/L的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LA培养基平板上，37℃温箱培养14-16小时(LA与LB配方参考上述《分子克隆实验指南》)。挑取单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过PCR筛选阳性克隆、酶切验证及测序验证后的质粒命名为pC2300-RID1(图3)。

实施例2：RID1基因在未成熟叶片中表达，定位于细胞核内

本发明首先利用半定量RT-PCR分析RID1基因的表达模式，植物组织总RNA样抽提、反转录及RT-PCR反应条件见参考文献(Huang等，Down-Regulation of a SILENT INFORMATION REGULATOR2-RelatedHistone Deacetylase Gene，OsSRT1，Induces DNA Fragmentation and Cell Death in Rice，Plant Physiol(2007)：1508-1519)。总RNA取自人工控制的日中性条件下(12小时白天/12小时黑夜)种植的野生型水稻品种“中花11号”及rid1突变体的植物组织：取发芽后35天的叶片、叶鞘、未成熟叶片、根、茎尖组织以及发芽后41天的花器官分生组织提取总RNA。RT-PCR结果显示，RID1基因仅仅在野生型水稻品种“中花11号”的未成熟叶片有极低水平的表达，而在其他组织中均不表达；此外，在rid1突变体的未成熟叶片中也检测不到RID1基因的表达(图4)，表明rid1突变体是一个功能丧失突变体。RT-PCR结果表明，已知的水稻抽穗期基因Ehd1、Hd3a在rid1突变体中的表达受到抑制(图4)，说明Ehd1、Hd3a在开花调控网络中处于RID1的下游。RT-PCR检测用的引物见表1。

                表1本发明中使用的RT-PCR引物

  引物名称  引物序列  (5’-3’)  扩增片段大小  基因组  反转录产  物cDNA  OsActinL  OsActinR  ZF-RT1L  ZF-RT1R  Hd3a-L  Hd3a-R  Hd1-1-F  Hd1-1-R  Ehd1-L  Ehd1-R  CAATCGTGAGAAGATGACCC  GTCCATCAGGAAGCTCGTAGC  TCGAGCTATTGTCGTCGTTG  GGAAGAGGGTGTACGTGTGC  TCAGGGTTTTTTGCAAGATCGATGG  ACGCTGCAGTAGTACCAGGAATATC  GTTTGCAGAGAAGGAAGGGAGCGAGTG  GGTCGTGCCTCTGCATACGCCTTTCTTG  CGAAAGCAAATGCAAGATCA  TGGCAACTTGCTCTCTTGTC  644   2172   620     498   395   647   325     349

为了进一步分析RID1基因的时空表达模式，本发明构建了一个启动子表达载体(命名为：RID1::RID1:GFP)，并通过农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativaL.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant Journal，1994(6)；271-282)将该启动子载体导入野生型水稻品种“中花11号”中。载体(RID1::RID1:GFP)构建方法如下：以BAC克隆OSJNBa0018A14(美国亚利桑那大学Rod Wing教授提供。http://ag.arizona.edu/pls/faculty/wing.htm)作为模板，通过引物RG-FF(5’-CACCCCTTATGTGTGCATGCTCTCT-3’)和RG-FR(5’-GAAGTTGTGGCTCCACGT-3’)PCR扩增出包括1.9kb长的启动子区间及整个RID1基因的编码区的目标片段。利用pENTR Directional TOPO CloningKit试剂盒(购自Invitrogen公司)将该目标片段克隆到pENTR/D-TOPO载体(pENTR Directional TOPOCloning Kit试剂盒成分)上，然后通过上述新构建的载体与pGWB4(Nakagawa等，Development of seriesof gateway binary vectors，pGWBs，for realizing efficient construction of fusion genes for plant transformation，(2007)：34-41)发生LR重组反应，即可完成RID1::RID1:GFP启动子载体的构建。转化后的植株经过体视显微镜(LEICA MZFL III，Germany)观察，本发明发现GFP荧光信号仅仅在RID1::RID1:GFP转基因植株的未成熟叶片中可以检测到(见图5中的A-E)。

由于本发明所获得的rid1突变体中的载体为Enhancer Trap元件，其上的报告基因带有一个剪切过的小启动子，仅含TATA box和转录起始点，不足以启动报告基因表达，而只有借助邻近的增强子元件才能表达。因此，通过检测报告基因的表达模式可以判断该增强子元件所控制基因的表达模式(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome，Plant J，2003：418-427)。GUS染色结果显示，在rid1突变体的未成熟叶片中可以观测到GUS表达，而在野生型水稻植株的未成熟叶片中则观测不到GUS表达(见图5中的E)。

为了分析RID1蛋白的亚细胞定位，本发明构建了一个亚细胞定位载体，命名为pRID1L。该亚细胞定位载体pRID1L的具体构建方法如下：以水稻品种“中花11号”DNA为模板，通过引物RID1NLSL(5’AAAGGATCCTTCTTGATCCCGGTCAGGTC3’)和RID1NLSR(5’AAAGGTACCTCGTATGGTGGTGGGTAGCC3’)PCR扩增出包括编码前112个氨基酸(包括预测的核定位信号，见图2中B)的DNA序列的目标片段，并通过KpnI和BamHI将该目标片段酶切后连接到pU1391GFP(Huang等，Down-regulation of a SILENT INFORMATIONREGULATOR2-related histone deacetylase gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation and cell deathin rice，Plant Physiol(2007)：1508-1519)中的GFP报告基因前面，以使RID1蛋白的前112个氨基酸与GFP报告基因相融合。利用基因枪介导将该亚细胞定位载体质粒pRID1L导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达的方法进行RID1蛋白亚细胞定位分析，具体操作按文献所述方法进行Huang等，Down-regulation of a SILENTINFORMATION REGULATOR2-related histone deacetylase gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation andcell death in rice，Plant Physiol(2007)：1508-1519)。通过共聚焦显微镜观察，发现RID1蛋白定位于洋葱表皮细胞的细胞核内(图5I)。

实施例3：RID1调控已知的抽穗期相关调控基因

为了分析RID1基因调控水稻开花的分子机制，本发明利用定量RT-PCR技术检测相关抽穗期调控基因在rid1突变体和野生型植株中的表达。结果如图4所示，无论在长日照条件(14小时白天/10小时黑夜)还是短日照条件(10小时白天/14小时黑夜)下的连续2天内，与野生型水稻植株中表达相比较，rid1突变体中Ehd1和Hd3a表达受到严重抑制，几乎检测不到；而Hd1基因在rid1突变体中表达相对野生型植株在白天有所下降，而在黑夜两者差异不明显。这说明RID1基因主要通过调控Ehd1和Hd3a的表达进而影响水稻的开花。研究还发现，无论在长日照条件(14小时白天/10小时黑夜)还是短日照条件(10小时白天/14小时黑夜)下的连续2天内，RID1基因在rid1突变体中检测不到表达，而在野生型植株中各个时间点之间的表达无明显的规律性变化，说明RID1基因的表达并不受生物钟调控。这进一步说明RID1基因具有调控水稻开花的功能，且这种功能不受生物钟调控，而是通过调控Ehd1和Hd3a等抽穗期调控基因的表达进而影响水稻的开花(图6)。

定量RT-PCR实验具体步骤参照Huang等的实验方法进行(Huang等，Down-regulation of a SILENTINFORMATION REGULATOR2-related histone deacetylase gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation andcell death in rice，Plant Physiol(2007)：1508-1519)。具体步骤如下：(1)RNA材料准备：挑选约500株RID1家系杂合型单株的种子播种于小钵中。播种10天后，取每个单株约3厘米叶片抽提总DNA，并利用PCR方法检测每份单株的基因型(方法为实施例1中3 T-DNA插入与突变表型的共分离检测)。DNA抽提及PCR检测每份单株的基因型方法同本发明实施例1。分别将纯合基因型和杂合基因型(基因型的检测方法参照实施例1中3 T-DNA插入与突变表型的共分离检测)的单株移栽到小钵至播种后28天，然后转移到人工培养生长箱中继续培养。对于短日照处理的水稻植株RNA样品，短日照条件(10小时白天/14小时黑夜；28℃；75％湿度)下生长3天后，然后连续取样2天，每隔4个小时取一次样，每次取样包括rid1突变体与野生型植株的成熟叶片及未成熟叶片，每份RNA样品各取3个生物学重复。对于长日照处理的RNA样品，长日照条件(14小时白天/10小时黑夜；28℃；75％湿度)下生长3天后，然后连续取样2天，每隔4个小时取一次样，每次取样包括rid1突变体与野生型植株的成熟叶片及未成熟叶片，每份RNA样品各取3个生物学重复。(2)RNA样品抽提及反转录按实施例2的方法进行。(3)定量RT-PCR在ABI7500定量PCR system(Applied Biosystems，美国)上进行，采用2^-ΔCT相对定量的方法进行表达量的比较。25μL反应体系包含：1μL反转录产物，12.5μL SYBR^ Premix EX Taq^TM(Takara)，0.5μl Rox ReferenceDye II(Takara)及0.2μM引物。反应参数设置如下：95℃/10sec；95℃/5sec，60℃/40sec，50cycles。所有定量RT-PCR引物参见表2。

              表2本发明中使用的定量RT-PCR引物

  引物名称  引物序列  扩增长度  Ubq-qRT-F  Ubq-qRT-R  ZF-qRT-L  ZF-qRT-R  Hd1-qRT-F  Hd1-qRT-R  Ehd1-qRT-L  Ehd1-qRT-R  Hd3a-qRT-1L  Hd3a-qRT-1R  AACCAGCTGAGGCCCAAGA  ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA  CGACGACAATAGCTCGATCGC  GTGCATGGTCACGGAGCCTT  TCAGCAACAGCATATCTTTCTCATCA  TCTGGAATTTGGCATATCTATCACC  GGATGCAAGGAAATCATGGA  AATCCCATCGGAAATCTTGG  CTTCAACACCAAGGACTTCGC  TAGTGAGCATGCAGCAGATCG  77bp   97bp   80bp   121bp   150bp 

实施例4：功能互补实验验证

1、互补载体的构建

利用实施例1中构建的互补载体为pC2300-RID1(图3)，把构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)菌株中，将含有载体pC2300-RID1的农杆菌菌株命名为ZF01。

2、遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant Journal，1994：271-282)将ZF01菌株导入基于PCR检测的rid1突变体基因型背景的愈伤，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有G418(购自北京原平皓生物技术有限公司)抗性的愈伤、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂及配方见申请人已经公开的专利，专利名称为：水稻木质素合成基因FC1及应用，申请号：200610018105.5；公开号：CN1995346)。按照相同的遗传转化方法将空载体pCAMBIA2300(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)导入基于PCR检测的rid1突变体基因型背景的愈伤，得到的转基因植株作为对照。

本发明研究结果显示，将ZF01菌株导入基于PCR检测的rid1突变体基因型背景的愈伤最后获得T0代(转化当代)互补转基因(ZF01)植株143株，在2006年武汉正季栽培条件下种植(5月上旬播种)，其中117份转基因植株恢复抽穗，而且这些转基因植株的抽穗期并不一致。此外，pCAMBIA2300空载体导入基于PCR检测的rid1突变体基因型背景的愈伤得到13份对照转基因植株，这13份对照材料仍然保持“不抽穗”的突变表型，详细的抽穗期数据见表1。

                        表3不同基因型植株抽穗期统计表

 植株  抽穗天数  总数  70-90  天  90-110  天  110-130  天  130-170  天 171-200 天 ＞360 天 中花11号  (W.T.) pCAMBIA2300转化  rid1 rid1突变体 pC2300-RID1转化  rid1   20        93          10          7          6         1     13  6      20    13   6   117 

表3的结果表明RID1调控了水稻的成花转换，rid1突变体“不开花”的表型确实是由于RID1基因突变而造成，RID1基因可以恢复rid1突变体开花并具有调控水稻抽穗期的功能。为了调查这些互补转基因植株的抽穗期是否与其转基因拷贝数相关，本发明随机选取12份T0代互补转基因植株，利用Southern杂交(具体操作参考：Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the ricegenome，Plant J，2003：418-427)分析这12份互补转基因植株的拷贝数。结果显示，其中有6份互补转基因植株为单拷贝，其余互补转基因植株含有2个或2个以上转基因拷贝，发现这些互补转基因植株的抽穗期与其转基因拷贝数并不相关，而可能与转基因剂量效应相关。此外，上述6份单拷贝互补转基因植株在T1代出现表型分离，其中恢复抽穗的植株为转基因阳性植株，而未恢复抽穗的植株为转基因阴性植株。这些研究结果进一步证明RID1调控了水稻的成花转换，同时RID1基因具有调控水稻抽穗期的功能。

实施例5：RID1基因在水稻开花网络中的作用及应用

由于rid1突变体植株表现为“不抽穗”的表型，功能互补转化RID1基因水稻植株恢复正常的开花特性并呈现不同的抽穗期，说明RID1基因起到了开花的分子开关作用，一旦它突变体后，水稻便不能行使开花的发育过程，一直停留在营养生长阶段；同时它的表达量的多少又决定了水稻抽穗的早晚(互补转化的不同单株表现为不同的抽穗期)，因此可以通过调控RID1基因的表达量来改良植物的开花时间。结合本发明中检测的水稻已知的开花基因在rid1突变体植株中的表达情况以及前人有关水稻开花时间的研究，提出了RID1基因调控水稻开花的分子网络(图7)。

通过植物基因工程技术可以将RID1基因在水稻中特定组织部位或特定时期异位表达，从而通过调控RID1基因的时空表达模式及表达量达到调控水稻抽穗期进而提高水稻品种的地区与季节适应性的目的。此外，可以利用植物基因工程技术抑制RID1的同源基因在其他植物(如菠菜、莴苣、红薯、土豆、松树或杉树等)中特定组织部位或特定时期异位表达，也可能延迟或避免这些植物的开花从而提高其有用的营养器官部分的得率，减少树种子和花器官对城市的污染。

                       序列表